Name: isolation, culture, and genetic engineering of mammalian primary pigment epithelial cells for non-viral gene therapy
Uploaded: 2021-02-26T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy at JoVE.com

תודה מגיעה לגרג סילי ואלן קונטי על הסיוע הטכני המצוין שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי הנציבות האירופית בהקשר של תוכנית המסגרת השביעית, הקרן הלאומית השוויצרית למדעים וקרן שמידר-בוהריש. Z.I. קיבל מימון ממועצת המחקר האירופית, ERC Advanced [ERC-2011-ADG 294742] ו- B.M.W. ממענק מחקר פולברייט ומלגת מצוינות ממשלתית שוויצרית.

הפרוטוקולים שבהם היו מעורבים בעלי חיים בוצעו על ידי אנשי צוות מוסמכים ולאחר אישור על ידי Département de la sécurité, de l'emploi et de la santé (DSES), Domaine de l'expérimentation animale של ז'נבה, שוויץ, ועל פי הצהרת ARVO לשימוש בבעלי חיים במחקר אופטלמי וחזון (אישור לא. GE/94/17). חולדות חום נורווגיה בריא למבוגרים, עכברי C57BL/6, וארנבות לב?...

לאחר שיטות סטנדרטיות כדי לבודד ותרבות תאי PE הוא היסוד בפיתוח גישות טיפול חדשות עבור מחלות ניווניות רשתית. עם הפרוטוקולים המוצגים כאן, תאי PE יכולים להיות מבודדים בהצלחה ממינים שונים ותרבית במשך תקופות ארוכות (עד כה, התרבות הארוכה ביותר נשמרה במשך שנתיים1,38); ?...

הקבוצה שלנו מתמקדת בפיתוח גישות רגנרטיביות לטיפול בניוון עצבי, כלומר AMD, על ידי RPE- ו- IPE מבוסס טיפול גנטי לא ויראלי. הממסד הקדם-קליני של טיפולים כאלה מחייב מודלים במבחנה הניתנים להעברה לבני אדם. לכן, מטרת המחקר המוצג כאן היא לספק פרוטוקולים לבידוד, לתרבות ולהנדסה גנטית של תאי RPE ו- IPE ראשוניים. הרציונל לבסס את הבידוד של תאי PE ממינים מרובים הוא לאשר בחוזקה את הבטיחות והיעילות של הגישה ולהגדיל את יכולת הרבייה וההעברה שלה. קו תא RPE האנושי הזמין ARPE-19 שונה מתאים ראשוניים (למשל, הם פחות פיגמנטים) ולכן, הוא רק בעלערךמוגבל עבור ניתוחים פרה קליניים 1 . בנוסף, ניתן לרכוש תאים לא אנושיים של יונקים בעלות נמוכה יותר ובכמויות גדולות יותר; רקמת תורם אנושי ניתן להשיג בנקי עיניים שונים, אבל הזמינות מוגבלת ויקרה. לבסוף, מוצרים רפואיים חדשים לטיפול מתקדם (ATMP, כלומר, תא, רקמה, או מוצר רפואי טיפול גנטי) צריך להיות מיושם לפחות שני מינים שונים לפני שנבדקו בחולים אלה במחקרים vivo לבקש את הכנת השתלות תאים אלוגניים.
מחלות ניווניות ברשתית הן הגורם המוביל לעיוורון במדינות מתועשות, הכוללות מחלות נפוצות כמו AMD, כמו גם מחלות נדירות כמו רטיניטיס פיגמנטוזה, שבהן המוות של תאי הרשתית מוביל בסופו של דבר לעיוורון. תאי RPE, קולטן אור ותאי גנגליון רשתית (RGC) נזק יכול במקרים מסוימים להיות מואט, אבל אין כרגע אין ריפוי זמין. ATMPs מציעים פוטנציאל לתקן פגמים גנטיים, לשלב גנים טיפוליים או להחליף תאים מנוונים, ובכך לאפשר התפתחות של טיפולים רגנרטיביים ומרפאים למחלות כגון AMD; 13 טיפולים גנטיים כבר קיבלו אישור שיווק כולל טיפול לטיפול בניוון רשתית הקשור למוטציה RPE652,3. בקרב מבוגרים (>60 שנה), ~ 30 מיליון אנשים ברחבי העולם מושפעים או ניאווסקולרי (nvAMD) או כלי דם (aAMD) AMD4. שתי הצורות נגרמות על ידי גורמים הקשורים לגיל כולל נזק חמצוני, פגיעה בתפקוד ואובדן של תאי RPE ואחריו השפלת photoreceptor, בין היתר (למשל אללים סיכון גנטי, עישון, יתר לחץ דם)5,6. ב- nvAMD, פתוגנזה מחמירה על ידי חוסר איזון של גורמים אנגיוגניים ואנטי אנגיוגניים לטובת גורם הגדילה האנדותל וסקולרי אנגיוגניים (VEGF) שגורם לניאווסקולריזציה choroidal (CNV). עד כה, רק nvAMD ניתן לטיפול על ידי זריקות תוך-ויטראליות חודשיות של מעכבי חלבון VEGF כדי לדכא את CNV; אין עדיין טיפול יעיל זמין עבור AAMD6,7.
מספר מחקרים העריכו טיפולים מבוססי תאים כדי להחליף את הטיפול נגד VEGF: מחקרים שנעשו על ידי בינדר ואח ', שבו תאי RPE אוטולוגיים שנקטפו זה עתה הושתלו בחולים עם nAMD8,9,10, הראו שיפור חזותי מתון, אבל רק קבוצה קטנה של חולים הגיעו חדות ראייה סופית גבוהה מספיק כדי לאפשר קריאה. לאחרונה, מחקר קליני שלב I השתמש תיקון RPE שמקורו בתא גזע עוברי לטיפול AMD עם תוצאות מבטיחות; כלומר, יעילות, יציבות ובטיחות של תיקון RPE עד 12 חודשים ב 2 מתוך 10 חולים שטופלו11. בנוסף, מספר קבוצות פרסמו מחקרים שבהם מדבקות הממברנה-כורואיד של RPE-Bruch האוטולוגיות נקצרו מהרשתית ההיקפית והושתלו למקולה12,13,14; ותחבושות RPE שמקורן בתאי גזע פלוריפוטנטיות (iPSC) נוצרו להשתלה15. עבור AAMD, נוגדנים המתמקדים במסלול המשלים נבדקו בניסויים קליניים6,16 ושלב מחקר אני באמצעות הזרקה תוך-ויטמינית אחת של וקטור ויראלי הקשור לאדנו (AAV) קידוד הגן לגורם CD59 (AAVCAGsCD59) בחולים עם ניוון גיאוגרפי (GA) הושלם17; מחקר שלב II החל לאחרונה ומטרתו לגייס 132 חולים עם AAMD מתקדם ולהעריך את התוצאה בגיל שנתיים לאחר התערבות18. לבסוף, קבוצת המחקר FocuS החלה ניסוי קליני רב מרכזי שלב I /II הערכת הבטיחות, תגובת המינון והיעילות של רקומביננטי לא שכפול וקטור AAV קידוד גורם משלים אנושי19.
בעיקר, המטרה של טיפול AMD רגנרטיבי היא השתלת תאי RPE פונקציונליים, אשר נפגעו או אבדו. עם זאת, תאי IPE ו- RPE חולקים קווי דמיון תפקודיים וגנטיים רבים (למשל, פאגוציטוזיס ומטבוליזם רטינול), ומכיוון שתאי IPE נקצרים באופן ריאלי יותר, הם הוצעו כתחליף RPE20. למרות שהוכח בעבר כי השתלת תאי IPE מעכבת ניוון פוטורצפטור במודלים של בעלי חיים21,22 ומייצבת את התפקוד החזותי בחולים עם nvAMD סופני, לא נצפה שיפור משמעותי בחולים אלה23. חוסר היעילות עשוי להיות בשל המספר הנמוך של תאים מושתלים, ו /או חוסר איזון של גורמי רשתית neuroprotective. גישה חלופית תהיה להשתיל תאי אפיתל פיגמנט transfected כי overexpress גורמים neuroprotective כדי לשחזר הומאוסטזיס רשתית, לשמור על תאי RPE הנותרים, ולהגן על קולטני אור ו RGCs מפני ניוון. כתוצאה מכך, אנו מציעים טיפול חדש הכולל השתלה של תאי RPE או IPE פונקציונליים שעברו הנדסה גנטית להפריש חלבונים neuroprotective ואנטי אנגיוגניים, כגון PEDF, GM-CSF או גורמי גדילה דמויי אינסולין (IGFs). היתרון של פיתוח וניתוח גישה זו במספר מינים במקום להשתמש בקו תאים, רק מין אחד, או רקמה אנושית הוא: 1) רבייה מוגברת ויכולת העברה של התוצאות כפי שמוצג על ידי מחקרים רבים שהתממשו במעבדות עצמאיות ובמינים שונים1,24,25; 2) תאי חזיר או בקר הם חד פעמיים באופן ריאלי ללא הקרבה של בעלי חיים נוספים; 3) הזמינות של תאי חזיר וטור במיוחד מאפשרת לסדרות בדיקה גדולות לייצר תוצאות חזקות; 4) הידע לבודד, לתרבות ולשנות גנטית תאים מהמודלים הנפוצים בעיקר מאפשר ניתוחי vivo במינים מרובים24,25,26 ובכך מציע יחס סיכון-תועלת משופר עבור החולים שטופלו לראשונה; 5) גמישות הפרוטוקול המוצג מאפשרת את השימוש בו במודלים שונים ובסטים ניסיוניים ולכל טיפולים מבוססי תאים עיניים עם ובלי הנדסה גנטית. לעומת זאת, טכניקות חלופיות כמו קווי תאים או רקמה אנושית הן רק של יכולת העברה מוגבלת ו /או חד פעמי מוגבל. קווי תאים כגון ARPE-19 הם אידיאליים לניסויים ראשוניים; עם זאת, פיגמנטציה נמוכה והתפשטות גבוהה שונים באופן משמעותי מהתאים העיקריים1. תאי RPE ו- IPE, המבודדים מרקמת התורם האנושי מציעים מקור יקר לניסויי מביה מובנים; עם זאת, אנו מקבלים רקמה אנושית מבנק עיניים אמריקאי-אמריקאי כלומר הרקמה בת יומיים לפחות (לאחר ההשתתפות) ודורשת הובלה ארוכה ויקרה, אך רקמת התורם המקומית אינה זמינה בכמויות מספיקות למחקר פרודוקטיבי. היתרון של השימוש בתאים ראשוניים מאושר על ידי מחקרים מרובים מקבוצות אחרות27,28.
לפיתוח של טיפול גנטי לא ויראלי מבוסס תא באמצעות מערכת טרנספוסון SB100X עבור transfecting תאי RPE ו- IPE ראשוניים עם קידוד הגנים עבור PEDF ו / או GM-CSF לטיפול nvAMD ו- aAMD, בהתאמה29,30,31,32, הקמנו לראשונה את transfection של ARPE-19 תאים1 . לאחר מכן, פרוטוקולי הבידוד וההדבקה הוקמו בתאי בקר וחזירים ראשיים נגישים. כעת, הבידוד וההדבקה של תאי RPE ו- IPE ראשוניים מחמישה מינים שונים הוקמו, מקטן (כעכבר) ליונקים גדולים (כבקר). זה אושר בתאי RPE ו- IPE ראשוניים שמקורם בעיני תורם אנושי30. ייצור תואם ייצור טוב (GMP) של ATMP אומת באמצעות רקמת תורם אנושי, כמו גם33. לבסוף, הן הבטיחות והן היעילות של הגישה הוערכו ב- vivo בשלושה מינים שונים שעבורם הותאם הפרוטוקול: עכבר, חולדה וארנב. במערך הקליני, ביופסיה קשתית תיקצר מהחולה ותאי IPE יהיו מבודדים ומודבקים בחדר הנקי, לפני שהתאים יושתלו בעדינות בחזרה לאותו חולה. התהליך כולו יתקיים במהלך מפגש כירורגי יחיד הנמשך כ-60 דקות. פיתוח גישת הטיפול והערכת יעילותה ביקשו מודלים מצוינים במבחנה ובאקס ויוו ליישום שיטות אספקתגניםחזקות ויעילות, לניתוח יעילות אספקת הגנים, ייצור חלבונים טיפוליים ואפקטים נוירו-הגנתיים, ולייצר השתלות תאים כדי לבחון את הגישה ב- vivo1,24,25,29,30 . ראוי להזכיר כי לטיפול יש את האישור האתי לניסוי שלב קליני Ib/ IIa מהוועדה האתית לחקר קנטון ז'נבה (מס '2019-00250) וכיום הנתונים הטרום קליניים האחרונים המבוקשים לאישור על ידי רשויות הרגולציה השוויצרית נאספים באמצעות הפרוטוקול המוצג. בהקשר זה, נתונים פרה קליניים ב- vivo הראו ירידה משמעותית CNV ובטיחות מעולה24,25,31.
כאן, הבידוד והתרבות של תאי RPE / IPE מפקעת בקר, חזיר, ארנב, חולדה ועכבר, והשימוש במערכת טרנספוסון SB100X אינטגרטיבית בשילוב עם אלקטרופורציה כשיטת אספקת גנים יעילה מתואר. במיוחד, תאי PE ראשוניים הועברו לדיכוי יתר של PEDF ו- GM-CSF. האוסף של פרוטוקולים אלה מאפשר את המחקרים במבחנה ובמחקרי ויוו להתבצע בכל השלבים הטרום קליניים של פיתוח ATMP. יתר על כן, ההקמה יש פוטנציאל להיות מותאם לגנים אחרים של עניין ומחלות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well plates</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>150687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>7657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine</td>
			<td>Mundipharma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bonn micro forceps flat</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri forceps (sterile)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/Ham`s F12</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drape (sterile)</td>
			<td>M&#246;lnlycke Health Care</td>
			<td>800530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation buffer 3P.14</td>
			<td>3P Pharmaceutical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Brunschwig</td>
			<td>P40-37500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (different size) (sterile)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze compress</td>
			<td>PROMEDICAL AG</td>
			<td>25403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl (0.9%)</td>
			<td>Laboratorium Dr. Bichsel AG</td>
			<td>1000090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle (18G)&#160;</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>TER-NN1838R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection kit 10 &#181;L</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK5000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber</td>
			<td>Marienfeld-superior</td>
			<td>640010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette (fire-polish)</td>
			<td>Witeg</td>
			<td>4100150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0781-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital (Thiopental Inresa)</td>
			<td>Ospedalia AG</td>
			<td>31408025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>150288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFAR4-PEDF</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFAR4-SB100X</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFAR4-Venus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Pastor et al., 2018. Kindly provided by Prof. Scherman and Prof. Marie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSB100X (250 ng/&#181;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>M&#225;t&#233;s et al., 2009. Provide by Prof. Izsvak</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pT2-CAGGS-Venus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Johnen et al., 2012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pT2-CMV-GMCSF-His plasmid DNA (250 ng/&#181;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cloned in our lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pT2-CMV-PEDF-His plasmid DNA (250 ng/&#181;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Pastor et al., 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scarpel no. 10</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scarpel no. 11</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp-sharp tip curved Extra Fine Bonn Scissors (sterile)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp-sharp tip straight Extra Fine Bonn Scissors (sterile)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tali Image-Based Cytometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>T10796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.25%&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25050014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 5%/EDTA 2%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas spring scissors curved (sterile)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture, and genetic engineering of mammalian primary pigment epithelial cells for non-viral gene therapy

ניוון מקולרי הקשור לגיל (AMD) הוא הגורם השכיח ביותר לעיוורון בחולים >60 שנה, המשפיע על כ -30 מיליון אנשים ברחבי העולם. AMD היא מחלה רב-גורמית המושפעת מגורמים סביבתיים וגנטיים, המובילים לפגיעה תפקודית ברשתית עקב ניוון תאי הפיגמנט ברשתית (RPE) ואחריו השפלת קולטני הפוטו. טיפול אידיאלי יכלול השתלה של תאי RPE בריאים מפרישים גורמים neuroprotective כדי למנוע מוות תאי RPE ניוון photoreceptor. בשל הדמיון התפקודי והגנטי והאפשרות לביופסיה פחות פולשנית, הוצעה השתלת תאי אפיתל פיגמנט איריס (IPE) כתחליף ל- RPE המנוון. הפרשת גורמים neuroprotective על ידי מספר נמוך של תאים מושתלים subretinally ניתן להשיג על ידי היפהפייה הנרדמת (SB100X) transposon בתיווך תעתיק עם גנים קידוד עבור גורם הפיגמנט נגזר אפיתל (PEDF) ו / או גרנולוציט מקרופאג'-מושבה גורם מגרה (GM-CSF). הקמנו את הבידוד, התרבות, ו- SB100Xבתיווך של תאי RPE ו- IPE ממינים שונים כולל מכרסמים, חזירים ובקר. גלובס מוסר והקרנית והעדשה מוסרות כדי לגשת לאיריס ולריתתית. באמצעות מרית בהזמנה אישית, תאי IPE מוסרים מה הקשתית המבודדת. כדי לקצור תאי RPE, דגירה טריפסין עשוי להידרש, בהתאם למין. לאחר מכן, באמצעות מרית מותאמת אישית של RPE, תאים מושעים במצב בינוני. לאחר זריעה, תאים מנוטרים פעמיים בשבוע, ולאחר שהגיעו למפגש, מועברים על ידי אלקטרופורציה. שילוב גנים, ביטוי, הפרשת חלבונים ותפקוד אושרו על ידי qPCR, WB, ELISA, אימונופלואורסצנטיות וביקורת תפקודית. בהתאם למין, 30,000-5 מיליון (RPE) ו-10,000-1.5 מיליון (IPE) תאים יכולים להיות מבודדים לכל עין. תאים מהונדסים גנטית מראים ביטוי יתר משמעותי של PEDF/GM-CSF עם היכולת להפחית עקה חמצונית ומציעים מערכת גמישה עבור ניתוחי ex vivo ובמחקרי vivo הניתנים להעברה לבני אדם כדי לפתח גישות לטיפול בגנים עיניים.

בידוד PE ממיני יונקים שונים באמצעות הפרוטוקולים הנ"ל, תאי IPE ו- RPE בודדו בהצלחה ותרביתו מחמישה מינים שונים. מספר התאים המתקבלים מכל הליך תלוי במין ובגודל העין(טבלה 1). כפי שמוצג באיור 1, תאים מראים מורפולוגיה טיפוסית של תאי PE ופיגמנטציה (למעט תאי ארנב המוצגי?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy at JoVE.com

Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy

כאן מוצג פרוטוקול לבידוד וזיהוי תאי אפיתל ראשוניים של איריס ושל פיגמנט רשתית מיונקים שונים (עכברים, חולדות, ארנב, חזיר וחזירים). השיטה מתאימה באופן אידיאלי לחקר גישות ריפוי גנטי עיניות במגוון סטים עבור ניתוחי ex vivo ובמחקרי vivo הניתנים להעברה לבני אדם.

בידוד, תרבות והנדסה גנטית של תאי אפיתל פיגמנט ראשוני של יונקים לטיפול גנטי לא ויראלי

Age-related macular degeneration (AMD) is the most frequent cause of blindness in patients &#62;60 years, affecting ~30 million people worldwide. AMD is a ...

הפרוטוקול הוא משמעותי שכן הוא מראה בידוד ו transfection של תאי אפיתל פיגמנט מחמישה יונקים כמערכת אופטימלית לחקר טיפול גנטי עינית בכיוונים שונים. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא הגמישות שלה, יכולת העברה, תפוקת תאים גבוהה, כדאיות ושיעור transfection בשל חמשת המינים ואת מערכת טרנספוסון SB100X לא ויראלי בשימוש. טכניקות אלה פותחו כדי לחקור גישות ריפוי גנטי המתמקדות בתאי אפיתל של פיגמנט רשתית ואיריס, אשר מבודדים ומודבקים בפרוטוקול הנוכחי, אך שמישים לכל מחקר עיני.מדגים את ההליך יהיה גרג סילי, טכנאי מהמעבדה. לאחר המתת חסד החיה, להשתמש במספריים מעוקלים מלקחיים קוליברי כדי להכשיר את העיניים, ולאחר מכן לנקות את רקמת השריר הנותרת ואת העור מהעיניים. לאסוף את העיניים בצינור 50 מיליליטר מלא PBS לא סטרילי ולהעביר את הצינור למכסה המנוע זרימה למינאר.לחטא אותם על ידי שקוע בתמיסה מבוססת יוד במשך שתי דקות, ולאחר מכן להעביר את העיניים לצינור 50 מיליליטר מלא PBS סטרילי. שים עין אחת על דחיסת גזה סטרילית והחזק בחוזקה את העין קרוב לעצב הראייה. ואז לחתוך ליד הגבול של הקשתית עם מספר 11 אזמל.באמצעות מספריים, לחתוך סביב הקשתית ולהסיר את החלק החלק החלק העורפי ולשים אותו בצלחת פטרי, משאיר את הנורה עם הזגג עד אפיתל הפיגמנט ברשתית, או תאי RPE, מבודדים. כדי לבודד אפיתל פיגמנט קשתית, או תאי IPE, להסיר את העדשה עם מלקחיים עדינים בעדינות לשלוף את הקשתית המכילה את תאי IPE. מניחים את הקשתית בצלחת פטרי ושטפים אותה עם PBS סטרילי.הוסף 500 מיקרוליטרים של 0.25%טריפסין ודגרה במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. הסר את טריפסין, להוסיף 500 microliters של מדיום מלא, ולגרד את IPE בעדינות עם פיפטה פסטר שטוח, אש מלוטשת. לאסוף את ההשעיה התא ולשים אותו בצינור 1.5 מיליליטר.לספור את התאים באמצעות תא Neubauer, ולזרוע 0.2 מיליון תאים לבאר בצלחת 24 היטב עם מיליליטר אחד של מדיום מלא. מניחים את הצלחת באינקובטור ותרבות זה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. כדי לבודד תאי RPE, הסר את ההומור והרשתית הזגגיים מהקטע האחורי עם מלקחיים דקים.שים את הנורות בצלחת 24 היטב ולהוסיף 500 microliters של 0.25%טריפסין לכל עין ודגרה במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. הסר טריפסין, הוסף 500 מיקרוליטרים של מדיום מלא לכל כדור ולגרד את תאי RPE בעדינות עם פיפטה פסטר מעוקל, מלוטש אש. לאסוף את ההשעיה התא ולשים אותו בצינור 1.5 מיליליטר.לספור את התאים באמצעות תא Neubauer ולזרוע את התאים כמתואר קודם לכן. מניחים את הצלחת באינקובטור. יש לנקות את רקמת השריר והעור הנותרים מהעיניים ולחטא את העיניים בתמיסה מבוססת יוד ולשטוף אותן ב-PBS.כדי לבודד תאי IPE, הסר את העדשה ומשוך את הקשתית כמתואר קודם לכן. לאחר הכנת שתי קשתיות, להוסיף מיליליטר אחד של מדיום מלא ולבודד את התאים על ידי גירוד עם פסטר שטוח, אש מלוטשת pipette, ולאחר מכן לספור ולזרוע את התאים. מניחים את הצלחת באינקובטור.כדי לבודד תאי RPE, להסיר את הזגג ואת הרשתית מן החלק האחורי ומניחים את הנורה בצלחת פטרי. מלא את הנורה עם מדיום מלא מיליליטר אחד. באמצעות פיפטת פסטר מעוקלת ומלוטשת, הסר את תאי ה- RPE.לאסוף את מתלה התא בתוך הנורה באמצעות 1,000 pipette microliter, ולהעביר אותו לתוך צינור 1.5 מיליליטר עבור resuspension. לאחר מכן לספור ולזרוע את התאים ולדגירה את הצלחת כפי שהוכח בעבר. לאחר ניקוי, לפתוח את העין לחתוך סביב הקשתית כדי להסיר את החלק החלקי, ולאחר מכן לשים צלחת פטרי.השאירו את הנורה עם הזכות עד שתאי RPE מבודדים. כדי לבודד תאי IPE, אם העדשה מגיעה עם המקטע החיצוני, הסר את העדשה והשתמש במלקחיים עדינים כדי לשלוף בעדינות את הקשתית המכילה את תאי IPE. מניחים את הקשתית בצלחת פטרי ושטפים אותה עם PBS סטרילי.חותכים את גוף הססנים עם אזמל מספר 10. לאחר הכנת הקשתית, לדגור אותם עם שני מיליליטר של 0.25% טריפסין ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. הסר את טריפסין ולהוסיף שני מיליליטר של מדיום שלם, ולאחר מכן לבודד את התאים על ידי גירוד עם פיפטה פסטר שטוח, אש מלוטשת.העבר את ההשעיה התא לתוך צינור שני מיליליטר וצנטריפוגה התאים במשך 10 דקות ב 120 פעמים G.להשליך את supernatant ול resuspend התאים בשני מיליליטר של מדיום מלא. זרע 0.32 מיליון תאים לבאר בצלחת שש באר בשלושה מיליליטר של מדיום מלא. מניחים את הצלחת באינקובטור ותרבות זה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני.כדי לבודד תאי RPE, הסר את ההומור והרשתית הזגגיים מהקטע האחורי עם מלקחיים. הימנע מפגיעה באפיתל הפיגמנט ברשתית. לשטוף את הנורה עם PBS.לאחר הכנת שתי העיניים, למלא את הנורה כשלושה רבעים מלאים עם טריפסין, ודגור במשך 25 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם מכסה צלחת פטרי על גבי עין הנורה. הסר את טריפסין ולהוסיף מיליליטר אחד של מדיום מלא. באמצעות פיפטת פסטר מעוקלת ומלוטשת, הסר את תאי ה- RPE.לאסוף את השעיית התא בתוך הנורה ולהעביר אותו לתוך צינור 1.5 מיליליטר עבור resuspension. צנטריפוגות התאים במשך 10 דקות ב 120 פעמים G.Seed 0.32 מיליון תאים לבאר בצלחת שש באר בשלושה מיליליטר של מדיום מלא. מניחים את הצלחת באינקובטור ותרבות זה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני.תרבית התאים ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני באינקובטור לח. לאחר שלושה עד ארבעה ימים, pipette למעלה ולמטה כדי לאסוף תאים שאינם רהוטים ולשים מחצית הנפח בבאר אחרת. ממלאים את הבאר למיליליטר אחד במדיום מלא.לאחר שלושה עד ארבעה ימים נוספים, חזור על אוסף התאים, והפעם צירוף התאים הלא-עקביים משתי בארות לאחת. מוסיפים בינוני לכל בארות. התבונן בתאים ושנה את המדיום פעמיים בשבוע.כאשר תאים מגיעים למפגש, עבור למדיום מלא עם 1%FBS. באמצעות הפרוטוקולים הנ"ל, תאי IPE ו- RPE בודדו בהצלחה ותרביתו מחמישה מינים שונים. תבנית ביטוי RPE אושרה בתאי IPE ראשיים של בקר על-ידי אימונופלואורסצנטיות עבור RPE65.הכדאיות של התא נחקרה כדי לא לכלול רעילות פוטנציאלית של מאגר אלקטרופורציה באמצעות ערכת בדיקת ציטוקסיה זמינה מסחרית ובקרה אלקטרופורציה קשר. לא נצפתה השפעה על הכדאיות של התא. תאי אפיתל פיגמנטים פרה-תרבותיים ממינים שונים הועברו לחלבון ונוס הפלואורסצנטי הצהוב.תאי RPE19 שהודבקו שימשו כפקד חיובי. הכימות של יעילות transfection ב RPE חזיר מראש מוצג כאן. תאי אפיתל פיגמנט ארנב מבודד טרי הועברו לחלבון הפלואורסצנטי הצהוב ונוס ונוטרו על ידי מיקרוסקופיה.תאי אפיתל פיגמנט היו transfected עם גורם נגזר אפיתל פיגמנט והפרשת חלבון היה במעקב על ידי כתם מערבי. האות לתאים שהודבקו היה גבוה יותר בהשוואה לתאים שאינם נגועים בכל המינים והימים שנחקרו, ולא נצפתה ירידה בהפרשת החלבון בתקופה זו. זה חיוני כדי למנוע גירוד התאים עם כלים חדים.כאן, פיפטות פסטר מלוטשות אש משמשים, למעט בעיני עכבר קטנות, שם יש להשתמש באזמל עגול. תאי אפיתל פיגמנט יכול לשמש לפיתוח גישות ריפוי גנטי כדי לדמות תנאים פתולוגיים, למשל, נזק ללחץ חמצוני. מודלים אלה יכולים לשמש גם לבדיקת תרופות טיפוליות.

Research

JoVE Journal

Biology

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

התרבות של תאים דנדריטים מיאלואידית מ מבשרי מח עצם

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

בידוד והתרבות של תאים מאזור nephrogenic של הכליה עכבר עובריים

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

בידוד תרבות למבוגרים גזע תאים אפיתל של העור האנושי

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

מערכת culturing איריס תאים פיגמנט אפיתל לחקר התחדשות עדשה של ניוט

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo התרבות של האדם תאים ראשוניים החצוצרה אפיתל

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

אינדוקציה ובדיקה של היפוקסיה בתרבות התא

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

בידוד תרבות ראשונית של תאים בכבד עכברוש

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

בידוד והתרבות של תאי לבלב הראשיים acinar עכבר

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

בידוד והתרבות ראשית של לתאי אנדותל עכבר אב העורקים

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

בידוד ותרבות של בתאי אבי העורקים הראשוניים מחזירים זעירים

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...