Name: isolation, culture, and genetic engineering of mammalian primary pigment epithelial cells for non-viral gene therapy
Uploaded: 2021-02-26T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy at JoVE.com

Un ringraziamento merita Gregg Sealy e Alain Conti per l'eccellente assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Commissione europea nell'ambito del Settimo programma quadro, della Fondazione nazionale svizzera per le scienze e della Fondazione Schmieder-Bohrisch. Z.I. ha ricevuto finanziamenti dal Consiglio europeo della ricerca, ERC Advanced [ERC-2011-ADG 294742] e B.M.W. da una borsa di ricerca Fulbright e da una borsa di studio di eccellenza del governo svizzero.

I protocolli in cui gli animali sono stati coinvolti sono stati eseguiti da personale certificato e previa autorizzazione del Dipartimento cantonale della sécurité, de l'emploi et de la santé (DSES), Domaine de l'expérimentation animale di Ginevra, Svizzera, e secondo la Dichiarazione ARVO per l'uso degli animali nella ricerca oftalmica e visiva (approvazione n. GE/94/17). Ratti adulti sani brown norway, topi C57BL/6 e conigli bianchi neozelandesi sono stati eutanasizzati da un sovradosaggio di Pentobarbital (150 mg/...

Avere metodi standardizzati per isolare e colturare le cellule PE è fondamentale nello sviluppo di nuovi approcci terapeutici per le malattie degenerative della retina. Con i protocolli qui presentati, le cellule PE possono essere isolate con successo da diverse specie e coltivate per lunghi periodi (fino ad ora, la coltura più lunga è stata mantenuta per 2 anni1,38); è stata osservata la morfologia, la pigmentazione e la funzione tipiche delle cellule PE (<s...

Il nostro gruppo si sta concentrando sullo sviluppo di approcci rigenerativi per il trattamento della degenerazione neuroretinica, cioè AMD, mediante terapia genica non virale basata su RPE e IPE. L'istituzione pre-clinica di tali terapie richiede modelli in vitro trasferibili agli esseri umani. Pertanto, l'obiettivo dello studio qui presentato è quello di fornire protocolli per l'isolamento, la coltura e l'ingegneria genetica delle cellule PRIMARIE RPE e IPE. Il razionale per stabilire l'isolamento delle cellule PE da più specie è quello di confermare in modo robusto la sicurezza e l'efficienza dell'approccio e aumentarne la riproducibilità e la trasferibilità. La linea cellulare RPE umana disponibile ARPE-19 differisce dalle cellule primarie (ad esempio, sono meno pigmentate) ed è, quindi, solo di valore limitato per le analisi pre-cliniche1. Inoltre, le cellule di mammifero non umane possono essere acquistate a costi inferiori e in quantità maggiori; il tessuto del donatore umano può essere ottenuto da varie banche oculari, ma la disponibilità è limitata e costosa. Infine, i nuovi medicinali per terapie avanzate (ATMP, cioè cellule, tessuti o medicinali per terapia genica) devono essere applicati in almeno due specie diverse prima di essere testati nei pazienti e questi studi in vivo richiedono la preparazione di trapianti di cellule allogeniche.
Le malattie neurodegenerative della retina sono la principale causa di cecità nei paesi industrializzati, comprendendo malattie comuni come l'AMD, così come malattie rare come la retinite pigmentosa, in cui la morte delle cellule retiniche alla fine porta alla cecità. Il danno alle cellule RPE, ai fotorecettori e alle cellule gangliari retiniche (RGC) può in alcuni casi essere rallentato, ma attualmente non sono disponibili terapie curative. Gli ATMP offrono il potenziale per correggere i difetti genetici, integrare geni terapeutici o sostituire le cellule degenerate, consentendo così lo sviluppo di terapie rigenerative e curative per malattie come l'AMD; 13 terapie geniche hanno già ottenuto l'approvazione alla commercializzazione, inclusa una terapia per il trattamento della degenerazione retinica associata alla mutazione RPE652,3. Tra gli anziani (>60 anni), ~ 30 milioni di persone in tutto il mondo sono affette da AMD4neovascolare (nvAMD) o avascolare (aAMD). Entrambe le forme sono indotte da fattori scatenanti associati all'età tra cui danno ossidativo, compromissione della funzione e perdita di cellule RPE seguita da degradazione dei fotorecettori, tra gli altri (ad esempio alleli di rischio genetico, fumo, ipertensione)5,6. In nvAMD, la patogenesi è aggravata da uno squilibrio di fattori angiogenici e anti-angiogenici a favore del fattore di crescita endoteliale vascolare angiogenico (VEGF) che induce la neovascolarizzazione coroidale (CNV). Ad oggi, solo nvAMD è curabile con iniezioni intravitreali mensili di inibitori della proteina VEGF per sopprimere il CNV; nessun trattamento efficace è ancora disponibile per aAMD6,7.
Diversi studi hanno valutato terapie cellulari per sostituire la terapia anti-VEGF: gli studi condotti da Binder et al., in cui cellule RPE autologhe appena raccolte sono state trapiantate in pazienti con nAMD8,9,10,hanno mostrato un moderato miglioramento visivo, ma solo un piccolo gruppo di pazienti ha raggiunto un'acuità visiva finale abbastanza alta da consentire la lettura. Recentemente, uno studio clinico di fase I ha utilizzato un cerotto RPE derivato da cellule staminali embrionali per trattare l'AMD con risultati promettenti; vale a dire, efficacia, stabilità e sicurezza del cerotto RPE per un massimo di 12 mesi in 2 dei 10 pazienti trattati11. Inoltre, diversi gruppi hanno pubblicato studi in cui i cerotti autologhi RPE-Bruch membrana-coroide sono stati prelevati dalla retina periferica e trapiantati nella macula12,13,14; e per il trapianto sono stati generati cerotti RPE derivati da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC)15. Per l'aAMD, gli anticorpi mirati alla via del complemento sono stati testati in studi clinici6,16 e uno studio di fase I utilizzando una singola iniezione intravitreale di un vettore virale adeno-associato (AAV) che codifica il gene per il fattore CD59 (AAVCAGsCD59) in pazienti con atrofia geografica (GA) è stato completato17; lo studio di fase II è stato recentemente avviato e mira a reclutare 132 pazienti con aAMD avanzata e a valutare l'esito a 2 anni dopo l'intervento18. Infine, il gruppo di studio FocuS ha avviato uno studio clinico multicentrico di fase I/II che valuta la sicurezza, la risposta alla dose e l'efficacia di un vettore AAV ricombinante non replicante che codifica un fattore del complemento umano19.
In primo luogo, l'obiettivo di una terapia rigenerativa AMD è il trapianto di cellule RPE funzionali, che sono state danneggiate o perse. Tuttavia, le cellule IPE e RPE condividono molte somiglianze funzionali e genetiche (ad esempio, fagocitosi e metabolismo del retinolo) e, poiché le cellule IPE sono raccolte in modo più fattibile, sono state proposte come sostituto RPE20. Anche se è stato precedentemente dimostrato che il trapianto di cellule IPE ritarda la degenerazione dei fotorecettori nei modelli animali21,22 e stabilizza la funzione visiva nei pazienti con nvAMD allo stadio finale, non è stato osservato alcun miglioramento significativo in questipazienti 23. La mancanza di efficacia può essere dovuta al basso numero di cellule trapiantate e/o allo squilibrio dei fattori retinici neuroprotettivi. Un approccio alternativo sarebbe quello di trapiantare cellule epiteliali pigmentate trasfettate che sovraesprimono fattori neuroprotettivi per ripristinare l'omeostasi retinica, mantenere le cellule RPE rimanenti e proteggere i fotorecettori e gli RGC dalla degenerazione. Di conseguenza, proponiamo una nuova terapia che comprende il trapianto di cellule funzionali RPE o IPE che sono state sottoposte a ingegneria genetica per secernere proteine neuroprotettive e anti-angiogeniche, come PEDF, GM-CSF o fattori di crescita insulino-simili (IGF). Il vantaggio di sviluppare e analizzare questo approccio in diverse specie invece di utilizzare una linea cellulare, una sola specie, o tessuto umano è: 1) aumentata riproducibilità e trasferibilità dei risultati come dimostrato da numerosi studi realizzati in laboratori indipendenti e diverse specie1,24,25; 2) le cellule suine o bovine sono fattibilmente usa e getta senza il sacrificio di altri animali; 3) la disponibilità soprattutto di cellule suine e bovine consente a grandi serie di test di produrre risultati robusti; 4) la conoscenza di isolare, colturare e modificare geneticamente le cellule dai modelli maggiormente utilizzati consente analisi in vivo in più specie24,25,26 e offre quindi un migliore rapporto rischio-beneficio per i primi pazienti trattati; 5) la flessibilità del protocollo presentato ne consente l'utilizzo in vari modelli e set up sperimentali e per tutte le terapie cellulari oculari con e senza ingegneria genetica. Al contrario, tecniche alternative come le linee cellulari o il tessuto umano sono solo di limitata trasferibilità e/ o disponibilità limitata. Le linee cellulari come l'ARPE-19 sono ideali per esperimenti preliminari; tuttavia, la bassa pigmentazione e l'alta proliferazione differiscono significativamente dalle cellule primarie1. Le cellule RPE e IPE, isolate dal tessuto umano del donatore, offrono una preziosa fonte per esperimenti in vitro trasferibili; tuttavia, otteniamo tessuto umano da una Banca degli occhi statunitense-americana, il che significa che il tessuto ha almeno due giorni (dopo l'enucleazione) e richiede un trasporto lungo e costoso, ma il tessuto del donatore locale non è disponibile in quantità sufficienti per una ricerca produttiva. Il vantaggio dell'uso di cellule primarie è confermato da molteplici studi di altri gruppi27,28.
Per lo sviluppo di una terapia genica non virale a base cellulare utilizzando il sistema di trasposoni SB100X per trasfettare cellule primarie RPE e IPE con i geni che codificano per PEDF e/o GM-CSF per trattare nvAMD e aAMD, rispettivamente29,30,31,32,abbiamo prima stabilito la trasfezione delle cellule ARPE-191 . Successivamente, i protocolli di isolamento e trasfezione sono stati stabiliti in cellule primarie bovine e sucine facilmente accessibili. Ora, è stato stabilito l'isolamento e la trasfezione di cellule primarie RPE e IPE da cinque diverse specie, da piccoli (come topi) a grandi mammiferi (come bovini). È stato confermato in cellule primarie RPE e IPE derivate da occhi di donatori umani30. La produzione conforme alle buone pratiche di fabbricazione (GMP) dell'ATMP è stata convalidata utilizzando anche tessuto di donatore umano33. Infine, sia la sicurezza che l'efficienza dell'approccio sono state valutate in vivo in tre diverse specie per le quali il protocollo è stato adattato: topo, ratto e coniglio. Nel set-up clinico, una biopsia dell'iride sarà prelevata dal paziente e le cellule IPE saranno isolate e trasfettate nella camera bianca, prima che le cellule vengano trapiantate subretinamente nello stesso paziente. L'intero processo si svolgerà durante una singola sessione chirurgica della durata di circa 60 minuti. Lo sviluppo dell'approccio terapeutico e la valutazione della sua efficienza hanno richiesto eccellenti modelli in vitro ed ex vivo per implementare metodi di consegna genica robusti ed efficienti, per analizzare l'efficienza della consegna genica, la produzione terapeutica di proteine e gli effetti neuroprotettivi e per produrre trapianti di cellule per testare l'approccio in vivo1,24,25,29,30 . Vale la pena ricordare che la terapia ha l'approvazione etica per uno studio clinico di fase Ib/IIa da parte della commissione etica per la ricerca del Cantone di Ginevra (n. 2019-00250) e attualmente gli ultimi dati pre-clinici richiesti per l'autorizzazione dalle autorità di regolamentazione svizzere sono raccolti utilizzando il protocollo presentato. A questo proposito, i dati pre-clinici in vivo hanno dimostrato una significativa riduzione del CNV e un'ottima sicurezza24,25,31.
Qui viene descritto l'isolamento e la coltura di cellule RPE / IPE da bovini, suini, conigli, ratti e topi e l'uso del sistema di trasposone integrativo SB100X combinato con l'elettroporazione come metodo efficiente di consegna genica. In particolare, le cellule PE primarie sono state trasfettate per sovraesprimere PEDF e GM-CSF. La raccolta di questi protocolli consente di eseguire gli studi in vitro e in vivo in tutte le fasi pre-cliniche dello sviluppo di ATMP. Inoltre, il set-up ha il potenziale per essere adattato ad altri geni di interesse e malattie.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well plates</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>150687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>7657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine</td>
			<td>Mundipharma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bonn micro forceps flat</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri forceps (sterile)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/Ham`s F12</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drape (sterile)</td>
			<td>M&#246;lnlycke Health Care</td>
			<td>800530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation buffer 3P.14</td>
			<td>3P Pharmaceutical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Brunschwig</td>
			<td>P40-37500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (different size) (sterile)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze compress</td>
			<td>PROMEDICAL AG</td>
			<td>25403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl (0.9%)</td>
			<td>Laboratorium Dr. Bichsel AG</td>
			<td>1000090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle (18G)&#160;</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>TER-NN1838R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection kit 10 &#181;L</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK5000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber</td>
			<td>Marienfeld-superior</td>
			<td>640010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette (fire-polish)</td>
			<td>Witeg</td>
			<td>4100150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0781-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital (Thiopental Inresa)</td>
			<td>Ospedalia AG</td>
			<td>31408025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>150288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFAR4-PEDF</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFAR4-SB100X</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFAR4-Venus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Pastor et al., 2018. Kindly provided by Prof. Scherman and Prof. Marie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSB100X (250 ng/&#181;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>M&#225;t&#233;s et al., 2009. Provide by Prof. Izsvak</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pT2-CAGGS-Venus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Johnen et al., 2012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pT2-CMV-GMCSF-His plasmid DNA (250 ng/&#181;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cloned in our lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pT2-CMV-PEDF-His plasmid DNA (250 ng/&#181;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Pastor et al., 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scarpel no. 10</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scarpel no. 11</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp-sharp tip curved Extra Fine Bonn Scissors (sterile)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp-sharp tip straight Extra Fine Bonn Scissors (sterile)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tali Image-Based Cytometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>T10796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.25%&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25050014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 5%/EDTA 2%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas spring scissors curved (sterile)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture, and genetic engineering of mammalian primary pigment epithelial cells for non-viral gene therapy

La degenerazione maculare legata all'età (AMD) è la causa più frequente di cecità nei pazienti >60 anni, che colpisce circa 30 milioni di persone in tutto il mondo. L'AMD è una malattia multifattoriale influenzata da fattori ambientali e genetici, che portano a compromissione funzionale della retina a causa della degenerazione cellulare epiteliale pigmentata retinica (RPE) seguita dalla degradazione dei fotorecettori. Un trattamento ideale includerebbe il trapianto di cellule RPE sane che secernono fattori neuroprotettivi per prevenire la morte delle cellule RPE e la degenerazione dei fotorecettori. A causa delle somiglianze funzionali e genetiche e della possibilità di una biopsia meno invasiva, il trapianto di cellule epiteliali pigmentate dell'iride (IPE) è stato proposto come sostituto dell'RPE degenerato. La secrezione di fattori neuroprotettivi da parte di un basso numero di cellule trapiantate subretinamente può essere ottenuta mediante trasfezione mediata da trasposoni(SB100X)con geni che codificano per il fattore derivato dall'epitelio pigmentato (PEDF) e / o il fattore stimolante le colonie di macrofagi dei granulociti (GM-CSF). Abbiamo stabilito l'isolamento, la coltura e la trasfezione mediata da SB100Xdi cellule RPE e IPE di varie specie tra cui roditori, maiali e bovini. I globi vengono espiantati e la cornea e la lente vengono rimosse per accedere all'iride e alla retina. Utilizzando una spatola su misura, le celle IPE vengono rimosse dall'iride isolata. Per raccogliere le cellule RPE, può essere necessaria un'incubazione di tripsina, a seconda della specie. Quindi, utilizzando la spatola personalizzata RPE, le celle vengono sospese nel mezzo. Dopo la semina, le cellule vengono monitorate due volte a settimana e, dopo aver raggiunto la confluenza, trasfettate dall'elettroporazione. L'integrazione genica, l'espressione, la secrezione proteica e la funzione sono state confermate da qPCR, WB, ELISA, immunofluorescenza e saggi funzionali. A seconda della specie, 30.000-5 milioni (RPE) e 10.000-1,5 milioni (IPE) di cellule possono essere isolate per occhio. Le cellule geneticamente modificate mostrano una significativa sovraespressione di PEDF/GM-CSF con la capacità di ridurre lo stress ossidativo e offrono un sistema flessibile per analisi ex vivo e studi in vivo trasferibili all'uomo per sviluppare approcci di terapia genica oculare.

Isolamento dell'EP da diverse specie di mammiferi Utilizzando i protocolli di cui sopra, le cellule IPE e RPE sono state isolate e coltivate con successo da cinque specie diverse. Il numero di cellule ottenute da ciascuna procedura dipende dalla specie e dalle dimensioni dell'occhio (Tabella 1). Come mostrato nella Figura 1,le cellule mostrano la morfologia e la pigmentazione tipiche delle cellule PE (ad eccezione delle cellule di coniglio mostrate, deriv...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy at JoVE.com

Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy

Qui viene presentato un protocollo per isolare e trasfezionare le cellule epiteliali primarie dell'iride e del pigmento retinico da vari mammiferi (topi, ratti, conigli, suini e bovini). Il metodo è ideale per studiare approcci di terapia genica oculare in vari set-up per analisi ex vivo e studi in vivo trasferibili all'uomo.

Isolamento, coltura e ingegneria genetica delle cellule epiteliali pigmentate primarie dei mammiferi per la terapia genica non virale

Age-related macular degeneration (AMD) is the most frequent cause of blindness in patients &#62;60 years, affecting ~30 million people worldwide. AMD is a ...

Il protocollo è significativo poiché mostra l'isolamento e la trasfezione di cellule epiteliali pigmentate da cinque mammiferi come un sistema ottimale per studiare la terapia genica oculare in varie configurazioni. Il vantaggio principale di questo metodo è la sua flessibilità, trasferibilità, alta resa cellulare, vitalità e tasso di trasfezione a causa delle cinque specie e del sistema di trasposone SB100X non virale utilizzato. Queste tecniche sono state sviluppate per studiare approcci di terapia genica mirati alle cellule epiteliali pigmentate della retina e dell'iride, che sono isolate e trasfettate nel presente protocollo, ma sono utilizzabili per qualsiasi ricerca oculare.A dimostrare la procedura sarà Gregg Sealy, un tecnico del laboratorio. Dopo l'eutanasia dell'animale, utilizzare forbici curve e pinza Colibri per enucleare gli occhi, quindi pulire il tessuto muscolare rimanente e la pelle dagli occhi. Raccogliere gli occhi in un tubo da 50 millilitro riempito con PBS non sterile e trasferire il tubo nella cappa a flusso laminare.Disinfettarli immergendoli in una soluzione a base di iodio per due minuti, quindi trasferire gli occhi in un tubo da 50 millilitro riempito con PBS sterile. Metti un occhio su una garza sterile e tieni saldamente l'occhio vicino al nervo ottico. Quindi tagliare vicino al limite dell'iride con un bisturi numero 11.Usando le forbici, tagliare intorno all'iride e rimuovere il segmento anteriore e metterlo in una capsula di Petri, lasciando il bulbo con il vitreo fino a quando l'epiteliale pigmentato retinico, o cellule RPE, sono isolati. Per isolare l'epiteliale pigmentato dell'iride, o cellule IPE, rimuovere la lente con una pinciglia fine ed estrarre delicatamente l'iride contenente le cellule IPE. Mettere l'iride in una capsula di Petri e lavarla con PBS sterile.Aggiungere 500 microlitri di tripsina allo 0,25% e incubare per 10 minuti a 37 gradi Celsius. Rimuovere la tripsina, aggiungere 500 microlitri di mezzo completo e raschiare delicatamente l'IPE con una pipetta Pasteur piatta e lucidata a fuoco. Raccogliere la sospensione cellulare e metterla in un tubo da 1,5 millilitro.Contare le cellule usando la camera neubauer e seminare 0,2 milioni di cellule per pozzetto in una piastra da 24 pozzetti con un millilitro di mezzo completo. Posizionare la piastra in un'incubatrice e coltivata a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Per isolare le cellule RPE, rimuovere l'umore vitreo e la retina dal segmento posteriore con una pinna sottile.Mettere le lampadine nella piastra a 24 pozzetti e aggiungere 500 microlitri da 0,25% di tripsina per occhio e incubare per 10 minuti a 37 gradi Celsius. Rimuovere la tripsina, aggiungere 500 microlitri di mezzo completo per globo e raschiare delicatamente le celle RPE con una pipetta Pasteur curva e lucidata a fuoco. Raccogliere la sospensione cellulare e metterla in un tubo da 1,5 millilitro.Contare le cellule usando la camera di Neubauer e seminare le cellule come descritto in precedenza. Posizionare il piatto nell'incubatrice. Pulire il tessuto muscolare e la pelle rimanenti dagli occhi e disinfettare gli occhi in una soluzione a base di iodio e risciacquarli con PBS.Per isolare le cellule IPE, rimuovere la lente ed estrarre l'iride come descritto in precedenza. Dopo aver preparato due iris, aggiungere un millilitro di mezzo completo e isolare le cellule graffiando con una pipetta Pasteur piatta e lucidata a fuoco, quindi contare e seminare le cellule. Posizionare il piatto nell'incubatrice.Per isolare le cellule RPE, rimuovere il vitreo e la retina dal segmento posteriore e posizionare il bulbo in una capsula di Petri. Riempire il bulbo con un mezzo completo da un millilitro. Utilizzando una pipetta Pasteur curva e lucidata a fuoco, rimuovere le celle RPE.Raccogliere la sospensione cellulare all'interno del bulbo utilizzando una pipetta da 1.000 microlitri e trasferirla in un tubo da 1,5 millilitro per la ricasuspensione. Quindi contare e seminare le cellule e incubare la piastra come precedentemente dimostrato. Dopo la pulizia, aprire l'occhio e tagliare intorno all'iride per rimuovere il segmento anteriore, quindi inserire una capsula di Petri.Lasciare il bulbo con il vitreo fino a quando le cellule RPE non sono isolate. Per isolare le cellule IPE, se la lente viene fornito con il segmento anteriore, rimuovere la lente e utilizzare una pinzo fine per estrarre delicatamente l'iride contenente le cellule IPE. Mettere l'iride in una capsula di Petri e lavarla con PBS sterile.Tagliare il corpo ciliare con un bisturi numero 10. Dopo aver preparato le iridi, incubarle con due millilitri di tripsina allo 0,25% a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Rimuovere la tripsina e aggiungere due millilitri di mezzo completo, quindi isolare le celle graffiando con una pipetta Pasteur piatta e lucidata a fuoco.Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da due millilitri e centrifugare le cellule per 10 minuti a 120 volte G.Scartare il surnatante e risospentare le cellule in due millilitri di mezzo completo. Semina 0,32 milioni di cellule per pozzo in una piastra a sei pozzetti in tre millilitri di mezzo completo. Posizionare la piastra in un'incubatrice e coltivata a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica.Per isolare le cellule RPE, rimuovere l'umore vitreo e la retina dal segmento posteriore con una pinca. Evitare di danneggiare l'epitelio pigmentato retinico. Lavare la lampadina con PBS.Dopo aver preparato entrambi gli occhi, riempire il bulbo di circa tre quarti pieno di tripsina e incubare per 25 minuti a 37 gradi Celsius con la palpebra della capsula di Petri sulla parte superiore dell'occhio del bulbo. Rimuovere la tripsina e aggiungere un millilitro di mezzo completo. Utilizzando una pipetta Pasteur curva e lucidata a fuoco, rimuovere le celle RPE.Raccogliere la sospensione cellulare all'interno del bulbo e trasferirla in un tubo da 1,5 millilitro per la ricaspensione. Centrifugare le cellule per 10 minuti a 120 volte G.Seed 0,32 milioni di cellule per pozzetti in una piastra a sei pozzetti in tre millilitri di mezzo completo. Posizionare la piastra in un'incubatrice e coltivata a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica.Coltura le cellule a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica in un incubatore umidificato. Dopo tre o quattro giorni, pipettare su e giù per raccogliere cellule non aderenti e mettere metà del volume in un altro pozzo. Riempire il pozzo a un millilitro con un mezzo completo.Dopo altri tre o quattro giorni, ripeti la raccolta delle cellule, questa volta combinando le cellule non aderenti da due pozzeli in uno. Aggiungi medio a tutti i pozzi. Osservare le cellule e cambiare il mezzo due volte a settimana.Quando le celle raggiungono la confluenza, passare al mezzo completo con l'1% di FBS. Utilizzando i protocolli di cui sopra, le cellule IPE e RPE sono state isolate e coltivate con successo da cinque specie diverse. Il modello di espressione di RPE è stato confermato nelle cellule IPE bovine primarie mediante immunofluorescenza per RPE65.La vitalità cellulare è stata studiata per escludere una potenziale tossicità del tampone di elettroporazione utilizzando un kit di analisi della citotossicità disponibile in commercio e un controllo elettroporato del nodo. Non è stato osservato alcun impatto sulla vitalità cellulare. Le cellule epiteliali pigmentate precolturate di diverse specie sono state trasfettate con la proteina Di Venere fluorescente gialla.Le cellule RPE19 trasfettate sono state utilizzate come controllo positivo. La quantificazione dell'efficienza di trasfezione nell'RPE dei suini precolturati è mostrata qui. Le cellule epiteliali del pigmento di coniglio appena isolate sono state trasfettate con la proteina fluorescente gialla Venere e sono state monitorate al microscopio.Le cellule epiteliali pigmentate sono state trasfettate con il fattore derivato dall'epitelio pigmentato e la secrezione proteica è stata monitorata da Western blot. Il segnale per le cellule trasfettate era più alto rispetto alle cellule non trasfettate per tutte le specie e i giorni studiati, e non è stata osservata alcuna diminuzione della secrezione proteica entro questo periodo. È fondamentale evitare di raschiare le cellule con strumenti affilati.Qui vengono utilizzate pipette Pasteur lucidate a fuoco, tranne che nei piccoli occhi di topo, dove deve essere usato un bisturi rotondo. Le cellule epiteliali pigmentate possono essere utilizzate per sviluppare approcci di terapia genica e per simulare condizioni patologiche, ad esempio danni da stress ossidativo. Questi modelli possono anche essere utilizzati per testare farmaci terapeutici.

Research

JoVE Journal

Biology

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

Cultura di cellule dendritiche mieloidi dai precursori del midollo osseo

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

Ricerca

Biologia

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Isolamento e coltura di cellule dalla Zona nefrogenica del Rene embrionali di topo

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

Isolamento e la coltura di cellule staminali epiteliali da pelle umana

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Un sistema per la coltura cellule epiteliali del pigmento Iris a studio Rigenerazione Lens Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Cultura Vivo di cellule primarie umane tube di Falloppio epiteliale

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Induzione e test di ipossia in coltura cellulare

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Isolamento e la coltura primaria di cellule epatiche di ratto

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Isolamento e Cultura del mouse principale acinose pancreatiche Cellule

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolamento e colture primarie di cellule di topo aortica endoteliali

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

Isolamento e cultura delle cellule endoteliali aortiche primarie dai suini in miniatura

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...