Name: isolation, culture, and genetic engineering of mammalian primary pigment epithelial cells for non-viral gene therapy
Uploaded: 2021-02-26T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy at JoVE.com

그렉 실리와 알린 콘티의 뛰어난 기술 지원에 감사드립니다. 이 작품은 제7프레임 워크 프로그램, 스위스 국립 과학 재단 및 슈미더 보리쉬 재단의 맥락에서 유럽 위원회에 의해 지원되었다. Z.I.는 풀브라이트 연구 보조금과 스위스 정부 우수 장학금으로부터 유럽 연구 위원회, ERC Advanced [ERC-2011-ADG 294742] 및 B.M.W. 로부터 자금을 지원받았습니다.

동물이 연루된 프로토콜은 공인 인력에 의해 수행되었으며, 스위스 제네바의 도멘 드 l'expémentation 동물인 de l'emploi et de la santé(DSES), 도멘 드 l'expémentation animale, 그리고 Ophalmic 및 비전 연구에서 동물 사용에 대한 ARVO 성명서에 따라 승인된 후에 수행되었습니다. GE/94/17). 성인 건강한 갈색 노르웨이 쥐, C57BL/6 마우스, 뉴질랜드 흰 토끼는 펜토바르비탈(150 mg/kg)의 과다 복용으로 안락사되었고, 0.9% NaCl...

PE 세포를 분리하고 배양하는 표준화된 방법을 갖는 것은 망막 퇴행성 질병을 위한 새로운 치료 접근을 개발하는 데 근본적입니다. 여기에 제시 된 프로토콜으로, PE 세포는 성공적으로 다른 종에서 분리하고 오랜 기간 동안 배양 될 수있다 (지금까지, 가장 긴 배양은 2 년동안유지되었다1,38); 전형적인 PE 세포 형태, 색소 침착 및 기능이 관찰되었다(도<str...

우리 그룹은 RPE-및 IPE 기반 비 바이러스 유전자 치료에 의해 신경 망후 변성을 치료하는 재생 접근법의 개발에 초점을 맞추고 있습니다. 이러한 치료의 전 임상 설립은 인간에게 양도 할 수있는 체외 모델을 필요로한다. 따라서, 여기에서 제시된 연구 결과의 목표는 1 차적인 RPE 및 IPE 세포의 격리, 문화 및 유전 공학을 위한 프로토콜을 전달하는 것입니다. 여러 종에서 PE 세포의 격리를 확립하는 근거는 접근의 안전성과 효율성을 강력하게 확인하고 재현성과 전달성을 높이는 것입니다. 사용 가능한 인간 RPE 세포주 ARPE-19는 1차 세포(예를 들어, 덜 색소)와 다르며, 따라서 전임상 분석에 대한 제한된값만이다. 추가적으로, 비 인간 포유류 세포는 더 적은 비용 및 더 큰 양으로 살 수 있습니다; 인간 기증자 조직은 다양한 눈 은행에서 얻을 수 있지만 가용성은 제한적이고 비용이 많이 듭니다. 마지막으로, 새로운 고급 치료 약용 제품 (ATMP, 즉, 세포, 조직, 또는 유전자 치료 약용 제품)은 환자에서 테스트되기 전에 적어도 두 개의 다른 종에 적용되어야하며 생체 내 연구는 동종 세포 이식의 준비를 요청합니다.
망막 신경 퇴행성 질환은 AMD와 같은 일반적인 질병뿐만 아니라 망막 세포 사망이 결국 실명으로 이어지는 망막 색소증과 같은 희귀 질환을 포함하는 선진국의 주요 실명 원인입니다. RPE 세포, 광수용체 및 망막 신경절 세포 (RGC) 손상은 어떤 경우에는 느려질 수 있지만 현재 치료 요법은 없습니다. ATMpPs는 유전자 결함을 정정하고, 치료 유전자를 통합하거나, 퇴화세포를 대체할 수 있는 잠재력을 제공하므로 AMD와 같은 질병에 대한 재생 및 치료 요법의 개발을 가능하게 합니다. 13개의 유전자 치료는 이미 RPE65 돌연변이 관련 망막 변성을 치료하는 치료를 포함하여 마케팅 승인을 얻었다2,3. > 전 세계적으로 3천만~3,000만 명의 노인중 에서 신생아(nvAMD) 또는 혈관(aAMD) AMD4의영향을 받습니다. 두 형태 는 산화 손상을 포함하는 연령 관련 트리거에 의해 유도된다, 기능 장애 및 광수용체 저하 다음 RPE 세포의 손실, 그 외 (예를 들어, 유전 위험 알레일, 흡연, 고혈압)5,6. nvAMD에서, 병원성 은 혈관 신생 및 항 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)에 찬성 하는 혈관 신생 및 항 혈관 형성 인자의 불균형에 의해 악화 (CNV). 현재까지, 만 nvAMD는 CNV를 억제하기 위해 VEGF 단백질의 억제제의 월간 인트라비티리얼 주사에 의해 치료할 수 있습니다; AAMD6,7에대한 효과적인 치료는 아직 사용할 수 없습니다.
몇몇 연구 결과는 반대로 VEGF 치료를 대체하기 위하여 세포 기지를 둔 치료를 평가했습니다: 새로 수확한 자가 RPE 세포가 nAMD8,9,10을가진 환자로 이식된 바인더 외에 의한 연구 결과는 적당한 시각 개선을 보여주었습니다, 그러나 환자의 단지 작은 단은 독서를 가능하게 하기에 충분히 높은 최종 적인 시력에 도달했습니다. 최근에는, 1상 임상 연구는 유망한 결과로 AMD를 취급하기 위하여 배아 줄기 세포 유래 RPE 패치를 이용했습니다; 즉, 10명의 환자 중 2명이11명으로최대 12개월 동안 RPE 패치의 효능, 안정성 및 안전성 및 효능, 안정성 및 안전성. 또한, 여러 그룹은 자가 RPE-Bruch의 막-choroid 패치가 말초 망막에서 수확되고 황반12,13,14로이식되는 연구를 발표했습니다. 유도된 다능성 줄기세포(iPSC)-유래 RPE 패치는이식용(15)을위해 생성되었다. aAMD의 경우, 보완 경로를 표적으로 하는 항체는 시험6,16 및 단계 I연구에서 시험된 시험은 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터의 단일 인트라비탈 주입을 사용하여 지리 위축(GA)을 가진 환자에서 CD59(AAVCAGsCD59)를 코딩하는 유전자를 코딩하였다. 단계 II 연구는 최근에 시작하고 고급 aAMD를 가진 132명의 환자를 모집하고 2 년 후 개입18에서결과를 평가하는 것을 목표로 합니다. 마지막으로, FocuS 연구그룹은 인간 보체인19를인코딩하는 재조합 비복제 AAV 벡터의 안전성, 용량 반응 및 효능을 평가하는 단계 I/II 다중센터 임상 시험을 시작했다.
주로, 재생 AMD 치료의 목표는 손상되거나 분실된 기능적인 RPE 세포의 이식입니다. 그러나, IPE 및 RPE 세포는 많은 기능적 및 유전적 유사성(예를 들어, phagocytosis 및 망막 대사)을 공유하고, IPE 세포가 더 태아에게 수확되기 때문에, 그들은 RPE 대체20으로제안되었다. IPE 세포 이식이 동물모델(21,22)에서 광수용체 변성을 지연시키고 말기 nvAMD 환자에서 시각 기능을 안정화시키는 것으로 입증되었지만, 이들환자(23)에서는유의한 개선이 관찰되지 않았다. 효능의 부족은 이식 된 세포의 낮은 수 때문일 수 있습니다., 및/또는 신경 보호 망막 요인의 불균형. 다른 접근법은 망막 항상성을 복원하고, 남은 RPE 세포를 유지하고, 광수용체와 RG를 변성으로부터 보호하기 위해 신경 보호 인자를 과발적으로 표현하는 전감염된 안료 상피 세포를 이식하는 것입니다. 따라서, 우리는 PEDF, GM-CSF 또는 인슐린 같이 성장 인자 (IGFs)와 같은 신경 보호 및 항 혈관신생 단백질을 분비하기 위하여 유전 공학을 겪은 기능적인 RPE 또는 IPE 세포의 이식을 포함하는 새로운 치료를 제안합니다. 세포주 대신 여러 종에서 이러한 접근법을 개발하고 분석하는 이점, 단 하나의 종, 또는 인간 조직: 1) 독립적인 실험실 및 다른 종1,24,25에서실현된 수많은 연구에 의해 나타난 바와 같이 결과의 재현성 및 전달성이 향상된다. 2) 돼지 또는 소 세포는 추가 동물의 희생없이 가능한 일회용; 3) 특히 돼지와 소 세포의 가용성은 강력한 결과를 생성하는 큰 테스트 시리즈를 허용; 4) 주로 사용되는 모델으로부터 세포를 분리, 배양 및 유전적으로 수정하는 지식은24,25,26의 다중 종에서 생체 내 분석을 가능하게 하고 따라서 첫번째 치료된 환자를 위한 향상된 위험 이득 비율을 제공합니다; 5) 제시 된 프로토콜의 유연성은 다양한 모델및 실험 설정 및 유전 공학유무에 관계없이 모든 안구 세포 기반 치료법에 사용할 수 있게합니다. 대조적으로, 세포주 또는 인간 조직으로 대체 기술은 제한된 전달 가능성 및/또는 제한된 단화성의 뿐입니다. ARPE-19와 같은 세포주들은 예비 실험에 이상적입니다. 그러나, 낮은 색소 침착 및 높은 증식은 1차 세포1과크게 다릅니다. 인간 기증자 조직으로부터 분리되는 RPE 및 IPE 세포는 체외 실험을 양도할 수 있는 귀중한 원천을 제공합니다. 그러나, 우리는 조직이 적어도 이틀 (enucleation 후에) 오래되고 비싼 수송을 필요로 한다는 것을 의미하는 미국-미국 안과 은행에서 인간 적인 조직을 얻고, 그러나 현지 기증자 조직은 생산적인 연구를 위한 충분한 양으로 유효하지 않습니다. 1차 세포의 사용의 장점은다른 그룹(27,28)으로부터의 여러 연구에 의해 확인된다.
EBF 및/또는 GM-CSF를 코딩하는 유전자를 가진 1차 RPE 및 IPE 세포를 이식하기 위한 SB100X 트랜스포슨 시스템을 이용한 세포 기반 비바이러스 유전자 치료의 개발을 위해 각각29,30,31,32,ARPE-19 세포의 트랜스페션을 최초로확립했습니다. . 다음으로, 쉽게 접근할 수 있는 소와 돼지 1차 세포에서 격리 및 경질 프로토콜이 확립되었다. 지금, 5개의 다른 종에서 1 차적인 RPE 및 IPE 세포의 격리 그리고 transfection는 작은 (마우스로) 큰 포유동물 (가축으로)에, 설치되었습니다. 인간 기증자눈(30)으로부터유래된 1차 RPE 및 IPE 세포에서 확인되었다. ATMP의 우수 제조 관행(GMP)준수 생산은 인간 기증자 조직뿐만 아니라33을사용하여 검증되었다. 마지막으로, 접근법의 안전성과 효율성은 프로토콜이 조정된 세 가지 다른 종에서 생체 내에서 평가되었습니다: 마우스, 쥐 및 토끼. 임상 설정에서, 홍채 생검은 환자에게서 수확되고 IPE 세포는 세포가 같은 환자로 다시 피복되기 전에, 깨끗한 방에서 격리되고 전염될 것입니다. 전체 과정은 약 60 분 지속되는 단일 수술 세션 중에 진행됩니다. 치료 접근법의 개발 및 그 효율성의 평가는 견고하고 효율적인 유전자 전달 방법을 구현하고, 유전자 전달의 효율을 분석하고, 치료 단백질 생산 및 신경 보호 효과를 분석하고, 생체 내 접근법을 시험하기 위해 세포 이식을 생산하기 위해 시험관 및 전 생체 내 모델에서우수한 것을 요구하였다1,24,25,29,30 . 이 치료법은 제네바 주(2019-00250호) 연구를 위한 윤리위원회에서 임상 단계 Ib/IIa 임상 시험에 대한 윤리적 승인을 받았으며 현재 스위스 규제 당국이 승인요청받은 마지막 전임상 데이터가 제시된 프로토콜을 사용하여 수집된다는 점을 언급할 가치가 있습니다. 이와 관련하여, 생체 내 전 임상 데이터는 CNV의 현저한 감소와 우수한안전(24,25,31)을입증했다.
여기서, 소, 돼지, 토끼, 쥐 및 마우스로부터 RPE/IPE 세포의 분리 및 배양, 그리고 효율적인 유전자 전달 방법으로 전기기와 결합된 통합 SB100X 트랜스포슨 시스템의 사용이 설명된다. 특히, 1차 PE 세포는 PEDF 및 GM-CSF를 과발현하기 위해 전형되었다. 이러한 프로토콜의 수집은 ATMP 개발의 모든 전임상 단계에서 시험관 내 및 생체 내 연구를 수행할 수 있게 한다. 더욱이, 셋업은 관심과 질병의 그밖 유전자에 적응될 가능성이 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well plates</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>150687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>7657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine</td>
			<td>Mundipharma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bonn micro forceps flat</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri forceps (sterile)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/Ham`s F12</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drape (sterile)</td>
			<td>M&#246;lnlycke Health Care</td>
			<td>800530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation buffer 3P.14</td>
			<td>3P Pharmaceutical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Brunschwig</td>
			<td>P40-37500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (different size) (sterile)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze compress</td>
			<td>PROMEDICAL AG</td>
			<td>25403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl (0.9%)</td>
			<td>Laboratorium Dr. Bichsel AG</td>
			<td>1000090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle (18G)&#160;</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>TER-NN1838R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection kit 10 &#181;L</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK5000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber</td>
			<td>Marienfeld-superior</td>
			<td>640010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette (fire-polish)</td>
			<td>Witeg</td>
			<td>4100150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0781-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital (Thiopental Inresa)</td>
			<td>Ospedalia AG</td>
			<td>31408025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>150288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFAR4-PEDF</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFAR4-SB100X</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFAR4-Venus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Pastor et al., 2018. Kindly provided by Prof. Scherman and Prof. Marie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSB100X (250 ng/&#181;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>M&#225;t&#233;s et al., 2009. Provide by Prof. Izsvak</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pT2-CAGGS-Venus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Johnen et al., 2012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pT2-CMV-GMCSF-His plasmid DNA (250 ng/&#181;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cloned in our lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pT2-CMV-PEDF-His plasmid DNA (250 ng/&#181;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Pastor et al., 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scarpel no. 10</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scarpel no. 11</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp-sharp tip curved Extra Fine Bonn Scissors (sterile)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp-sharp tip straight Extra Fine Bonn Scissors (sterile)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tali Image-Based Cytometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>T10796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.25%&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25050014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 5%/EDTA 2%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas spring scissors curved (sterile)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture, and genetic engineering of mammalian primary pigment epithelial cells for non-viral gene therapy

노화관련 황반 변성(AMD)은 전 세계적으로 3천만 명에게 영향을 미치는 >60년 환자에서 가장 빈번한 실명 원인입니다. AMD는 환경 및 유전적 요인에 의해 영향을 받는 다인성 질환으로, 망막 색소 상피(RPE) 세포 변성으로 인한 망막의 기능적 손상으로 이어지는 후 광수용체 분해가 뒤따릅니다. 이상적인 치료는 RPE 세포 사멸과 광수용체 변성을 방지하기 위해 신경 보호 인자를 분비 건강한 RPE 세포의 이식을 포함 할 것이다. 기능적 및 유전적 유사성 및 덜 침습적인 생검의 가능성으로 인해 홍채 색소 상피 (IPE) 세포의 이식은 퇴화 된 RPE를 대신할 수 있도록 제안되었습니다. 낮은 수의 피하 이식 된 세포에 의한 신경 보호 인자의 분비는 안료 상피 유래 인자 (PEDF) 및 /또는 과립구 대식세포 -콜로니 자극 인자 (GM-CSF)에 대한 코딩 유전자와 함께 슬리핑 뷰티 (SB100X)트랜스 포손 매개 형 경화에 의해 달성 될 수있다. 설치류, 돼지, 가축 등 다양한 종에서 RPE 및 IPE 세포의 격리, 문화 및 SB100X매개 형 트랜스퍼를 설립했습니다. 글로브는 짜고 각막과 렌즈가 제거되어 홍채와 망막에 접근합니다. IPE 세포는 사용자 정의 주걱을 사용하여 격리 된 홍채에서 제거됩니다. RPE 세포를 수확하기 위해 종에 따라 트립신 배큐어가 필요할 수 있습니다. 그런 다음 RPE 사용자 지정 주걱을 사용하여 세포가 중간으로 일시 중단됩니다. 파종 후, 세포는 일주일에 두 번 모니터링되며, 합류에 도달 한 후 전기 화에 의해 감염됩니다. 유전자 통합, 발현, 단백질 분비 및 기능은 qPCR, WB, ELISA, 면역형성 및 기능성 분석서에 의해 확인되었다. 종에 따라 30,000-5백만 개의 RPE 및 10,000-150만 개의 세포가 눈당 격리될 수 있습니다. 유전자 변형 된 세포는 산화 스트레스를 감소시키는 능력으로 상당한 PEDF / GM-CSF 과발현을 나타내며 전 생체 분석 및 인체에 전달 가능한 생체 내 연구를위한 유연한 시스템을 제공하여 안구 유전자 치료 접근법을 개발합니다.

다른 포유류 종에서 PE 격리 전술한 프로토콜을 사용하여 IPE 및 RPE 세포는 성공적으로 분리되어 5개의 다른 종으로부터 배양되었다. 각 절차에서 얻은 세포의 수는 눈의 종 및 크기에 따라 달라집니다(표 1). 도 1에도시된 바와 같이, 세포는 전형적인 PE 세포 형태학 및 색소 침착을 나타내고 있다(알비노 뉴질랜드 화이트(NZW) 토끼로부터 유래된 토끼...

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Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy

여기서, 다양한 포유류(마우스, 쥐, 토끼, 돼지 및 소)로부터 일차 홍채 및 망막 색소 상피 세포를 분리하고 변형시키는 프로토콜이 제시된다. 이 방법은 전 생체 분석 및 인간에게 양도 할 수있는 생체 내 연구를위한 다양한 셋업에서 안구 유전자 치료 접근 방식을 연구하는 데 이상적입니다.

비 바이러스 유전자 치료를 위한 포유류 1차 안료 상피 세포의 격리, 배양 및 유전 공학

Age-related macular degeneration (AMD) is the most frequent cause of blindness in patients &#62;60 years, affecting ~30 million people worldwide. AMD is a ...

이 프로토콜은 5개의 포유동물로부터 안료 상피 세포의 격리 및 이식을 다양한 설정에서 안구 유전자 치료를 연구하는 최적의 시스템으로 서 있기 때문에 중요합니다. 이 방법의 주요 장점은 5종 및 비바이러스 SB100X 트랜스포슨 시스템으로 인한 유연성, 전달성, 높은 세포 수율, 생존율 및 경질속도이다. 이러한 기술은 현재 프로토콜에서 분리되고 전염되는 망막 및 홍채 색소 상피 세포를 표적으로 하는 유전자 치료 접근법을 연구하기 위해 개발되었지만 어떤 안구 연구에도 사용할 수 있습니다.절차를 시연하는 것은 실험실의 기술자 인 그레그 실리 (Gregg Sealy)가 될 것입니다. 동물을 안락사한 후, 구부러진 가위와 대장균 을 사용하여 눈을 방출한 다음 나머지 근육 조직과 피부를 눈에서 청소하십시오. 비멸 PBS로 채워진 50 밀리리터 튜브에서 눈을 수집하고 라미나르 흐름 후드로 튜브를 전송합니다.요오드 기반 용액을 2분 동안 잠근 다음 멸균 PBS로 채워진 50 밀리리터 튜브로 눈을 옮기십시오. 멸균 거즈 압축에 한 눈을 넣어 단단히 시신경에 가까운 눈을 잡고. 그런 다음 숫자 11 메스와 홍채의 한계 근처에 잘라.가위를 사용하여 홍채 를 자르고 전방 세그먼트를 제거하고 페트리 접시에 넣고 망막 색소 상피 또는 RPE 세포가 분리 될 때까지 유리체로 전구를 남깁니다. 홍채 색소 상피 또는 IPE 세포를 분리하려면 미세 한 집게로 렌즈를 제거하고 IPE 세포를 포함하는 홍채를 섬세하게 꺼냅니다. 홍채를 페트리 접시에 놓고 멸균 PBS로 씻어내라.섭씨 37도에서 10분 동안 500마이크로리터를 0.25%의 트립신과 인큐베이션으로 추가합니다. 트립신을 제거하고, 500 마이크로리터의 완전한 매체를 추가하고, 평평하고 불을 닦은 파스퇴르 파이펫으로 IPE를 섬세하게 긁어냅니다. 세포 현탁액을 수집하고 1.5 밀리리터 튜브에 넣습니다.Neubauer 챔버를 사용하여 세포를 계산하고, 완전한 배지의 1 밀리리터와 24 우물 판에서 잘 당 0.2 백만 세포를 종자. 접시를 인큐베이터에 놓고 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 배양합니다. RPE 세포를 격리하려면 얇은 집게로 후방 세그먼트에서 유리체 유머와 망막을 제거합니다.전구를 24웰 플레이트에 넣고 눈당 0.25%의 트립신 500마이크로리터를 넣고 섭씨 37도에서 10분 동안 배양합니다. 트립신을 제거하고, 전 세계 에 500 마이크로 리터를 추가하고 곡선, 화재 광택 파스퇴르 파이펫으로 RPE 세포를 섬세하게 긁어. 세포 현탁액을 수집하고 1.5 밀리리터 튜브에 넣습니다.Neubauer 챔버를 사용하여 세포를 계산하고 이전에 설명한 바와 같이 세포를 시드하십시오. 접시를 인큐베이터에 놓습니다. 눈에서 남은 근육 조직과 피부를 청소하고 요오드 기반 용액으로 눈을 소독하고 PBS로 헹구습니다.IPE 세포를 격리하려면 렌즈를 제거하고 이전에 설명한 대로 홍채를 꺼냅니다. 두 개의 붓불을 준비한 후, 완전한 매체의 밀리리터 1밀리리터를 추가하고 평평하고 불을 닦은 파스퇴르 파이펫으로 긁음으로써 세포를 분리한 다음 세포를 계산하고 시드합니다. 접시를 인큐베이터에 놓습니다.RPE 세포를 분리하려면 후부 세그먼트에서 유리체와 망막을 제거하고 전구를 페트리 접시에 놓습니다. 전구를 1밀리리터 완전 매체로 채웁니다. 곡면, 불을 닦은 파스퇴르 파이펫을 사용하여 RPE 셀을 제거합니다.1, 000 마이크로리터 파이펫을 사용하여 전구 내의 세포 현탁액을 수집하고 1.5 밀리리터 튜브로 이송하여 재서스펜션을 합니다. 그런 다음 세포를 계산하고 시드하고 이전에 설명한 대로 플레이트를 배양합니다. 청소 후, 눈을 열고 홍채 주위에 잘라 전방 세그먼트를 제거 한 다음 페트리 접시에 넣어.RPE 세포가 분리될 때까지 전구를 유리체로 둡니다. IPE 세포를 분리하려면 렌즈가 전방 세그먼트와 함께 있는 경우 렌즈를 제거하고 미세 한 집게를 사용하여 IPE 세포를 포함하는 홍채를 섬세하게 꺼냅니다. 홍채를 페트리 접시에 놓고 멸균 PBS로 씻어내라.메스 번호 10으로 섬모 본체를 잘라냅니다. 붓불을 준비한 후 10분 동안 섭씨 37도에서 0.25%의 트립신 2밀리리터로 배양합니다. 트립신을 제거하고 완전한 매체의 두 밀리리터를 추가한 다음, 평평한 불을 닦은 파스퇴르 파이펫으로 긁음으로써 세포를 분리합니다.세포 현탁액을 2밀리리터 튜브로 옮기고 세포를 120배 G.에서 10분 동안 원심분리하여 수퍼네티드를 버리고 완전한 배지의 2밀리리터로 세포를 재연한다. 완전한 배지의 3밀리리터에서 6개의 웰 플레이트에서 우물당 0.32백만 개의 세포를 시드합니다. 접시를 인큐베이터에 놓고 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 배양합니다.RPE 세포를 격리하려면, 집게로 후방 세그먼트에서 유리체 유머와 망막을 제거합니다. 망막 안료 상피 손상을 피하십시오. PBS로 전구를 씻으시다.두 눈을 준비 한 후, 트립신으로 가득 약 3/4에 대한 전구를 채우고, 전구 눈 위에 페트리 접시 뚜껑과 섭씨 37도에서 25 분 동안 배양. 트립신을 제거하고 완전한 매체의 밀리리터 1밀리리터를 추가합니다. 곡면, 불을 닦은 파스퇴르 파이펫을 사용하여 RPE 셀을 제거합니다.전구 내의 세포 현탁액을 수집하고 재서스펜션을 위해 1.5 밀리리터 튜브로 옮기십시오. 전체 배지의 3밀리리터에서 6개의 웰 플레이트에서 잘 120배 G.Seed 0.32 백만 세포당 10분 동안 세포를 원심분리합니다. 접시를 인큐베이터에 놓고 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 배양합니다.가습 된 인큐베이터에서 섭씨 37도 및 이산화탄소 5 %에서 세포를 배양합니다. 3 ~4 일 후, 피펫 위아래로 비 부착 된 세포를 수집하고 다른 우물에 볼륨의 절반을 넣어. 완벽한 매체로 1 밀리리터에 우물을 채웁니다.또 다른 3 ~ 4 일 후, 세포 수집을 반복, 이번에는 두 개의 우물에서 1로 비 부착 세포를 풀링. 모든 우물에 매체를 추가합니다. 세포를 관찰하고 일주일에 두 번 배지를 변경합니다.세포가 합류에 도달하면 1%의 FBS로 중간을 완료하도록 전환합니다. 전술한 프로토콜을 사용하여 IPE 및 RPE 세포는 성공적으로 분리되어 5개의 다른 종으로부터 배양되었다. RPE 발현 패턴은 RPE65에 대한 면역 형광에 의해 1차 소 IPE 세포에서 확인되었다.세포 생존능력은 시판적으로 이용 가능한 세포독성 분석 키트 및 매듭 전기화 제어를 사용하여 전기화 완충제의 잠재적 독성을 배제하기 위해 연구되었다. 세포 생존가능성에 미치는 영향은 관찰되지 않았다. 다른 종에서 사전 배양 된 안료 상피 세포는 황형 금성 단백질로 전형화되었다.감염된 RPE19 세포는 양성 대조군으로 사용하였다. 사전 배양된 돼지 RPE에서의 경질 효율의 정량화는 여기에 나와 있다. 새로 분리된 토끼 색소 상피 세포는 황색 형광 단백질 금성으로 전감염되었고 현미경 검사법에 의해 모니터링되었다.안료 상피 세포는 색소 상피 유래 인자와 단백질 분비로 전감염되어 서양 얼룩에 의해 모니터링되었다. 전감염된 세포에 대한 신호는 모든 종 과 며칠 동안 비감염 된 세포와 비교하여 더 높았으며, 이 시간 내에 단백질 분비의 감소가 관찰되지 않았다. 날카로운 도구로 세포를 긁어 하지 않도록 하는 것이 중요 하다.여기서는 둥근 메스를 사용해야 하는 작은 마우스 눈을 제외하고 불을 닦은 파스퇴르 파이펫이 사용됩니다. 안료 상피 세포는 유전자 치료 접근법을 개발하고 병리학적 조건, 예를 들어 산화 스트레스 손상을 시뮬레이션하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 모델은 또한 치료 약물을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

골수 엽 성의 전구 물질에서 골수양 돌기 세포의 문화

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

연구

생물학

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

배아 마우스 신장의 Nephrogenic 지대의 세포의 분리 및 문화

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

사람의 피부에서 성인 상피 줄기 세포의 분리 및 문화

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

뉴트의 렌즈 재생을 공부 Culturing 이리스 안료 상피 세포에 대한 시스템

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

기본 인간 난관 상피 세포의 전의 VIVO 문화

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

세포 배양의 유도와 Hypoxia의 시험

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

쥐 간장 세포의 분리 및 차 문화

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

마우스 기본 췌장 포상 세포의 분리 및 문화

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

분리 및 마우스 대동맥 내피 세포의 차 문화

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

소형 돼지에서 1 차 대동맥 내피 세포의 격리 및 배양

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...