Name: isolation, culture, and genetic engineering of mammalian primary pigment epithelial cells for non-viral gene therapy
Uploaded: 2021-02-26T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy at JoVE.com

En takk fortjener Gregg Sealy og Alain Conti for deres utmerkede tekniske assistanse. Dette arbeidet ble støttet av EU-kommisjonen i sammenheng med det syvende rammeprogrammet, Swiss National Sciences Foundation og Schmieder-Bohrisch Foundation. Z.I. mottok støtte fra European Research Council, ERC Advanced [ERC-2011-ADG 294742] og B.M.W. fra et Fulbright Research Grant og Swiss Government Excellence Scholarship.

Protokollene der dyr var involvert ble utført av sertifisert personell og etter autorisasjon av kantonal Département de la sécurité, de l'emploi et de la santé (DSES), Domaine de l'expérimentation animale of Geneva, Sveits, og ifølge ARVO Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research (godkjenning nr. GE/94/17). Voksne friske Brune Norge rotter, C57BL/6 mus, og New Zealand hvite kaniner ble euthanized av en overdose av Pentobarbital (150 mg/kg) fortynnet i 0,9% NaCl injisert intraperitoneal og ...

Å ha standardiserte metoder for å isolere og kultur PE-celler er grunnleggende for å utvikle nye terapitilnærminger for retinal degenerative sykdommer. Med protokollene som presenteres her, kan PE-celler isoleres fra forskjellige arter og dyrkes i lange perioder (frem til nå ble den lengste kulturen opprettholdt i 2 år1,38); typisk PE-cellemorfologi, pigmentering og funksjon ble observert (Figur 1, Figur 2<...

Vår gruppe fokuserer på utvikling av regenerative tilnærminger for å behandle nevroretinal degenerasjon, det vil si AMD, av RPE- og IPE-basert ikke-viral genterapi. Den prekliniske etableringen av slike terapier nødvendiggjør in vitro-modeller som kan overføres til mennesker. Dermed er målet med studien som presenteres her å levere protokoller for isolasjon, kultur og genteknologi av primære RPE- og IPE-celler. Begrunnelsen for å etablere isolering av PE-celler fra flere arter er å robust bekrefte sikkerheten og effektiviteten av tilnærmingen og øke reproduserbarheten og overførbarheten. Den tilgjengelige menneskelige RPE-cellelinjen ARPE-19 er forskjellig fra primærceller (f.eks. de er mindre pigmenterte) og er derfor bare av begrenset verdi for prekliniske analyser1. I tillegg kan ikke-menneskelige pattedyrceller kjøpes for mindre kostnader og i større mengder; humant donorvev kan fås fra ulike eye banks, men tilgjengeligheten er begrenset og dyr. Endelig må nye avanserte terapipreparater (ATMP, dvs. celle, vev eller genterapipreparat) brukes i minst to forskjellige arter før de testes hos pasienter, og disse in vivo-studiene ber om fremstilling av allogene celletransplantasjoner.
Retinal nevrodegenerative sykdommer er den ledende årsaken til blindhet i industrialiserte land, bestående av vanlige sykdommer som AMD, samt sjeldne sykdommer som retinitis pigmentosa, der retinal celledød til slutt fører til blindhet. RPE-celler, fotoreseptor og retinal ganglion celler (RGC) skade kan i noen tilfeller bli redusert, men det er for tiden ingen kurative terapier tilgjengelig. ATMPer tilbyr potensial til å korrigere genfeil, integrere terapeutiske gener eller erstatte degenererte celler, og dermed muliggjøre utvikling av regenerative og kurative terapier for sykdommer som AMD; 13 genterapier har allerede fått markedsføringsgodkjenning, inkludert en terapi for å behandle RPE65 mutasjonsrelatert retinal degenerasjon2,3. Blant eldre voksne (>60 år) påvirkes ~ 30 millioner mennesker over hele verden av enten neovascular (nvAMD) eller avascular (aAMD) AMD4. Begge formene er indusert av aldersrelaterte utløsere, inkludert oksidativ skade, funksjonshemming og tap av RPE-celler etterfulgt av fotoreseptorforringelse, blant annet (f.eks. genetiske risikohaller, røyking, hypertensjon)5,6. I nvAMD forverres patogenese av en ubalanse av angiogene og anti-angiogene faktorer til fordel for den angiogene vaskulære endoteliale vekstfaktoren (VEGF) som induserer koroidal neovascularization (CNV). Til dags dato kan bare nvAMD behandles ved månedlige intravitreale injeksjoner av inhibitorer av VEGF-proteinet for å undertrykke CNV; ingen effektiv behandling er ennå tilgjengelig for aAMD6,7.
Flere studier evaluerte cellebaserte terapier for å erstatte anti-VEGF-terapien: studier laget av Binder et al., der nyhøstede autologe RPE-celler ble transplantert til pasienter med nAMD8,9,10, viste moderat visuell forbedring, men bare en liten gruppe pasienter nådde en endelig synsskarphet høy nok til å muliggjøre lesing. Nylig brukte en klinisk fase I-studie en embryonal stamcelle-avledet RPE-patch for å behandle AMD med lovende resultater; det vil si effekt, stabilitet og sikkerhet av RPE-patchen i opptil 12 måneder hos 2 av de 10 pasientene som ble behandlet11. I tillegg har flere grupper publisert studier der autologE RPE-Bruchs membran-choroid flekker ble høstet fra perifer netthinnen og transplantert til makula12,13,14; og indusert pluripotent stamcelle (iPSC)-avledede RPE-flekker ble generert fortransplantasjon 15. For aAMD har antistoffer rettet mot komplementveien blitt testet i kliniske studier6,16 og en fase I-studie ved hjelp av en enkelt intravitreal injeksjon av en adeno-assosiert viral (AAV) vektorkoding av genet for faktor CD59 (AAVCAGsCD59) hos pasienter med geografisk atrofi (GA) ble fullført17; fase II-studien startet nylig og tar sikte på å rekruttere 132 pasienter med avansert aAMD og å evaluere utfallet ved 2 år etter intervensjon18. Til slutt har FocuS-studiegruppen startet en klinisk fase I/II multisenterstudie som evaluerer sikkerhet, doserespons og effekt av en rekombinant ikke-replikerende AAV-vektor som koder en menneskelig komplementfaktor19.
Primært er målet med en regenerativ AMD-terapi transplantasjon av funksjonelle RPE-celler, som ble skadet eller mistet. Imidlertid deler IPE- og RPE-celler mange funksjonelle og genetiske likheter (f.eks. fagocytose og retinolmetabolisme), og fordi IPE-celler er mer gjennomhøstet, har de blitt foreslått som en RPE-erstatning20. Selv om det tidligere har vist seg at IPE-celletransplantasjon forsinker fotoreseptordegenerering i dyremodeller21,22 og stabiliserer visuell funksjon hos pasienter med sluttfase nvAMD, ble det ikke observert noen signifikant forbedring hos disse pasientene23. Mangelen på effekt kan skyldes det lave antallet transplanterte celler, og/eller ubalansen av nevrobeskyttende netthinnefaktorer. En alternativ tilnærming ville være å transplantere transfekterte pigmentepiteleceller som overekspresserer nevrobeskyttende faktorer for å gjenopprette retinal homeostase, opprettholde gjenværende RPE-celler og beskytte fotoreseptorer og RGCer mot degenerasjon. Følgelig foreslår vi en ny terapi som består av transplantasjon av funksjonelle RPE- eller IPE-celler som har gjennomgått genteknologi for å utskille nevrobeskyttende og anti-angiogene proteiner, som PEDF, GM-CSF eller insulinlignende vekstfaktorer (IGFer). Fordelen med å utvikle og analysere denne tilnærmingen i flere arter i stedet for å bruke en cellelinje, bare en art eller menneskelig vev er: 1) økt reproduserbarhet og overførbarhet av resultatene som vist av mange studier realisert i uavhengige laboratorier og forskjellige arter1,24,25; 2) gris eller storfe celler er feasibly disponibel uten offer av flere dyr; 3) tilgjengeligheten av spesielt gris og storfe celler tillater store testserier å produsere robuste resultater; 4) kunnskapen om å isolere, kultur og genetisk modifisere celler fra de mest brukte modellene muliggjør in vivo analyser i flere arter24,25,26 og dermed tilbyr et forbedret risiko-nytte forhold for de første behandlede pasientene; 5) fleksibiliteten til protokollen som presenteres tillater bruk i ulike modeller og eksperimentelle oppsett og for alle okulære cellebaserte terapier med og uten genteknologi. I motsetning til dette er alternative teknikker som cellelinjer eller humant vev bare av begrenset overførbarhet og/eller begrenset disponerbarhet. Cellelinjer som ARPE-19 er ideelle for foreløpige eksperimenter. Lav pigmentering og høy spredning varierer imidlertid betydelig fra primærcellene1. RPE- og IPE-celler, som er isolert fra humant donorvev, tilbyr en dyrebar kilde for overførbare in vitro-eksperimenter; Vi får imidlertid menneskelig vev fra en amerikansk-amerikansk øyebank, noe som betyr at vevet er minst to dager gammelt (etter enucleation) og krever en lang og dyr transport, men lokalt donorvev er ikke tilgjengelig i tilstrekkelige mengder for en produktiv forskning. Fordelen med bruk av primærceller bekreftes av flere studier fra andre gruppe27,28.
For utvikling av en cellebasert ikke-viral genterapi ved hjelp av SB100X transposonsystem for transfektering av primære RPE- og IPE-celler med genkoding for PEDF og/eller GM-CSF for å behandle henholdsvis NVAMD og aAMD, henholdsvis29,30,31,32, etablerte vi først transfeksjonen av ARPE-19 celler19 celler 1 . Deretter ble isolasjons- og transfeksjonsprotokollene etablert i lett tilgjengelige bovine og porcin primærceller. Nå er isolasjon og transfeksjon av primære RPE- og IPE-celler fra fem forskjellige arter etablert, fra små (som mus) til store pattedyr (som storfe). Det ble bekreftet i primære RPE- og IPE-celler avledet fra humane donorøyne30. Good Manufacturing Practices (GMP)-kompatibel produksjon av ATMP ble validert ved hjelp av humant donorvev samt33. Til slutt ble både sikkerhet og effektivitet av tilnærmingen vurdert in vivo i tre forskjellige arter som protokollen er tilpasset: mus, rotte og kanin. I det kliniske oppsettet vil en irisbiopsi bli høstet fra pasienten, og IPE-celler vil bli isolert og transfektert i det rene rommet, før cellene blir transplantert subretinalt tilbake til samme pasient. Hele prosessen vil finne sted under en enkelt kirurgisk økt som varer ca. 60 minutter. Utviklingen av behandlingstilnærmingen og evalueringen av effektiviteten ba om gode in vitro- og ex vivo-modeller for å implementere robuste og effektive genleveringsmetoder, for å analysere effektiviteten av genlevering, terapeutisk proteinproduksjon og nevrobeskyttende effekter, og å produsere celletransplantasjoner for å teste tilnærmingen i vivo1,24,25,29,30 . Det er verdt å nevne at terapien har den etiske godkjenningen for en klinisk fase Ib / IIa-studie fra den etiske kommisjonen for forskning av Kantonen Genève (nr. 2019-00250) og for tiden samles siste prekliniske data forespurt om autorisasjon av sveitsiske reguleringsmyndigheter ved hjelp av den presenterte protokollen. I denne forbindelse viste pre-kliniske in vivo-data en betydelig reduksjon i CNV og utmerket sikkerhet24,25,31.
Her beskrives isolasjonen og kulturen til RPE/IPE-celler fra storfe, gris, kanin, rotte og mus, og bruken av det integrative SB100X transposonsystemet kombinert med elektroporasjon som en effektiv genleveringsmetode. Spesielt ble primære PE-celler transfektert til overekspress PEDF og GM-CSF. Innsamlingen av disse protokollene gjør det mulig å utføre in vitro- og in vivo-studier i alle prekliniske faser av ATMP-utvikling. Videre har oppsettet potensial til å tilpasses andre gener av interesse og sykdommer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well plates</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>150687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>7657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine</td>
			<td>Mundipharma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bonn micro forceps flat</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri forceps (sterile)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/Ham`s F12</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drape (sterile)</td>
			<td>M&#246;lnlycke Health Care</td>
			<td>800530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation buffer 3P.14</td>
			<td>3P Pharmaceutical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Brunschwig</td>
			<td>P40-37500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (different size) (sterile)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze compress</td>
			<td>PROMEDICAL AG</td>
			<td>25403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl (0.9%)</td>
			<td>Laboratorium Dr. Bichsel AG</td>
			<td>1000090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle (18G)&#160;</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>TER-NN1838R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection kit 10 &#181;L</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK5000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber</td>
			<td>Marienfeld-superior</td>
			<td>640010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette (fire-polish)</td>
			<td>Witeg</td>
			<td>4100150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0781-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital (Thiopental Inresa)</td>
			<td>Ospedalia AG</td>
			<td>31408025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>150288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFAR4-PEDF</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFAR4-SB100X</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFAR4-Venus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Pastor et al., 2018. Kindly provided by Prof. Scherman and Prof. Marie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSB100X (250 ng/&#181;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>M&#225;t&#233;s et al., 2009. Provide by Prof. Izsvak</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pT2-CAGGS-Venus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Johnen et al., 2012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pT2-CMV-GMCSF-His plasmid DNA (250 ng/&#181;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cloned in our lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pT2-CMV-PEDF-His plasmid DNA (250 ng/&#181;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Pastor et al., 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scarpel no. 10</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scarpel no. 11</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp-sharp tip curved Extra Fine Bonn Scissors (sterile)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp-sharp tip straight Extra Fine Bonn Scissors (sterile)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tali Image-Based Cytometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>T10796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.25%&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25050014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 5%/EDTA 2%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas spring scissors curved (sterile)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture, and genetic engineering of mammalian primary pigment epithelial cells for non-viral gene therapy

Aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD) er den hyppigste årsaken til blindhet hos pasienter >60 år, og påvirker ~ 30 millioner mennesker over hele verden. AMD er en multifaktoriell sykdom påvirket av miljømessige og genetiske faktorer, noe som fører til funksjonsnedsettelse av netthinnen på grunn av retinal pigment epitel (RPE) celle degenerasjon etterfulgt av fotoreseptor nedbrytning. En ideell behandling vil omfatte transplantasjon av sunne RPE-celler som utskiller nevrobeskyttende faktorer for å forhindre RPE-celledød og fotoreseptordegenerering. På grunn av funksjonelle og genetiske likheter og muligheten for en mindre invasiv biopsi, ble transplantasjonen av irispigment epitelceller (IPE) foreslått som en erstatning for degenererte RPE. Sekresjon av nevrobeskyttende faktorer med et lavt antall subretinally-transplanterte celler kan oppnås ved Sleeping Beauty (SB100X) transposonmediert transfeksjon med genkoding for pigment epitel-avledet faktor (PEDF) og / eller granulocytt makrofag-koloni stimulerende faktor (GM-CSF). Vi etablerte isolasjon, kultur og SB100X-mediert transfeksjon av RPE- og IPE-celler fra ulike arter, inkludert gnagere, griser og storfe. Globuser er utplantet og hornhinnen og linsen fjernes for å få tilgang til iris og netthinnen. Ved hjelp av en skreddersydd spatel fjernes IPE-celler fra den isolerte irisen. For å høste RPE-celler kan det være nødvendig med en trypsininkubasjon, avhengig av arten. Deretter, ved hjelp av RPE-tilpasset spatel, blir celler suspendert i medium. Etter sådd overvåkes celler to ganger i uken, og etter å ha nådd samløp, transfektert av elektroporasjon. Genintegrasjon, uttrykk, proteinsekresjon og funksjon ble bekreftet av qPCR, WB, ELISA, immunfluorescens og funksjonelle analyser. Avhengig av arten kan 30.000-5 millioner (RPE) og 10.000-1,5 millioner (IPE) celler isoleres per øye. Genmodifiserte celler viser betydelig PEDF/GM-CSF-overtrykk med kapasitet til å redusere oksidativt stress og tilbyr et fleksibelt system for ex vivo-analyser og in vivo-studier som kan overføres til mennesker for å utvikle okulære genterapitilnærminger.

PE-isolasjon fra ulike pattedyrarter Ved hjelp av de nevnte protokollene ble IPE- og RPE-celler vellykket isolert og dyrket fra fem forskjellige arter. Antall celler oppnådd fra hver prosedyre avhenger av arten og størrelsen på øyet (Tabell 1). Som vist i figur 1, viser celler typisk PE-cellemorfologi og pigmentering (unntatt kaninceller vist, avledet fra albino New Zealand White (NZW) kaniner). Etter 21 dager etter isolasjon er cellene konfluensielle...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy at JoVE.com

Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy

Her presenteres en protokoll for å isolere og transfektere primær iris og retinal pigment epitelceller fra ulike pattedyr (mus, rotte, kanin, gris og storfe). Metoden er ideelt egnet til å studere okulære genterapitilnærminger i ulike oppsett for ex vivo-analyser og in vivo-studier som kan overføres til mennesker.

Isolasjon, kultur og genteknologi av pattedyr primærpigment epitelceller for ikke-viral genterapi

Age-related macular degeneration (AMD) is the most frequent cause of blindness in patients &#62;60 years, affecting ~30 million people worldwide. AMD is a ...

Protokollen er betydelig siden den viser isolasjon og transfeksjon av pigment epitelceller fra fem pattedyr som et optimalt system for å studere okulær genterapi i ulike oppsett. Den største fordelen med denne metoden er dens fleksibilitet, overførbarhet, høyt celleutbytte, levedyktighet og transfeksjonshastighet på grunn av de fem artene og det ikke-virale SB100X transposonsystemet som brukes. Disse teknikkene er utviklet for å studere genterapi tilnærminger rettet mot retinal og iris pigment epitelceller, som er isolert og transfektert i dagens protokoll, men er brukbare for enhver okulær forskning.Demonstrere prosedyren vil være Gregg Sealy, en tekniker fra laboratoriet. Etter euthanizing dyret, bruk buet saks og Colibri tang for å enucleate øynene, og rengjør deretter gjenværende muskelvev og hud fra øynene. Samle øynene i et 50 milliliterrør fylt med ikke-steril PBS og overfør røret til laminær strømningshette.Desinfiser dem ved å senke dem ned i jodbasert løsning i to minutter, og overfør deretter øynene til et 50 milliliterrør fylt med steril PBS. Sett ett øye på en steril gasbind komprimere og hold øyet godt nær synsnerven. Klipp deretter nær grensen til iris med en nummer 11 skalpell.Bruk saks, kutt rundt iris og fjern det fremre segmentet og legg det i en Petri-tallerken, og la pæren være glasslegemet til retinal pigmentepitelet epitel, eller RPE-celler, er isolert. For å isolere irispigment epitelial, eller IPE-celler, fjern linsen med fine tang og trekk forsiktig ut iris som inneholder IPE-cellene. Legg iris i en Petri-tallerken og vask den med steril PBS.Tilsett 500 mikroliter med 0,25% trypsin og inkuber i 10 minutter ved 37 grader Celsius. Fjern trypsin, tilsett 500 mikroliter med komplett medium, og skrap IPE delikat med en flat, brannpolert Pasteur pipette. Samle cellefjæringen og legg den i et 1,5 milliliterrør.Tell cellene ved hjelp av Neubauer-kammeret, og frø 0,2 millioner celler per brønn i en 24 brønnplate med en milliliter komplett medium. Plasser platen i en inkubator og kultur den på 37 grader Celsius og 5% karbondioksid. For å isolere RPE-celler, fjern glasslegemet humor og netthinne fra det bakre segmentet med tynne tang.Sett pærene i 24 brønnplaten og tilsett 500 mikroliter 0,25% trypsin per øye og inkuber i 10 minutter ved 37 grader Celsius. Fjern trypsin, tilsett 500 mikroliter med komplett medium per globus og skrap RPE-cellene delikat med en buet, brannpolert Pasteur pipette. Samle cellefjæringen og legg den i et 1,5 milliliterrør.Tell cellene ved hjelp av Neubauer-kammeret og frø cellene som beskrevet tidligere. Plasser platen i inkubatoren. Rengjør gjenværende muskelvev og hud fra øynene og desinfiser øynene i jodbasert løsning og skyll dem med PBS.For å isolere IPE-celler, fjern linsen og trekk ut iris som beskrevet tidligere. Etter å ha forberedt to iriser, legg til en milliliter komplett medium og isoler cellene ved å skrape med en flat, brannpolert Pasteur pipette, og tell og frø cellene. Plasser platen i inkubatoren.For å isolere RPE-celler, fjern glasslegemet og netthinnen fra det bakre segmentet og legg pæren i en Petri-tallerken. Fyll pæren med en milliliter komplett medium. Bruk en buet, brannpolert Pasteur-pipette til å fjerne RPE-cellene.Samle cellefjæringen i pæren ved hjelp av en 1000 mikroliterpipette, og overfør den til et 1,5 milliliterrør for resuspensjon. Tell deretter og frø cellene og inkuber platen som tidligere demonstrert. Etter rengjøring åpner du øyet og kutter rundt iris for å fjerne det fremre segmentet, og legg deretter i en Petri-tallerken.La pæren stå med glasslegemet til RPE-cellene er isolert. Hvis objektivet leveres med det fremre segmentet for å isolere IPE-cellene, fjerner du objektivet og bruker fine tanger for å trekke ut iris som inneholder IPE-cellene, på en delikat måte. Legg iris i en Petri-tallerken og vask den med steril PBS.Klipp ciliary kroppen med en skalpell nummer 10. Etter å ha forberedt irisene, inkuber dem med to milliliter på 0,25% trypsin ved 37 grader Celsius i 10 minutter. Fjern trypsin og tilsett to milliliter av komplett medium, og isoler deretter cellene ved å skrape med en flat, brannpolert Pasteur pipette.Overfør celleopphenget til et to milliliterrør og sentrifuger cellene i 10 minutter ved 120 ganger G.Kast supernatanten og resuspender cellene i to milliliter av komplett medium. Frø 0,32 millioner celler per brønn i en seks brønnplate i tre milliliter komplett medium. Plasser platen i en inkubator og kultur den på 37 grader Celsius og 5% karbondioksid.For å isolere RPE-celler, fjern glasslegemet humor og netthinne fra det bakre segmentet med tang. Unngå å skade retinal pigment epitel. Vask pæren med PBS.Etter å ha forberedt begge øynene, fyll pæren omtrent tre fjerdedeler full med trypsin, og inkuber i 25 minutter ved 37 grader Celsius med Petri parabolen lokket på toppen av pæreøyet. Fjern trypsin og legg til en milliliter komplett medium. Bruk en buet, brannpolert Pasteur-pipette til å fjerne RPE-cellene.Samle cellefjæringen i pæren og overfør den til et 1,5 milliliterrør for resuspensjon. Sentrifuger cellene i 10 minutter ved 120 ganger G.Seed 0,32 millioner celler per brønn i en seks brønnplate i tre milliliter komplett medium. Plasser platen i en inkubator og kultur den på 37 grader Celsius og 5% karbondioksid.Kultur cellene ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid i en fuktet inkubator. Etter tre til fire dager, pipette opp og ned for å samle ikke-stille celler og sette halvparten av volumet i en annen brønn. Fyll brønnen til en milliliter med komplett medium.Etter ytterligere tre til fire dager gjentar du cellesamlingen, denne gangen slår du sammen de ikke-sammenhengende cellene fra to brønner til en. Tilsett medium til alle brønner. Vær oppmerksom på cellene og bytt medium to ganger i uken.Når cellene når samløp, bytter du til et komplett medium med 1 % FBS. Ved hjelp av de nevnte protokollene ble IPE- og RPE-celler vellykket isolert og dyrket fra fem forskjellige arter. RPE-uttrykksmønsteret ble bekreftet i primære bovine IPE-celler ved immunfluorescens for RPE65.Celle levedyktighet ble studert for å utelukke en potensiell toksisitet av elektroporasjonsbufferen ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig cytotoksisitetsanalysesett og en knuteeelektroporert kontroll. Ingen innvirkning på celle levedyktighet ble observert. Precultured pigment epitelceller fra forskjellige arter ble transfektert med det gule fluorescerende Venus-proteinet.Transfekterte RPE19-celler ble brukt som en positiv kontroll. Kvantifiseringen av transfeksjonseffektiviteten i precultured gris RPE er vist her. Nyisolerte kaninpigment epitelceller ble transfektert med det gule fluorescerende proteinet Venus og ble overvåket av mikroskopi.Pigment epitelceller ble transfektert med pigment epitel avledet faktor og protein sekresjon ble overvåket av vestlig blot. Signalet for transfekterte celler var høyere sammenlignet med ikke-transfekerte celler for alle arter og dager studert, og ingen reduksjon i proteinsekresjon ble observert innen denne tiden. Det er viktig å unngå å skrape cellene med skarpe verktøy.Her brukes brannpolerte Pasteur pipetter, unntatt i små museøyne, hvor en rund skalpell må brukes. Pigment epitelceller kan brukes til å utvikle genterapi tilnærminger og for å simulere patologiske forhold, for eksempel oksidativ stressskade. Disse modellene kan også brukes til å teste terapeutiske legemidler.

Research

JoVE Journal

Biology

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Isolering og Primær kultur Rat Nedsatt Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Isolasjon og kultur av mus Primær acinøse Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolasjon og Primær Culture of Mouse endotelceller fra aorta

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

Isolering og kultur av primær aorta endothelial celler fra miniatyr griser

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...