Name: isolation, culture, and genetic engineering of mammalian primary pigment epithelial cells for non-viral gene therapy
Uploaded: 2021-02-26T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy at JoVE.com

Отдельного заслуживают грегг Сили и Ален Конти за отличную техническую помощь. Эта работа была поддержана Европейской комиссией в контексте Седьмой рамочной программы, Швейцарским национальным фондом наук и Фондом Шмидера-Бориша. Z.I. получил финансирование от Европейского исследовательского совета, ERC Advanced [ERC-2011-ADG 294742] и B.M.W. из исследовательского гранта Фулбрайта и стипендии правительства Швейцарии.

Протоколы, в которых участвовали животные, были выполнены сертифицированным персоналом и после получения разрешения кантонального департамента по защите порядка, безопасности и здоровья (DSES), Домена экспериментации животных Женевы, Швейцария, и в соответствии с Заявлением ARVO об испол...

Наличие стандартизированных методов выделения и культивирования клеток ПЭ имеет основополагающее значение для разработки новых подходов к терапии дегенеративных заболеваний сетчатки. С помощью представленных здесь протоколов ПЭ-клетки можно успешно выделять из разных видов и куль?...

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well plates</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>150687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>7657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine</td>
			<td>Mundipharma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bonn micro forceps flat</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri forceps (sterile)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/Ham`s F12</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drape (sterile)</td>
			<td>M&#246;lnlycke Health Care</td>
			<td>800530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation buffer 3P.14</td>
			<td>3P Pharmaceutical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Brunschwig</td>
			<td>P40-37500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (different size) (sterile)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze compress</td>
			<td>PROMEDICAL AG</td>
			<td>25403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl (0.9%)</td>
			<td>Laboratorium Dr. Bichsel AG</td>
			<td>1000090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle (18G)&#160;</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>TER-NN1838R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection kit 10 &#181;L</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK5000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber</td>
			<td>Marienfeld-superior</td>
			<td>640010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette (fire-polish)</td>
			<td>Witeg</td>
			<td>4100150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0781-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital (Thiopental Inresa)</td>
			<td>Ospedalia AG</td>
			<td>31408025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>150288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFAR4-PEDF</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFAR4-SB100X</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFAR4-Venus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Pastor et al., 2018. Kindly provided by Prof. Scherman and Prof. Marie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSB100X (250 ng/&#181;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>M&#225;t&#233;s et al., 2009. Provide by Prof. Izsvak</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pT2-CAGGS-Venus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Johnen et al., 2012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pT2-CMV-GMCSF-His plasmid DNA (250 ng/&#181;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cloned in our lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pT2-CMV-PEDF-His plasmid DNA (250 ng/&#181;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Pastor et al., 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scarpel no. 10</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scarpel no. 11</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp-sharp tip curved Extra Fine Bonn Scissors (sterile)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp-sharp tip straight Extra Fine Bonn Scissors (sterile)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tali Image-Based Cytometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>T10796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.25%&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25050014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 5%/EDTA 2%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas spring scissors curved (sterile)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture, and genetic engineering of mammalian primary pigment epithelial cells for non-viral gene therapy

Возрастная макулярная дегенерация (ВМД) является наиболее частой причиной слепоты у пациентов >60 лет, затрагивая ~ 30 миллионов человек во всем мире. ВМД является многофакторным заболеванием, на которое влияют факторы окружающей среды и генетические факторы, которые приводят к функциональному нарушению сетчатки из-за дегенерации пигментных эпителиальных клеток сетчатки (RPE) с последующей деградацией фоторецепторов. Идеальное лечение будет включать трансплантацию здоровых клеток RPE, секретирующих нейропротекторные факторы для предотвращения гибели клеток RPE и дегенерации фоторецепторов. Из-за функционального и генетического сходства и возможности менее инвазивной биопсии в качестве замены дегенерированной РПЭ была предложена трансплантация пигментных эпителиальных клеток радужной оболочки глаза (IPE). Секреция нейропротекторных факторов малым количеством субретинально трансплантированных клеток может быть достигнута транспозонно-опосредованием трансфекции «Спящей красавицы» (SB100X)с генами, кодирующими фактор, полученный из пигментного эпителия (PEDF) и/ или гранулоцитарный макрофагально-колониестимулирующий фактор (GM-CSF). Мы установили изоляцию, культуру и SB100X-опосредованнуютрансфекцию клеток RPE и IPE от различных видов, включая грызунов, свиней и крупный рогатый скот. Глобусы эксплантируются, а роговица и хрусталик удаляются для доступа к радужной оболочке и сетчатке. С помощью изготовленного на заказ шпателя клетки IPE удаляются из изолированной радужной оболочки. Для сбора клеток RPE может потребоваться инкубация трипсина, в зависимости от вида. Затем, используя шпатель, настроенный на RPE, клетки суспензируются в среде. После посева клетки контролируют два раза в неделю и, достигнув слияния, трансфектируют электропорацией. Интеграция генов, экспрессия, секреция белка и функция были подтверждены qPCR, WB, ELISA, иммунофлуоресценцией и функциональными анализами. В зависимости от вида, 30 000-5 миллионов (RPE) и 10 000-1,5 миллиона (IPE) клеток могут быть выделены на глаз. Генетически модифицированные клетки демонстрируют значительную сверхэкспрессию PEDF / GM-CSF со способностью уменьшать окислительный стресс и предлагают гибкую систему для анализа ex vivo и исследований in vivo, переносимых на людей для разработки подходов к окулярной генной терапии.

Выделение ПЭ из различных видов млекопитающих Используя вышеупомянутые протоколы, клетки IPE и RPE были успешно выделены и культивированы из пяти различных видов. Количество клеток, получаемых в результате каждой процедуры, зависит от вида и размера глаза(табл. 1). Как ?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy at JoVE.com

Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy

Здесь представлен протокол выделения и трансфектии первичных пигментных эпителиальных клеток радужной оболочки и сетчатки от различных млекопитающих (мышей, крыс, кроликов, свиней, крупного рогатого готья). Метод идеально подходит для изучения подходов к генной терапии глаз в различных установках для анализа ex vivo и исследований in vivo, переносимых на людей.

Выделение, культивация и генная инженерия первичных пигментных эпителиальных клеток млекопитающих для невирусной генной терапии

Age-related macular degeneration (AMD) is the most frequent cause of blindness in patients &#62;60 years, affecting ~30 million people worldwide. AMD is a ...

Протокол имеет большое значение, поскольку он показывает выделение и трансфекцию пигментных эпителиальных клеток пяти млекопитающих в качестве оптимальной системы для изучения глазной генной терапии в различных установках. Основным преимуществом этого метода является его гибкость, переносимость, высокий выход клеток, жизнеспособность и скорость трансфекции благодаря пяти видам и используемой невирусной транспозонной системе SB100X. Эти методы были разработаны для изучения подходов генной терапии, нацеленных на пигментные эпителиальные клетки сетчатки и радужной оболочки глаза, которые выделены и трансфекционированы в настоящем протоколе, но могут использоваться для любых глазных исследований.Демонстрацию процедуры будет демонстрировать Грегг Сили, техник из лаборатории. После усыпления животного используйте изогнутые ножницы и щипцы Колибри для энуклеации глаз, затем очистите оставшуюся мышечную ткань и кожу от глаз. Соберите глаза в 50-миллилитровую трубку, заполненную нестерильным PBS, и перенесите трубку в ламинарную вытяжку.Дезинфицируйте их, погружая в раствор на основе йода на две минуты, затем перенесите глаза в 50-миллилитровую трубку, заполненную стерильным PBS. Положите один глаз на стерильный марлевой компресс и крепко держите глаз близко к зрительной нерве. Затем обрежьте около предела радужной оболочки скальпелем no 11.С помощью ножниц обрежьте вокруг радужной оболочки и удалите передний сегмент и поместите его в чашку Петри, оставив луковицу со стекловидным стекловидом до тех пор, пока не будет выделен пигментный эпителий сетчатки или клетки RPE. Чтобы изолировать эпителиальные пигментные клетки радужной оболочки, или клетки IPE, удалите хрусталик тонкими щипцами и деликатно вытащите радужную оболочку, содержащую клетки IPE. Поместите ирис в чашку Петри и вымойте ее стерильным PBS.Добавьте 500 микролитров 0,25% трипсина и инкубировать в течение 10 минут при 37 градусах Цельсия. Удалите трипсин, добавьте 500 микролитров полной среды и деликатно соскоблите IPE плоской, отполированной огнем пипеткой Пастера. Соберите клеточную суспензию и поместите ее в 1,5-миллилитровую трубку.Подсчитайте клетки, используя камеру Нойбауэра, и посейте 0,2 миллиона клеток на лунку в 24-луночную пластину с одним миллилитром полной среды. Поместите пластину в инкубатор и культивируете ее при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа. Чтобы изолировать клетки RPE, удалите стекловидное тело и сетчатку из заднего сегмента тонкими щипцами.Поместите луковицы в 24-луночную пластину и добавьте 500 микролитров 0,25% трипсина на глаз и высиживайте в течение 10 минут при 37 градусах Цельсия. Удалите трипсин, добавьте 500 микролитров полной среды на глобус и деликатно соскоблите ячейки RPE изогнутой, отполированной огнем пипеткой Пастера. Соберите клеточную суспензию и поместите ее в 1,5-миллилитровую трубку.Подсчитайте клетки с помощью камеры Нойбауэра и засыпляйте клетки, как описано выше. Поместите тарелку в инкубатор. Очистите оставшуюся мышечную ткань и кожу от глаз и продезинфицируйте глаза в растворе на основе йода и промойте их PBS.Чтобы изолировать клетки IPE, удалите хрусталик и вытащите радужную оболочку, как описано ранее. После приготовления двух ирисов добавьте один миллилитр полной среды и изолируйте клетки, поцарапав плоской, отполированной огнем пипеткой Пастера, затем подсчитайте и засейте клетки. Поместите тарелку в инкубатор.Чтобы изолировать клетки RPE, удалите стекловидное стекло и сетчатку из заднего сегмента и поместите луковицу в чашку Петри. Наполните луковицу одним миллилитром полной среды. С помощью изогнутой, отполированной огнем пипетки Пастера удалите ячейки RPE.Соберите клеточную суспензию внутри колбы, используя пипетку 1000 микролитров, и перенесите ее в трубку размером 1,5 миллилитра для повторного суспендирования. Затем подсчитайте и посейте клетки и инкубируем пластину, как было продемонстрировано ранее. После очистки откройте глаз и обрежьте вокруг радужной оболочки, чтобы удалить передний сегмент, затем положите в чашку Петри.Оставьте луковицу со стекловидным стекловидом до тех пор, пока клетки RPE не будут изолированы. Чтобы изолировать клетки IPE, если хрусталик приходит с передним сегментом, удалите хрусталик и используйте тонкие щипцы, чтобы деликатно вытащить радужную оболочку, содержащую клетки IPE. Поместите ирис в чашку Петри и вымойте ее стерильным PBS.Режут цилиарное тело скальпелем No 10. После приготовления ирисов высиживают их двумя миллилитрами 0,25% трипсина при 37 градусах Цельсия в течение 10 минут. Удалите трипсин и добавьте два миллилитра полной среды, затем изолируйте клетки, поцарапав плоской, отполированной огнем пипеткой Пастера.Переложите клеточную суспензию в двухмиллилитровую трубку и центрифугируют клетки в течение 10 минут в 120 раз больше G.Отбросьте супернатант и повторно суспендьте клетки в двух миллилитрах полной среды. Посейте 0,32 миллиона клеток на лунку в шести луночную пластину в трех миллилитрах полной среды. Поместите пластину в инкубатор и культивируете ее при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа.Чтобы изолировать клетки RPE, удаляют стекловидное тело и сетчатку из заднего сегмента щипцами. Избегайте повреждения пигментного эпителия сетчатки. Вымойте лампочку PBS.После подготовки обоих глаз наполните луковицу трипсином примерно на три четверти и высиживание в течение 25 минут при 37 градусах Цельсия крышкой чашки Петри поверх глазка луковицы. Удалите трипсин и добавьте один миллилитр полной среды. С помощью изогнутой, отполированной огнем пипетки Пастера удалите ячейки RPE.Соберите клеточную суспензию внутри колбы и переложите ее в трубку размером 1,5 миллилита для повторного суспензии. Центрифугируют клетки в течение 10 минут при 120 разах G.Seed 0,32 млн клеток на лунку в шести лунке пластины в трех миллилитрах полной среды. Поместите пластину в инкубатор и культивируете ее при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа.Культивирует клетки при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в увлажненный инкубатор. Через три-четыре дня пипетку вверх и вниз, чтобы собрать неприлипание клетки и положить половину объема в другой колодец. Наполните лунку до одного миллилитра полной средой.Еще через три-четыре дня повторите сбор клеток, на этот раз объединив неприсоединяющиеся клетки из двух скважин в одну. Добавьте среду ко всем скважинам. Наблюдайте за клетками и меняйте среду два раза в неделю.Когда клетки достигнут слияния, переключитесь на полную среду с 1% FBS. Используя вышеупомянутые протоколы, клетки IPE и RPE были успешно выделены и культивированы из пяти различных видов. Паттерн экспрессии RPE был подтвержден в первичных бытовых клетках IPE иммунофлуоресценцией для RPE65.Жизнеспособность клеток изучали для исключения потенциальной токсичности электропорационного буфера с использованием коммерчески доступного набора для анализа цитотоксичности и электропорированного контроля узла. Никакого влияния на жизнеспособность клеток не наблюдалось. Прекультурные пигментные эпителиальные клетки разных видов были трансфекциированы желтым флуоресцентным белком Венеры.Трансфекированные клетки RPE19 использовались в качестве положительного контроля. Здесь показана количественная оценка эффективности трансфекции в прекультурных свиноводческих RPE. Свежеизолированные пигментные эпителиальные клетки кролика были трансфекционны желтым флуоресцентным белком Венеры и контролировались с помощью микроскопии.Пигментные эпителиальные клетки трансфектировали фактором, полученным из пигментного эпителия, а секреция белка контролировалась западным пятном. Сигнал для трансфекционных клеток был выше по сравнению с непереперераженными клетками для всех видов и дней исследования, и в течение этого времени не наблюдалось снижения секреции белка. Очень важно избегать соскабливания ячеек острыми инструментами.Здесь используются огнеполированные пипетки Пастера, за исключением маленьких мышиных глаз, где необходимо использовать круглый скальпель. Пигментные эпителиальные клетки могут быть использованы для разработки подходов генной терапии и для моделирования патологических состояний, например, повреждения окислительным стрессом. Эти модели также могут быть использованы для тестирования терапевтических препаратов.

Research

JoVE Journal

Biology

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

Культура миелоидных дендритных клеток из костного мозга прекурсоров

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Выделение и культуре клеток из нефрогенной зона эмбриональных почек мышь

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

Выделение и культуры взрослых Эпителиальные стволовые клетки из человеческой кожи

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Система для культивирования Ирис пигмента эпителиальных клеток по изучению регенерации линз в Ньют

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Экс Vivo культуры первичных человеческих маточных труб эпителиальных клеток

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Индукция и тестирование Гипоксия в культуре клеток

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Выделение и первичной культуре клеток крысы Печеночная

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Выделение и культивирование Мышь первичные клетки поджелудочной Ацинарных

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Выделение и первичной культуре мышиных эндотелиальных клеток аорты

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

Изоляция и культура первичных аортальных эндотелиальных клеток от миниатюрных свиней

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...