Name: isolation, culture, and genetic engineering of mammalian primary pigment epithelial cells for non-viral gene therapy
Uploaded: 2021-02-26T13:30:00
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Un agradecimiento merece a Gregg Sealy y Alain Conti por su excelente asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por la Comisión Europea en el contexto del Séptimo Programa Marco, la Fundación Nacional Suiza de Ciencias y la Fundación Schmieder-Bohrisch. Z.I. recibió financiación del Consejo Europeo de Investigación, ERC Advanced [ERC-2011-ADG 294742] y B.M.W. de una beca de investigación Fulbright y una beca de excelencia del gobierno suizo.

Los protocolos en los que participaron los animales fueron llevados a cabo por personal certificado y previa autorización del Departamento cantonal de la seguridad, de l'emploi et de la santé (DSES), Domaine de l'expérimentation animale de Ginebra, Suiza, y de acuerdo con la Declaración arVO para el uso de animales en la investigación oftálmica y de la visión (aprobación no. GE/94/17). Las ratas adultas sanas de Brown Norway, los ratones C57BL / 6 y los conejos blancos de Nueva Zelanda fueron sacrificados por una...

Contar con métodos estandarizados para aislar y cultivar células de EP es fundamental en el desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos para las enfermedades degenerativas de la retina. Con los protocolos presentados aquí, las células de PE pueden aislarse con éxito de diferentes especies y cultivarse durante largos períodos (hasta ahora, el cultivo más largo se mantuvo durante 2 años1,38); se observó morfología, pigmentación y función típicas de las...

Nuestro grupo se centra en el desarrollo de enfoques regenerativos para tratar la degeneración neurorretinina, es decir, la DMAE, mediante la terapia génica no viral basada en RPE e IPE. El establecimiento preclínico de tales terapias requiere modelos in vitro transferibles a los seres humanos. Por lo tanto, el objetivo del estudio presentado aquí es entregar protocolos para el aislamiento, cultivo e ingeniería genética de células primarias de RPE e IPE. La razón para establecer el aislamiento de células de PE de múltiples especies es confirmar sólidamente la seguridad y la eficiencia del enfoque y aumentar su reproducibilidad y transferibilidad. La línea celular de EPR humano disponible ARPE-19 difiere de las células primarias (por ejemplo, están menos pigmentadas) y, por lo tanto, es de valor limitado para los análisis preclínicos1. Además, las células de mamíferos no humanos se pueden comprar a un costo menor y en mayores cantidades; el tejido de donante humano se puede obtener de varios bancos de ojos, pero la disponibilidad es limitada y costosa. Por último, los nuevos medicamentos de terapia avanzada (ATMP, es decir, células, tejidos o medicamentos de terapia génica) deben aplicarse en al menos dos especies diferentes antes de ser probados en pacientes y estos estudios in vivo solicitan la preparación de trasplantes de células alogénicas.
Las enfermedades neurodegenerativas de la retina son la principal causa de ceguera en los países industrializados, que comprenden enfermedades comunes como la DMAE, así como enfermedades raras como la retinosis pigmentaria, en la que la muerte de las células de la retina finalmente conduce a la ceguera. El daño de las células RPE, los fotorreceptores y las células ganglionares de la retina (RGC) puede en algunos casos disminuirse, pero actualmente no hay terapias curativas disponibles. Los ATMP ofrecen el potencial de corregir defectos genéticos, integrar genes terapéuticos o reemplazar células degeneradas, lo que permite el desarrollo de terapias regenerativas y curativas para enfermedades como la DMAE; 13 terapias génicas ya obtuvieron la aprobación de comercialización, incluida una terapia para tratar la degeneración retiniana asociada a la mutación RPE652,3. Entre los adultos mayores (>60 años), ~ 30 millones de personas en todo el mundo se ven afectadas por la DMAE neovascular (nvAMD) o avascular (aAMD)4. Ambas formas son inducidas por desencadenantes asociados a la edad, incluido el daño oxidativo, el deterioro de la función y la pérdida de células RPE, seguidos de la degradación de los fotorreceptores, entre otros (por ejemplo, alelos de riesgo genético, tabaquismo, hipertensión)5,6. En nvAMD, la patogénesis se ve agravada por un desequilibrio de factores angiogénicos y antiangiogénicos a favor del factor de crecimiento endotelial vascular angiogénico (VEGF) que induce la neovascularización coroidea (CNV). Hasta la fecha, solo la nvAMD es tratable mediante inyecciones intravítreas mensuales de inhibidores de la proteína VEGF para suprimir la CNV; todavía no se dispone de un tratamiento eficaz para laAAMD 6,7.
Varios estudios evaluaron las terapias basadas en células para reemplazar la terapia anti-VEGF: los estudios realizados por Binder et al., en los que se trasplantaron células autólogas de EPR recién cosechadas en pacientes con nAMD8,9,10,mostraron una mejoría visual moderada, pero solo un pequeño grupo de pacientes alcanzó una agudeza visual final lo suficientemente alta como para permitir la lectura. Recientemente, un estudio clínico de fase I utilizó un parche de ERP derivado de células madre embrionarias para tratar la DMAE con resultados prometedores; es decir, eficacia, estabilidad y seguridad del parche RPE hasta 12 meses en 2 de los 10 pacientes tratados11. Además, varios grupos han publicado estudios en los que se recolectaron parches autólogos de RPE-Bruch-coroides de la retina periférica y se trasplantaron a la mácula12,13,14; y se generaron parches de EPR derivados de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) para trasplante15. Para la AAMD, los anticuerpos dirigidos a la vía del complemento se han probado en ensayos clínicos6,16 y se completó un estudio de fase I utilizando una única inyección intravítrea de un vector viral adenoaso asociado (AAV) que codifica el gen para el factor CD59 (AAVCAGsCD59) en pacientes con atrofia geográfica (GA)17; el estudio de fase II comenzó recientemente y tiene como objetivo reclutar a 132 pacientes con AAMD avanzada y evaluar el resultado a los 2 años posteriores a la intervención18. Finalmente, el grupo de estudio FocuS ha iniciado un ensayo clínico multicéntrico de fase I/II evaluando la seguridad, dosis-respuesta y eficacia de un vector AAV no replicante recombinante que codifica un factor19del complemento humano.
Principalmente, el objetivo de una terapia de DMAE regenerativa es el trasplante de células RPE funcionales, que se dañaron o perdieron. Sin embargo, las células IPE y RPE comparten muchas similitudes funcionales y genéticas (por ejemplo, fagocitosis y metabolismo del retinol), y debido a que las células IPE se cosechan de manera más factible, se han propuesto como un sustituto de RPE20. A pesar de que se ha demostrado previamente que el trasplante de células IPE retrasa la degeneración del fotorreceptor en modelos animales21,22 y estabiliza la función visual en pacientes con nvAMD en etapa final, no se observó una mejoría significativa en estos pacientes23. La falta de eficacia puede deberse al bajo número de células trasplantadas y/o al desequilibrio de los factores neuroprotectores de la retina. Un enfoque alternativo sería trasplantar células epiteliales pigmentarias transfectadas que sobreexpresan factores neuroprotectores para restaurar la homeostasis retiniana, mantener las células RPE restantes y proteger los fotorreceptores y RGC de la degeneración. En consecuencia, proponemos una nueva terapia que comprende el trasplante de células funcionales de EPR o IPE que han sido sometidas a ingeniería genética para secretar proteínas neuroprotectoras y antiangiogénicas, como PEDF, GM-CSF o factores de crecimiento similares a la insulina (IGF). La ventaja de desarrollar y analizar este enfoque en varias especies en lugar de utilizar una línea celular, una sola especie, o tejido humano es: 1) mayor reproducibilidad y transferibilidad de los resultados como lo demuestran numerosos estudios realizados en laboratorios independientes y diferentes especies1,24,25; 2) las células de cerdo o bovino son factiblemente desechables sin el sacrificio de animales adicionales; 3) la disponibilidad de células especialmente porcinas y bovinas permite que grandes series de ensayos produzcan resultados sólidos; 4) el conocimiento para aislar, cultivar y modificar genéticamente células a partir de los modelos más utilizados permite realizar análisis in vivo en múltiples especies24,25,26 y,por lo tanto, ofrece una mejor relación riesgo-beneficio para los primeros pacientes tratados; 5) la flexibilidad del protocolo presentado permite su uso en diversos modelos y conjuntos experimentales y para todas las terapias basadas en células oculares con y sin ingeniería genética. Por el contrario, las técnicas alternativas como las líneas celulares o el tejido humano son solo de transferibilidad limitada y / o desechabilidad limitada. Las líneas celulares como el ARPE-19 son ideales para experimentos preliminares; sin embargo, la baja pigmentación y la alta proliferación difieren significativamente de las células primarias1. Las células RPE e IPE, que se aíslan del tejido de donantes humanos, ofrecen una fuente valiosa para experimentos in vitro transferibles; sin embargo, obtenemos tejido humano de un banco de ojos estadounidense, lo que significa que el tejido tiene al menos dos días de edad (después de la enucleación) y requiere un transporte largo y costoso, pero el tejido del donante local no está disponible en cantidades suficientes para una investigación productiva. La ventaja del uso de células primarias es confirmada por múltiples estudios de otros grupos27,28.
Para el desarrollo de una terapia génica no viral basada en células utilizando el sistema de transposones SB100X para transfectar células primarias de RPE e IPE con los genes que codifican para PEDF y / o GM-CSF para tratar nvAMD y aAMD, respectivamente29,30,31,32, primero establecimos la transfección de células ARPE-191 . A continuación, se establecieron los protocolos de aislamiento y transfección en células primarias bovinas y porcinas de fácil acceso. Ahora, se ha establecido el aislamiento y la transfección de células primarias de RPE e IPE de cinco especies diferentes, desde pequeños (como ratones) hasta grandes mamíferos (como ganado). Se confirmó en células primarias de RPE e IPE derivadas de ojos de donantes humanos30. La producción del ATMP conforme a las Buenas Prácticas de Fabricación (GMP) se validó utilizando también tejido de donante humano33. Finalmente, tanto la seguridad como la eficiencia del enfoque se evaluaron in vivo en tres especies diferentes para las que se ha adaptado el protocolo: ratón, rata y conejo. En la configuración clínica, se extraerá una biopsia de iris del paciente y las células IPE se aislarán y transfectarán en la sala limpia, antes de que las células se trasplanten subretinalmente al mismo paciente. Todo el proceso se llevará a cabo durante una sola sesión quirúrgica que dura aproximadamente 60 minutos. El desarrollo del enfoque de tratamiento y la evaluación de su eficiencia solicitaron excelentes modelos in vitro y ex vivo para implementar métodos de administración de genes robustos y eficientes, para analizar la eficiencia de la entrega de genes, la producción terapéutica de proteínas y los efectos neuroprotectores, y para producir trasplantes celulares para probar el enfoque in vivo1,24,25,29,30 . Cabe mencionar que la terapia cuenta con la aprobación ética para un ensayo de fase clínica Ib/IIa de la comisión ética para la investigación del Cantón de Ginebra (nº 2019-00250) y actualmente los últimos datos preclínicos solicitados para su autorización por las autoridades reguladoras suizas se recopilan utilizando el protocolo presentado. En este sentido, los datos preclínicos in vivo demostraron una reducción significativa de la NVC y una excelente seguridad24,25,31.
Aquí, se describe el aislamiento y cultivo de células RPE / IPE de bovinos, cerdos, conejos, ratas y ratones, y el uso del sistema integrador de transposones SB100X combinado con electroporación como un método eficiente de administración de genes. En particular, las células primarias de PE se transfectaron para sobreexpresar PEDF y GM-CSF. La recogida de estos protocolos permite realizar los estudios in vitro e in vivo en todas las fases preclínicas del desarrollo de ATMP. Además, la configuración tiene el potencial de adaptarse a otros genes de interés y enfermedades.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well plates</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>150687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>7657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine</td>
			<td>Mundipharma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bonn micro forceps flat</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri forceps (sterile)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/Ham`s F12</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drape (sterile)</td>
			<td>M&#246;lnlycke Health Care</td>
			<td>800530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation buffer 3P.14</td>
			<td>3P Pharmaceutical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Brunschwig</td>
			<td>P40-37500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (different size) (sterile)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze compress</td>
			<td>PROMEDICAL AG</td>
			<td>25403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl (0.9%)</td>
			<td>Laboratorium Dr. Bichsel AG</td>
			<td>1000090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle (18G)&#160;</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>TER-NN1838R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection kit 10 &#181;L</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK5000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber</td>
			<td>Marienfeld-superior</td>
			<td>640010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette (fire-polish)</td>
			<td>Witeg</td>
			<td>4100150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0781-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital (Thiopental Inresa)</td>
			<td>Ospedalia AG</td>
			<td>31408025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>150288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFAR4-PEDF</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFAR4-SB100X</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFAR4-Venus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Pastor et al., 2018. Kindly provided by Prof. Scherman and Prof. Marie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSB100X (250 ng/&#181;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>M&#225;t&#233;s et al., 2009. Provide by Prof. Izsvak</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pT2-CAGGS-Venus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Johnen et al., 2012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pT2-CMV-GMCSF-His plasmid DNA (250 ng/&#181;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cloned in our lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pT2-CMV-PEDF-His plasmid DNA (250 ng/&#181;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Pastor et al., 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scarpel no. 10</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scarpel no. 11</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp-sharp tip curved Extra Fine Bonn Scissors (sterile)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp-sharp tip straight Extra Fine Bonn Scissors (sterile)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tali Image-Based Cytometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>T10796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.25%&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25050014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 5%/EDTA 2%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas spring scissors curved (sterile)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture, and genetic engineering of mammalian primary pigment epithelial cells for non-viral gene therapy

La degeneración macular relacionada con la edad (DMAE) es la causa más frecuente de ceguera en pacientes >60 años, afectando a ~ 30 millones de personas en todo el mundo. La DMAE es una enfermedad multifactorial influenciada por factores ambientales y genéticos, que conducen a un deterioro funcional de la retina debido a la degeneración de las células epiteliales pigmentarias de la retina (EPR) seguida de la degradación de los fotorreceptores. Un tratamiento ideal incluiría el trasplante de células RPE sanas que secretan factores neuroprotectores para prevenir la muerte celular RPE y la degeneración de los fotorreceptores. Debido a las similitudes funcionales y genéticas y la posibilidad de una biopsia menos invasiva, se propuso el trasplante de células epiteliales pigmentarias del iris (IPE) como sustituto del EPR degenerado. La secreción de factores neuroprotectores por un bajo número de células trasplantadas subretinalmente se puede lograr mediante la transfección mediada por transposón de la Bella Durmiente (SB100X)con genes que codifican para el factor derivado del epitelio pigmentario (PEDF) y / o el factor estimulante de colonias de macrófagos granulocitos (GM-CSF). Establecimos el aislamiento, el cultivo y la transfección mediada por SB100Xde células RPE e IPE de varias especies, incluidos roedores, cerdos y ganado. Se explantan globos y se extrae la córnea y el cristalino para acceder al iris y la retina. Usando una espátula hecha a medida, las células IPE se eliminan del iris aislado. Para cosechar células RPE, se puede requerir una incubación de tripsina, dependiendo de la especie. Luego, usando espátula personalizada por RPE, las células se suspenden en medio. Después de la siembra, las células son monitoreadas dos veces por semana y, después de llegar a la confluencia, transfectadas por electroporación. La integración génica, la expresión, la secreción de proteínas y la función se confirmaron mediante ensayos qPCR, WB, ELISA, inmunofluorescencia y funcionales. Dependiendo de la especie, se pueden aislar 30.000-5 millones (RPE) y 10.000-1,5 millones de células (IPE) por ojo. Las células modificadas genéticamente muestran una sobreexpresión significativa de PEDF/GM-CSF con la capacidad de reducir el estrés oxidativo y ofrece un sistema flexible para análisis ex vivo y estudios in vivo transferibles a humanos para desarrollar enfoques de terapia génica ocular.

Aislamiento de EP de diferentes especies de mamíferos Utilizando los protocolos antes mencionados, las células IPE y RPE se aislaron y cultivaron con éxito de cinco especies diferentes. El número de células obtenidas de cada procedimiento depende de la especie y el tamaño del ojo (Tabla 1). Como se muestra en la Figura 1,las células muestran la morfología y pigmentación típica de las células de PE (a excepción de las células de conejo mostrad...

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Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy

Aquí, se presenta un protocolo para aislar y transfectar el iris primario y las células epiteliales pigmentarias de la retina de varios mamíferos (ratones, ratas, conejos, cerdos y bovinos). El método es ideal para estudiar los enfoques de terapia génica ocular en varias instalaciones para análisis ex vivo y estudios in vivo transferibles a humanos.

Aislamiento, cultivo e ingeniería genética de células epiteliales de pigmento primario de mamíferos para terapia génica no viral

Age-related macular degeneration (AMD) is the most frequent cause of blindness in patients &#62;60 years, affecting ~30 million people worldwide. AMD is a ...

El protocolo es significativo ya que muestra el aislamiento y la transfección de células epiteliales pigmentarias de cinco mamíferos como un sistema óptimo para estudiar la terapia génica ocular en diversas configuraciones. La principal ventaja de este método es su flexibilidad, transferibilidad, alto rendimiento celular, viabilidad y tasa de transfección debido a las cinco especies y al sistema de transposones SB100X no viral utilizado. Estas técnicas se han desarrollado para estudiar enfoques de terapia génica dirigidos a las células epiteliales pigmentarias de la retina y el iris, que están aisladas y transfectadas en el presente protocolo, pero que son utilizables para cualquier investigación ocular.Demostrando el procedimiento estará Gregg Sealy, un técnico del laboratorio. Después de la eutanasia del animal, use tijeras curvas y pórceps Colibri para enuclear los ojos, luego limpie el tejido muscular restante y la piel de los ojos. Recoja los ojos en un tubo de 50 mililitros lleno de PBS no estéril y transfiera el tubo a la campana de flujo laminar.Desinfecte sumergiéndolos en una solución a base de yodo durante dos minutos, luego transfiera los ojos a un tubo de 50 mililitros lleno de PBS estéril. Ponga un ojo en una compresa de gasa estéril y sostenga firmemente el ojo cerca del nervio óptico. Luego corte cerca del límite del iris con un bisturí número 11.Usando tijeras, corte alrededor del iris y retire el segmento anterior y colórelo en una placa de Petri, dejando el bulbo con el vítreo hasta que se aísle el epitelio pigmentario de la retina, o células RPE. Para aislar el epitelial pigmentario del iris, o células IPE, retire la lente con fórceps finos y extraiga delicadamente el iris que contiene las células IPE. Coloque el iris en una placa de Petri y lávelo con PBS estéril.Agregue 500 microlitros de tripsina al 0.25% e incube durante 10 minutos a 37 grados centígrados. Retire la tripsina, agregue 500 microlitros de medio completo y raspe el IPE delicadamente con una pipeta Pasteur plana y pulida al fuego. Recoja la suspensión celular y colóquela en un tubo de 1,5 mililitros.Cuente las células usando la cámara de Neubauer y sise 0.2 millones de células por pozo en una placa de 24 pozos con un mililitro de medio completo. Coloque la placa en una incubadora y cultíquela a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Para aislar las células RPE, retire el humor vítreo y la retina del segmento posterior con forrórceps delgados.Coloque los bulbos en la placa de 24 pozos y agregue 500 microlitros de tripsina al 0.25% por ojo e incube durante 10 minutos a 37 grados centígrados. Retire la tripsina, agregue 500 microlitros de medio completo por globo y raspe las células de RPE delicadamente con una pipeta Pasteur curva y pulida al fuego. Recoja la suspensión celular y colóquela en un tubo de 1,5 mililitros.Cuente las células usando la cámara de Neubauer y semble las células como se describió anteriormente. Coloque la placa en la incubadora. Limpie el tejido muscular restante y la piel de los ojos y desinfecte los ojos en una solución a base de yodo y enjuáguelos con PBS.Para aislar las células IPE, retire la lente y extraiga el iris como se describió anteriormente. Después de preparar dos iris, agregue un mililitro de medio completo y aísle las células rascando con una pipeta Pasteur plana y pulida al fuego, luego cuente y seme las células. Coloque la placa en la incubadora.Para aislar las células RPE, retire el vítreo y la retina del segmento posterior y coloque el bulbo en una placa de Petri. Llene la bombilla con un medio completo de mililitros. Con una pipeta Pasteur curva y pulida al fuego, retire las celdas de RPE.Recoja la suspensión celular dentro de la bombilla con una pipeta de 1.000 microlitros y transfiérala a un tubo de 1,5 mililitros para su resuspensión. Luego cuente y sese las células e incube la placa como se demostró anteriormente. Después de la limpieza, abra el ojo y corte alrededor del iris para eliminar el segmento anterior, luego coloque una placa de Petri.Deje el bulbo con el vítreo hasta que se aíslan las células RPE. Para aislar las células IPE, si la lente viene con el segmento anterior, retire la lente y use fórceps finos para extraer delicadamente el iris que contiene las células IPE. Coloque el iris en una placa de Petri y lávelo con PBS estéril.Cortar el cuerpo ciliar con un bisturí número 10. Después de preparar los iris, incube con dos mililitros de tripsina al 0,25% a 37 grados centígrados durante 10 minutos. Retire la tripsina y agregue dos mililitros de medio completo, luego aísle las células rascando con una pipeta Pasteur plana y pulida al fuego.Transfiera la suspensión celular a un tubo de dos mililitros y centrifute las células durante 10 minutos a 120 veces G.Deseche el sobrenadante y vuelva a colocar las células en dos mililitros de medio completo. Seed 0,32 millones de células por pozo en una placa de seis pozos en tres mililitros de medio completo. Coloque la placa en una incubadora y cultíquela a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.Para aislar las células RPE, retire el humor vítreo y la retina del segmento posterior con pórceps. Evite dañar el epitelio pigmentario de la retina. Lave la bombilla con PBS.Después de preparar ambos ojos, llene el bulbo aproximadamente tres cuartos llenos de tripsina e incube durante 25 minutos a 37 grados centígrados con la tapa de la placa de Petri en la parte superior del ojo del bulbo. Retire la tripsina y agregue un mililitro de medio completo. Con una pipeta Pasteur curva y pulida al fuego, retire las celdas de RPE.Recoja la suspensión celular dentro de la bombilla y transfiérala a un tubo de 1,5 mililitros para su resuspensión. Centrifugar las células durante 10 minutos a 120 veces G.Seed 0.32 millones de células por pozo en una placa de seis pozos en tres mililitros de medio completo. Coloque la placa en una incubadora y cultíquela a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.Culta las células a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono en una incubadora humidificada. Después de tres o cuatro días, pipetee hacia arriba y hacia abajo para recolectar células no adherentes y coloque la mitad del volumen en otro pozo. Llene el pozo a un mililitro con medio completo.Después de otros tres o cuatro días, repita la recolección de células, esta vez agrupando las células no adherentes de dos pozos en uno. Agregue medio a todos los pozos. Observe las células y cambie el medio dos veces por semana.Cuando las células alcancen la confluencia, cambie a un medio completo con 1% FBS. Utilizando los protocolos antes mencionados, las células IPE y RPE se aislaron y cultivaron con éxito de cinco especies diferentes. El patrón de expresión de RPE se confirmó en células IPE bovinas primarias por inmunofluorescencia para RPE65.Se estudió la viabilidad celular para excluir una toxicidad potencial del tampón de electroporación utilizando un kit de ensayo de citotoxicidad disponible comercialmente y un control electroporado de nudo. No se observó impacto en la viabilidad celular. Las células epiteliales pigmentarias precultivadas de diferentes especies fueron transfectadas con la proteína amarilla fluorescente venusna.Se utilizaron células RPE19 transfectadas como control positivo. La cuantificación de la eficiencia de transfección en RPE de cerdo precultivo se muestra aquí. Las células epiteliales pigmentarias de conejo recién aisladas fueron transfectadas con la proteína fluorescente amarilla Venus y fueron monitoreadas por microscopía.Las células epiteliales pigmentarias fueron transfectadas con factor derivado del epitelio pigmentario y la secreción de proteínas fue monitoreada por Western blot. La señal para las células transfectadas fue mayor en comparación con las células no transfectadas para todas las especies y días estudiados, y no se observó una disminución en la secreción de proteínas dentro de este tiempo. Es crucial evitar raspar las células con herramientas afiladas.Aquí, se utilizan pipetas Pasteur pulidas al fuego, excepto en pequeños ojos de ratón, donde se debe usar un bisturí redondo. Las células epiteliales pigmentarias se pueden utilizar para desarrollar enfoques de terapia génica y para simular condiciones patológicas, por ejemplo, el daño por estrés oxidativo. Estos modelos también se pueden utilizar para probar fármacos terapéuticos.

Research

JoVE Journal

Biology

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Investigación

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Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Aislamiento y cultivo de ratón primarias células acinares pancreáticas

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Aislamiento y cultivo primario de células endoteliales aórticas de ratón

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

Aislamiento y cultivo de células endoteliales aórticas primarias de cerdos en miniatura

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...