Name: isolation, culture, and genetic engineering of mammalian primary pigment epithelial cells for non-viral gene therapy
Uploaded: 2021-02-26T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy at JoVE.com

Ett tack förtjänar till Gregg Sealy och Alain Conti för deras utmärkta tekniska hjälp. Detta arbete stöddes av Europeiska kommissionen inom ramen för det sjunde ramprogrammet, Den schweiziska nationella vetenskapsstiftelsen och Schmieder-Bohrisch-stiftelsen. Z.I. fick finansiering från Europeiska forskningsrådet, ERC Advanced [ERC-2011-ADG 294742] och B.M.W. från ett Fulbright Research Grant och Swiss Government Excellence Scholarship.

De protokoll i vilka djur var inblandade utfördes av certifierad personal och efter godkännande av det kantonala Département de la sécurité, de l'emploi et de la santé (DSES), Domaine de l'expérimentation animale i Genève, Schweiz, och enligt ARVO-uttalandet om användning av djur i oftalmisk forskning och visionsforskning (godkännande nr. GE/94/17). Vuxna friska bruna norge råttor, C57BL/6 möss och Nya Zeeland vita kaniner avlivades genom en överdos av Pentobarbital (150 mg/kg) utspädd i 0,9% NaCl injiceras...

Att ha standardiserade metoder för att isolera och odla PE-celler är grundläggande för att utveckla nya terapimetoder för retinala degenerativa sjukdomar. Med de protokoll som presenteras här kan PE-celler framgångsrikt isoleras från olika arter och odlas under långa perioder (hittills har den längsta kulturen upprätthållits i 2 år1,38); typisk PE-cellmorfologi, pigmentering och funktion observerades (figur 1, <strong cl...

Vår grupp fokuserar på utveckling av regenerativa metoder för att behandla neuroretinal degeneration, det vill säga AMD, genom RPE- och IPE-baserad icke-viral genterapi. Den prekliniska etableringen av sådana terapier kräver in vitro-modeller som kan överföras till människor. Således är målet med studien som presenteras här att leverera protokoll för isolering, kultur och genteknik av primära RPE- och IPE-celler. Motiveringen för att fastställa isoleringen av PE-celler från flera arter är att på ett robust sätt bekräfta säkerheten och effektiviteten i tillvägagångssättet och öka dess reproducerbarhet och överförbarhet. Den tillgängliga humana RPE-cellinjen ARPE-19 skiljer sig från primärceller (t.ex. de är mindre pigmenterade) och är därför endast av begränsat värde för prekliniska analyser1. Dessutom kan icke-mänskliga däggdjursceller köpas för mindre kostnad och i större mängder; mänsklig donatorvävnad kan erhållas från olika eyebanks, men tillgängligheten är begränsad och dyr. Slutligen måste nya läkemedel för avancerad terapi (ATMP, dvs. cell-, vävnads- eller genterapiläkemedel) appliceras på minst två olika arter innan de testas på patienter och dessa in vivo-studier kräver att allogena celltransplantationer förbereds.
Retinal neurodegenerativa sjukdomar är den ledande orsaken till blindhet i industrialiserade länder, bestående av vanliga sjukdomar som AMD, liksom sällsynta sjukdomar som retinitis pigmentosa, där retinalcellens död så småningom leder till blindhet. RPE-celler, fotoreceptor och retinal ganglion celler (RGC) skador kan i vissa fall bromsas, men det finns för närvarande inga botande terapier tillgängliga. ATMPs erbjuder potential att korrigera gendefekter, integrera terapeutiska gener eller ersätta degenererade celler, vilket möjliggör utveckling av regenerativa och botande terapier för sjukdomar som AMD; 13 genterapier har redan fått godkännande för försäljning inklusive en behandling för att behandla RPE65 mutationsassocierad retinal degeneration2,3. Bland äldre vuxna (>60 år) påverkas ~ 30 miljoner människor över hela världen av antingen neovaskulära (nvAMD) eller avascular (aAMD) AMD4. Båda formerna framkallas av åldersrelaterade utlösare inklusive oxidativ skada, funktionsnedsättning och förlust av RPE-celler följt av fotoreceptornedbrytning, bland annat (t.ex. genetiska risk alleler, rökning, högt blodtryck)5,6. I nvAMD förvärras patogenesen av en obalans av angiogena och anti-angiogena faktorer till förmån för den angiogena vaskulär endotel tillväxtfaktorn (VEGF) som inducerar choroidal neovascularization (CNV). Hittills kan endast nvAMD behandlas med månatliga intravitreala injektioner av hämmare av VEGF-proteinet för att undertrycka CNV; ingen effektiv behandling ännu är tillgänglig för aAMD6,7.
Flera studier utvärderade cellbaserade terapier för att ersätta anti-VEGF-behandlingen: studier gjorda av Binder et al., där nyskördade autologa RPE-celler transplanterades till patienter med nAMD8,9,10, visade måttlig visuell förbättring, men endast en liten grupp patienter nådde en slutlig synskärpa tillräckligt hög för att möjliggöra läsning. Nyligen använde en klinisk fas I-studie ett embryonalt stamcellsbaserat RPE-plåster för att behandla AMD med lovande resultat; RPE-plåstrets effekt, stabilitet och säkerhet i upp till 12 månader hos 2 av de 10 behandlade patienterna11. Dessutom har flera grupper publicerat studier där autologa RPE-Bruchs membran-choroid fläckar skördades från den perifera näthinnan och transplanterades till makula12,13,14; och inducerad pluripotent stamcell (iPSC)-härledda RPE plåster genererades för transplantation15. För aAMD har antikroppar riktade mot komplementvägen testats i kliniska prövningar6,16 och en fas I-studie med en enda intravitreal injektion av en adenoassocierad virusvektor (AAV) som kodar genen för faktorn CD59 (AAVCAGsCD59) hos patienter med geografisk atrofi (GA) slutfördes17; fas II-studien har nyligen påbörjats och syftar till att rekrytera 132 patienter med avancerad aAMD och att utvärdera utfallet vid 2 år efter intervention18. Slutligen har FocuS-studiegruppen inlett en klinisk fas I/II-studie med multicenter som utvärderar säkerheten, dosresponsen och effekten hos en rekombinant icke-replikerande AAV-vektor som kodar för ett mänskligt komplementfaktor19.
I första hand är målet med en regenerativ AMD-terapi transplantation av funktionella RPE-celler, som skadades eller förlorades. IPE- och RPE-celler delar dock många funktionella och genetiska likheter (t.ex. fagocytos och retinolmetabolism), och eftersom IPE-celler är mer genomförbara skördade har de föreslagits som ett RPE-substitut20. Även om det tidigare har visats att IPE-celltransplantationen fördröjer fotoreceptordegeneration i djurmodeller21,22 och stabiliserar den visuella funktionen hos patienter med slutfas nvAMD, observerades ingen signifikant förbättring hos dessa patienter23. Bristen på effekt kan bero på det låga antalet transplanterade celler och/eller obalansen av neuroprotektiva näthinnefaktorer. Ett alternativt tillvägagångssätt skulle vara att transplantera transfected pigment epitelial celler som överuttryck neuroprotektiva faktorer för att återställa retinal homeostas, upprätthålla återstående RPE celler och skydda photoreceptors och RGCs från degeneration. Följaktligen föreslår vi en ny terapi som omfattar transplantation av funktionella RPE- eller IPE-celler som har genomgått genteknik för att utsöndra neuroprotektiva och anti-angiogena proteiner, såsom PEDF, GM-CSF eller insulinliknande tillväxtfaktorer (IGF). Fördelen med att utveckla och analysera detta tillvägagångssätt hos flera arter istället för att använda en cellinje, endast en art eller mänsklig vävnad är: 1) ökad reproducerbarhet och överförbarhet av resultaten som framgår av många studier som realiseras i oberoende laboratorier och olika arter1,24,25; 2) Gris- eller nötkreatursceller är möjliga engångsceller utan att ytterligare djur offras. 3) Tillgången till särskilt svin- och nötkreatursceller gör det möjligt för stora testserier att ge robusta resultat. 4) Kunskapen om att isolera, odla och genetiskt modifiera celler från de mest använda modellerna möjliggör in vivo-analyser hos flera arter24,25,26 och erbjuder därmed ett förbättrat risk-nyttoförhållande för de första behandlade patienterna. 5) Flexibiliteten i det protokoll som presenteras gör det möjligt att använda det i olika modeller och experimentella upplägg och för alla okulära cellbaserade terapier med och utan genteknik. Alternativa tekniker som cellinjer eller mänsklig vävnad är däremot endast av begränsad överförbarhet och/eller begränsad disposabilitet. Cellinjer som ARPE-19 är idealiska för preliminära experiment; Låg pigmentering och hög spridning skiljer sig dock avsevärt från primärcellerna1. RPE- och IPE-celler, som är isolerade från mänsklig donatorvävnad, erbjuder en värdefull källa för överförbara in vitro-experiment. Vi får dock mänsklig vävnad från en amerikansk-amerikansk ögonbank vilket innebär att vävnaden är minst två dagar gammal (efter enucleation) och kräver en lång och dyr transport, men lokal donatorvävnad är inte tillgänglig i tillräckliga mängder för en produktiv forskning. Fördelen med användning av primärceller bekräftas av flera studier från andra grupper27,28.
För utveckling av en cellbaserad icke-viral genterapi med hjälp av SB100X transposonsystem för transfektering av primära RPE- och IPE-celler med generna som kodar för PEDF och/eller GM-CSF för att behandla nvAMD respektive aAMD, respektive29,30,31,32,fastställde vi först transfektionen av ARPE-19 celler1 . Därefter fastställdes isolerings- och transfektion protokollen i lättillgängliga bovin och svin primära celler. Nu har isolering och transfektion av primära RPE- och IPE-celler från fem olika arter etablerats, från små (som mus) till stora däggdjur (som nötkreatur). Det bekräftades i primära RPE- och IPE-celler som härrör från mänskliga donatorögon30. Produktionen av god tillverkningssed (GMP) av ATMP validerades med hjälp av mänsklig donatorvävnad samt33. Slutligen bedömdes både säkerhet och effektivitet i tillvägagångssättet in vivo i tre olika arter för vilka protokollet har anpassats: mus, råtta och kanin. I den kliniska installationen kommer en irisbiopsi att skördas från patienten och IPE-celler kommer att isoleras och transfekteras i renrummet, innan cellerna transplanteras subretinally tillbaka till samma patient. Hela processen kommer att ske under en enda kirurgisk session som varar cirka 60 minuter. Utvecklingen av behandlingsmetoden och utvärderingen av dess effektivitet begärde utmärkta in vitro- och ex vivo-modeller för att implementera robusta och effektiva genleveransmetoder, analysera effektiviteten hos genleverans, terapeutisk proteinproduktion och neuroprotektiva effekter och för att producera celltransplantationer för att testa tillvägagångssättet in vivo1,24,25,29,30 . Det är värt att nämna att behandlingen har det etiska godkännandet för en klinisk fas Ib/ IIa-studie från den etiska kommissionen för forskning i kantonen Genève (nr 2019-00250) och för närvarande sista prekliniska data som begärts för godkännande av schweiziska tillsynsmyndigheter samlas in med hjälp av det presenterade protokollet. I detta avseende visade prekliniska in vivo-data en signifikant minskning av CNV och utmärkt säkerhet24,25,31.
Här beskrivs isoleringen och kulturen av RPE/IPE-celler från nötkreatur, gris, kanin, råtta och mus och användningen av det integrativa SB100X transposon-systemet i kombination med elektroporation som en effektiv genleveransmetod. Särskilt primära PE celler transfected för att överuttryck PEDF och GM-CSF. Insamlingen av dessa protokoll gör det möjligt att genomföra in vitro- och in vivo-studierna i alla prekliniska faser av ATMP-utveckling. Dessutom har upplägget potential att anpassas till andra gener av intresse och sjukdomar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well plates</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>150687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>7657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine</td>
			<td>Mundipharma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bonn micro forceps flat</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri forceps (sterile)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/Ham`s F12</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drape (sterile)</td>
			<td>M&#246;lnlycke Health Care</td>
			<td>800530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation buffer 3P.14</td>
			<td>3P Pharmaceutical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Brunschwig</td>
			<td>P40-37500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (different size) (sterile)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze compress</td>
			<td>PROMEDICAL AG</td>
			<td>25403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl (0.9%)</td>
			<td>Laboratorium Dr. Bichsel AG</td>
			<td>1000090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle (18G)&#160;</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>TER-NN1838R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection kit 10 &#181;L</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK5000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber</td>
			<td>Marienfeld-superior</td>
			<td>640010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette (fire-polish)</td>
			<td>Witeg</td>
			<td>4100150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0781-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital (Thiopental Inresa)</td>
			<td>Ospedalia AG</td>
			<td>31408025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>150288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFAR4-PEDF</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFAR4-SB100X</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFAR4-Venus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Pastor et al., 2018. Kindly provided by Prof. Scherman and Prof. Marie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSB100X (250 ng/&#181;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>M&#225;t&#233;s et al., 2009. Provide by Prof. Izsvak</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pT2-CAGGS-Venus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Johnen et al., 2012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pT2-CMV-GMCSF-His plasmid DNA (250 ng/&#181;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cloned in our lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pT2-CMV-PEDF-His plasmid DNA (250 ng/&#181;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Pastor et al., 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scarpel no. 10</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scarpel no. 11</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp-sharp tip curved Extra Fine Bonn Scissors (sterile)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp-sharp tip straight Extra Fine Bonn Scissors (sterile)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tali Image-Based Cytometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>T10796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.25%&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25050014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 5%/EDTA 2%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas spring scissors curved (sterile)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture, and genetic engineering of mammalian primary pigment epithelial cells for non-viral gene therapy

Åldersrelaterad makuladegeneration (AMD) är den vanligaste orsaken till blindhet hos patienter >60 år, vilket påverkar ~ 30 miljoner människor över hela världen. AMD är en multifaktoriell sjukdom som påverkas av miljömässiga och genetiska faktorer, som leder till funktionella nedskrivningar av näthinnan på grund av att retinal pigment epitelial (RPE) cell degeneration följt av photoreceptor nedbrytning. En idealisk behandling skulle omfatta transplantation av friska RPE celler utsöndrar neuroprotektiva faktorer för att förhindra RPE cell död och photoreceptor degeneration. På grund av funktionella och genetiska likheter och möjligheten till en mindre invasiv biopsi, föreslogs transplantation av iris pigment epitelial (IPE) celler som ersättning för de urartade RPE. Utsöndring av neuroprotektiva faktorer med ett lågt antal subretinally transplanterade celler kan uppnås genom Törnrosa (SB100X) transposonmedierad transfektion med gener som kodar för pigmentet epitel-härledd faktor (PEDF) och/eller granulocyt makrofagkolonistimulerande faktor (GM-CSF). Vi etablerade isolering, kultur och SB100X-medieradtransfektion av RPE- och IPE-celler från olika arter inklusive gnagare, grisar och nötkreatur. Jordglober explanteras och hornhinnan och linsen avlägsnas för att komma åt iris och näthinnan. Med hjälp av en specialtillverkad spatel avlägsnas IPE-celler från den isolerade iris. För att skörda RPE-celler kan en trypsininkubation krävas, beroende på arten. Sedan, med hjälp av RPE-anpassad spatel, suspenderas cellerna i medium. Efter sådd övervakas cellerna två gånger i veckan och, efter att ha nått sammanflöde, transfected av elektroporation. Gen integration, uttryck, protein utsöndring och funktion bekräftades av qPCR, WB, ELISA, immunofluorescens och funktionella analyser. Beroende på arten kan 30 000-5 miljoner (RPE) och 10 000-1,5 miljoner (IPE) celler isoleras per öga. Genetiskt modifierade celler visar betydande PEDF/GM-CSF överuttryck med kapacitet att minska oxidativ stress och erbjuder ett flexibelt system för ex vivo-analyser och in vivo-studier som kan överföras till människor för att utveckla okulära genterapimetoder.

PE isolering från olika däggdjursarter Med hjälp av ovannämnda protokoll isolerades IPE- och RPE-celler framgångsrikt från fem olika arter. Antalet celler som erhålls från varje förfarande beror på ögats art och storlek(tabell 1). Som visas i figur 1visar cellerna typisk PE-cellmorfologi och pigmentering (med undantag för kaninceller som visas, härledda från albino Nya Zeelands vita (NZW) kaniner). Vid 21 dagar efter isoleringen är cellerna...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy at JoVE.com

Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy

Här presenteras ett protokoll för att isolera och transfektera primära iris och retinal pigment epitelial celler från olika däggdjur (möss, råtta, kanin, gris och nötkreatur). Metoden är idealisk för att studera okulära genterapimetoder i olika upplägg för ex vivo-analyser och in vivo-studier som kan överföras till människor.

Isolering, kultur och genteknik av däggdjurs primära pigment epitelceller för icke-viral genterapi

Age-related macular degeneration (AMD) is the most frequent cause of blindness in patients &#62;60 years, affecting ~30 million people worldwide. AMD is a ...

Protokollet är betydande eftersom det visar isolering och transfection av pigment epitelial celler från fem däggdjur som ett optimalt system för att studera okulär genterapi i olika inställningar. Den största fördelen med denna metod är dess flexibilitet, överförbarhet, höga cellutbyte, livskraft och transfekteringsgrad på grund av de fem arter och det icke-virala SB100X-transponeringssystemet som används. Dessa tekniker har utvecklats för att studera genterapi metoder riktade retinal och iris pigment epitelial celler, som är isolerade och transfected i detta protokoll, men är användbara för all okulär forskning.Gregg Sealy, en tekniker från laboratoriet, demonstrerar proceduren. Efter avlivning av djuret, använd böjd sax och Colibri-tång för att enukleera ögonen och rengör sedan den återstående muskelvävnaden och huden från ögonen. Samla ögonen i ett 50 ml rör fyllt med icke-steril PBS och överför röret till den laminära flödeshuven.Desinficera dem genom att dränka i jodbaserad lösning i två minuter och överför sedan ögonen till ett 50 ml rör fyllt med steril PBS. Sätt ett öga på en steril gasbindning och håll ögat ordentligt nära synnerven. Skär sedan nära irisgränsen med en skalpell nummer 11.Använd sax, skär runt iris och ta bort det främre segmentet och lägg det i en Petri-maträtt och lämna glödlampan med glaskroppen tills näthinnepigmentet epitelial, eller RPE-celler, isoleras. För att isolera irispigment epitelceller, eller IPE-celler, ta bort linsen med fina tångar och försiktigt dra ut iris som innehåller IPE-cellerna. Placera iris i en Petri-skål och tvätta den med steril PBS.Tillsätt 500 mikroliter på 0,25% trypsin och inkubera i 10 minuter vid 37 grader Celsius. Ta bort trypsin, tillsätt 500 mikroliter av komplett medium och skrapa IPE försiktigt med en platt, brandpolerad Pasteur-pipett. Samla cellfjädringen och lägg den i ett 1,5 ml rör.Räkna cellerna med Neubauer-kammaren och frö 0,2 miljoner celler per brunn i en 24-brunnsplatta med en milliliter komplett medium. Placera plattan i en inkubator och odla den vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid. För att isolera RPE-celler, ta bort glasaktig humor och näthinna från det bakre segmentet med tunna tångar.Sätt glödlamporna i 24-brunnsplattan och tillsätt 500 mikroliter på 0,25% trypsin per öga och inkubera i 10 minuter vid 37 grader Celsius. Ta bort trypsin, tillsätt 500 mikroliter komplett medium per jordglob och skrapa RPE-cellerna försiktigt med en krökt, brandpolerad Pasteur-pipett. Samla cellfjädringen och lägg den i ett 1,5 ml rör.Räkna cellerna med Neubauer-kammaren och så cellerna enligt beskrivningen tidigare. Placera plattan i inkubatorn. Rengör återstående muskelvävnad och hud från ögonen och desinficera ögonen i jodbaserad lösning och skölj dem med PBS.För att isolera IPE-celler, ta bort linsen och dra ut iris som beskrivits tidigare. Efter att ha förberett två iris, tillsätt en milliliter komplett medium och isolera cellerna genom att skrapa med en platt, brandpolerad Pasteur pipetter, räkna och frö cellerna. Placera plattan i inkubatorn.För att isolera RPE-celler, ta bort glaskroppen och näthinnan från det bakre segmentet och placera glödlampan i en Petri-maträtt. Fyll glödlampan med ett milliliter komplett medium. Ta bort RPE-cellerna med hjälp av en böjd, brandpolerad Pasteur-pipett.Samla cellupphängningen i glödlampan med en 1 000 mikroliterpipett och överför den till ett 1,5 ml rör för resuspension. Räkna sedan och frö cellerna och inkubera plattan som tidigare visats. Efter rengöring, öppna ögat och skär runt iris för att ta bort det främre segmentet och lägg sedan i en Petri-maträtt.Lämna glödlampan med glaskroppen tills RPE-cellerna är isolerade. För att isolera IPE-celler, om linsen levereras med det främre segmentet, ta bort linsen och använd fina tångar för att försiktigt dra ut iris som innehåller IPE-cellerna. Placera iris i en Petri-skål och tvätta den med steril PBS.Skär ciliary kroppen med en skalpell nummer 10. Efter att ha förberett iris, inkubera dem med två milliliter på 0,25% trypsin vid 37 grader Celsius i 10 minuter. Ta bort trypsin och tillsätt två milliliter komplett medium och isolera sedan cellerna genom att skrapa med en platt, brandpolerad Pasteur-pipett.Överför cellfjädringen till ett två milliliterrör och centrifugera cellerna i 10 minuter vid 120 gånger G.Kassera supernatanten och återanvänd cellerna i två milliliter komplett medium. Frö 0,32 miljoner celler per brunn i en sex brunnsplatta i tre milliliter komplett medium. Placera plattan i en inkubator och odla den vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid.För att isolera RPE-celler, ta bort glasaktig humor och näthinna från det bakre segmentet med tång. Undvik att skada näthinnepigmentet epitel. Tvätta glödlampan med PBS.Efter att ha förberett båda ögonen, fyll glödlampan ungefär tre fjärdedelar full med trypsin och inkubera i 25 minuter vid 37 grader Celsius med Petri-disklocket ovanpå glödlampans öga. Ta bort trypsin och tillsätt en milliliter komplett medium. Ta bort RPE-cellerna med hjälp av en böjd, brandpolerad Pasteur-pipett.Samla cellfjädringen i glödlampan och överför den till ett 1,5 ml rör för resuspension. Centrifugera cellerna i 10 minuter vid 120 gånger G.Seed 0,32 miljoner celler per brunn i en sex brunnsplatta i tre milliliter komplett medium. Placera plattan i en inkubator och odla den vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid.Odla cellerna vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid i en fuktad inkubator. Efter tre till fyra dagar, pipetter upp och ner för att samla icke-arvsceller och lägg hälften av volymen i en annan brunn. Fyll brunnen till en milliliter med komplett medium.Efter ytterligare tre till fyra dagar upprepar du cellsamlingen, den här gången slår du samman de icke-arvscellerna från två brunnar till en. Lägg till medium till alla brunnar. Observera cellerna och byt medium två gånger per vecka.När cellerna når sammanflöde, byt till komplett medium med 1%FBS. Med hjälp av ovannämnda protokoll isolerades IPE- och RPE-celler framgångsrikt från fem olika arter. RPE uttrycksmönstret bekräftades i primära bovin IPE celler genom immunofluorescens för RPE65.Cellens livskraft studerades för att utesluta en potentiell toxicitet hos elektroporationsbufferten med hjälp av en kommersiellt tillgänglig cytotoxicitetsanalyssats och en knut elektroporerad kontroll. Ingen påverkan på cellens livskraft observerades. Precultured pigment epitelial celler från olika arter transfected med den gula fluorescerande Venus proteinet.Transfected RPE19 celler användes som en positiv kontroll. Kvantifieringen av transfekteringseffektiviteten i förkultad gris RPE visas här. Nyisolerade kaninpigment epitelial celler transfected med det gula fluorescerande proteinet Venus och övervakades av mikroskopi.Pigment epitelial celler var transfected med pigment epitel härledda faktor och protein sekrende övervakades av västra blot. Signalen för transfectedceller var högre jämfört med icke-transfekterade celler för alla arter och dagar studerade, och ingen minskning av proteinsekresion observerades inom denna tid. Det är viktigt att undvika att skrapa cellerna med vassa verktyg.Här används brandpolerade Pasteur pipetter, utom i små musögon, där en rund skalpell måste användas. Pigment epitelceller kan användas för att utveckla genterapimetoder och för att simulera patologiska tillstånd, till exempel oxidativ stressskada. Dessa modeller kan också användas för att testa terapeutiska läkemedel.

Research

JoVE Journal

Biology

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

Kultur av myeloisk dendritiska celler från benmärg prekursorer

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Isolering och odling av celler från Nefrogen Zonen av embryonala Mouse Kidney

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

Isolering och odling av vuxna Epithelial stamceller från mänskliga Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Ett system för odling Iris Pigment epitelceller att studera Lens Regenerering vid Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex vivo Kultur av primära humana äggledaren epitelceller

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Induktion och testning av Hypoxi i cellodling

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Isolering och Primär kultur av celler Rat Hepatiska

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Isolering och odling av mus Primära bukspottkörtel Acinar

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolering och Primär kultur av mus aortaendotelceller

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

Isolering och kultur av primära aortic endotelceller från miniatyr svin

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...