Name: isolation, culture, and genetic engineering of mammalian primary pigment epithelial cells for non-viral gene therapy
Uploaded: 2021-02-26T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy at JoVE.com

Gregg Sealy ve Alain Conti'ye mükemmel teknik yardımları için bir teşekkürü hak ediyor. Bu çalışma Avrupa Komisyonu tarafından Yedinci Çerçeve Programı, İsviçre Ulusal Bilimler Vakfı ve Schmieder-Bohrisch Vakfı bağlamında desteklenmiştir. Z.I., Avrupa Araştırma Konseyi, ERC Advanced [ERC-2011-ADG 294742] ve B.M.W.'den Fulbright Araştırma Hibesi ve İsviçre Hükümeti Mükemmellik Bursu'ndan fon aldı.

Hayvanların dahil olduğu protokoller sertifikalı personel tarafından ve kantonel Département de la sécurité, de l'emploi et de la santé (DSES), İsviçre'nin Cenevre'deki Domaine de l'expérimentation hayvanı tarafından yetkilendirilmesinden sonra ve ARVO Oftalmik ve Vizyon Araştırmalarında Hayvanların Kullanımına İlişkin Bildiri'ye göre gerçekleştirildi (onay no. GE/94/17). Yetişkin sağlıklı Kahverengi Norveç sıçanları, C57BL / 6 fareler ve Yeni Zelanda beyaz tavşanları,% 0.9 NaCl enjekte ...

PE hücrelerini izole etmek ve kültüre etmek için standart yöntemlere sahip olmak, retina dejeneratif hastalıklar için yeni tedavi yaklaşımları geliştirmek için temeldir. Burada sunulan protokoller ile PE hücreleri farklı türlerden başarıyla izole edilebilir ve uzun süre kültürlenebilir (şimdiye kadar en uzun kültür 2 yıl boyunca korundu1,38); tipik PE hücre morfolojisi, pigmentasyonu ve fonksiyonu gözlenmiştir (Şek...

Grubumuz, nöroretinal dejenerasyon, yani AMD'yi RPE ve IPE tabanlı viral olmayan gen tedavisi ile tedavi etmek için rejeneratif yaklaşımların geliştirilmesine odaklanmaktadır. Bu tür tedavilerin klinik öncesi kurulması, insana aktarılabilir in vitro modelleri gerektirir. Bu nedenle, burada sunulan çalışmanın amacı, birincil RPE ve IPE hücrelerinin izolasyonu, kültürü ve genetik mühendisliği için protokoller sunmaktır. PE hücrelerinin birden fazla türden izolasyonunu belirlemenin gerekçesi, yaklaşımın güvenliğini ve verimliliğini sağlam bir şekilde onaylamak ve tekrarlanabilirliğini ve aktarılabilirliğini artırmaktır. Mevcut insan RPE hücre hattı ARPE-19 birincil hücrelerden farklıdır (örneğin, daha az pigmentlidirler) ve bu nedenle, klinik öncesi analizler için sadece sınırlıdeğerdedir 1. Ek olarak, insan olmayan memeli hücreleri daha az maliyetle ve daha büyük miktarlarda satın alınabilir; insan donör dokusu çeşitli Göz Bankalarından elde edilebilir, ancak kullanılabilirliği sınırlı ve pahalıdır. Son olarak, yeni İleri Terapi Tıbbi Ürünlerinin (ATMP, yani hücre, doku veya Gen Terapisi Tıbbi Ürünü) hastalarda test edilmeden önce en az iki farklı türde uygulanması gerekir ve bu in vivo çalışmalar allojenik hücre nakillerinin hazırlanmasını talep eder.
Retinal nörodejeneratif hastalıklar, AMD gibi yaygın hastalıkların yanı sıra retina hücre ölümünün sonunda körlüğe yol açtığı retinitis pigmentosa gibi nadir hastalıklardan oluşan endüstriyel ülkelerde körlüğün önde gelen nedenidir. RPE hücreleri, fotoreceptör ve retinal ganglion hücreleri (RGC) hasarı bazı durumlarda yavaşlatılabilir, ancak şu anda iyileştirici tedavi yoktur. ATMP'ler gen kusurlarını düzeltme, terapötik genleri entegre etme veya dejenere hücreleri değiştirme potansiyeli sunar, böylece AMD gibi hastalıklar için rejeneratif ve iyileştirici tedavilerin geliştirilmesini sağlar; RPE65 mutasyonu ile ilişkili retina dejenerasyonu 2,3tedavisi de dahil olmak üzere13gen tedavisi zaten pazarlama onayı aldı. Yaşlı yetişkinler arasında (>60 yıl), dünya çapında yaklaşık 30 milyon kişi neovasküler (nvAMD) veya avasküler (aAMD) AMD4'denetkilenir. Her iki form da oksidatif hasar, fonksiyon bozukluğu ve RPE hücrelerinin kaybı ve ardından fotoreceptör bozulması dahil olmak üzere yaşa bağlı tetikleyiciler tarafından indüklenir, diğerleri arasında (örneğin genetik risk alelleri, sigara, hipertansiyon)5,6. NvAMD'de patogenez, koroidal neovaskülarizasyona (CNV) neden olan anjiyojenik Vasküler Endotel Büyüme Faktörü (VEGF) lehine anjiyojenik ve anti-anjiyojenik faktörlerin dengesizliği ile ağırlaşır. Bugüne kadar, sadece nvAMD, CNV'yi bastırmak için VEGF proteininin inhibitörlerinin aylık intravitreal enjeksiyonları ile tedavi edilebilir; aAMD6,7için henüz etkili bir tedavi mevcut değildir.
Çeşitli çalışmalar anti-VEGF tedavisinin yerini almak için hücre bazlı tedavileri değerlendirdi: nAMD8,9,10ile hastalara taze hasat edilen otolog RPE hücrelerinin nakledildiği Binder ve ark. Son zamanlarda, bir faz I klinik çalışması AMD'yi umut verici sonuçlarla tedavi etmek için embriyonik kök hücre türevi bir RPE yaması kullandı; yani, tedavi edilen 10 hastanın 2'sinde 12 aya kadar RPE yamasının etkinliği, stabilitesi ve güvenliği11. Ek olarak, birkaç grup otolog RPE-Bruch'un membran-koroid yamalarının periferik retinadan toplandığını ve makula12 , 13,14'e nakledildiği çalışmalar yayınladı; ve transplantasyon için indüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) türevi RPE yamaları oluşturulmuştur15. AAMD için, kompleman yolunu hedefleyen antikorlar klinik çalışmalarda test edilmiştir6,16 ve coğrafi atrofisi (GA) olan hastalarda CD59 (AAVCAGsCD59) faktörü için geni kodlayan adeno ilişkili viral (AAV) vektörün tek bir intravitreal enjeksiyonu kullanılarak yapılan bir faz I çalışmasıtamamlanmıştır 17; faz II çalışması yakın zamanda başlamış ve ileri aAMD'li 132 hastayı işe almayı ve sonucu 2 yıllık müdahale sonrası18yaşında değerlendirmeyi amaçlamaktadır. Son olarak, FocuS çalışma grubu, bir insan tamamlayıcı faktörünü kodlayan bir rekombinant çoğalmayan AAV vektörün güvenliğini, doz yanıtını ve etkinliğini değerlendiren bir faz I / II çok merkezli klinik çalışma başlattı19.
Öncelikle, rejeneratif bir AMD tedavisinin amacı, hasar görmüş veya kaybolmuş fonksiyonel RPE hücrelerinin naklidir. Bununla birlikte, IPE ve RPE hücreleri birçok fonksiyonel ve genetik benzerliği (örneğin, fagositoz ve retinol metabolizması) paylaşır ve IPE hücreleri daha uygun bir şekilde hasat edildiği için, RPEikame 20olarak önerilmiştir. IPE hücre naklinin hayvan modelleri21 , 22'defotoreceptör dejenerasyonunu geciktirdiğini ve son evre nvAMD'li hastalarda görme fonksiyonunu stabilize ettiği daha önce gösterilmiş olsa da, bu hastalarda anlamlı bir iyileşme gözlenmedi 23. Etkinlik eksikliği, nakledilen hücrelerin sayısının düşüklüğünden ve/veya nöroprotektif retina faktörlerinin dengesizliğinden kaynaklanabilir. Alternatif bir yaklaşım, retina homeostazını geri yüklemek, kalan RPE hücrelerini korumak ve fotoreceptörleri ve RGC'leri dejenerasyondan korumak için nöroprotektif faktörleri aşırı ifade eden transkrefected pigment epitel hücrelerinin nakledililmesi olacaktır. Sonuç olarak, PEDF, GM-CSF veya insülin benzeri büyüme faktörleri (IGF' ler) gibi nöroprotektif ve anti-anjiyojenik proteinleri salgılamak için genetik mühendislikten geçmiş fonksiyonel RPE veya IPE hücrelerinin naklini içeren yeni bir tedavi öneriyoruz. Bu yaklaşımın hücre hattı, sadece bir tür veya insan dokusu kullanmak yerine birkaç türde geliştirilmesinin ve analiz etmenin avantajı: 1) bağımsız laboratuvarlarda ve farklı türlerde gerçekleştirilen çok sayıda çalışmada gösterildiği gibi sonuçların tekrarlanabilirliğini ve aktarılabilirliğini artırmıştır1,24,25; 2) domuz veya sığır hücreleri, ek hayvanların kurban edilmeden fizibilite olarak tek kullanımlıktır; 3) özellikle domuz ve sığır hücrelerinin mevcudiyeti, büyük test serilerinin sağlam sonuçlar üretmesine izin verir; 4) çoğunlukla kullanılan modellerden hücreleri izole etme, kültür ve genetik olarak değiştirme bilgisi, birden fazla tür24 , 25,26'da in vivo analizlere olanak tanır ve böylece ilk tedavi edilen hastalar için gelişmiş bir risk-fayda oranı sunar; 5) sunulan protokolün esnekliği, çeşitli modellerde ve deneysel kurulumlarda ve genetik mühendisliği olan ve olmayan tüm oküler hücre bazlı tedavilerde kullanılmasına izin verir. Buna karşılık, hücre hatları veya insan dokusu olarak alternatif teknikler sadece sınırlı aktarilebilirlik ve/ veya sınırlı bertaraf edilebilirliktir. ARPE-19 gibi hücre hatları ön deneyler için idealdir; bununla birlikte, düşük pigmentasyon ve yüksek çoğalma birincil hücrelerden önemli ölçüde farklıdır1. İnsan donör dokusundan izole edilen RPE ve IPE hücreleri, transfer edilebilir in vitro deneyler için değerli bir kaynak sunar; bununla birlikte, insan dokusunu bir ABD-Amerikan Göz Bankası'ndan elde ediyoruz, yani doku en az iki günlük (enükleasyondan sonra) ve uzun ve pahalı bir taşıma gerektiriyor, ancak yerel donör dokusu üretken bir araştırma için yeterli miktarda mevcut değil. Birincil hücrelerin kullanımının avantajı, diğer gruplardan27,28.
NvAMD ve aAMD'yi tedavi etmek için PEDF ve/veya GM-CSF için kodlayan genlerle birincil RPE ve IPE hücrelerinin transfeksiyonu için SB100X transposon sistemini kullanan hücre bazlı viral olmayan gen tedavisinin geliştirilmesi için, sırasıyla29,30,31,32, ilk olarak ARPE-19 hücrelerinin transfeksiyonunu kurduk1 . Daha sonra, kolayca erişilebilen sığır ve porcine birincil hücrelerinde izolasyon ve transfeksiyon protokolleri oluşturulmuştur. Şimdi, küçük (fare olarak) büyük memelilerden (sığır olarak) beş farklı türden birincil RPE ve IPE hücrelerinin izolasyonu ve transfeksiyonu oluşturulmuştur. İnsan donör gözlerinden elde edilen primer RPE ve IPE hücrelerinde doğrulandı30. ATMP'nin İyi Üretim Uygulamaları (GMP) uyumlu üretimi, insan donör dokusu kullanılarak da doğrulandı33. Son olarak, yaklaşımın hem güvenliği hem de verimliliği, protokolün uyarlanmış olduğu üç farklı türde in vivo olarak değerlendirildi: fare, sıçan ve tavşan. Klinik kurulumda, hastadan bir iris biyopsisi yapılacak ve IPE hücreleri izole edilecek ve temiz odada trans enfekte edilecektir, hücreler alt olarak aynı hastaya geri nakledilmeden önce. Tüm süreç yaklaşık 60 dakika süren tek bir cerrahi seansta gerçekleşecektir. Tedavi yaklaşımının geliştirilmesi ve verimliliğinin değerlendirilmesi, sağlam ve verimli gen iletim yöntemlerini uygulamak, gen iletiminin verimliliğini, terapötik protein üretimini ve nöroprotektif etkileri analiz etmek ve yaklaşımı test etmek için hücre nakli üretmek için mükemmel in vitro ve ex vivomodelleri talep etti 1,24,25,29,30 . Terapinin Cenevre Kantonunun (no. 2019-00250) araştırılması için etik komisyondan klinik faz Ib / IIa denemesi için etik onay aldığını ve şu anda İsviçre düzenleyici makamları tarafından yetkilendirme için talep edilen son klinik öncesi verilerin sunulan protokol kullanılarak toplandığını belirtmek gerekir. Bu bağlamda, klinik öncesi in vivo veriler CNV ve mükemmel güvenlik 24,25,31'deönemli bir azalma olduğunu göstermiştir.
Burada sığır, domuz, tavşan, sıçan ve fareden RPE/IPE hücrelerinin izolasyonu ve kültürü ile etkili bir gen iletim yöntemi olarak elektroporasyon ile birlikte bütünleştirici SB100X transposon sisteminin kullanımı açıklanmıştır. Özellikle, birincil PE hücreleri aşırı ifade PEDF ve GM-CSF'ye transkripsiyon edildi. Bu protokollerin toplanması, IN VITRO ve in vivo çalışmaların ATMP gelişiminin tüm klinik öncesi aşamalarında gerçekleştirilmelerini sağlar. Ayrıca, kurulum diğer ilgi ve hastalık genlerine adapte olma potansiyeline sahiptir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well plates</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>150687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>7657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine</td>
			<td>Mundipharma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bonn micro forceps flat</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri forceps (sterile)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/Ham`s F12</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drape (sterile)</td>
			<td>M&#246;lnlycke Health Care</td>
			<td>800530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation buffer 3P.14</td>
			<td>3P Pharmaceutical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Brunschwig</td>
			<td>P40-37500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (different size) (sterile)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze compress</td>
			<td>PROMEDICAL AG</td>
			<td>25403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl (0.9%)</td>
			<td>Laboratorium Dr. Bichsel AG</td>
			<td>1000090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle (18G)&#160;</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>TER-NN1838R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection kit 10 &#181;L</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK5000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber</td>
			<td>Marienfeld-superior</td>
			<td>640010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette (fire-polish)</td>
			<td>Witeg</td>
			<td>4100150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0781-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital (Thiopental Inresa)</td>
			<td>Ospedalia AG</td>
			<td>31408025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>150288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFAR4-PEDF</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFAR4-SB100X</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFAR4-Venus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Pastor et al., 2018. Kindly provided by Prof. Scherman and Prof. Marie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSB100X (250 ng/&#181;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>M&#225;t&#233;s et al., 2009. Provide by Prof. Izsvak</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pT2-CAGGS-Venus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Johnen et al., 2012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pT2-CMV-GMCSF-His plasmid DNA (250 ng/&#181;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cloned in our lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pT2-CMV-PEDF-His plasmid DNA (250 ng/&#181;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Pastor et al., 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scarpel no. 10</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scarpel no. 11</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp-sharp tip curved Extra Fine Bonn Scissors (sterile)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp-sharp tip straight Extra Fine Bonn Scissors (sterile)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tali Image-Based Cytometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>T10796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.25%&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25050014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 5%/EDTA 2%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas spring scissors curved (sterile)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture, and genetic engineering of mammalian primary pigment epithelial cells for non-viral gene therapy

Yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD), dünya çapında yaklaşık 30 milyon kişiyi etkileyen 60 > hastalarda körlüğün en sık nedenidir. AMD, retina pigment epitel (RPE) hücre dejenerasyonu ve ardından fotoreceptör bozulması nedeniyle retinanın fonksiyonel olarak bozulmasına yol açan çevresel ve genetik faktörlerden etkilenen çok faktörlü bir hastalıktır. İdeal bir tedavi, RPE hücre ölümünü ve fotoreceptör dejenerasyonunu önlemek için nöroprotektif faktörleri salgılayan sağlıklı RPE hücrelerinin naklini içerecektir. Fonksiyonel ve genetik benzerlikler ve daha az invaziv biyopsi olasılığı nedeniyle, dejenere RPE'nin yerine iris pigment epitel (IPE) hücrelerinin nakli önerildi. Nöroprotektif faktörlerin düşük sayıda subretinal olarak nakledilen hücre ile salgılanması, pigment epitel türevi faktör (PEDF) ve/veya granülosit makrofaj-koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) için kodlayan genlerle Uyuyan Güzel(SB100X)transposon aracılı transfeksiyon ile elde edilebilir. Kemirgenler, domuzlar ve sığırlar da dahil olmak üzere çeşitli türlerden RPE ve IPE hücrelerinin izolasyonu, kültürü ve SB100Xaracılı transfeksiyonunu kurduk. Küreler çıkarılır ve iris ve retinaya erişmek için kornea ve lens çıkarılır. Özel yapım bir spatula kullanılarak, IPE hücreleri yalıtılmış iristen çıkarılır. RPE hücrelerini hasat etmek için, türlere bağlı olarak bir trypsin inkübasyonu gerekebilir. Daha sonra, RPE ile özelleştirilmiş spatula kullanılarak, hücreler orta olarak askıya alınır. Tohumlamadan sonra, hücreler haftada iki kez izlenir ve izdihama ulaştıktan sonra elektroporasyon ile transkripsiyon. Gen entegrasyonu, ekspresyonu, protein salgılanması ve fonksiyonu qPCR, WB, ELISA, immünofluoresans ve fonksiyonel tahliller ile doğrulandı. Türlere bağlı olarak, göz başına 30.000-5 milyon (RPE) ve 10.000-1.5 milyon (IPE) hücre izole edilebilir. Genetiği değiştirilmiş hücreler, oksidatif stresi azaltma kapasitesine sahip önemli PEDF/GM-CSF aşırı ekspresyonu gösterir ve oküler gen tedavisi yaklaşımları geliştirmek için insanlara aktarılabilir ex vivo analizleri ve in vivo çalışmalar için esnek bir sistem sunar.

Farklı memeli türlerinden PE izolasyonu Yukarıda belirtilen protokoller kullanılarak, IPE ve RPE hücreleri beş farklı türden başarıyla izole edildi ve kültürlendi. Her işlemden elde edilen hücre sayısı gözün türüne ve büyüklüğüne bağlıdır (Tablo 1). Şekil 1'degösterildiği gibi, hücreler tipik PE hücre morfolojisi ve pigmentasyonunu gösterir (gösterilen tavşan hücreleri hariç, albino Yeni Zelanda Beyazı (NZW) tavşanl...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy at JoVE.com

Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy

Burada, birincil iris ve retina pigment epitel hücrelerini çeşitli memelilerden (fareler, sıçan, tavşan, domuz ve sığır) izole etmek ve transfekte etmek için bir protokol sunulmaktadır. Yöntem, insanlara aktarılabilir ex vivo analizleri ve in vivo çalışmalar için çeşitli kurulumlarda oküler gen tedavisi yaklaşımlarını incelemek için idealdir.

Viral Olmayan Gen Tedavisi için Memeli Primer Pigment Epitel Hücrelerinin İzolasyonu, Kültürü ve Genetik Mühendisliği

Age-related macular degeneration (AMD) is the most frequent cause of blindness in patients &#62;60 years, affecting ~30 million people worldwide. AMD is a ...

Protokol, beş memeliden pigment epitel hücrelerinin izolasyonunu ve transfeksiyonunu çeşitli kurulumlarda oküler gen tedavisini incelemek için en uygun sistem olarak gösterdiğinden önemlidir. Bu yöntemin temel avantajı, beş tür ve kullanılan viral olmayan SB100X transposon sistemi nedeniyle esnekliği, aktarilebilirliği, yüksek hücre verimi, canlılığı ve transfeksiyon oranıdır. Bu teknikler, mevcut protokolde izole edilen ve transkre enfekte olan, ancak herhangi bir oküler araştırma için kullanılabilir olan retina ve iris pigment epitel hücrelerini hedefleyen gen tedavisi yaklaşımlarını incelemek için geliştirilmiştir.Prosedürü gösteren gregg Sealy, laboratuvardan bir teknisyen. Hayvanı ötenazi yaptıktan sonra, gözleri enükle etmek için kavisli makas ve Kolibri tokmakları kullanın, ardından kalan kas dokusunu ve cildi gözlerden temizleyin. Gözleri steril olmayan PBS ile dolu 50 mililitrelik bir tüpte toplayın ve tüpü laminer akış başlığına aktarın.İki dakika boyunca iyot bazlı çözeltiye batırarak dezenfekte edin, ardından gözleri steril PBS ile dolu 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. Bir gözünü steril bir gazlı bez kompresine koyun ve gözü optik sinire sıkıca yakın tutun. Daha sonra 11 numaralı neşter ile iris sınırına yakın kesin.Makas kullanarak, irisin etrafını kesin ve ön segmenti çıkarın ve bir Petri kabına koyun, retina pigment epitel veya RPE hücreleri izole edilene kadar ampulü vitreus ile bırakın. İris pigment epitelini veya IPE hücrelerini izole etmek için lensi ince epektlerle çıkarın ve IPE hücrelerini içeren irisi hassas bir şekilde çekin. İrisi bir Petri kabına yerleştirin ve steril PBS ile yıkayın.% 0.25 tripsin 500 mikrolitre ekleyin ve 37 santigrat derecede 10 dakika kuluçkaya yatırın. Tripsin çıkarın, 500 mikrolitre tam orta ekleyin ve IPE'yi düz, ateş cilalı bir Pasteur pipetle hassas bir şekilde kazıyın. Hücre süspansiyonu toplayın ve 1,5 mililitrelik bir tüpe koyun.Neubauer odasını kullanarak hücreleri sayın ve bir mililitre tam orta ile 24 kuyu plakasında kuyu başına 0.2 milyon hücre tohumlayın. Plakayı bir inkübatöre yerleştirin ve 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte kültüre edin. RPE hücrelerini izole etmek için, vitreus mizahını ve retinayı ince torpidolarla arka segmentten çıkarın.Ampulleri 24 kuyu plakasına koyun ve göz başına% 0.25 trypsin 500 mikrolitre ekleyin ve 37 santigrat derecede 10 dakika kuluçkaya yatırın. Tripsin çıkarın, dünya başına 500 mikrolitre tam orta ekleyin ve RPE hücrelerini kavisli, ateş cilalı bir Pasteur pipetle hassas bir şekilde kazıyın. Hücre süspansiyonu toplayın ve 1,5 mililitrelik bir tüpe koyun.Neubauer odasını kullanarak hücreleri sayın ve hücreleri daha önce açıklandığı gibi tohumlayın. Plakayı inkübatöre yerleştirin. Kalan kas dokusunu ve cildi gözlerden temizleyin ve gözleri iyot bazlı çözeltide dezenfekte edin ve PBS ile durulayın.IPE hücrelerini izole etmek için lensi çıkarın ve daha önce açıklandığı gibi irisi çekin. İki iris hazırladıktan sonra, bir mililitre tam orta ekleyin ve düz, ateşle cilalanmış bir Pasteur pipetle çizerek hücreleri izole edin, ardından hücreleri sayın ve tohumlayın. Plakayı inkübatöre yerleştirin.RPE hücrelerini izole etmek için, vitreus ve retinayı arka segmentten çıkarın ve ampulü bir Petri kabına yerleştirin. Ampulü bir mililitre komple orta ile doldurun. Kavisli, ateş cilalı pasteur pipet kullanarak RPE hücrelerini çıkarın.Hücre süspansiyonunu 1.000 mikrolitre pipet kullanarak ampul içinde toplayın ve resüspensiyon için 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Daha sonra hücreleri sayın ve tohumlayın ve plakayı daha önce gösterildiği gibi kuluçkaya yatırın. Temizledikten sonra, gözü açın ve ön segmenti çıkarmak için irisin etrafını kesin, ardından bir Petri kabına koyun.RPE hücreleri izole edilene kadar ampulü vitreus ile bırakın. IPE hücrelerini izole etmek için, lens ön segmentle birlikte geliyorsa, lensi çıkarın ve IPE hücrelerini içeren irisi hassas bir şekilde çıkarmak için ince önps kullanın. İrisi bir Petri kabına yerleştirin ve steril PBS ile yıkayın.Silier gövdeyi 10 numaralı neşterle kesin. İrisleri hazırladıktan sonra, 10 dakika boyunca 37 santigrat derecede% 0.25 trypsin iki mililitre ile kuluçkaya yatırın. Tripsin çıkarın ve iki mililitre tam orta ekleyin, ardından düz, ateş cilalı bir Pasteur pipet ile çizerek hücreleri izole edin.Hücre süspansiyonu iki mililitrelik bir tüpe aktarın ve hücreleri 120 kez 10 dakika boyunca santrifüjleyin G.Süpernatantı atın ve hücreleri iki mililitrelik tam ortamda yeniden biriktirin. Tohum 0.32 milyon hücre kuyu başına altı kuyu plakasında üç mililitre tam orta. Plakayı bir inkübatöre yerleştirin ve 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte kültüre edin.RPE hücrelerini izole etmek için, vitreus mizahını ve retinayı arka segmenttenps ile çıkarın. Retina pigment epitelinin zarar görmesinden kaçının. Ampulü PBS ile yıkayın.Her iki gözü de hazırladıktan sonra, ampulü yaklaşık dörtte üçü trypsin ile doldurun ve ampul gözünün üstünde petri kabı kapağı ile 37 santigrat derecede 25 dakika kuluçkaya yatırın. Tripsin çıkarın ve bir mililitre tam orta ekleyin. Kavisli, ateş cilalı pasteur pipet kullanarak RPE hücrelerini çıkarın.Hücre süspansiyonunu ampul içinde toplayın ve resüspensiyon için 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Hücreleri 10 dakika boyunca 120 kez G.Seed 0.32 milyon hücrede üç mililitrelik tam ortamda altı kuyu plakasında santrifüjleyin. Plakayı bir inkübatöre yerleştirin ve 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte kültüre edin.Hücreleri 37 santigrat derecede ve nemlendirilmiş bir inkübatörde% 5 karbondioksitle kültürlendir. Üç ila dört gün sonra, doğal olmayan hücreleri toplamak için pipet yukarı ve aşağı ve hacmin yarısını başka bir kuyuya koyun. Kuyuyu tam orta ile bir mililitreye doldurun.Üç ila dört gün sonra, hücre koleksiyonunu tekrarlayın, bu sefer doğal olmayan hücreleri iki kuyudan bire bir toplayın. Tüm kuyulara orta ekleyin. Hücreleri gözlemleyin ve ortamı haftada iki kez değiştirin.Hücreler birleştiğinde,% 1 FBS ile komple ortama geçin. Yukarıda belirtilen protokoller kullanılarak, IPE ve RPE hücreleri beş farklı türden başarıyla izole edildi ve kültürlendi. RPE ekspresyon deseni birincil sığır IPE hücrelerinde RPE65 için immünofluoresans ile doğrulandı.Hücre canlılığı, piyasada bulunan bir sitotoksiklik test kiti ve düğüm elektroporlu kontrolü kullanılarak elektroporasyon tamponunun potansiyel toksisitesini dışlamak için çalışıldı. Hücre canlılığı üzerinde herhangi bir etki gözlenmedi. Farklı türlerden prekültüre pigment epitel hücreleri sarı floresan Venüs proteini ile transfekte edildi.Transfected RPE19 hücreleri pozitif kontrol olarak kullanıldı. Önceden şekillendirilmiş domuz RPE'sinde transfeksiyon verimliliğinin nicelemesi burada gösterilmiştir. Yeni izole edilmiş tavşan pigment epitel hücreleri sarı floresan protein Venüs ile transkred edildi ve mikroskopi ile izlendi.Pigment epitel hücreleri pigment epitel türevi faktör ile transkredasyon edildi ve protein salgısı Batı blot tarafından izlendi. Transfected hücreler için sinyal, çalışılan tüm türler ve günler için transkıpte olmayan hücrelere kıyasla daha yüksekti ve bu süre içinde protein salgısında bir azalma gözlenmedi. Hücreleri keskin aletlerle kazımaktan kaçınmak çok önemlidir.Burada, yuvarlak bir neşter kullanılması gereken küçük fare gözleri dışında ateş cilalı Pasteur pipetler kullanılır. Pigment epitel hücreleri gen tedavisi yaklaşımları geliştirmek ve patolojik durumları simüle etmek için kullanılabilir, örneğin oksidatif stres hasarı. Bu modeller terapötik ilaçları test etmek için de kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Biology

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

Myeloid dendritik hücreler kemik iliği öncüleri Kültür

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Embriyonik Fare Böbrek Nefrojenik Zone Hücreleri İzolasyon ve Kültür

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

İnsan Cilt Yetişkin Epitel Kök Hücre İzolasyonu ve Kültür

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Newt Lens Rejenerasyon Eğitim Kültürleme İris Pigment Epitel Hücreler için Sistem

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Kültür İlköğretim İnsan Fallop Tüp Epitel Hücreleri

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Hücre Kültürü ve Hipoksi Test İndüksiyon

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Sıçan Karaciğer Hücreleri İzolasyon ve İlköğretim Kültür

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Fare Primer Pankreas Asiner Hücreleri İzolasyon ve Kültür

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

İzolasyon ve Fare aort endotel hücreleri İlköğretim Kültür

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

Minyatür Domuzlardan Birincil Aort Endotel Hücrelerinin İzolasyon ve Kültürü

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...