نحن ممتنون لكيونا باركر (UCI) لتقديمها صورا ليرقات An. Stephensi المعدلة وراثيا ، ولفريزر كولمان (LSTM) وبيث بولتون (LSTM) لتوفير يرقات An. gambiae المعدلة وراثيا. كما قدمت بيث بولتون (LSTM) مساعدة ثمينة أثناء تصوير يرقات الغامبيا . تم تمويل هذا العمل من قبل معهد تاتا لعلم الوراثة والمجتمع (TIGS) وصندوق محفز مدير LSTM الممنوح ل A.A. (DCF2014AA). A.A.J. هو أستاذ دونالد برين في جامعة كاليفورنيا ، إيرفين.

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

يعد التصميم الدقيق للبلازميدات الموسومة بعلامة attB المتوافقة مع خط الإرساء المفضل أمرا بالغ الأهمية لنجاح التجربة. يجب النظر بعناية في اختيار العلامة المستخدمة لفحص المحولات ، بما في ذلك لون التألق ونمط تعبيره ، والذي سيخضع للنمط الموجود بالفعل في خط الالتحام. من الضروري استخدام علامات الفلورسنت التي يمكن تمييزها بسهولة: تشمل مجموعات العلامات الجيدة RFP (أحمر) / CFP (سماوي) ، RFP (أحمر) / GFP (أخضر) ، RFP (أحمر) / YFP (أصفر) ، و YFP (أصفر) / CFP (سماوي) ، في حين أن المجموعات التي يجب تجنبها هي YFP (أصفر) / GFP (أخضر) و CFP (سماوي) / GFP (أخضر). يعد المروج 3xP39 ، الخاص بالعينين والحبل العصبي ، هو الأكثر استخداما لدفع التعبير عن علامات الفلورسنت لتكوين البعوض. في الواقع ، تستخدم جميع خطوط إرساء Anopheles المتاحة حاليا هذا المروج. المناطق التنظيمية البديلة هي تلك الخاصة بجين An. gambiae polyubiquitin (PUBc)5 أو المروج الفيروسي IE120 ، الذي يدفع التعبير في أنسجة متعددة. عند استخدامها جنبا إلى جنب مع 3xP3 ، فإن هؤلاء المروجين سيوسعون مجموعات الألوان المحتملة وحتى استخدام نفس الفلوروفور. ينشط المروجون المشار إليهم طوال دورة حياة البعوض مما يسمح بالفحص ومراقبة التألق في جميع مراحل الحياة. هناك اعتبار إضافي أثناء تصميم البلازميد وهو حجم الشحنة المراد دمجها أو تبادلها. في حين أن نظام φC31 لديه قدرات حمل ملحوظة18 ، ينبغي اعتبار أن حجم البلازميد المانح يرتبط بشكل سلبي بشكل عام بكفاءة التحول22.
في البروتوكول الموصوف ، مصدر integrase هو بلازميد مساعد يعبر عن الإنزيم في كل مكان40. قد يؤدي وجود التكاملات في كل مكان إلى تحول الخلايا الجسدية إذا لم يتم توجيه الحقن المجهري بدقة إلى المنطقة التي يتشكل فيها الخط الجرثومي. في حين أن أحداث التحول هذه ستفقد لأنها غير قابلة للتوريث ، فإن التأثيرات الجسدية يمكن أن تقلل من لياقة الأفراد الذين يتم حقنهم. لتجنب ذلك وزيادة كفاءة التحول، يمكن أن يقتصر تعبير integrase على الخط الجرثومي، على سبيل المثال باستخدام مروج vasa22,26. تصف بروتوكولات أخرى استخدام الحمض النووي الريبي الرسولي المنسوخ في المختبر (mRNA) كمصدر ل φC31 integrase19,24,43. ومع ذلك ، فإن هذا ينطوي على إعداد شاق للحمض النووي الريبوزي المرسال ويتطلب معالجة دقيقة لمزيج الحقن واستخدام الكواشف الخالية من RNase لتجنب التدهور. وقد ثبت أن مصادر البلازميد للتكامل في كل من An. gambiae9,21,22,26,33,37 و An. Stephensi (A.A. التواصل الشخصي) موثوقة وتؤدي إلى تحول فعال ، وبالتالي فهي خيارنا المفضل. خيار آخر لتسليم integrase هو إنتاجه في الجسم الحي في خطوط مساعدة ذاتية الالتحام. تم إنشاء مثل هذه الخطوط في An. gambiae التي تعبر عن تكامل φC31 تحت تنظيم nanos المروج الخاص بالخط الجرثومي ووجد أنها تؤدي إلى تحسين كفاءة البقاء على قيد الحياة والتحول20. ومع ذلك ، يجب النظر في أحمال اللياقة البدنية المحتملة التي يفرضها الإنتاج في الجسم الحي لإنزيم integrase على خط المساعدة.
وكما هو الحال مع التقنيات المعدلة وراثيا الأخرى، يجب إيلاء عناية خاصة لتربية وعبور الأفراد المشتقين من الأجنة المحقونة لزيادة فرص استعادة المحولات إلى أقصى حد. يمكن أولا استرداد الأفراد الذين ورثوا الجين المحور بثبات في ذرية G1. ومع ذلك ، يمكن تقييم العلامات المبكرة للتحول المحتمل من خلال وجود تعبير عرضي عابر لعلامة الفلورسنت في الحليمات الشرجية و / أو الحبل العصبي ليرقات G0 الأولى والثانية عند استخدام مروج 3xP343. في حين أن وجود التألق العابر يشير إلى نجاح توصيل البلازميد ، إلا أنه لا يضمن تحول الخط الجرثومي الوراثي. وبالمثل ، فإن عدم وجود تعبير عابر لا يستبعد التحول الناجح. ومع ذلك ، فقد لوحظ أن الأفراد الإيجابيين بشكل عابر هم أكثر عرضة لإنتاج ذرية معدلة وراثيا مقارنة بالأفراد السلبيين العابرين 43,48. في أيدي الخبراء ، قد تكون تربية وعبور الأفراد الإيجابيين فقط خيارا لتقليل أعداد البعوض. ومع ذلك ، نظرا لأهمية وهشاشة يرقات G0 الصغيرة ، لا يزال من المستحسن أقل قدر من التلاعب ويوصى دائما بتربية جميع أفراد G0.
تم تصميم مخطط التزاوج المبلغ عنه في هذا البروتوكول لزيادة فرصة التزاوج إلى أقصى حد وعزل أحداث التحول المستقلة. ومع ذلك ، إذا كانت المساحة الحشرية أو توافر الموظفين يمثل مشكلة ، فيمكن تجميع البالغين G0 حسب الجنس في أقفاص واحدة إذا تم توفير عدد كاف من الأفراد من الجنس الآخر. مثل هذا الإعداد لن يسمح بالتمييز بين أحداث التحول المتعددة التي تحدث في الأفراد من نفس القفص. اعتمادا على الإعداد التجريبي ، من المتوقع وجود علامة مزدوجة (تكامل فردي) أو واحدة (RMCE) أثناء عملية الفحص. في تجارب التكامل الفردي ، من المهم التحقق من وجود العلامة الأصلية من خط الإرساء ، بينما في RMCE من المهم التحقق من فقدان العلامة المدمجة سابقا. في الواقع ، ليس من غير المألوف في تصميمات RMCE استعادة المحولات التي حدث فيها تكامل واحد بدلا من التبادل بسبب إعادة تركيب موقع attP واحد9,33. في مثل هؤلاء الأفراد ، توجد علامات الفلورسنت بالإضافة إلى العمود الفقري البلازميد الكامل للمتبرع الذي يسلط الضوء على أهمية إجراء فحص شامل لكل من علامات الفلورسنت.
في حين أن وجود أنماط التألق المتوقعة يشير إلى التحول الناجح ، يجب إجراء التوصيف الجزيئي لموقع الإدراج. وللقيام بذلك، يعد إعداد خرائط دقيقة لموضع الإدخال المتوقع، بما في ذلك المناطق الجينومية المحيطة بخط الالتحام، أمرا بالغ الأهمية لتصميم أوليغونوكليوتيد أوليغونوكليوتيد تشخيصي كاف لتحليلات تضخيم الجينات. تؤدي أحداث التكامل الفردي إلى تكوين مواقع هجينة attR و attL عند التقاطع بين الحمض النووي المدمج حديثا والكاسيت الذي تم إدخاله مسبقا. يمكن استهداف هذه المواقع للتحقق من صحة موقع الإدراج. في تصاميم RMCE ، يمكن أن يحدث إدخال كاسيت المتبرع في اتجاهين بديلين فيما يتعلق بالموضع الجينومي ، وبالتالي يمكن استخدام أربعة اشعال في مجموعات PCR بديلة للكشف عن الاتجاه الذي يحمله الخط. نظرا لأن اتجاه إدخال الكاسيت قد يؤثر على التعبير الجيني العابر ، في تحليل التعبير الجيني المقارن ، من المهم استخدام خطوط تحمل نفس اتجاه الإدراج.
عند العمل مع أعداد منخفضة من المحولات ، قد لا يكون من المستحسن التضحية بأفراد كاملين من أجل التحليل الجزيئي. ويتمثل أحد الخيارات في ذلك في إجراء تحليل جزيئي على الحمض النووي المستخرج من أرجل شخص بالغ واحد46 لأن فقدان الساق لا يؤثر على قدرة الأنثى البالغة على التزاوج والبيض49. ومع ذلك ، هناك خطر من إتلاف الفرد في عملية إزالة الساق. تم الحصول على النجاح باستخدام حالات العذراء المهملة (L. Grigoraki التواصل الشخصي) ، ولكن النهج الأكثر أمانا هو إجراء التحليل الجزيئي على الآباء G2 بعد الحصول على ذرية G3 قابلة للحياة.
في السنوات الأخيرة، أحدثت تقنية كريسبر/كاس9 ثورة في طريقة إجراء تحرير الجينوم الخاص بالموقع26,41,50,51. على عكس RMCE الموجهة للموقع ، فإن عمليات تكامل الجينات بوساطة CRISPR / Cas9 (طرق الاختراق) مستقلة عن وجود مواقع إعادة التركيب المدرجة مسبقا مع حدث تحويل من خطوة واحدة فقط مطلوبة. ومع ذلك، يعتمد نظام كريسبر/كاس9 على وجود تسلسلات جينومية كبيرة معروفة تحيط بموقع الإدخال المطلوب للإصلاح الموجه بالتماثل الناجح، وكذلك على التعرف الفعال على الموقع بوساطة الحمض النووي الريبي المرشد. لا يمكن دائما استيفاء هذه الشروط أو قد تكون شاقة لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها ، وبالنظر إلى توفر خطوط التحام متعددة في An. gambiae و An. Stephensi والخطوط المشتقة منها ، يظل نظام φC31 أداة قيمة للغاية لإجراء مقارنات مباشرة بين الأنماط الظاهرية بين الجينات المحورة في نفس المواقع الجينومية.

وقد عززت القدرة على تعديل جينوم نواقل البعوض للأمراض بشكل موثوق وقابل للتكرار التحقق الوظيفي للجينات في الجسم الحي وفتحت الأبواب أمام استراتيجيات قابلة للتحقيق لمكافحة النواقل الوراثية، مثل تلك التي تستهدف بعوض الأنوفيليس الذي ينقل الملاريا1.
اعتمد تحرير جينوم البعوض المبكر فقط على التحول بوساطة العناصر القابلة للتحويل (TE) ، مع كون piggyBac هو الترانسبوزون الأكثر استخداما في Anopheles2,3,4. ومع ذلك، يمكن أن تؤدي الطبيعة العشوائية لتكامل TE إلى تعديلات غير مرغوب فيها مثل الضربات القاضية الجينية (الطفرات الإدراجية) وتأثيرات الموضع الكبيرة على التعبير الجيني المتغير5،6،7،8. عمليات الإدراج المتعددة هي أيضا أمر شائع الحدوث عند استخدام piggyBac5,9 ، مما يجعل التحقق من صحة وعزل الخطوط المعدلة وراثيا مع عمليات الإدخال الفردية شاقة. وتشمل العيوب الأخرى إعادة تعبئتها المحتملة ، كما لوحظ في الخط الجرثومي ل Anopheles stephensi عند توفير مصدر ل piggyBac transposase10,11,12 ، وحجمها المحدود من شحنات الحمض النووي (10-15 كيلو بايت في الطول) مع انخفاض كفاءة التحول مع زيادة حجم البلازميد المانح 13,14.
تم إدخال نهج التكامل الموجهة نحو الموقع للتحايل على هذه القضايا. تعديل الجينوم الأكثر شيوعا الموجه للموقع في البعوض هو ذلك الذي يتوسط فيه نظام φC31 (الشكل 1 أ). ويعزى ذلك إلى التكاملات الفيروسية التي تحفز إعادة التركيب بين موقعين مرتبطين غير متجانسين (att) يحدثان بشكل طبيعي في جينوم البكتيريا φC31 (attP) وفي مضيف بكتيريا العقدية (attB)15. إعادة تركيب الموقعين أحادية الاتجاه وتؤدي إلى تكوين مواقع هجينة (attL و attR). إن إعادة تركيب مثل هذه المواقع الهجينة (التي تؤدي إلى استئصال الحمض النووي) لن تتطلب فقط وجود إنتيغراز فيروسي نشط ولكن أيضا عامل إعادة تركيب آخر مشفر بالعاثيات16,17. وهكذا ينشأ موقع تكامل مستقر يخفف من مسألة احتمال إعادة التعبئة غير المرغوب فيها(15). علاوة على ذلك ، يسمح النظام بدمج الشحنات الكبيرة (على سبيل المثال ، تم الإبلاغ عن تكامل هياكل > 100 كيلو بايت في D. melanogaster18) ، مما يزيد بشكل كبير من القدرات الاستيعابية. يحدث التكامل في موضع جينومي واحد محدد مسبقا مما يبسط إلى حد كبير التحقق من صحة الإدخال ومخطط التزاوج للحصول على خط معدل وراثيا مستقر. وأخيرا، تسمح طبيعة التكامل الموجهة نحو الموقع بتطبيع التعبير حيث توجد الجينات المحورة البديلة في نفس الموضع وبالتالي يتم تنظيمها في نفس السياق الجينومي المجاور. في الواقع ، أحد التطبيقات الرئيسية لهذه التقنية هو المقارنة المباشرة للأنماط الظاهرية التي تمنحها الجينات المحورة المختلفة بعد إدخالها في موضع مماثل.
ينطوي تحقيق التكامل بوساطة φC31 على مرحلتين: المرحلة الأولى هي إنشاء خطوط إرساء معدلة وراثيا تحمل موقع (مواقع) attP، والمرحلة الثانية هي التكامل الموجه نحو الموقع لشحنة محاطة ب attB في جينوم خط الالتحام 19. اعتمد إنشاء خطوط الالتحام في المرحلة الأولى على التكامل العشوائي بوساطة TE للتركيبات الموسومة بعلامة attP ، وبالتالي تضمن عملية شاقة أولية (بما في ذلك اللطخة الجنوبية وتحليلات PCR العكسية على ذرية أنثى واحدة) لعزل والتحقق من صحة الخطوط المعدلة وراثيا التي تحمل حدث تكامل واحد في مواقع جينومية فريدة ونشطة نسخيا ومحايدة للياقة البدنية. ومع ذلك ، تم تطوير العديد من خطوط الالتحام للتكامل الفردي بوساطة φC31 والتحقق من صحتها في An. gambiae19,20,21,22 وفي An. stephensi23,24,25 (الجدول 1). يختلف كل من هذه الخطوط من حيث الموقع الجينومي لموقع الالتحام والخلفية الجينية الخاصة بالسلالة ويمكن من خلالها إنشاء مجموعة كبيرة ومتنوعة من الخطوط المعدلة وراثيا الجديدة. يمكن الآن التحايل على التحقق المعقد من عمليات التكامل بوساطة TE لإنتاج خطوط الإرساء بواسطة تقنية CRISPR/Cas926؛ ومع ذلك ، يعتمد هذا على المعرفة المسبقة بالمواقع المحايدة التي سيتم استهدافها والتسلسلات المحيطة بها.
تم تطبيق التكامل بوساطة φC31 على نطاق واسع لتحرير جينوم الحشرات من الكائن الحي النموذجي D. melanogaster27 ، إلى البعوض Aedes aegypti13,28 ، Ae. albopictus29 ، An. gambiae19 ، و An. stephensi24 ، بالإضافة إلى الحشرات الأخرى بما في ذلك Ceratitis capitata30 و Bombyx mori31.
ومن القيود المفروضة على التكامل بوساطة φC31، لا سيما بالنظر إلى الإطلاقات الميدانية المحتملة لمكافحة النواقل، التكامل في جينوم البعوض لكامل البلازميد المانح الحامل ل attB، بما في ذلك التسلسلات غير المرغوب فيها مثل العلامات الجينية المقاومة للمضادات الحيوية ومكونات العمود الفقري للبلازميد ذات الأصل البكتيري. ولمعالجة ذلك، تم تنفيذ تعديل للنظام القياسي، وهو تبادل الكاسيت بوساطة المؤتلف (RMCE)، الذي يسمح بالاستعاضة الدقيقة عن كاسيت معدل وراثيا كان متكاملا سابقا بحمض نووي جديد للمتبرع (الشكل 1 ب). ويتحقق ذلك باستخدام موقعين مقلوبين يحيطان بأشرطة الكاسيت المانحة والمتلقية في كل طرف، مما يدفع حدثين مستقلين لإعادة التركيب يحدثان في وقت واحد مما يؤدي إلى تبادل الكاسيت دون تكامل العمود الفقري للبلازميد. هذا التصميم المحسن يتحايل على تكامل التسلسلات غير المرغوب فيها ويوسع نطاق تطبيق أنظمة φC31 لتشمل على سبيل المثال تكامل شحنات الحمض النووي غير المميزة عن طريق فحص فقدان علامة الفلورسنت المدمجة سابقا32.
تم تحقيق RMCE أولا مع D. melanogaster32 وتم تطبيقه لاحقا بنجاح على الحشرات غير النموذجية بما في ذلك An. gambiae9,26,33 و Ae. aegypti34 و Plutella xylostella34 و B. mori35. تم تطوير العديد من خطوط الإرساء ل RMCE والتحقق من صحتها في An. gambiae5,9,26 (الجدول 1). على حد علمنا ، لم يتم استكشاف RMCE بعد في أنواع ناقلات الأنوفيلة الأخرى.
حتى الآن، تم استخدام نظام φC31 على نطاق واسع في بعوض الأنوفيليس لإدخال ودراسة مجموعة متنوعة من الجزيئات بما في ذلك المستجيبات المضادة للملاريا19،24،36، ومكونات نظام GAL4/UAS للمبالغة في التعبير عن الجينات وتدميرها لدراسات مقاومة المبيدات الحشرية9،33، والعناصر التنظيمية، والجينات المراسلة5،21،37، وعناصر محرك الجينات26 ، 38.
يصف هذا البروتوكول كيفية إجراء 1) التكامل الموجه نحو الموقع لشحنة محاطة ب attB و 2) RMCE لمبنى محاط بمواقع attB مقلوبة في جينوم خطوط التحام Anopheles . ويتحقق ذلك باستخدام اثنين من البلازميدات: بلازميد المتبرع الموسوم بعلامة attB الذي يحمل الجين المتحول محل الاهتمام ، والبلازميد المساعد الذي يعبر عن تكامل φC31 . وتستخدم نواقل الملاريا الرئيسية An. gambiae و An. stephensi كأمثلة محددة، ومع ذلك فإن هذه البروتوكولات تنطبق على أنواع الأنوفيلة الأخرى.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig01.jpg"> الشكل 1. تعديلات الجينوم الموجهة للموقع ، والتكامل الفردي وتبادل الكاسيت بوساطة المؤتلف (RMCE) ، باستخدام نظام φC31. يحفز تكامل φC31 (INT ، سهم مزدوج رمادي) إعادة التركيب بين موقع (مواقع) attB (مخطط أرجواني) موجود في بلازميد مانح وموقع (مواقع) attP (مخطط أزرق) موجود في خط الالتحام المتلقي ، مما يؤدي إلى تكوين مواقع هجينة attL و attR. أ) يتحقق التكامل عندما يتم إعادة دمج مواقع attB و attP المفردة وينتج عنها وجود علامتين متكاملتين (الأزرق والأحمر). ب) يحدث RMCE عندما يعاد دمج موقعين attB / P في وقت واحد ويؤدي إلى استبدال الكاسيت بين مواقع att لخط الالتحام (العلامة الزرقاء) بتلك التي يحملها البلازميد المانح (العلامة الحمراء). ج) تسلسلات النيوكليوتيدات الجزئية ل attP (الأزرق) و attB (الأرجواني) والمواقع الهجينة attL / R. تحدث إعادة التركيب بين التسلسلات الأساسية "TT" المميزة باللون الأسود الغامق. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL eppendorf tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well microslides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MARI1216690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree&#160;Plasmid&#160;Maxi&#160;Kit (10)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Absolute, Molecular Biology Grade</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter set CFP for Leica MZ FLIII Excitation 436/20 nm, extinction 480/40 nm</td>
			<td>Leica</td>
			<td>10446363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter set dsRED for Leica MZ FLIII Excitation 545/30 nm, extinction 620/60 nm</td>
			<td>Leica</td>
			<td>10447079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter set YFP customised for Leica MZ FLIII</td>
			<td>Omega Optical</td>
			<td>500QM25, 500QM35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 27</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 700</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium&#160;chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium&#160;Acetate&#160;Solution (3 M),&#160;pH&#160;5.2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Life Technologies)</td>
			<td>R1181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stable brush Size 0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

site-directed &#966;c31-mediated integration and cassette exchange in anopheles vectors of malaria

يعتمد التحليل الجينومي الوظيفي والاستراتيجيات ذات الصلة للمكافحة الجينية للملاريا على طرق معتمدة وقابلة للتكرار لتعديل جينوم بعوض الأنوفيليس بدقة. من بين هذه الطرق ، يسمح نظام φC31 بالتكامل الدقيق والمستقر الموجه نحو الموقع للجينات المحورة ، أو استبدال الكاسيت المعدلة وراثيا المتكاملة عبر تبادل الكاسيت بوساطة المؤتلف (RMCE). تعتمد هذه الطريقة على عمل البكتيريا العقدية φC31 integrase لتحفيز إعادة التركيب بين موقعين محددين للتعلق المعينين attP (المشتقين من العاثية) و attB (المشتق من البكتيريا المضيفة). يستخدم النظام موقعا أو موقعين من مواقع attP التي تم دمجها سابقا في جينوم البعوض وموقع (مواقع) attB في الحمض النووي لقالب المانح. نوضح هنا كيفية تعديل جينوم خطوط التحام الأنوفيلة الحاملة ل attP بشكل ثابت باستخدام اثنين من البلازميدات: متبرع يحمل علامة attB يحمل قالب التكامل أو التبادل وبلازميد مساعد يشفر تكامل φC31 integrase. لقد أبلغنا عن نتيجتين تمثيليتين للتعديل الموجه بوساطة φC31: التكامل الفردي لكاسيت معدل وراثيا في An. Stephensi و RMCE في البعوض An. gambiae. يوفر التلاعب بالجينوم بوساطة φC31 ميزة التعبير الجيني العابر القابل للتكرار من مواقع الجينوم المحايدة التي تم التحقق من صحتها ، مما يسمح بإجراء تحليلات نوعية وكمية مقارنة للأنماط الظاهرية. كما أن طبيعة التكامل الموجهة نحو الموقع تبسط إلى حد كبير التحقق من صحة موقع الإدراج الفردي ومخطط التزاوج للحصول على خط معدل وراثيا مستقر. هذه الخصائص وغيرها تجعل من نظام φC31 مكونا أساسيا في مجموعة الأدوات الجينية للتلاعب المعدل وراثيا ببعوض الملاريا وغيره من نواقل الحشرات.

يتيح البروتوكول الموضح هنا توليد خط أنوفيليس مستقر معدل وراثيا في حوالي 10 أسابيع (بافتراض دورة حياة البعوض لمدة 21 يوما).
من المتوقع أن تكون معدلات فقس اليرقات بعد الحقن في An. gambiae أقل بشكل عام من An. Stephensi ، ولكن تم الإبلاغ عن معدلات الفقس بين 10-50٪ 9,20,24,26,33,43,47. بالنظر إلى تقنية الحقن المناسبة ، فإن معدلات الفقس التي تبلغ ≥20٪ كافية بشكل عام لإنتاج المحولات. يمكن تقييم امتصاص الحمض النووي من قبل الأجنة عن طريق فحص اليرقات الصغيرة للتعبير العابر عن علامة الفلورسنت. في تجارب RMCE الناجحة في An. gambiae باستخدام مروج 3xP3 ، أظهر ما يصل إلى 50٪ من يرقات G0 الباقية على قيد الحياة تعبيرا عرضيا عن العلامة في الحليمات الشرجية48.
من الصعب تقييم التقديرات المعممة لكفاءة التحول بين المختبرات وحتى بين التجارب لأن التحول يعتمد على تفاعل معقد للمتغيرات بما في ذلك النقاء والتركيز والحجم والسمية المحتملة للحمض النووي المحقون ، وجودة البيض ، والتعامل مع البيض قبل وبعد الحقن ، وتربية البعوض ، والأهم من ذلك تجربة المشغل. تم الحصول على معدلات تحويل تصل إلى 7٪ ل RMCE في An. gambiae (محسوبة على أنها عدد أحداث التحول المستقلة في إجمالي أفراد G0) 9,26,33 ، وما يصل إلى 2.2٪ معدل التحويل للتكامل في An. stephensi. نقترح حقن ما لا يقل عن 500 جنين ، مما يؤدي إلى فقس ما لا يقل عن 100 يرقات G0 وإلى مؤسسي G0 البالغين الذين يمكن من خلالها الحصول على ذرية متحولة بشكل ثابت. إذا كان فحص التعبير العابر في يرقات G0 ، يمكن توقع ما يصل إلى 40 يرقات إيجابية.
يتم الإبلاغ عن أمثلة على التحقق من صحة النمط الظاهري للتحول عن طريق فحص علامات الفلورسنت التي ينظمها مروج 3xP3 في الشكل 4 والشكل  5. يوضح الشكل 4 خطا جديدا ل An. Stephensi تم الحصول عليه عن طريق إدخال كاسيت يحمل علامة DsRed في خط إرساء يحمل علامة CFP (80.9 ، الجدول 1) ، مما أدى إلى تعبير ذرية G1 عن كلا العلامتين كما هو موضح في التألق الأحمر والأزرق المكتشف في العينين.
ومن المتوقع بدلا من ذلك أن تؤدي تصاميم RMCE إلى استبدال العلامة التي تم إدخالها أصلا في خط الالتحام بعلامة البلازميد المانحة. ويبين الشكل 5 ألف والشكل باء تبادل العلامات هذا في خط التحام في الغامبيا الموسومة ب CFP (A11، الجدول 1) حيث تفقد علامة CFP بعد نجاح RMCE وتكتسب علامة YFP مما يؤدي إلى تألق أصفر (ولكن ليس أزرق) للعين والحبل  العصبي33. في بعض الأحيان ، يمكن أن يؤدي RMCE إلى حدث تكامل واحد بدلا من تبادل الكاسيت المعدل وراثيا المطلوب كما هو موضح في الشكل 5C ، حيث يتم عرض يرقة مميزة بكل من علامات CFP الأصلية وعلامات YFP الجديدة. يذكر أن ما يصل إلى 50٪ من إجمالي عدد أحداث التحول هي عمليات تكامل فردية9,33.
عند فحص وجود علامة الفلورسنت ، من الأهمية بمكان التمييز بين إشارتها والتألق الذاتي المحتمل في الخلفية. هذا مهم بشكل خاص عند استخدام CFP حيث تعرض يرقات الأنوفيليس التألق الذاتي الأزرق الطبيعي (الشكل 6A). إن زيادة التكبير والتركيز على الأنسجة والأعضاء التي يتوقع أن يكون فيها التألق مدفوعا من قبل المروج ضروري لتحديد الأفراد الحقيقيين الإيجابيين ل CFP كما هو موضح في الشكل 6B باستخدام علامة 3xP3-CFP.
يتم أخيرا تقييم المحولات الفردية جزيئيا عبر PCR لتأكيد موقع الإدخال المتوقع. ويشير الشكل 7 إلى التحقق من صحة تفاعل البوليميراز المتسلسل لدى الأفراد من خط تبادل An. gambiae الذي يبين الاتجاهين المحتملين للإدراج في جينوم البعوض33.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig04.jpg"> الشكل 4. التحقق من صحة التكامل الفردي φC31 في يرقات An. stephensi (العرض الظهري). أ) يعبر خط الإرساء (80.9 ، الجدول 1) عن CFP في العيون بموجب تنظيم مروج 3xP3 . ب) يؤدي التكامل الناجح إلى التعبير عن DsRed المكتسبة حديثا بالإضافة إلى علامة CFP الأصلية في العينين. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig04large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig05.jpg"> الشكل 5. التحقق من صحة φC31 RMCE في يرقات الغامبية (عرض بطني). أ) يعبر خط الالتحام (A10 ، الجدول 1) عن CFP بموجب تنظيم المروج 3xP3 في العينين (ه) والحبل العصبي (nc)5. ب) نتائج RMCE الناجحة في مبادلة علامة الفلورسنت من CFP إلى YFP33. ج) حدث تكامل واحد حدث أثناء تجربة RMCE حيث تعبر اليرقة المحولة عن كل من علامات CFP و YFP. تحمل هذه اليرقة مكونات GAL4 / UAS التي تسبب نمط تعبير واسع من YFP ، قوي بشكل خاص في عضلات البطن (am). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig05large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig06.jpg"> الشكل 6. CFP autofluorescence في يرقات An. gambiae (عرض الظهرية). أ) صورة جنبا إلى جنب ليرقة L4 إيجابية (CFP+) وسالبة (CFP-) باستخدام مرشح CFP. ب) صورة مقربة لعيون اليرقات تكشف عن CFP + مقابل CFP- فرد. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig06large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig07.jpg"> الشكل 7. التحقق الجزيئي من اتجاه إدخال الكاسيت في An. gambiae المعدلة وراثيا التمثيلية التي أنشأتها φC31 RMCE. يمكن إدخال الكاسيت المعدل وراثيا في أحد الاتجاهين البديلين (A أو B) فيما يتعلق بموقع الإدراج. يستخدم كل تفاعل PCR (I - IV) مزيجا من الاشعال (5-8)33 المصممة لإعطاء جزء تضخيم تشخيصي لكل اتجاه كما هو موضح في خرائط البلازميد التخطيطية. T1: تمثيل الفرد المعدل وراثيا الذي يحمل اتجاه الإدخال A ؛ T2: تمثيل الفرد المعدل وراثيا الذي يحمل اتجاه الإدخال B ؛ WT: نوع البرية. DL: خط الإرساء ؛ -: تفاعل سلبي التحكم حيث تم استخدام الماء كقالب. تم تعديل هذا الرقم من Adolfi et al. (2019)33. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig07large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>جنس</td>
			<td>وتر</td>
			<td>اسم</td>
			<td>attP (ق)</td>
			<td>كروموسوم بعض</td>
			<td>علامة المروج</td>
			<td>مؤسسة المنشأ</td>
			<td>مرجع</td>
		</tr>
<tr>
<td>أ. ستيفنسي</td>
			<td>إنديانا
</td>
			<td>26.10ب
</td>
			<td>واحد</td>
			<td>2R</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>جامعة كاليفورنيا إيرفين</td>
			<td>25</td>
		</tr>
<tr>
<td>أ. ستيفنسي</td>
			<td>إنديانا
</td>
			<td>44 سيبل
</td>
			<td>واحد</td>
			<td>X</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>جامعة كاليفورنيا إيرفين</td>
			<td>23, 24</td>
		</tr>
<tr>
<td>أ. ستيفنسي</td>
			<td>إنديانا
</td>
			<td>80.9ب
</td>
			<td>واحد</td>
			<td>2 لتر</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>جامعة كاليفورنيا إيرفين</td>
			<td>هذه الدراسة</td>
		</tr>
<tr>
<td>الغامبية</td>
			<td>جي 3</td>
			<td>113</td>
			<td>واحد</td>
			<td>2R</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>جامعة كاليفورنيا إيرفين</td>
			<td>هذه الدراسة</td>
		</tr>
<tr>
<td>الغامبية</td>
			<td>كيل</td>
			<td>إي سي
</td>
			<td>واحد</td>
			<td>3R</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>جامعة كيلي.</td>
			<td>19, 43</td>
		</tr>
<tr>
<td>الغامبية</td>
			<td>جي 3</td>
			<td>اكس 1</td>
			<td>واحد</td>
			<td>2 لتر</td>
			<td>لا توجد علامة</td>
			<td>جامعة ستراسبورغ</td>
			<td>22</td>
		</tr>
<tr>
<td>الغامبية</td>
			<td>جي 3</td>
			<td>YAttP</td>
			<td>واحد</td>
			<td>Y</td>
			<td>3xP3-RFP</td>
			<td>إمبريال كوليدج لندن</td>
			<td>21</td>
		</tr>
<tr>
<td>الغامبية</td>
			<td>جي 3</td>
			<td>أ١٠ ب
</td>
			<td>مزدوج</td>
			<td>2R</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>مدرسة ليفربول Trop. Med.</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>الغامبية</td>
			<td>جي 3</td>
			<td>أ١١ ب
</td>
			<td>مزدوج</td>
			<td>2R</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>مدرسة ليفربول Trop. Med.</td>
			<td>9</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="8">a. سلالة من جامعة جونز هوبكنز (هدية من M. Jacobs-Lorena) وفي الثقافة في جامعة كاليفورنيا إيرفين لمدة >20 عاما.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="8">b. هذه السطور متاحة من المؤلفين بناء على طلب معقول.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="8">ج. هذا الخط متاح في مستودع BEI www.beiresources.org باسم MRA-1163.</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 1. خطوط إرساء Anopheles attP .

Watch this Scientific Journal Video about Site-Directed Ãâ€ C31-Mediated Integration and Cassette Exchange in Anopheles Vectors of Malaria at JoVE.com

Site-Directed ÃƒÂÃ¢â‚¬Â C31-Mediated Integration and Cassette Exchange in Anopheles Vectors of Malaria

يصف البروتوكول كيفية تحقيق تعديلات موجهة للموقع في جينوم بعوض ملاريا الأنوفيليس باستخدام نظام φC31 . وتشمل التعديلات الموصوفة كلا من تكامل وتبادل الأشرطة المعدلة وراثيا في جينوم خطوط الالتحام الحاملة ل attP.

التكامل بوساطة φC31 الموجهة بالموقع وتبادل الكاسيت في نواقل الأنوفيليس للملاريا

Functional genomic analysis and related strategies for genetic control of malaria rely on validated and reproducible methods to accurately modify the ...

يدعم هذا البروتوكول توصيف دور جينات البعوض المشاركة في مجموعة متنوعة من المسارات الفسيولوجية ، بما في ذلك ، على سبيل المثال ، مقاومة الحشرات وتطور طفيليات الملاريا. تدفع هذه الطريقة إدخال الجينات المحورة في مواقع جينومية واحدة مميزة مسبقا ، وبالتالي تسمح بمقارنة الأنماط الظاهرية الناتجة عن الجينات المحورة البديلة بشكل فعال لتجنب مسألة التأثير الموضعي. يمكن تطبيق هذه الطريقة على مجموعة متنوعة من أنواع الحشرات ذات الأهمية العامة والزراعية وتمتد تطبيقاتها على نطاق واسع من البكتيريا إلى خلايا الثدييات.ابدأ بتصميم بلازميدات مانحة attB تحمل علامة الفلورسنت السائدة ومواقع إعادة تركيب attB والشحنة الجينية المحورة المطلوبة. استخدم موقعا واحدا ل attB لدمج البلازميد الكامل الذي يحمل الكاسيت المعدل وراثيا أو موقعين مقلوب attB لتبادل الكاسيت. تنقية البلازميدات المانحة والمساعدة، باستخدام مجموعة تنقية خالية من السموم الداخلية.اجمع بين بلازميد المتبرع الموسوم attB الذي يحمل الجين المتحول محل الاهتمام والبلازميد المساعد الذي يحمل التكاملات للحصول على مزيج بتركيز نهائي قدره 350 نانوغرام لكل ميكرولتر من بلازميد المتبرع و 150 نانوغرام لكل ميكرولتر من البلازميد المساعد. عجل الحمض النووي عن طريق إضافة 0.1 حجم من ثلاثة خلات الصوديوم المولية و 2.5 حجم من الجليد البارد 100 ٪ من الإيثانول ، ثم دوامة. يجب أن يكون الراسب الأبيض مرئيا على الفور.اغسل الكريات وأعد تعليقها في مخزن مؤقت للحقن للوصول إلى تركيز نهائي إجمالي قدره 500 نانوغرام لكل ميكرولتر. ثم قم بإعداد أليكوتس من 10-15 ميكرولتر لكل منها وتخزينها عند سالب 20 درجة مئوية. يغذي الدم البعوض البالغ من العمر أربعة إلى سبعة أيام من خط الالتحام المطلوب ونظرائه من النوع البري قبل 72 ساعة من الحقن الدقيق.قم بإجراء الحقن الدقيقة لجنين Anopheles gambiae في كلوريد الصوديوم 25 ملليمولار عن طريق استهداف القطب الخلفي للجنين بزاوية 45 درجة. قم بإجراء حقن الجنين الدقيقة Anopheles stephensi في زيت الهالوكربون عن طريق استهداف القطب الخلفي بزاوية 30 درجة. مباشرة بعد الحقن ، انقل البيض إلى طبق بتري مملوء بالماء المقطر المعقم وأعاده إلى الظروف الحشرية.عند الفقس ، انقل يرقة G0 إلى صينية بالماء المقطر المملح يوميا وخلفها إلى الشرانق. فرز الشرانق G0 حسب الجنس تحت منظار مجسم. اسمح للذكور بالظهور في أقفاص منفصلة في مجموعات من ثلاثة إلى خمسة وأضف عشرة أضعاف عدد الإناث البرية المتطابقة مع العمر.السماح للإناث بالظهور في أقفاص منفصلة في مجموعات من 10 إلى 15 وإضافة عدد متساو من الذكور من النوع البري المطابق للعمر. السماح للبالغين بالتزاوج لمدة أربعة إلى خمسة أيام وتزويد الإناث بوجبة دم. جمع البيض والخلفية الناشئة الجيل القادم G1s.اجمع يرقة G1 و L3 و L4 في طبق بتري مبطن بورق ترشيح مبلل أو على شريحة مجهر وقم بفحصها باستخدام مجسمة فلورسنت لوجود العلامة المقدمة مع البضائع الموسومة ب attB. بالنسبة لتصميمات attB المفردة ، قم بفحص وجود العلامة الجديدة والموجودة مسبقا. بالنسبة لتصميمات attB المزدوجة لتبادل الكاسيت ، شاشة لوجود العلامة الجديدة وفقدان العلامة الموجودة مسبقا.فرز تحويل الشرانق G1 حسب الجنس وعبورها بشكل جماعي مع الجنس الآخر من الأفراد من النوع البري المطابق للعمر. اسمح للبالغين بالتزاوج لمدة أربعة إلى خمسة أيام وتقديم وجبة دم. بالنسبة لتجارب التكامل الفردية ، اجمع البيض مباشرة من الصليب الجماعي.بالنسبة لتجارب تبادل الكاسيت ، قم بجمع البيض من الإناث العازبات والحفاظ على النسل منفصلا حتى يكتمل التقييم الجزيئي بسبب الوجود المحتمل لاتجاهين بديلين للكاسيت. فحص ذرية G2 لوجود علامة الفلورسنت وتخصيص مجموعة فرعية من الأفراد الإيجابيين G2 للتحليل الجزيئي. قم بإرجاع الباقي إلى مرحلة البلوغ.إجراء التحقق الجزيئي من مواقع الإدراج باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل كما هو موضح في مخطوطة النص. من أجل التكامل الفردي ، تأكد من أن موقع الإدخال المتوقع يحمل بنية الإرساء الأصلية ، بالإضافة إلى التسلسل الكامل للبلازميد المانح بين الموقعين الهجينين attL و attR. بالنسبة لتبادل الكاسيت، تأكد من أن موقع الإدراج المتوقع مطابق لموقع خط الإرساء حيث تحل مواقع attL المقلوبة المختلطة محل مواقع attP المقلوبة الأصلية ويحل قالب التبادل محل الكاسيت الموجود أصلا بينهما.تم استخدام البروتوكول لإنشاء خط أنوفيليس مستقر معدل وراثيا في حوالي 10 أسابيع. تم إجراء التحقق من صحة النمط الظاهري للتحول عن طريق فحص علامات الفلورسنت التي ينظمها مروج 3xP3 هنا. تم الحصول على خط Anopheles stephensi جديد عن طريق إدخال كاسيت يحمل علامة DS حمراء في خط الالتحام المميز ب CFP مما أدى إلى تعبير ذرية G1 عن كلا العلامتين كما هو موضح في التألق الأحمر والأزرق في العينين.تؤدي تصميمات تبادل الكاسيت إلى استبدال العلامة التي تم إدخالها في الأصل في خط الالتحام بعلامة البلازميد المانحة. وقد تجلى تبادل العلامات هذا في خط التحام Anopheles gambiae حيث فقدت علامة CFP واكتسبت علامة YFP مما أدى إلى تألق العين الصفراء والحبل العصبي. في بعض الأحيان ، يمكن أن يؤدي RMCE إلى حدث تكامل واحد بدلا من تبادل الكاسيت المعدل وراثيا المطلوب حيث يتم تمييز اليرقة بكل من علامات CFP الأصلية وعلامات YFP الجديدة.عند فحص وجود علامة الفلورسنت ، من الأهمية بمكان التمييز بين إشارتها والتألق التلقائي المحتمل في الخلفية. إن زيادة التكبير والتركيز على الأنسجة والأعضاء التي يتوقع أن يكون فيها التألق مدفوعا من قبل المروج أمر ضروري لتحديد الأفراد الإيجابيين الحقيقيين ل CFP. كما تم تقييم المحولات الفردية جزيئيا عبر تفاعل البوليميراز المتسلسل لتأكيد موقع الإدخال المتوقع.يظهر هنا التحقق من PCR في الأفراد من خط Anopheles gambiae المتبادل. حتى تقنية الحقن الدقيقة المناسبة ، والتصميم الدقيق وإعداد البلازميدات المانحة والمساعدة ، وكذلك اتباع مخطط تربية البعوض المناسب هي المفتاح للحصول على الأفراد المعدلة وراثيا. يمكن استخدام هذا الإجراء لإدراج العناصر التي تسبب الإفراط في التعبير الجيني أو إسكات الصوت ، على سبيل المثال ، نظام GAL4 / UAS ، وكذلك عناصر محرك الجينات والجزيئات المضادة للأمراض للسيطرة الوراثية للبعوض.

Research

JoVE Journal

Genetics

Site-Directed &#966;C31-Mediated Integration and Cassette Exchange in Anopheles Vectors of Malaria

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

سيرنا ترنسفكأيشن وEMSA تحاليل المعزولة حديثا أرومة غاذية خلوية زغبي الإنسان

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

قياس موازية التعبير الإيقاعية جين ساعة وهرمون إفراز في مزارع الخلايا الأولية البشرية

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

علم البصريات الوراثي الطفرات عشوائية عن طريق هيستون-miniSOG في<em&gt; C. ايليجانس</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

تربية ومزدوجة الذين تقطعت بهم السبل بوساطة الحمض النووي الريبي الجينات ضربة قاضية في إخفاء بيتل،<em&gt; Dermestes المبقعة</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

موقع التكامل ثنائي الاتجاه للفيروسات القهقرية منهجية ير والتحليل الكمي للبيانات سير العمل

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions

ريتروفيرال المسح الضوئي: تعيين مواقع تكامل ملف لتحديد المناطق التنظيمية الخاصة بالخلية

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

كريسبر/Cas9-بوساطة التكامل المستهدفة في فيفو استخدام استراتيجية تستند إلى الانضمام إلى التماثل بوساطة نهاية

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

بروتوكول لإنتاج ناقلات لينتيفيرال إينتيجراسي التي تفتقر لخروج المغلوب كريسبر/Cas9-بوساطة الجينات في تقسيم الخلايا

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

"جعل طفرات مشروطة طفيل الملاريا البشرية" المنجلية "تحرير الجينات" كريسبر/Cas9

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

يصف هستون تعديل بوستترانسلاشونال التعديلات في نماذج بروتينوباثي الأعصاب الخميرة

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...