我们感谢Kiona Parker（UCI）提供转基因 An. stephensi 幼虫的图像，并感谢Fraser Colman（LSTM）和Beth Poulton（LSTM）提供转基因 An. gambiae 幼虫。Beth Poulton（LSTM）在 冈比亚锥 虫幼虫的成像过程中也提供了宝贵的帮助。这项工作由塔塔遗传学与社会研究所（TIGS）和LSTM的催化剂基金主任授予A.A.（DCF2014AA）资助。A.A.J.是加州大学欧文分校的唐纳德·布伦教授。

注：图 2所示协议的工作流程示意图。
1. φC31 attB 标记质粒的设计（图3）
<ol><li>创建携带以下基本成分的 attB 供体质粒<ol>
<li>显性荧光标记物<ol>
<li>选择一种启动子来驱动荧光标记物的表达。 注意：对于 按蚊 的转基因，荧光标志物通常在 3xP3 启动子39的调节下，其驱动眼睛和神经索的表达。或者，当需要在多个组织中表达时，可以使用 PUBc 启动子5 。使用 3xP3 启动子标记供体质粒和该方案中用作示例的对接线。</li>
			<li>选择与接收对接线兼容的荧光蛋白（FP），以便它们易于区分。 注意：不要使用对接线路中已经存在的相同标记，并避免同时使用GFP（绿色）/YFP（黄色）和GFP（绿色）/CFP（青色），因为它们很难可靠地区分。在该协议中用作示例的供体质粒用DsRed或YFP标记，因为它们将被集成到标有CFP的对接线中。</li>
		</ol>
</li>
		<li>
ATTB 重组位点<ol>
<li>使用 单个 attB 位点集成转基因盒（单 attB 设计）（图 3A）。</li>
			<li>使用 两个倒置的 attB 位点进行RMCE（双attB 设计），其中位点彼此倒置并包围供体DNA模板（图3B）。 注意： attB 站点的方向必须与停靠线中存在的 attP 站点的方向兼容。</li>
		</ol>
</li>
		<li>所需的转基因货物<ol>
<li>根据实验的具体目的，使用任何其他期望的特征来整合到蚊子基因组中。在这里，我们描述了抗疟效应分子整合到 An. stephensi 的基因组中，以及GAL4 / UAS系统的组分整合到 An. gambiae 蚊子中。</li>
		</ol>
</li>
		<li>质粒骨架组分<ol>
<li>除用于在细菌中复制质粒的其他基本成分外，还包括体外质粒选择的标志物（即抗生素 耐药基因）。 注：质粒骨架将整合到蚊子基因组的单attB 设计中进行整合（图3A），而不会插入RMCE的双attB 设计中（图3B）。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 用于显微注射混合物的质粒的制备
注意：这里说明的协议涉及使用两个质粒：一个携带目标转基因的attB标记的供体质粒，以及一个在果蝇Hsp70启动子40的监管下表达φC31整合酶的辅助质粒。
<ol><li>使用不含内毒素的质粒纯化试剂盒纯化供体和辅助质粒。 注：对用于注射的最终质粒制剂进行测序，以验证所有组分的完整性。</li>
	<li>当重悬于注射缓冲液中时，将适量的两种质粒混合以获得终浓度为350ng / μL供体质粒和150 ng / μL辅助质粒的混合物。 注意：在计算必要的混合物体积时，请考虑10-15μL足以满足每天的计划注射，并且DNA可以提前制备并储存在-20°C。 还报告了整合酶辅助质粒浓度为60-500 ng/μL和供体质粒浓度为85-200 ng/μL21，22，26，41。</li>
	<li>通过加入0.1体积的3M乙酸钠（pH 5.2）和2.5体积的冰冷100%EtOH和涡旋来沉淀DNA。白色沉淀物应立即可见。具有高度浓缩的初始质粒制剂（即~1μg/μL）可提高沉淀效率。 注意：停止点 - 沉淀物可以在-20°C下储存过夜。</li>
	<li>在4°C下以15，000× g 离心20分钟，弃去上清液，并用1mL冰冷的70%EtOH洗涤沉淀。</li>
	<li>用1mL冰冷的70%EtOH洗涤沉淀，并在室温下以15，000× g 离心5分钟。</li>
	<li>丢弃上清液而不干扰沉淀物并风干。</li>
	<li>将沉淀重悬于1x注射缓冲液（0.1mM Na3PO4，5mM KCl，pH 7.2，0.22μm过滤器灭菌）中以达到总最终浓度为500ng / μL。 注意：假设在沉淀过程中会丢失一些DNA;因此，首先加入较小体积的注射缓冲液，在分光光度计（例如，Nanodrop）上检查浓度，然后添加适当的剩余体积以达到500ng / μL。</li>
	<li>确保DNA完全重悬，制备每个10-15μL的等分试样，并将其储存在-20°C。</li>
	<li>在注射当天，解冻一个等分试样，并以15，000× g 离心5分钟以除去任何颗粒残留物。 注意：去除颗粒的另一种方法是通过0.22μm过滤器过滤溶液。避免注射混合物中存在颗粒残留物，因为它们会导致胚胎显微注射期间针头堵塞。</li>
</ol>3. 从 按蚊 对接线显微注射胚胎
<ol><li>在显微注射前72小时从所需的对接线喂养4-7天大的蚊子（即，在星期一和星期二注射，在前一个星期五喂养雌性;在同一周的星期一，星期四和星期五注射喂养雌性）。</li>
	<li>在同一天给野生型（WT）蚊子（即具有相同对接线基因组背景的蚊子）供血;这些将是外杂交所必需的。 注意：血粉的大小和质量会影响卵子的质量，因此建议始终使用新鲜血液（即 前7天内抽血）。手臂喂养或喂养小鼠可能会增加卵子的质量和数量，但不鼓励使用这些方法。对于人类和动物的使用，需要特定批准的协议。</li>
	<li>进行胚胎显微注射<ol>
<li>通过以45度角靶向胚胎的后极，在25 mM NaCl42中进行冈比亚胚微注射。有关胚胎收集，对准和显微注射的详细方案，请参阅Pondeville等人.43和Lobo等人.44。</li>
		<li>通过以30度角靶向胚胎的后极，在卤烃油中以700：27（2：1）进行 An. stephensi 胚胎显微注射。胚胎收集，对齐和显微注射的详细方案可以在Terenius等人.45 和Lobo等人.44中找到。</li>
		<li>注射后立即将鸡蛋转移到装满无菌蒸馏水（pH 7.2）的培养皿中，并将它们恢复到昆虫条件下。</li>
	</ol>
</li>
	<li>孵化后，每天将G0 幼虫转移到装有盐渍蒸馏水（0.1%滋补盐）的托盘中，并返回蛹。</li>
	<li>创纪录的孵化率（即孵化 的幼虫数量/注射的胚胎数量）。 注意：胚胎运动有助于孵化，因此温和的旋转是可取的。孵化应在注射后约48小时开始。由于注射可能导致轻微的发育延迟，因此建议继续监测晚孵化幼虫3-4天。</li>
</ol>4. 变种人的穿越和筛查
<ol><li>[可选步骤]筛选G0（注射）1龄或2龄幼虫（L1-L2）用于荧光标记物的瞬时表达。<ol>
<li>使用细尖玻璃移液器将G0 L1-L2幼虫转移到带有孔的显微镜载玻片上。在每个孔中放置一个幼虫。</li>
		<li>使用带有适当滤光片的荧光立体镜来筛选荧光标记物是否存在瞬态表达。 注意：瞬时表达的模式由所使用的启动子决定。当使用3xP3启动子时，荧光标记物的瞬时表达在肛门乳头中可见（参见Pinderville等人的图6.</li>
		<li>后 G0 阳性个体单独。</li>
	</ol></li>
	<li>在立体镜下按性别对G0 蛹进行排序52。</li>
	<li>让雄性以3-5个（创始人家庭）为一组，在单独的笼子里出现，并增加10倍的年龄匹配的WT雌性。 注意：由于雄性多次交配，因此重要的是提供过量的WT雌性，以最大限度地提高每个雄性的交配机会。</li>
	<li>让雌性以10-15（创始人家庭）为一组，在单独的笼子中出现，并添加相同数量的年龄匹配的WT雄性。 注意：如果昆虫的空间有限，雌性可以一起出现在一个笼子里。男女比例可以低至1男3女。</li>
	<li>允许成年人交配4-5天，并为女性提供血粉。 注意：多次从G0 雌性中进血和收集卵子，以最大限度地提高从多个淋巴结周期中获得转化者的机会。</li>
	<li>同时为WT个体提供血液喂养以进行异型杂交。</li>
	<li>收集鸡蛋并饲养新兴的下一代G1。</li>
	<li>筛选 G1 L3-L4 幼虫以形成适当的荧光以识别转化子。<ol>
<li>在衬有滤纸的培养皿中收集幼虫，或使用荧光立体镜在显微镜载玻片和屏幕上收集幼虫，该荧光立体镜具有适当的过滤器，以显示随 attB标签货物引入的标记物的存在。 注意：由 3xP3 启动子驱动的荧光在所有胚胎后阶段都是可见的，并且可以对较年轻的幼虫进行筛选，但是这些幼虫更脆弱，必须相对小心地处理。蛹也可以进行筛查。<ol>
<li>对于单 attB 设计，用于集成屏幕，用于存在新的和预先存在的标记;它们都应该存在，因为新盒插入到原始盒旁边（图3A， 图4）。 注：筛选单个 attB 设计的异常：使用无标记对接线22 时，仅筛选是否存在新标记。当使用对接线时，如果积分导致预先存在的标记21失活，请筛选是否存在新标记和丢失预先存在的标记。</li>
			<li>对于 RMCE 的双 attB 设计，筛选是否存在新标记和丢失预先存在的标记，应仅存在新引入的标记，因为新盒取代了原始盒（图 3B， 图 5）。 注意：在RMCE实验中，偶尔的整合事件可以恢复，其中只有一个attP重新组合，因此两个标记物都将存在。G1个体的筛查也可以按照相同的程序在蛹阶段进行52。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>转移将G1 个体转化为幼虫托盘并后部到蛹。丢弃非荧光个体和具有意外标记表达模式的个体。</li>
	<li>按性别对转化的G1 蛹进行分类，并与异性年龄匹配的WT个体 集体 交叉。</li>
	<li>让成虫交配4-5天，提供血粉，收集卵子，并饲养下一代G2 后代。<ol>
<li>对于单次整合实验，直接从 集体 交叉收集卵子，因为所有个体的整合位点是相同的。</li>
		<li>对于RMCE实验，从单个雌性收集卵子并保持后代分离，直到分子评估完成，因为可能存在两个替代的盒取向（图3B）。</li>
	</ol></li>
	<li>筛选G2 后代（在幼虫或蛹阶段）是否存在荧光标记物（预计50%的个体为阳性），丢弃非荧光后代。</li>
	<li>留出一部分G2 阳性个体进行分子分析，其余部分留到成年期。 注意：如果必须保持所有G2 个体的存活，则可以对单个成年人的腿进行分子分析46 或蛹病例DNA提取（L. Grigoraki个人通信）。或者，可以在所有G2 个体产卵和卵孵化后进行分子分析。</li>
	<li>允许成年雄性和雌性在同一笼子中杂交，以建立新的转基因品系。 注意：对于RMCE实验，成年杂交必须发生在来自单个雌性的兄弟姐妹之间，直到通过分子分析确定插入的方向。</li>
</ol>5. 通过DNA扩增（PCR）对插入位点进行分子验证
<ol><li>准备转化后对接线基因组中预测的插入位点的图谱。<ol>
<li>单次整合：确保预测的插入位点携带原始对接结构以及两个杂交位点 attL 和 attR 之间的供体质粒的整个序列（图3A）。</li>
		<li>RMCE：确保预测的插入站点与对接线的插入站点相同，其中混合倒置 attL 站点替换原始倒置 attP 站点，交换模板替换它们之间最初存在的盒式磁带（图 3B）。</li>
	</ol>
</li>
	<li>设计寡核苷酸引物以扩增整合位点两侧的插入连接。<ol>
<li>单一整合：设计跨越 attR 和/或 attL 位点的寡核苷酸引物对。一个引物必须与先前集成的对接结构结合，另一个引物必须与新集成的转基因结合（图3A）。</li>
		<li>RMCE：盒式替换可以相对于染色体（指定为A和B）以 两种不同的方向 发生。设计4种寡核苷酸引物的替代组合，仅在其中一个取向中给出离散产物，其中一对用于定向A，另一对用于定向B（图3B， 图6）。</li>
	</ol>
</li>
	<li>从G2 阳性个体中提取基因组DNA，并执行诊断性PCR和凝胶电泳，以从预测的整合位点图中可视化预期诊断扩增子的存在。 注意：DNA也可以从单个成年人的腿中提取46 或蛹病例（L. Grigoraki个人交流）。</li>
	<li>对PCR产品进行测序以确认预期的序列。</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig02.jpg"> 图 2.按蚊中定点性φC31基因组修饰的工作流程图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig03.jpg"> 图 3.φC31介导的单积分（A）和RMCE（B）的分子基础。 A）在携带单个attP位点并用CFP标记的An. stephensi对接线（80.9，表1）中的基因组插入示意图，单attB设计供体质粒标有DsRed（中间），以及成功整合后产生的预期插入位点（底部）。B）在携带两个倒置attP位点并用CFP标记的冈比亚锥形对接线（A11，表1）中的基因组插入示意图，标有YFP（中间）的双attB设计供体质粒以及成功RMCE后产生的预期插入位点（底部）。波浪线：蚊子基因组;条纹箭头：小猪Bac转座臂;3xP3：荧光标记物的启动子;SV40： 病毒终结者;Ori：复制的起源;AmpR：氨苄西林抗性基因。交叉线表示 attP 和 attB 站点之间重组的站点。编号的黑色箭头代表用于插入位点的分子验证的引物结合位点（方案的步骤5）。作者可根据要求提供完全注释的单质粒和双 attB 标记质粒。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

作者没有什么可透露的。

与所选对接线兼容的 attB标记质粒的精确设计对于实验的成功至关重要。必须仔细考虑选择用于筛选转化子的标记物，包括荧光颜色及其表达模式，这将受到对接线中已经存在的模式的影响。有必要使用易于区分的荧光标记：好的标记组合包括RFP（红色）/ CFP（青色），RFP（红色）/ GFP（绿色），RFP（红色）/ YFP（黄色）和YFP（黄色）/ CFP（青色），而要避免的组合是YFP（黄色）/ GFP（绿色）和CFP（青色）/ GFP（绿色）。 3xP3 启动子39，特定于眼睛和神经索，是最常用于驱动蚊子转基因荧光标志物表达的。事实上，目前可用的所有 按蚊 对接线都使用这种启动剂。替代调控区域是 冈比亚多 泛素基因（PUBc）5 或病毒启动子IE120，它们驱动多个组织中的表达。当与 3xP3一起使用时，这些启动子将扩大可能的颜色组合，甚至使用相同的荧光团。指示的启动子在整个蚊子生命周期中都是活跃的，允许在所有生命阶段进行筛查和荧光监测。质粒设计过程中的另一个考虑因素是要集成或交换的货物的大小。虽然 φC31 系统具有显着的承载能力18，但应考虑供体质粒的大小通常与转化效率呈负相关22。
在所描述的方案中，整合酶的来源是普遍表达酶的辅助质粒40。如果显微注射未精确地指向种系形成的区域，则整合素的普遍存在可能导致体细胞的转化。虽然这种转化事件会丢失，因为它们是不可遗传的，但体细胞效应会降低注射个体的适应性。为了避免这种情况并提高转化效率，整合素的表达可以限制在种系中，例如通过使用血管启动子22，26。其他方案描述了使用体外转录的信使RNA（mRNA）作为φC31整合酶的来源19，24，43。然而，这涉及mRNA的费力制备，需要仔细处理注射混合物并使用不含RNase的试剂以避免降解。整合素的质粒来源已经在冈比亚锥虫9，21，22，26，33，37和An. stephensi（A.A.个人通信）中被证明是可靠的，并导致有效的转化，因此是我们的首选。整合酶交付的另一种选择是在自对接辅助生产线上进行体内生产。在种系特异性启动子纳米的调节下，在冈比亚锥体中创造了表达φC31整合酶的系，并被发现可以提高存活和转化效率20。然而，必须考虑在辅助品系上体内产生整合酶所带来的潜在健康负荷。
与其他转基因技术一样，必须特别注意从注射胚胎中提取的个体的饲养和杂交，以最大限度地提高恢复转化子的机会。稳定遗传转基因的个体可以首先在G1后代中恢复。然而，当使用 3xP3 启动子43 时，可以通过 G0 第一龄和第二龄幼虫的肛门乳头和/或神经索中存在荧光标志物的短暂性表观表达来评估潜在转化的早期迹象。虽然瞬时荧光的存在表明质粒递送成功，但它并不能保证可遗传的种系转化。同样，缺乏瞬态表达式也不排除成功的转换。然而，已经观察到，与短暂阴性个体相比，短暂阳性个体更有可能产生转基因后代43，48。在专家手中，仅饲养和杂交阳性个体可能是减少蚊子数量的一种选择。然而，鉴于小型G0幼虫的重要性和脆弱性，仍然建议进行最少的操作，并且始终建议饲养所有G0个体。
该协议中报告的交配方案旨在最大限度地提高交配机会并隔离独立的转化事件。但是，如果昆虫空间或人员可用性是一个问题，如果提供足够的异性个体，G0 成虫可以按性别汇集在单个笼子中。这样的设置不允许区分来自同一笼子的个体中发生的多个转换事件。根据实验设置，在筛选过程中预计会出现双（单整合）或单（RMCE）标记。在单积分实验中，验证来自对接线的原始标记的存在非常重要，而在RMCE中，验证先前集成标记的损失非常重要。事实上，在RMCE设计中，由于单个 attP 位点的重组而发生单一整合而不是交换的转化子的转化子并不少见9，33。在这些个体中，既存在荧光标记物，也存在整个供体质粒骨架，这强调了对两种荧光标记物进行彻底筛选的重要性。
虽然预期的荧光模式的存在表明成功转化，但必须对插入位点进行分子表征。为此，制备预测插入位点的准确图谱，包括对接线的侧翼基因组区域，对于设计用于基因扩增分析的足够诊断寡核苷酸引物至关重要。单次整合事件导致 在新 整合的DNA和先前插入的盒之间的连接处形成 attR和attL 杂交位点。可以将这些网站作为插入网站验证的目标。在RMCE设计中，供体盒的插入可以相对于基因组位点以两种替代方向发生，因此可以在替代PCR组合中使用四个引物来检测该线携带哪个方向。由于盒插入的方向可能会影响转基因表达，因此在比较基因表达分析中，使用携带相同插入方向的品系非常重要。
当使用少量的转化子时，牺牲整个个体进行分子分析可能是不可取的。一种选择是对从单个成年腿中提取的 DNA 进行分子分析 46 ，因为腿部丧失不会影响成年女配和产卵的能力 49 。但是，在移除腿部的过程中存在损坏个体的风险。使用丢弃的蛹病例（L. Grigoraki个人交流）已经取得了成功，但是最安全的方法是在获得可行的G3后代后对G2亲本进行分子分析。
近年来，CRISPR / Cas9彻底改变了进行位点特异性基因组编辑的方式26，41，50，51。与位点导向的RMCE不同，CRISPR/Cas9介导的基因整合（敲入）独立于预插入重组位点的存在，只需要一步转化事件。然而，CRISPR/Cas9系统依赖于在所需插入位点两侧存在大量已知基因组序列，以实现成功的同源定向修复，以及由引导RNA介导的有效位点识别。这些条件不能总是得到满足，或者可能很难排除故障，并且，鉴于 An. gambiae 和 An. stephensi 中有多条对接线以及从它们衍生的线的可用性， φC31 系统仍然是一个非常有价值的工具，可以在相同的基因组位置对转基因进行直接表型比较。

可靠且可重复地修改疾病蚊子载体基因组的能力加强了基因的 体内 功能验证，并为可实现的遗传病媒控制策略打开了大门，例如针对传播疟疾 的按蚊 的基因载体1。
早期的蚊子基因组编辑完全依赖于转座元件（TE）介导的转化，其中piggyBac是按蚊中最常用的转座子2，3，4。然而，TE整合的随机性可导致不良修饰，例如基因敲除（插入诱变）和对转基因表达的显着位置影响5，6，7，8。使用 piggyBac5，9 时，多次插入也很常见，这使得单次插入的转基因品系的验证和分离变得费力。其他缺点包括它们的潜在再动员，正如在提供piggyBac转座酶来源时在按蚊的种系中观察到的那样10，11，12，以及它们的DNA货物（长度为10-15 kb）的有限尺寸，随着供体质粒大小的增加，转化效率下降13，14。
引入了以站点为导向的集成方法来规避这些问题。蚊子中最常见的位点导向基因组修饰是由φC31系统介导的基因组修饰（图1a）。这是由病毒整合酶驱动的，该整合酶催化噬菌体φC31（attP）和链霉菌细菌宿主（attB）基因组中天然存在的两个异特异性附着（att）位点之间的重组15。两个位点的重组是单向的，并导致混合位点（attL和attR）的形成。这种杂交位点的重组（导致DNA切除）不仅需要活性病毒整合素的存在，还需要另一种噬菌体编码的重组因子16，17。这样就产生了一个稳定的整合地点，缓解了潜在的不受欢迎的重新动员问题15。此外，该系统允许集成大型货物（例如，集成>D. melanogaster18中报告了100 kb结构），显着提高了承载能力。整合发生在单个预定义的基因组位点中，这大大简化了插入的验证和配接方案，以获得稳定的转基因系。最后，整合的位点导向性质允许表达的归一化，因为替代转基因位于同一位点，因此在同一相邻基因组环境中受到调节。事实上，该技术的主要应用之一是直接比较插入相同位点后由不同转基因赋予的表型。
实现φC31介导的整合涉及两个阶段：第一阶段是创建携带attP位点的转基因对接线，第二阶段是将attB侧翼的货物的位点导向整合到对接线的基因组中19。I期对接线的创建依赖于TE介导的attP标记构建体的随机整合，因此涉及初始的艰苦过程（包括对单雌性后代的南方印迹和逆PCR分析），以分离和验证在独特的，转录活性的和适应性中立的基因组位置携带单个整合事件的转基因系。尽管如此，在An. gambiae19，20，21，22和An. stephensi23，24，25中已经开发和验证了用于φC31介导的单积分的几条对接线（表1）。这些品系中的每一条在对接位点的基因组位置和菌株特异性遗传背景方面各不相同，并且可以从中创建出各种各样的新转基因品系。现在，CRISPR/Cas9技术可以规避用于生产对接线的TE介导集成的复杂验证26;然而，这依赖于要靶向的中性位点及其周围序列的先验知识。
φC31介导的整合已被广泛应用于从模式生物D. melanogaster27到蚊子埃及伊蚊13，28，Ae. albopictus29，An. gambiae19和An. stephensi24的昆虫基因组编辑，以及其他昆虫，包括Ceratitis capitata30和Bombyx mori31。
φC31介导的整合的局限性，特别是考虑到用于病媒控制的潜在场释放，是整个含有attB的供体质粒在蚊子基因组中的整合，包括不需要的序列，如抗生素抗性基因标记和细菌来源的质粒骨架组分。为了解决这个问题，对标准系统进行了修改，重组酶介导的盒交换（RMCE），允许用新的供体DNA精确地替换先前集成的转基因盒（图1b）。这是通过使用两个倒置的 att 位点来实现的，两端的供体和受体盒两侧，这驱动两个独立的重组事件同时发生，从而在不整合质粒骨架的情况下进行盒式交换。这种改进的设计规避了不需要的序列的整合，并扩展了φC31系统的应用，例如包括通过筛选先前集成的荧光标记物的丢失来整合未标记的DNA货物32。
RMCE首先通过D. melanogaster32实现，后来成功应用于非模型昆虫，包括An. gambiae9，26，33，Ae. aegypti34，Plutella xylostella34和B. mori35。在An. gambiae5，9，26中已经开发和验证了用于RMCE的几条对接线（表1）。据我们所知，RMCE尚未在其他按蚊病媒物种中进行探索。
迄今为止， φC31 系统已广泛用于 按蚊 中，以引入和研究多种分子，包括抗疟效应物19，24，36，GAL4 / UAS系统的成分，用于杀虫剂耐药性研究的过表达和敲低基因9，33，调节元件，报告基因5，21，37和基因驱动元件26，38.
该协议描述了如何执行1） attB侧翼货物的位点导向整合和2）由倒置的 attB 位点组成的构建体的RMCE到 按蚊 对接线的基因组中。这是通过使用两个质粒来实现的：一个携带目标转基因的供体 attB标记质粒，以及一个表达 φC31 整合酶的帮助性质粒。主要疟疾病媒 An. gambiae 和 An. stephensi 被用作具体例子，但这些方案适用于其他 按蚊 物种。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig01.jpg"> 图 1.使用φC31系统进行位点导向基因组修饰，单次整合和重组酶介导的盒式交换（RMCE）。φC31整合素（INT，灰色双箭头）催化供体质粒中存在的attB位点（紫色条纹）与接收对接线中存在的attP位点（蓝色条纹）之间的复合，从而形成杂交位点attL和attR。A） 当单个 attB 和 attP 位点重新组合并导致存在两个集成标记（蓝色和红色）时，可实现集成。B）当两个attB / P位点同时重新组合并导致对接线（蓝色标记）的att位点之间的盒与供体质粒携带的盒（红色标记）替换时，会发生RMCE。C）attP（蓝色）和attB（紫色）的部分核苷酸序列以及杂交位点attL / R。重组发生在以粗体黑色突出显示的"TT"核心序列之间。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL eppendorf tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well microslides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MARI1216690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree&#160;Plasmid&#160;Maxi&#160;Kit (10)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Absolute, Molecular Biology Grade</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter set CFP for Leica MZ FLIII Excitation 436/20 nm, extinction 480/40 nm</td>
			<td>Leica</td>
			<td>10446363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter set dsRED for Leica MZ FLIII Excitation 545/30 nm, extinction 620/60 nm</td>
			<td>Leica</td>
			<td>10447079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter set YFP customised for Leica MZ FLIII</td>
			<td>Omega Optical</td>
			<td>500QM25, 500QM35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 27</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 700</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium&#160;chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium&#160;Acetate&#160;Solution (3 M),&#160;pH&#160;5.2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Life Technologies)</td>
			<td>R1181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stable brush Size 0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

site-directed &#966;c31-mediated integration and cassette exchange in anopheles vectors of malaria

功能基因组分析和疟疾遗传控制的相关策略依赖于经过验证和可重复的方法来准确修改按蚊的基因组。在这些方法中，φC31系统允许精确和稳定的位点导向整合转基因，或通过重组酶介导的盒交换（RMCE）替换集成的转基因盒。该方法依赖于链霉菌φC31噬菌体整合酶的作用来催化两个特定附着位点之间的重组，这些位点指定为attP（来自噬菌体）和attB（来自宿主细菌）。该系统使用一个或两个先前已整合到蚊子基因组中的attP位点和供体模板DNA中的attB位点。在这里，我们说明了如何使用两个质粒稳定地修饰携带attP的按蚊对接线的基因组：携带整合或交换模板的attB标记供体和编码φC31整合酶的帮助性质粒。我们报告了φC31介导的位点定向修饰的两个代表性结果：An. stephensi中转基因盒的单次整合和Cann. gambiae蚊子中的RMCE。φC31介导的基因组操作提供了来自经过验证的，适应性中立的基因组位点的可重复转基因表达的优势，允许对表型进行比较定性和定量分析。整合的位点导向性质也大大简化了单个插入位点的验证和配接方案，以获得稳定的转基因品系。这些和其他特性使φC31系统成为转基因操纵疟疾蚊子和其他昆虫媒介的遗传工具包的重要组成部分。

这里展示的协议能够在~10周内产生稳定的 按蚊 转基因品系（假设蚊子生命周期为21天）。
预计冈比亚桔梗的注射后幼虫孵化率一般低于安氏椿，但据报道孵化率在10-50%之间9，20，24，26，33，43，47。如果采用适当的注射技术，≥20%的孵化率通常足以产生转化子。胚胎的DNA摄取可以通过筛选幼虫的荧光标记物的瞬时表达来评估。在使用3xP3启动子在冈比亚锥虫中成功的RMCE实验中，高达50%的存活G0幼虫显示出肛门乳头中标记物的表观表达48。
在实验室之间甚至在实验中，很难对转化效率进行普遍估计，因为转化取决于变量的复杂相互作用，包括注射DNA的纯度，浓度，大小和潜在毒性，卵的质量，卵子的注射前后处理，蚊子饲养，最重要的是操作员的经验。 冈比亚羚 羊的RMCE转化率高达7%（计算为G0 个体总数中的独立转化事件数）9，26，33， 而在An. stephensi中整合的转化率高达2.2%。我们建议注射至少500个胚胎，这应该导致至少100个G0 幼虫的孵化和2-7个G0 成年创始人，从中获得稳定转化的后代。如果筛查G0 幼虫的瞬时表达，预计最多可有40个阳性幼虫。
图4和 图5中报告了通过筛选由3xP3启动子调节的荧光标记物来验证转化的表型验证示例。图4显示了通过将DsRed标记的盒插入标有CFP的对接线（80.9，表1）中获得的新An. stephensi线，导致G1后代表达两种标记物，如眼睛中检测到的红色和蓝色荧光所示。
相反，RMCE设计有望导致最初插入对接线的标记物与供体质粒的标记物的标记物的替换。图5A和 图B说明了在标有CFP（A11，表1）的冈比亚对接线中的这种标记交换，其中RMCE成功后CFP标记丢失，并且YFP标记被获取，导致黄色（但不是蓝色）眼睛和神经索荧光33。有时，RMCE可以导致单个整合事件，而不是如图5C所示的所需转基因盒的交换，其中显示了用原始CFP和新的YFP标记标记的幼虫。据悉，高达 50% 的转换事件总数是单个集成9，33。
在筛选荧光标记物的存在时，将其信号与可能的背景自发荧光区分开来至关重要。当使用CFP作为按蚊幼虫显示天然蓝色自发荧光时，这一点尤其重要（图6A）。增加放大倍率并聚焦于荧光预计将由启动子驱动的组织和器官是必要的，以便使用3xP3-CFP标记物识别真正的CFP阳性个体，如图6B所示。
最终通过PCR对单个转化子进行分子评估，以确认预期的插入位点。 图7 报告了来自交换 性冈比亚线 的个体PCR验证，显示了蚊子基因组中插入的两种潜在方向33。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig04.jpg"> 图 4. φC31 单次整合在 An. stephensi 幼虫中的验证（背视图）。A）对接线（80.9，表1）在 3xP3 启动子的调节下在眼睛中表达CFP。B）成功整合导致新获得的DsRed以及原始CFP标记在眼睛中的表达。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig05.jpg"> 图 5.φC31 RMCE在冈比亚虫幼虫中的验证（腹侧视图）。A）对接线（A10，表1）在眼睛（e）和神经索（nc）5中3xP3启动子的调节下表达CFP。B）成功的RMCE导致荧光标记物从CFP到YFP33的交换。C）在RMCE实验期间发生单一整合事件，其中转化剂幼虫同时表达CFP和YFP标记。这种幼虫携带GAL4 / UAS成分，导致YFP的广泛表达模式，在腹部肌肉（am）中特别强。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig06.jpg"> 图 6.冈 比亚虫 幼虫的CFP自发荧光（背视图）。 A） 使用CFP过滤器对正（CFP+）和负（CFP-）L4 幼虫的并排图像。B）幼虫眼睛的特写图像，显示CFP + 与 CFP-个体。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig07.jpg"> 图 7.由φC31 RMCE创建的具有代表性的转基因冈比亚锥体插入方向的分子验证。转基因盒可以相对于插入位点以两种替代方向（A或B）之一插入。每个PCR反应（I - IV）使用引物（5-8）33的组合，旨在为每个取向提供诊断性扩增片段，如示意图质粒图所示。T1：具有代表性的转基因个体携带位位A;T2：具有代表性的转基因个体携带位位的插入B;WT：野生型;DL：对接线;-：反应阴性对照，其中水被用作模板。该数字已根据Adolfi等人（2019）33进行了修改。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>物种</td>
			<td>应变</td>
			<td>名字</td>
			<td>产品</td>
			<td>色谱</td>
			<td>启动子标记</td>
			<td>原籍机构</td>
			<td>参考</td>
		</tr>
<tr>
<td>斯蒂芬西</td>
			<td>印度娜
</td>
			<td>26.10b
</td>
			<td>单</td>
			<td>2R</td>
			<td>3xP3-易西氟乙烯</td>
			<td>加州大学欧文分校</td>
			<td>25</td>
		</tr>
<tr>
<td>斯蒂芬西</td>
			<td>印度娜
</td>
			<td>44Cb
</td>
			<td>单</td>
			<td>X</td>
			<td>3xP3-易西氟乙烯</td>
			<td>加州大学欧文分校</td>
			<td>23, 24</td>
		</tr>
<tr>
<td>斯蒂芬西</td>
			<td>印度娜
</td>
			<td>80.9亿
</td>
			<td>单</td>
			<td>2L</td>
			<td>3xP3-易西氟乙烯</td>
			<td>加州大学欧文分校</td>
			<td>本研究</td>
		</tr>
<tr>
<td>冈比亚</td>
			<td>G3</td>
			<td>113</td>
			<td>单</td>
			<td>2R</td>
			<td>3xP3-易西氟乙烯</td>
			<td>加州大学欧文分校</td>
			<td>本研究</td>
		</tr>
<tr>
<td>冈比亚</td>
			<td>基尔</td>
			<td>断续器
</td>
			<td>单</td>
			<td>3R</td>
			<td>3xP3-易西氟乙烯</td>
			<td>基尔大学</td>
			<td>19, 43</td>
		</tr>
<tr>
<td>冈比亚</td>
			<td>G3</td>
			<td>X1</td>
			<td>单</td>
			<td>2L</td>
			<td>无标记</td>
			<td>斯特拉斯堡大学</td>
			<td>22</td>
		</tr>
<tr>
<td>冈比亚</td>
			<td>G3</td>
			<td>YAttP</td>
			<td>单</td>
			<td>Y</td>
			<td>3xP3-RFP</td>
			<td>伦敦帝国理工学院</td>
			<td>21</td>
		</tr>
<tr>
<td>冈比亚</td>
			<td>G3</td>
			<td>A10b
</td>
			<td>双</td>
			<td>2R</td>
			<td>3xP3-易西氟乙烯</td>
			<td>利物浦学校Trop. Med.</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>冈比亚</td>
			<td>G3</td>
			<td>A11b
</td>
			<td>双</td>
			<td>2R</td>
			<td>3xP3-易西氟乙烯</td>
			<td>利物浦学校Trop. Med.</td>
			<td>9</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="8">一个。约翰霍普金斯大学（M. Jacobs-Lorena的礼物）和加州大学欧文分校的文化>20年。</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="8">b.这些行可根据合理要求从作者处获得。</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="8">c. 此行可在 BEI 存储库 www.beiresources.org MRA-1163 中找到。</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1. 按蚊 attP 对接线。

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Site-Directed ÃƒÂÃ¢â‚¬Â C31-Mediated Integration and Cassette Exchange in Anopheles Vectors of Malaria

该协议描述了如何使用φC31系统在按蚊的基因组中实现位点导向的修饰。所描述的修饰包括在携带attP的对接线的基因组中转基因盒的整合和交换。

位点导向 的φC31介导的疟疾 按蚊 载体中的整合和盒式交换

Functional genomic analysis and related strategies for genetic control of malaria rely on validated and reproducible methods to accurately modify the ...

该协议支持表征蚊子基因在各种生理途径中的作用，例如，包括昆虫抗性和疟疾寄生虫的发展。该方法驱动转基因插入到单个预先表征的基因组位置，因此允许直接比较由替代转基因产生的表型，从而有效地避免了位置效应的问题。该方法可应用于各种具有公共卫生和农业重要性的昆虫物种，其应用范围从细菌延伸到哺乳动物细胞。首先设计携带显性荧光标记、attB重组位点和所需转基因货物的 attB 供体质粒。使用单个attB位点整合携带转基因盒的整个质粒或两个倒置的attB位点进行盒交换。使用不含内毒素的纯化试剂盒纯化供体和辅助质粒。将携带目标转基因的attB标记供体质粒和携带整合原的帮助质粒组合在一起，得到最终浓度为每微升供体质粒350纳克和辅助质粒每微升150纳克的混合物。通过加入0.1体积的三摩尔乙酸钠和2.5体积的冰冷100%乙醇沉淀DNA，然后涡旋。白色沉淀物应立即可见。洗涤沉淀并将其重悬于注射缓冲液中，以达到每微升500纳克的总终浓度。然后准备每个10-15微升的等分试样，并将其储存在负20摄氏度。在微量注射前72小时，血液从所需的对接线和野生型蚊子中喂养四到七天大的蚊子。通过以45度角靶向胚胎的后极，在25毫摩尔氯化钠中进行按蚊胚胎微量注射。通过以30度角靶向后极，在卤烃油中进行按蚊胚胎微量注射。注射后立即将鸡蛋转移到装满无菌蒸馏水的培养皿中，并将它们恢复到昆虫状态。孵化后，每天将G0幼虫转移到装有盐渍蒸馏水的托盘中，并返回蛹。在立体镜下按性别对G0蛹进行排序。允许雄性以三到五组的组在单独的笼子中出现，并添加十倍以上的年龄匹配的野生型雌性。允许雌性在单独的笼子中出现，每组10至15只，并添加相同数量的年龄匹配的野生型雄性。允许成年人交配四到五天，并为女性提供血餐。收集鸡蛋并培养新兴的下一代G1。将 G1、L3 和 L4 幼虫收集在衬有湿滤纸的培养皿中或在显微镜载玻片上，并使用荧光立体镜筛选它们，以确定是否存在随 attB 标记的货物引入的标记物。对于单个 attB 设计，筛选是否存在新的和预先存在的标记。对于用于盒式磁带交换的双 attB 设计，筛选新标记的存在和先前存在的标记的丢失。按性别对转化的G1蛹进行分类，并将其与异性年龄匹配的野生型个体集体交叉。允许成年人交配四到五天，并提供血餐。对于单次整合实验，直接从集体交叉收集卵子。对于盒交换实验，从单个雌性收集卵子并保持后代分离，直到由于可能存在两个替代盒方向而完成分子评估。筛选G2后代是否存在荧光标记物，并留出G2阳性个体的子集进行分子分析。将其余的抚养到成年。如文本手稿中所述，使用PCR对插入位点进行分子验证。对于单次整合，确保预测的插入位点携带原始的对接结构，以及两个杂交位点attL和attR之间的供体质粒的整个序列。对于盒式磁带交换，请确保预测的插入站点与坞站的插入站点相同，其中混合倒置 attL 站点替换原始倒置 attP 站点，交换模板替换它们之间最初存在的盒式磁带。该协议用于在大约10周内产生稳定的按蚊转基因系。通过筛选由3xP3启动子调节的荧光标记物来执行转化的表型验证，如下所示。通过将DS红色标记的盒插入标有CFP的对接线中获得新的按蚊史蒂芬氏体线，这导致G1后代表达眼睛中的红色和蓝色荧光所指示的两种标记物。盒式交换设计导致最初插入对接线的标记物与供体质粒的标记物的标记物的替换。这种标记交换在冈比亚按蚊对接线中得到了证明，其中CFP标记丢失并且YFP标记获得导致黄眼和神经索荧光。有时，RMCE可以导致单个整合事件，而不是交换所需的转基因盒，其中幼虫用原始CFP和新的YFP标记标记。在筛选荧光标记物的存在时，将其信号与可能的背景自动荧光区分开来至关重要。增加放大倍率并聚焦于荧光预计将由启动子驱动的组织和器官对于识别真正的CFP阳性个体是必要的。还通过PCR对单个转化子进行分子评估，以确认预期的插入位点。此处显示了交换冈比亚按蚊线的个体的PCR验证。即使是适当的微量注射技术，供体和辅助质粒的准确设计和制备，以及遵循适当的蚊子饲养方案是获得转基因个体的关键。该程序可用于插入导致基因过度表达或沉默的元素，例如GAL4 / UAS系统，以及用于蚊子遗传控制的基因驱动元件和抗病原体分子。

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