Vi er taknemmelige for Kiona Parker (UCI) for at levere billeder af transgene An. stephensi larver, og til Fraser Colman (LSTM) og Beth Poulton (LSTM) for at levere transgene An. gambiae larver. Beth Poulton (LSTM) ydede også dyrebar hjælp under billeddannelsen af An. gambiae larver. Dette arbejde blev finansieret af Tata Institute for Genetics and Society (TIGS) og LSTM's Director Catalyst Fund tildelt AA (DCF2014AA). A.A.J. er en Donald Bren professor ved University of California, Irvine.

BEMÆRK: En skematisk arbejdsgang for den illustrerede protokol er vist i figur 2.
1. Design af φC31 attB -mærkede plasmider (figur 3)
<ol><li>Opret attB-donorplasmider , der bærer følgende væsentlige komponenter<ol>
<li>Dominerende fluorescerende markør<ol>
<li>Vælg en promotor til at drive udtrykket af den fluorescerende markør. BEMÆRK: For Anopheles transgenese er fluorescerende markører normalt under regulering af 3xP3 promotor39, som driver udtryk i øjnene og nerveledningen. Alternativt kan PUBc promotor5 anvendes, når ekspression i flere væv ønskes. Donorplasmider og dockinglinjer, der anvendes som eksempler i denne protokol, er markeret ved hjælp af 3xP3-promotoren .</li>
			<li>Vælg et fluorescerende protein (FP), der er kompatibelt med den modtagende dockinglinje, så de let kan skelnes. BEMÆRK: Brug ikke den samme markør, der allerede findes i dockinglinjen, og undgå samtidig brug af GFP (grøn)/YFP (gul) og GFP (grøn)/CFP (cyan), da de er meget vanskelige at skelne pålideligt. Donorplasmider, der anvendes som eksempler i denne protokol, er mærket med enten DsRed eller YFP, da de skal integreres i en dockinglinje markeret med den fælles fiskeripolitik.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
attB-rekombinationssted (er)<ol>
<li>Brug et enkelt attB-sted til integration af en transgen kassette (single-attB-design ) (figur 3A).</li>
			<li>Brug to omvendte attB-steder til RMCE (double-attB-design ), hvor lokaliteterne ligger omvendt i forhold til hinanden og omslutter donor-DNA-skabelonen (figur 3B). BEMÆRK: Retningen af attB-lokaliteten /-stederne skal være kompatibel med retningen for det eller de attP-steder , der findes i dockinglinjen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Ønsket transgen last<ol>
<li>Brug eventuelle andre ønskede funktioner, der skal integreres i myggens genom baseret på det specifikke formål med eksperimentet. Her beskriver vi integrationen af et antimalarialt effektormolekyle i genomet af An. stephensi og integrationen af komponenterne i GAL4 / UAS-systemet i An. gambiae myg.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Plasmid rygrad komponenter<ol>
<li>Inkluder blandt andre væsentlige komponenter til plasmidreplikation i bakterier en markør for plasmidudvælgelse in vitro (dvs. et antibiotikaresistensgen). BEMÆRK: Plasmidrygraden vil blive integreret i myggegenomet i single-attB-designet til integration (figur 3A), mens det ikke vil blive indsat i dobbelt-attB-designet for RMCE (figur 3B).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Fremstilling af plasmider til mikroinjektionsblandingen
BEMÆRK: Protokollen illustreret her involverer brugen af to plasmider: et attB-mærket donorplasmid, der bærer transgenet af interesse, og et hjælperplasmid, der udtrykker φC31-integrasen under reguleringen af Drosophila Hsp70-promotoren40.
<ol><li>Rens donor- og hjælperplasmider ved hjælp af et endotoksinfrit plasmidrensningssæt. BEMÆRK: Sekvens det endelige plasmidpræparat, der anvendes til injektion, for at verificere integriteten af alle komponenter.</li>
	<li>Passende mængder af de to plasmider kombineres for at opnå en blanding med en endelig koncentration på 350 ng/μL af donorplasmidet og 150 ng/μL af hjælperplasmidet, når det resuspendereres i injektionsbufferen. BEMÆRK: Ved beregning af det nødvendige volumen blanding skal du overveje, at 10-15 μL er tilstrækkeligt for hver dag med planlagte injektioner, og DNA kan fremstilles på forhånd og opbevares ved -20 °C. Integrasehjælperplasmidkoncentrationer på 60-500 ng/μL og donorplasmidkoncentrationer på 85-200 ng/μL er også blevet rapporteret21,22,26,41.</li>
	<li>Udfælde DNA'et ved at tilsætte 0,1 volumener 3 M natriumacetat (pH 5,2) og 2,5 volumener iskold 100% EtOH og hvirvel. Et hvidt bundfald skal være umiddelbart synligt. At have stærkt koncentrerede indledende plasmidpræparater (dvs. ~ 1 μg / μL) forbedrer udfældningseffektiviteten. BEMÆRK: Stoppested - Bundfaldet kan opbevares ved -20 °C natten over.</li>
	<li>Centrifuge ved 15.000 x g i 20 minutter ved 4 °C, kassér supernatanten, og vask pillen med 1 ml iskold 70% EtOH.</li>
	<li>Vask pillen med 1 ml iskold 70% EtOH og centrifuge ved 15.000 x g i 5 min ved stuetemperatur.</li>
	<li>Kassér supernatanten uden at forstyrre pelleten og lufttørre.</li>
	<li>Genbrug pillen i 1x injektionsbuffer (0,1 mM Na3PO4, 5 mM KCl, pH 7,2, 0,22 μm filter steriliseret) for at nå en samlet endelig koncentration på 500 ng / μL. BEMÆRK: Antag, at noget DNA vil gå tabt under udfældningsprocessen; Tilsæt derfor først et mindre volumen injektionsbuffer, kontroller koncentrationen på et spektrofotometer (f.eks. Nanodrop), og tilsæt derefter et passende resterende volumen for at nå 500 ng / μL.</li>
	<li>Sørg for, at DNA'et er grundigt resuspended, tilbered alikvoter på 10-15 μL hver og opbevar dem ved -20 °C.</li>
	<li>På injektionsdagen optøes en alikvote og centrifuge ved 15.000 x g i 5 minutter for at fjerne eventuelle partiklerester. BEMÆRK: En alternativ metode til partikelfjernelse er at filtrere opløsningen gennem et 0,22 μm filter. Undgå tilstedeværelsen af partiklerester i injektionsblandingen, da de fører til nåleblokering under embryomikroinjektion.</li>
</ol>3. Mikroinjektion af embryoner fra en Anopheles dockinglinje
<ol><li>Blod fodrer 4-7 dage gamle myg fra den ønskede dockinglinje 72 timer før mikroinjektion (dvs. til injektion mandag og tirsdag fodrer hunner den foregående fredag; til injektion torsdag og fredag fodrer hunner mandag i samme uge).</li>
	<li>Blod fodrer vildtype (WT) myg (dvs. myg med samme genomiske baggrund af dockinglinjen) samme dag; disse vil være nødvendige for udkrydsning. BEMÆRK: Størrelsen og kvaliteten af blodmåltidet påvirker ægkvaliteten, så det anbefales altid at bruge frisk blod (dvs. blod trukket inden for de foregående 7 dage). Armfodring eller fodring af mus kan øge kvaliteten og mængden af æg, men disse metoder tilskyndes ikke. Specifikke godkendte protokoller vil være nødvendige til brug for mennesker og dyr.</li>
	<li>Udfør embryomikroinjektioner<ol>
<li>Udfør An. gambiae embryomikroinjektioner i 25 mM NaCl42 ved at målrette embryoets bageste pol i en 45 graders vinkel. For en detaljeret protokol for embryoopsamling, justering og mikroinjektion henvises til Pondeville et al.43 og Lobo et al.44.</li>
		<li>Udfør An. stephensi embryomikroinjektioner i halocarbonolie 700:27 (2:1) ved at målrette embryoets bageste pol i en 30 graders vinkel. En detaljeret protokol for embryoopsamling, justering og mikroinjektion findes i Terenius et al.45 og Lobo et al.44.</li>
		<li>Overfør æg umiddelbart efter injektion i en petriskål fyldt med sterilt destilleret vand (pH 7,2) og returner dem til insektforhold.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ved udklækning overføres G0 larver til en bakke med saltet destilleret vand (0,1% tonic salt) dagligt og bagud til pupper.</li>
	<li>Registrer udklækningshastighed (dvs. antal udklækkede larver/antal injicerede embryoner). BEMÆRK: Embryobevægelse hjælper med at klække, så blid hvirvlen er ønskelig. Hatching skal starte ~ 48 timer efter injektion. Da injektion kan forårsage en lille udviklingsforsinkelse, anbefales det at holde øje med senklækningslarver i 3-4 dage.</li>
</ol>4. Krydsning og screening af transformerede individer
<ol><li>[VALGFRIT TRIN] Skærm G0 (injiceret) 1. eller 2. instarlarver (L1-L2) til forbigående ekspression af fluorescerende markør.<ol>
<li>Brug en fin spids glaspipette til at overføre G0 L1-L2 larver til et mikroskop dias med brønde. Placer en larve i hver brønd.</li>
		<li>Brug et fluorescenssteroskop med det relevante filter til at screene for tilstedeværelsen af forbigående ekspression af fluorescerende markør. BEMÆRK: Mønsteret for forbigående udtryk dikteres af den anvendte promotor. Ved anvendelse af 3xP3-promotoren er forbigående ekspression af fluorescerende markør synlig i analpapillerne (se figur 6 i Pondeville et al.43)</li>
		<li>Bageste G0 positive individer separat.</li>
	</ol></li>
	<li>Sorter G0-pupper efter køn under et stereoskop52.</li>
	<li>Lad mænd dukke op i separate bure i grupper på 3-5 (grundlæggerfamilier) og tilføj et 10 gange overskud af aldersmatchede WT-hunner. BEMÆRK: Da hanner parrer sig flere gange, er det vigtigt at give et overskud af WT-hunner for at maksimere parringschancerne for hver han.</li>
	<li>Lad kvinder dukke op i separate bure i grupper på 10-15 (grundlæggerfamilier) og tilføj et lige antal aldersmatchede WT-mænd. BEMÆRK: Hvis der er begrænset plads i insektet, kan hunner dukke op alle sammen i et enkelt bur. Forholdet mellem kvinde og mand kan være så lavt som 1 mand til 3 kvinder.</li>
	<li>Lad voksne parre sig i 4-5 dage og give kvinder et blodmåltid. BEMÆRK: Blod fodrer og samler æg fra G0-hunner flere gange for at maksimere chancerne for at få transformerende stoffer fra flere gonotrofiske cyklusser.</li>
	<li>Blod fodrer WT-individer på samme tid til udkrydsning.</li>
	<li>Saml æg og bagved nye næste generations G1'er.</li>
	<li>Screen G1 L3-L4 larver for passende fluorescens til identifikation af transformanter.<ol>
<li>Saml larver i en petriskål foret med filterpapir eller på et mikroskop dias og skærm ved hjælp af et fluorescerende stereoskop med passende filtre for tilstedeværelsen af markøren indført med den attB-mærkede last. BEMÆRK: Fluorescens drevet af 3xP3-promotoren er synlig i alle postembryonale stadier, og screeningen kan udføres på yngre larver, men disse er mere skrøbelige og skal håndteres relativt omhyggeligt. Pupper kan også screenes.<ol>
<li>For single-attB-design til integrationsskærm for tilstedeværelsen af den nye og allerede eksisterende markør; de skal begge være til stede, da den nye kassette indsættes ved siden af den originale (figur 3A, figur 4).  BEMÆRK: Screeningsundtagelse for enkelt attB-design: Når du bruger markørfri dockinglinjer22, skal du kun screene for tilstedeværelsen af den nye markør. Når du bruger dockinglinjer, hvor integration resulterer i inaktivering af den allerede eksisterende markør21, skal du screene for tilstedeværelsen af den nye markør og tabet af den allerede eksisterende.</li>
			<li>For dobbelt-attB-design til RMCE, skærm for tilstedeværelsen af den nye markør og tabet af den allerede eksisterende, bør kun den nyligt indførte markør være til stede, da den nye kassette erstatter den oprindelige (figur 3B, figur 5). BEMÆRK: Lejlighedsvise integrationshændelser kan gendannes i RMCE-eksperimenter, hvor kun en enkelt attP rekombineres, og dermed vil begge markører være til stede. Screeningen af G1-individer kan også udføres på puppestadiet efter samme procedure52.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Overfør omdannede G1-individer til en larvebakke og bagud til pupper. Kassér ikke-fluorescerende individer og personer med et uventet markørudtryksmønster.</li>
	<li>Sorter transformerede G1-pupper efter køn og kryds dem en masse med modsatte køn aldersmatchede WT-individer.</li>
	<li>Lad voksne parre sig i 4-5 dage, give et blodmåltid, samle æggene og bage den næste generation G2-afkom .<ol>
<li>For enkeltintegrationseksperimenter skal du indsamle æg direkte fra massekrydset , da integrationsstedet er identisk i alle individer.</li>
		<li>I forbindelse med RMCE-forsøg indsamles æg fra enkelte hunner, og afkom holdes adskilt, indtil molekylær vurdering er afsluttet på grund af den potentielle tilstedeværelse af to alternative kassettenyninger (figur 3B).</li>
	</ol></li>
	<li>Screen G2-afkom (på enten larvestadiet eller puppestadiet) for tilstedeværelsen af fluorescerende markør (50% af individerne forventes at være positive), kassér ikke-fluorescerende afkom.</li>
	<li>Afsæt en delmængde af G2-positive individer til molekylær analyse, bag resten til voksenalderen. BEMÆRK: Hvis alle G2-individer skal holdes i live, kan molekylær analyse udføres på en enkelt voksens ben46 eller puppetilfælde DNA-ekstraktioner (L. Grigoraki personlig kommunikation). Alternativt kan molekylær analyse udføres, efter at alle G2-individer har ovipositeret og æg er klækket.</li>
	<li>Tillad voksne mænd og kvinder at krydse hinanden i samme bur for at etablere den nye transgene linje. BEMÆRK: For RMCE-eksperimenter skal voksen intercross forekomme mellem søskende, der stammer fra en enkelt kvinde, indtil orientering af indsættelsen bestemmes via molekylær analyse.</li>
</ol>5. Molekylær validering af indsættelsesstedet ved hjælp af DNA-amplifikation (PCR)
<ol><li>Forbered et kort over det forudsagte indsættelsessted i dockinglinjens genom efter transformation.<ol>
<li>Enkelt integration: Sørg for, at det forudsagte indsættelsessted bærer den oprindelige dockingkonstruktion plus hele sekvensen af donorplasmidet mellem de to hybridsteder attL og attR (figur 3A).</li>
		<li>RMCE: Sørg for, at det forudsagte indsættelsessted er identisk med dockinglinjen, hvor hybride inverterede attL-steder erstatter de oprindelige omvendte attP-steder , og udvekslingsskabelonen erstatter kassetten, der oprindeligt var til stede mellem dem (figur 3B).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Design oligonukleotidprimere for at forstærke det indsatte kryds på hver side af integrationslokusset.<ol>
<li>Enkelt integration: Design oligonukleotidprimerpar, der spænder over attR- og / eller attL-stederne . Den ene primer skal binde sig til den tidligere integrerede dockingkonstruktion og den anden til det nyligt integrerede transgen (figur 3A).</li>
		<li>RMCE: Kassetteudskiftning kan forekomme i to forskellige retninger med hensyn til kromosomet (betegnet A og B). Design alternative kombinationer af 4 oligonukleotidprimere for kun at give et diskret produkt i en af retningerne, hvor det ene par er diagnostisk for orientering A og det andet for orientering B (figur 3B, figur 6).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Uddrag genomisk DNA fra G2-positive individer og udfør den diagnostiske PCR- og gelelektroforese for at visualisere tilstedeværelsen af forventede diagnostiske ampliconer fra de forudsagte integrationsstedskort. BEMÆRK: DNA kan alternativt ekstraheres fra enlige voksnes ben46 eller puppetilfælde (L. Grigoraki personlig kommunikation).</li>
	<li>Sekvens PCR-produkter for at bekræfte forventede sekvenser.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig02.jpg"> Figur 2. Workflow diagram for site-directed φC31 genommodifikation i Anopheles myg. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig03.jpg"> Figur 3. Molekylært grundlag for φC31-medieret enkeltintegration (A) og RMCE (B). A) Skematiske kort over den genomiske indsættelse i en An. stephensi-dockinglinje (80.9, tabel 1), der bærer et enkelt attP-sted og er markeret med den fælles fiskeripolitik (øverst), et donorplasmid med et enkelt attB-design markeret med DsRed (midten) og det forventede indsættelsessted, der resulterer efter vellykket integration (nederst). B) Skematiske kort over den genomiske indsættelse i en An. gambiae-dockinglinje (A11, tabel 1), der bærer to omvendte attP-steder og markeret med den fælles fiskeripolitik (øverst), et donorplasmid med dobbelt attB-design markeret med YFP (midten) og det forventede indsættelsessted, der resulterer efter vellykket RMCE (nederst). Bølget linje: myg genom; Stribede pile: piggyBac transposon arme; 3xP3: promotor af den fluorescerende markør; SV40: viral terminator; Ori: replikationens oprindelse; AmpR: ampicillinresistensgen. Krydsningslinjer repræsenterer det eller de steder, hvor der rekombination mellem attP- og attB-steder. Nummererede sorte pile repræsenterer primerbindingssteder for molekylær validering af indsættelseslokus (trin 5 i protokollen). Fuldt kommenterede enkelt- og dobbelt attB-mærkede plasmider er tilgængelige fra forfatterne efter anmodning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>

Forfatterne har intet at afsløre.

Det nøjagtige design af attB-mærkede plasmider, der er kompatible med den valgte dockinglinje, er afgørende for eksperimentets succes. Der skal nøje tages hensyn til valget af den markør, der anvendes til screening af transformanter, herunder fluorescensfarven og dens ekspressionsmønster, som vil være underlagt det mønster, der allerede findes i dockinglinjen. Det er nødvendigt at anvende fluorescerende markører, der er lette at skelne: Gode markørkombinationer omfatter RFP (rød)/FFP (cyan), RFP (rød)/GFP (grøn), RFP (rød)/YFP (gul) og YFP (gul)/FFP (cyan), mens kombinationer, der skal undgås, er YFP (gul)/GFP (grøn) og FFP (cyan)/GFP (grøn). 3xP3-promotoren39, der er specifik for øjnene og nerveledningen, er den hyppigst anvendte til at drive ekspressionen af fluorescerende markører til myggetransgenese. Faktisk bruger alle Anopheles dockinglinjer, der i øjeblikket er tilgængelige, denne promotor. Alternative regulerende regioner er An. gambiae polyubiquitin genet (PUBc)5 eller den virale promotor IE120, som driver ekspression i flere væv. Når de bruges sammen med 3xP3, vil disse promotorer udvide de mulige farvekombinationer og endda brugen af den samme fluorofor. De angivne promotorer er aktive i hele myggens livscyklus, hvilket muliggør screening og fluorescensovervågning i alle livsfaser. En yderligere overvejelse under plasmiddesign er størrelsen på den last, der skal integreres eller udveksles. Selv om φC31-systemet har bemærkelsesværdige bæreevner18, bør det overvejes, at donorplasmidets størrelse generelt korrelerer negativt med transformationseffektiviteten22.
I den beskrevne protokol er kilden til integrase et hjælperplasmid, der udtrykker enzymet allestedsnærværende40. Integrasens allestedsnærværende tilstedeværelse kan føre til transformation af somatiske celler, hvis mikroinjektioner ikke er præcist rettet mod det område, hvor kimlinjen dannes. Mens sådanne transformationsbegivenheder vil gå tabt, da de ikke er arvelige, kan somatiske virkninger nedsætte egnetheden hos injicerede individer. For at undgå dette og øge transformationseffektiviteten kan integraseekspression begrænses til kimlinjen, for eksempel ved at bruge vasa promoter22,26. Andre protokoller beskriver brugen af in vitro transskriberet messenger RNA (mRNA) som kilde til φC31 integrase19,24,43. Dette indebærer imidlertid besværlig fremstilling af mRNA og kræver omhyggelig håndtering af injektionsblandingen og anvendelse af RNase-frie reagenser for at undgå nedbrydning. Plasmidkilder til integrase er blevet påvist i både An. gambiae9,21,22,26,33,37 og An. stephensi (AA personlig kommunikation) at være pålidelige og føre til effektiv transformation og er derfor vores foretrukne løsning. En yderligere mulighed for integraselevering er dens in vivo-produktion i selvdockende hjælpelinjer. Sådanne linjer blev oprettet i An. gambiae, der udtrykker φC31-integrasen under reguleringen af de kimlinjespecifikke promotornanoer og viste sig at føre til en forbedret overlevelses- og transformationseffektivitet20. Imidlertid skal potentielle fitnessbelastninger, der pålægges af in vivo-produktionen af integraseenzymet på hjælperlinjen, overvejes.
Som med andre transgene teknikker skal der udvises særlig omhu over for opdræt og krydsning af personer, der stammer fra injicerede embryoner for at maksimere chancerne for at genvinde transformerende stoffer. Personer, der stabilt har arvet transgenet, kan først genvindes ved G1-afkom. Tidlige tegn på potentiel transformation kan imidlertid evalueres ved tilstedeværelsen af forbigående episomal ekspression af fluorescerende markør i analpapillerne og/eller nerveledningen hos G0's første og anden instar larver ved anvendelse af 3xP3-promotoren43. Mens tilstedeværelsen af forbigående fluorescens antyder vellykket plasmidlevering, garanterer det ikke arvelig kimlinjetransformation. Tilsvarende udelukker manglen på forbigående udtryk ikke vellykket transformation. Ikke desto mindre er det blevet observeret, at forbigående positive individer er mere tilbøjelige til at give transgene afkom sammenlignet med forbigående negative43,48. I eksperthænder kan opdræt og krydsning af kun positive individer være en mulighed for at reducere mygantal. I betragtning af vigtigheden og skrøbeligheden af små G0-larver er det dog stadig tilrådeligt at anvende mindst mulig manipulation, og opdræt af alle G0-individer anbefales altid.
Parringsordningen, der er rapporteret i denne protokol, er designet til at maksimere chancen for parring og isolere uafhængige transformationshændelser. Men hvis insektplads eller personaletilgængelighed er et problem, kan G0-voksne samles efter køn i enkeltbure, hvis der er nok personer af modsat køn. En sådan opsætning vil ikke tillade forskelsbehandling mellem flere transformationshændelser, der forekommer hos personer fra samme bur. Afhængigt af forsøgsopstillingen forventes tilstedeværelsen af en dobbelt (enkelt integration) eller enkelt (RMCE) markør under screeningsprocessen. I enkeltintegrationseksperimenter er det vigtigt at verificere tilstedeværelsen af den originale markør fra dockinglinjen, mens det i RMCE er vigtigt at verificere tabet af den tidligere integrerede markør. Det er faktisk ikke ualmindeligt i RMCE-design at gendanne transformanter, hvor enkelt integration i stedet for udveksling fandt sted på grund af rekombinationen af et enkelt attP-sted9,33. Hos sådanne individer er begge fluorescerende markører til stede såvel som hele donorplasmidrygraden, hvilket understreger vigtigheden af at foretage en grundig screening for begge fluorescerende markører.
Mens tilstedeværelsen af forventede fluorescensmønstre indikerer en vellykket transformation, skal der foretages molekylær karakterisering af indsættelsesstedet. For at gøre dette er udarbejdelsen af nøjagtige kort over det forudsagte indsættelseslokus, herunder de flankerende genomiske områder af dockinglinjen, afgørende for udformningen af passende diagnostiske oligonukleotidprimere til genamplifikationsanalyser. Enkeltintegrationshændelser resulterer i dannelsen af attR - og attL-hybridsteder ved krydset mellem det nyligt integrerede DNA og den tidligere indsatte kassette. Disse websteder kan målrettes til validering af indsættelsessted. I RMCE-design kan indsættelsen af donorkassetten forekomme i to alternative retninger i forhold til det genomiske locus, således at fire primere kan anvendes i alternative PCR-kombinationer til at detektere, hvilken retning linjen bærer. Da orienteringen af kassetteindsættelse kan påvirke transgenekspressioner, er det i komparativ genekspressionsanalyse vigtigt at anvende linjer, der bærer den samme orientering af indsættelsen.
Når man arbejder med et lavt antal transformanter, er det måske ikke ønskeligt at ofre hele individer til molekylær analyse. En mulighed herpå er at udføre molekylær analyse af DNA ekstraheret fra enlig voksens ben46 , da bentab ikke påvirker en voksen kvindelig evne til at parre sig og oviposit49. Der er dog risiko for at skade den enkelte i processen med at fjerne benet. Succes er opnået ved hjælp af kasserede puppesager (L. Grigoraki personlig kommunikation), men den sikreste tilgang er at udføre molekylær analyse på G2-forældre efter opnåelse af levedygtige G3-afkom .
I de senere år har CRISPR/Cas9 revolutioneret måden at udføre stedsspecifik genomredigering på26,41,50,51. I modsætning til stedstyret RMCE er CRISPR/Cas9-medierede genintegrationer (knock-ins) uafhængige af tilstedeværelsen af forudindsatte rekombinationssteder med kun behov for en ettrinstransformationshændelse. Ikke desto mindre er CRISPR/Cas9-systemet afhængigt af tilstedeværelsen af store kendte genomiske sekvenser, der flankerer det ønskede indsættelsessted for vellykket homologistyret reparation samt af den effektive stedgenkendelse formidlet af guide-RNA'er. Disse betingelser kan ikke altid opfyldes eller kan være besværlige at fejlfinde, og i betragtning af tilgængeligheden af flere dockinglinjer i An. gambiae og An. stephensi og linjer afledt af dem forbliver φC31-systemet et meget værdifuldt værktøj til at udføre direkte fænotypiske sammenligninger mellem transgener på de samme genomiske steder.

Evnen til at modificere genomet af myggevektorer af sygdomme pålideligt og reproducerbart har styrket in vivo funktionel validering af gener og åbnet dørene til realiserbare genetiske vektorkontrolstrategier, såsom dem, der er rettet mod Anopheles-myg, der overfører malaria1.
Tidlig myggegenomredigering var udelukkende afhængig af transponerbar element (TE)-medieret transformation, hvor piggyBac var den mest almindeligt anvendte transposon i Anopheles2,3,4. Den tilfældige karakter af TE-integration kan imidlertid føre til uønskede modifikationer såsom genknockouts (indsættelsesmutagenese) og signifikante positionseffekter på transgenekspression5,6,7,8. Flere indsættelser er også en almindelig forekomst, når man bruger piggyBac5,9, hvilket gør valideringen og isoleringen af transgene linjer med enkelte indsættelser besværlig. Andre ulemper omfatter deres potentielle remobilisering, som observeret i kimlinjen af Anopheles stephensi, når de tilvejebringer en kilde til piggyBac transposase10,11,12, og deres begrænsede størrelse af DNA-last (10-15 kb i længden) med transformationseffektivitet, der falder med stigende størrelse af donorplasmidet13,14.
Site-rettet integration tilgange blev indført for at omgå disse spørgsmål. Den mest almindelige stedstyrede genommodifikation i myg er den, der formidles af φC31-systemet (figur 1a). Dette er drevet af en viral integrase, der katalyserer rekombinationen mellem to heterospecifikke fastgørelsessteder (att), der forekommer naturligt i bakteriofagens genom φC31 (attP) og i Streptomyces-bakterieværten (attB)15. Rekombination af de to steder er ensrettet og resulterer i dannelsen af hybridsteder (attL og attR). Rekombinationen af sådanne hybridsteder (der fører til DNA-excision) ville ikke kun kræve tilstedeværelsen af en aktiv viral integrase, men også en anden fagkodet rekombinationsfaktor16,17. Der genereres således et stabilt integrationssted, der aflaster spørgsmålet om potentiel uønsket remobilisering15. Desuden tillader systemet integration af store laster (f.eks. integration af >100 kb konstruktioner blev rapporteret i D. melanogaster18), hvilket signifikant øger bæreevnen. Integration sker i et enkelt foruddefineret genomisk locus, hvilket i høj grad forenkler valideringen af indsættelse og parringsskemaet for at opnå en stabil transgen linje. Endelig tillader integrationens stedstyrede karakter normalisering af ekspression, da alternative transgener er placeret i samme locus og derfor reguleres inden for samme nærliggende genomiske kontekst. En af de vigtigste anvendelser af teknikken er faktisk den direkte sammenligning af fænotyper, der er tildelt af forskellige transgener efter indsættelse i et identisk locus.
Opnåelse af φC31-medieret integration involverer to faser: fase I er oprettelsen af transgene dockinglinjer, der bærer attP-sted(er), og fase II er den stedstyrede integration af en attB-flankeret last i dockinglinjens genom19. Oprettelsen af fase I-dockinglinjer har været afhængig af den TE-medierede tilfældige integration af attP-mærkede konstruktioner og involverede således en indledende besværlig proces (herunder sydlige blot og inverse PCR-analyser på enkelthun-afkom) for at isolere og validere transgene linjer, der bærer en enkelt integrationshændelse på unikke, transkriptionsaktive og fitnessneutrale genomiske steder. Ikke desto mindre er flere dockinglinjer til φC31-medieret enkeltintegration blevet udviklet og valideret i An. gambiae19,20,21,22 og i An. stephensi23,24,25 (tabel 1). Hver af disse linjer varierer med hensyn til dockingstedets genomiske placering og den stammespecifikke genetiske baggrund, og fra dem kan der oprettes et stort udvalg af nye transgene linjer. Den komplekse validering af TE-medierede integrationer til fremstilling af dockinglinjer kan nu omgås af CRISPR/Cas9-teknologien26; dette afhænger imidlertid af a priori viden om neutrale loci, der skal målrettes, og deres omgivende sekvenser.
φC31-medieret integration er blevet anvendt i vid udstrækning til insektgenomredigering fra modelorganismen D. melanogaster27, til myggene Aedes aegypti13,28, Ae. albopictus29, An. gambiae19 og An. stephensi24 samt andre insekter, herunder Ceratitis capitata30 og Bombyx mori31.
En begrænsning af φC31-medieret integration, især i lyset af potentielle feltfrigivelser til vektorkontrol, er integrationen i myggegenomet af hele det attB-bærende donorplasmid, herunder uønskede sekvenser såsom antibiotikaresistensgenmarkører og plasmidrygradskomponenter af bakteriel oprindelse. For at imødegå dette blev der implementeret en ændring af standardsystemet, recombinase-medieret kassetteudveksling (RMCE), der muliggør præcis udskiftning af en tidligere integreret transgen kassette med et nyt donor-DNA (figur 1b). Dette opnås ved at anvende to omvendte att-steder , der flankerer donor- og modtagerkassetterne i hver ende, hvilket driver to uafhængige rekombinationshændelser til at finde sted samtidigt, hvilket resulterer i kassetteudveksling uden integration af plasmidrygraden. Dette forbedrede design omgår integrationen af uønskede sekvenser og udvider anvendelsen af φC31-systemer til f.eks. at omfatte integration af umærkede DNA-laster ved screening for tab af en tidligere integreret fluorescerende markør32.
RMCE blev opnået først med D. melanogaster32 og senere anvendt med succes på ikke-model insekter, herunder An. gambiae9,26,33, Ae. aegypti34, Plutella xylostella34 og B. mori35. Flere dockinglinjer til RMCE er blevet udviklet og valideret i An. gambiae5,9,26 (tabel 1). Så vidt vi ved, er RMCE endnu ikke udforsket i andre Anopheles vektorer arter.
Hidtil er φC31-systemet blevet brugt i vid udstrækning i Anopheles-myg til at introducere og studere en række molekyler, herunder antimalaria-effektorer19,24,36, komponenter i GAL4/UAS-systemet til at overudtrykke og slå gener til insekticidresistensundersøgelser9,33, regulatoriske elementer, reportergener5,21,37 og gene-drive-elementer26 ,38.
Denne protokol beskriver, hvordan man udfører 1) stedstyret integration af en attB-flankeret last og 2) RMCE af en konstruktion flankeret af omvendte attB-steder i genomet af Anopheles dockinglinjer. Dette opnås ved at anvende to plasmider: et donorattB-mærket plasmid, der bærer transgenet af interesse, og et hjælperplasmid, der udtrykker φC31-integrasen . De vigtigste malariavektorer An. gambiae og An. stephensi bruges som specifikke eksempler, men disse protokoller gælder for andre Anopheles-arter .
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig01.jpg"> Figur 1. Site-rettede genommodifikationer, enkelt integration og rekombinase-medieret kassetteudveksling (RMCE) , ved hjælp af φC31-systemet. φC31-integrasen (INT, grå dobbeltpil) katalyserer rekombinationen mellem attB-stedet (e) (lilla stribet), der er til stede i et donorplasmid, og attP-stedet (e) (blåstribet), der er til stede i en modtagende dockinglinje, hvilket resulterer i dannelsen af hybridsteder attL og attR. A) Integration opnås, når enkelte attB- og attP-steder rekombineres og resulterer i tilstedeværelsen af to integrerede markører (blå og rød). B) RMCE opstår, når to attB/P-steder rekombineres samtidigt og resulterer i udskiftning af kassetten mellem dockinglinjens att-steder (blå markør) med den, der bæres af donorplasmidet (rød markør). C) Partielle nukleotidsekvenser af attP (blå) og attB (lilla) og hybridstederne attL/R. Rekombination sker mellem 'TT' kernesekvenserne fremhævet med fed sort. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL eppendorf tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well microslides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MARI1216690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree&#160;Plasmid&#160;Maxi&#160;Kit (10)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Absolute, Molecular Biology Grade</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter set CFP for Leica MZ FLIII Excitation 436/20 nm, extinction 480/40 nm</td>
			<td>Leica</td>
			<td>10446363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter set dsRED for Leica MZ FLIII Excitation 545/30 nm, extinction 620/60 nm</td>
			<td>Leica</td>
			<td>10447079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter set YFP customised for Leica MZ FLIII</td>
			<td>Omega Optical</td>
			<td>500QM25, 500QM35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 27</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 700</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium&#160;chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium&#160;Acetate&#160;Solution (3 M),&#160;pH&#160;5.2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Life Technologies)</td>
			<td>R1181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stable brush Size 0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

site-directed &#966;c31-mediated integration and cassette exchange in anopheles vectors of malaria

Funktionel genomisk analyse og relaterede strategier til genetisk kontrol af malaria er afhængige af validerede og reproducerbare metoder til nøjagtigt at ændre genomet af Anopheles myg. Blandt disse metoder muliggør φC31-systemet præcis og stabil stedstyret integration af transgener eller substitution af integrerede transgene kassetter via rekombinasemedieret kassetteudveksling (RMCE). Denne metode er afhængig af virkningen af Streptomyces φC31 bakteriofagintegrase for at katalysere rekombination mellem to specifikke fastgørelsessteder betegnet attP (afledt af fagen) og attB (afledt af værtsbakterien). Systemet bruger et eller to attP-steder, der tidligere er blevet integreret i myggegenomet og attB-stedet (e) i donorskabelonens DNA. Her illustrerer vi, hvordan man stabilt ændrer genomet af attP-bærende Anopheles-dockinglinjer ved hjælp af to plasmider: en attB-mærket donor, der bærer integrations- eller udvekslingsskabelonen og et hjælperplasmid, der koder for φC31-integrasen. Vi rapporterer to repræsentative resultater af φC31-medieret stedstyret modifikation: den enkelte integration af en transgen kassette i An. stephensi og RMCE i An. gambiae myg. φC31-medieret genommanipulation giver fordelen ved reproducerbar transgenekspression fra validerede, fitnessneutrale genomiske steder, hvilket muliggør komparative kvalitative og kvantitative analyser af fænotyper. Integrationens stedstyrede karakter forenkler også i væsentlig grad valideringen af det enkelte indsættelsessted og parringsordningen for at opnå en stabil transgen linje. Disse og andre egenskaber gør φC31-systemet til en væsentlig komponent i det genetiske værktøjssæt til transgen manipulation af malariamyg og andre insektvektorer.

Protokollen illustreret her gør det muligt at generere en stabil Anopheles transgen linje i ~ 10 uger (forudsat en 21-dages myg livscyklus).
Efterinjektion larver ruge satser i An. gambiae forventes at være generelt lavere end An. stephensi, men ruge satser mellem 10-50% er blevet rapporteret9,20,24,26,33,43,47. I betragtning af en passende injektionsteknik er udklækningshastigheder på ≥20% generelt tilstrækkelige til at give transformerende stoffer. Embryonernes DNA-optagelse kan vurderes ved at screene unge larver for forbigående ekspression af fluorescerende markør. I vellykkede RMCE-eksperimenter i An. gambiae ved hjælp af 3xP3-promotoren viste op til 50% af de overlevende G0-larver episomal ekspression af markøren i analpapillerne48.
Generaliserede estimater af transformationseffektivitet er vanskelige at evaluere blandt laboratorier og endda blandt eksperimenter, da transformation afhænger af et komplekst samspil mellem variabler, herunder renhed, koncentration, størrelse og potentiel toksicitet af det injicerede DNA, ægkvalitet, håndtering af æg før og efter injektion af æg, myggeopdræt og vigtigst af alt operatørens erfaring. Transformationshastigheder på op til 7% er opnået for RMCE i An. gambiae (beregnet som antallet af uafhængige transformationsbegivenheder i de samlede G0-individer) 9,26,33 og op til 2,2% transformationshastighed for integration i An. stephensi. Vi foreslår at injicere mindst 500 embryoner, hvilket skal føre til udklækning af mindst 100 G0 larver og til 2-7 G0 voksne grundlæggere, hvorfra stabilt transformerede afkom kan opnås. Ved screening for forbigående ekspression i G0-larver kan der forventes op til 40 positive larver.
Eksempler på fænotypisk validering af transformation via screening af fluorescerende markører reguleret af 3xP3-promotoren er rapporteret i figur 4 og  figur 5. Figur 4 viser en ny An. stephensi-linje opnået ved indsættelse af en DsRed-mærket kassette i en dockinglinje mærket med CFP (80.9, tabel 1), hvilket resulterer i, at G1-afkom udtrykker begge markører som angivet af den røde og blå fluorescens, der er detekteret i øjnene.
RMCE-design forventes i stedet at resultere i udskiftning af markøren, der oprindeligt blev indsat i dockinglinjen, med donorplasmidets. Figur 5A og  figur B illustrerer denne markørudveksling i en An. gambiae-dockinglinje markeret med den fælles fiskeripolitik (A11, tabel 1), hvor cfp-markøren efter en vellykket RMCE går tabt, og YFP-markøren erhverves, hvilket resulterer i gul (men ikke blå) øjen- og nervestrengsfluorescens33. Lejlighedsvis kan RMCE resultere i en enkelt integrationshændelse i stedet for udveksling af den ønskede transgene kassette som illustreret i figur 5C, hvor en larve mærket med både den oprindelige fælles fiskeripolitik og de nye YFP-markører vises. Det rapporteres, at op til 50% af det samlede antal transformationsbegivenheder er enkeltintegrationer9,33.
Ved screening for tilstedeværelsen af en fluorescerende markør er det afgørende at skelne dens signal fra mulig baggrundsautofluorescens. Dette er især vigtigt, når man bruger den fælles fiskeripolitik, da Anopheles-larver udviser naturlig blå autofluorescens (figur 6A). Det er nødvendigt at øge forstørrelsen og fokusere på væv og organer, hvor fluorescens forventes at blive drevet af promotoren, for at identificere ægte CFP-positive individer som illustreret i figur 6B ved hjælp af 3xP3-CFP-markøren.
Individuelle transformanter vurderes endelig molekylært via PCR for at bekræfte det forventede indsættelsessted. Figur 7 viser PCR-validering hos individer fra en udveksling An. gambiae-linje , der viser de to potentielle orienteringer for indsættelse i myggens genom33.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig04.jpg"> Figur 4. Validering af φC31 enkelt integration i An. stephensi larver (dorsal visning). A) Dockinglinjen (80.9, tabel 1) udtrykker den fælles fiskeripolitik i øjnene i henhold til reguleringen af 3xP3-promotoren . B) En vellykket integration resulterer i udtryk for den nyerhvervede DsRed samt den oprindelige markør for den fælles fiskeripolitik i øjnene. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig05.jpg"> Figur 5. Validering af φC31 RMCE i An. gambiae larver (ventral visning). A) Dockinglinjen (A10, tabel 1) udtrykker den fælles fiskeripolitik under reguleringen af 3xP3-promotoren i øjnene (e) og nerveledningen (nc)5. B) En vellykket RMCE resulterer i ombytning af fluorescerende markører fra den fælles fiskeripolitik til YFP33. C) Enkelt integrationshændelse opstod under RMCE-eksperimentet, hvor den transformerende larve udtrykker både den fælles fiskeripolitik og YFP-markørerne. Denne larve bærer GAL4 / UAS-komponenter, der forårsager et bredt ekspressionsmønster af YFP, især stærk i mavemusklerne (am). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig05large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig06.jpg"> Figur 6. CFP autofluorescens i An. gambiae larver (dorsal visning). A) Side om side-billede af en positiv (CFP+) og en negativ (CFP-) L4-larve ved hjælp af den fælles fiskeripolitiks filter. B) Nærbillede af larveøjnene, der afslører en CFP+ vs CFP-individ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig06large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig07.jpg"> Figur 7. Molekylær validering af orienteringen af kassetteindsættelse i repræsentativ transgen An. gambiae skabt af φC31 RMCE. Den transgene kassette kan indsættes i en af to alternative retninger (A eller B) i forhold til indsættelsesstedet. Hver PCR-reaktion (I - IV) bruger en kombination af primere (5-8)33 designet til at give et diagnostisk forstærkningsfragment for hver orientering som angivet i de skematiske plasmidkort. T1: repræsentativ transgen individuel bæreretning af indsættelse A; T2: repræsentativ transgen individuel bæreorientering af indsættelse B; WT: vildtype; DL: dockinglinje; -: reaktion negativ kontrol, hvor vand blev brugt som skabelon. Dette tal er ændret fra Adolfi et al. (2019)33. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig07large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Art</td>
			<td>Stamme</td>
			<td>Navn</td>
			<td>attP(s)</td>
			<td>Kromo-nogle</td>
			<td>Promotor-markør</td>
			<td>Oprindelsesinstitution</td>
			<td>Henvisning</td>
		</tr>
<tr>
<td>An. stephensi</td>
			<td>Indiana
</td>
			<td>26.10b
</td>
			<td>Enlig</td>
			<td>2R</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>Univ. af Californien Irvine</td>
			<td>25</td>
		</tr>
<tr>
<td>An. stephensi</td>
			<td>Indiana
</td>
			<td>44Cb
</td>
			<td>Enlig</td>
			<td>X</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>Univ. af Californien Irvine</td>
			<td>23, 24</td>
		</tr>
<tr>
<td>An. stephensi</td>
			<td>Indiana
</td>
			<td>80,9b
</td>
			<td>Enlig</td>
			<td>2L</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>Univ. af Californien Irvine</td>
			<td>Denne undersøgelse</td>
		</tr>
<tr>
<td>An. gambiae</td>
			<td>G3</td>
			<td>113</td>
			<td>Enlig</td>
			<td>2R</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>Univ. af Californien Irvine</td>
			<td>Denne undersøgelse</td>
		</tr>
<tr>
<td>An. gambiae</td>
			<td>KIL</td>
			<td>Ec
</td>
			<td>Enlig</td>
			<td>3R</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>Keele Univ.</td>
			<td>19, 43</td>
		</tr>
<tr>
<td>An. gambiae</td>
			<td>G3</td>
			<td>X1</td>
			<td>Enlig</td>
			<td>2L</td>
			<td>Ingen markør</td>
			<td>Univ. af Strasbourg</td>
			<td>22</td>
		</tr>
<tr>
<td>An. gambiae</td>
			<td>G3</td>
			<td>YAttP</td>
			<td>Enlig</td>
			<td>Y</td>
			<td>3xP3-RFP</td>
			<td>4 stjerner</td>
			<td>21</td>
		</tr>
<tr>
<td>An. gambiae</td>
			<td>G3</td>
			<td>A10b
</td>
			<td>Dobbelt</td>
			<td>2R</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>Liverpool Skole Trop.</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>An. gambiae</td>
			<td>G3</td>
			<td>A11b
</td>
			<td>Dobbelt</td>
			<td>2R</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>Liverpool Skole Trop.</td>
			<td>9</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="8">en. Stamme fra Johns Hopkins University (gave fra M. Jacobs-Lorena) og i kultur ved Univ. of California Irvine i >20 år.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="8">b. Disse linjer er tilgængelige fra forfatterne efter rimelig anmodning.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="8">c. Denne linje er tilgængelig på BEI-lageret www.beiresources.org som MRA-1163.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1. Anopheles attP docking linjer.

Watch this Scientific Journal Video about Site-Directed Ãâ€ C31-Mediated Integration and Cassette Exchange in Anopheles Vectors of Malaria at JoVE.com

Site-Directed ÃƒÂÃ¢â‚¬Â C31-Mediated Integration and Cassette Exchange in Anopheles Vectors of Malaria

Protokollen beskriver, hvordan man opnår stedstyrede modifikationer i genomet af Anopheles malaria myg ved hjælp af φC31-systemet . De beskrevne modifikationer omfatter både integration og udveksling af transgene kassetter i genomet af attP-bærende dockinglinjer.

Site-Directed φC31-medieret integration og kassetteudveksling i anopheles vektorer af malaria

Functional genomic analysis and related strategies for genetic control of malaria rely on validated and reproducible methods to accurately modify the ...

Denne protokol understøtter karakteriseringen af myggegenernes rolle involveret i en række fysiologiske veje, herunder for eksempel insektresistens og malariaparasitudvikling. Metoden driver transgenindsættelse i enkelte prækarakteristikerede genomiske steder og gør det derfor muligt direkte at sammenligne fænotyper som følge af alternative transgener effektivt at undgå spørgsmålet om positionseffekt. Denne metode kan anvendes på en række insektarter af folkesundhedsmæssig og landbrugsmæssig betydning, og dens anvendelser strækker sig bredt fra bakterier til pattedyrceller.Begynd med at designe attB-donorplasmider, der bærer den dominerende fluorescerende markør, attB-rekombinationssteder og den ønskede transgene last. Brug et enkelt attB-sted til integration af hele plasmidet, der bærer den transgene kassette eller to omvendte attB-steder til kassetteudveksling. Rens donor- og hjælperplasmider ved hjælp af et endotoksinfrit rensningssæt.Kombiner det attB-mærkede donorplasmid, der bærer transgenet af interesse, og hjælperplasmidet, der bærer integrasen, for at opnå en blanding med en endelig koncentration på 350 nanogram pr. Mikroliter af donorplasmidet og 150 nanogram pr. Mikroliter af hjælperplasmidet. Udfælde DNA'et ved at tilsætte 0,1 volumen af tre molære natriumacetat og 2,5 volumener iskold 100% ethanol og derefter hvirvel. Et hvidt bundfald skal være umiddelbart synligt.Vask pelleten og resuspend den i injektionsbuffer for at nå en samlet endelig koncentration på 500 nanogram pr. Mikroliter. Forbered derefter alikvoter på 10-15 mikroliter hver og opbevar dem ved negative 20 grader Celsius. Blod fodrer fire til syv dage gamle myg fra den ønskede dockinglinje og deres vildtype modstykker 72 timer før mikroinjektion.Udfør Anopheles gambiae embryo mikroinjektioner i 25 millimolær natriumchlorid ved at målrette embryoets bageste pol i en 45 graders vinkel. Udfør Anopheles stephensi embryo mikroinjektioner i halocarbonolie ved at målrette mod den bageste pol i en 30 graders vinkel. Umiddelbart efter injektion overføres æggene til en petriskål fyldt med sterilt destilleret vand og returneres til insektforhold.Ved udklækning overføres G0 larve til en bakke med saltet destilleret vand dagligt og bagud til pupper. Sorter G0-pupper efter køn under et stereoskop. Lad hannerne dukke op i separate bure i grupper på tre til fem og tilføj et tifoldigt overskud af aldersmatchede vildtypehunner.Lad hunnerne dukke op i separate bure i grupper på 10 til 15 år, og tilføj et lige antal aldersmatchede vildtypehanner. Tillad voksne at parre sig i fire til fem dage og give kvinder et blodmåltid. Saml æggene og bagved nye næste generations G1'er.Saml G1-, L3- og L4-larven i en petriskål foret med vådt filterpapir eller på et mikroskopdias, og afskærm dem ved hjælp af et fluorescerende stereoskop for tilstedeværelsen af markøren, der blev introduceret med den attB-mærkede last. For enkelt attB-design skal du screene for tilstedeværelsen af den nye og allerede eksisterende markør. For dobbelt attB-design til kassetteudveksling, skærm for tilstedeværelsen af den nye markør og tabet af den allerede eksisterende.Sorter transformerede G1-pupper efter køn og kryds dem en masse med modsatte køn aldersmatchede vilde type individer. Tillad voksne at parre sig i fire til fem dage og give et blodmåltid. Ved enkeltintegrationseksperimenter skal du samle æg direkte fra massekrydset.Ved kassetteudvekslingsforsøg skal du indsamle æg fra enkelte hunner og holde afkom adskilt, indtil molekylær vurdering er afsluttet på grund af den potentielle tilstedeværelse af to alternative kassettenorienteringer. Screen G2-afkom for tilstedeværelsen af den fluorescerende markør og afsæt en delmængde af G2-positive individer til molekylær analyse. Bag resten til voksenalderen.Udfør molekylær validering af indsættelsesstederne med PCR som beskrevet i tekstmanuskriptet. Ved enkelt integration skal det sikres, at det forudsagte indsættelsessted bærer den oprindelige dockingkonstruktion plus hele sekvensen af donorplasmidet mellem de to hybridsteder attL og attR. Ved kassetteudveksling skal det sikres, at det forudsagte indsættelsessted er identisk med dockinglinjens, hvor hybride omvendte attL-steder erstatter de oprindelige omvendte attP-steder, og udvekslingsskabelonen erstatter kassetten, der oprindeligt var til stede mellem dem.Protokollen blev brugt til at generere en stabil Anopheles transgen linje på cirka 10 uger. Fænotypisk validering af transformation blev udført ved screening for fluorescerende markører reguleret af 3xP3-promotoren er vist her. En ny Anopheles stephensi-linje blev opnået ved indsættelse af en DS-rød markeret kassette i en dockinglinje markeret med CFP, hvilket resulterede i, at G1-afkom udtrykte begge markører som angivet af den røde og blå fluorescens i øjnene.Kassetteudvekslingsdesign resulterer i udskiftning af markøren, der oprindeligt blev indsat i dockinglinjen, med donorplasmidets. Denne markørudveksling blev demonstreret i en Anopheles gambiae-dockinglinje, hvor CFP-markøren gik tabt, og YFP-markøren blev erhvervet, hvilket resulterede i gul øjen- og nervestrengsfluorescens. Lejlighedsvis kan RMCE resultere i en enkelt integrationshændelse i stedet for udveksling af den ønskede transgene kassette, hvor en larve er markeret med både den oprindelige fælles fiskeripolitik og de nye YFP-markører.Ved screening for tilstedeværelsen af en fluorescerende markør er det afgørende at skelne dens signal fra mulig baggrundsautofluorescens. Det er nødvendigt at øge forstørrelsen og fokusere på væv og organer, hvor fluorescens forventes at blive drevet af promotoren, for at identificere ægte cfp-positive individer. Individuelle transformanter blev også vurderet molekylært via PCR for at bekræfte det forventede indsættelsessted.PCR-validering hos personer fra en udveksling Anopheles gambiae-linje er vist her. Selv passende mikroinjektionsteknik, nøjagtigt design og forberedelse af donor- og hjælperplasmiderne samt at følge den passende myggeholdsordning er nøglen til opnåelse af transgene individer. Denne procedure kan bruges til at indsætte elementer, der forårsager genekspression eller hæmning, for eksempel GAL4 / UAS-systemet, samt gene drive-elementer og antipatogenmolekyler til myggegenetisk kontrol.

Research

JoVE Journal

Genetics

Site-Directed &#966;C31-Mediated Integration and Cassette Exchange in Anopheles Vectors of Malaria

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

siRNA transfektion og EMSA Analyser på frisk isoleret humant villus cytotrophoblaster

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Parallel Måling af døgnrytmen ur genekspression og hormon sekretion i Human primære cellekulturer

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Tilfældig mutagenese ved anvendelse histon-miniSOG i<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Opdræt og dobbelt-strenget RNA-medieret Gene Knockdown i Skjul Beetle,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

Tovejs Retroviral Integration Site PCR Metode og Quantitative Data Analysis Workflow

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions

Retroviral Scanning: Kortlægning af MLV Integration Sites til at definere Cell-specifikke Regulatory Regions

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-medieret målrettede Integration In Vivo ved hjælp af en homologi-medieret End at deltage-baseret strategi

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

En protokol til produktion af Integrase-mangelfuld Lentiviral vektorer for CRISPR/Cas9-medieret gen Knockout i dividere celler

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 gen redigering at gøre betinget mutanter af menneskelige Malaria parasitten, P. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Kendetegner Histon posttranslationel modifikation ændringer i gær Neurodegenerative Proteinopathy modeller

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...