We zijn Kiona Parker (UCI) dankbaar voor het leveren van beelden van transgene An. stephensi larven, en Fraser Colman (LSTM) en Beth Poulton (LSTM) voor het leveren van transgene An. gambiae larven. Beth Poulton (LSTM) heeft ook kostbare hulp geboden bij het in beeld brengen van An. gambiae larven. Dit werk werd gefinancierd door het Tata Institute for Genetics and Society (TIGS) en het LSTM's Director Catalyst Fund toegekend aan A.A. (DCF2014AA). A.A.J. is een Donald Bren Professor aan de Universiteit van Californië, Irvine.

OPMERKING: Een schematische workflow van het geïllustreerde protocol wordt weergegeven in figuur 2.
1. Ontwerp van φC31 attB -tagged plasmiden (figuur 3)
<ol><li>Maak attB-donorplasmiden met de volgende essentiële componenten<ol>
<li>Dominante fluorescerende marker<ol>
<li>Kies een promotor om de expressie van de fluorescerende marker aan te sturen. OPMERKING: Voor Anopheles-transgenese vallen fluorescerende markers meestal onder de regulatie van de 3xP3 promoter39, die de expressie in de ogen en het zenuwkoord stimuleert. Als alternatief kan de PUBc promoter5 worden gebruikt wanneer expressie in meerdere weefsels gewenst is. Donorplasmiden en dockinglijnen die als voorbeelden in dit protocol worden gebruikt, worden gemarkeerd met behulp van de 3xP3-promotor .</li>
			<li>Kies een fluorescerend eiwit (FP) dat compatibel is met dat van de ontvangende dockinglijn, zodat ze gemakkelijk te onderscheiden zijn. OPMERKING: Gebruik niet dezelfde marker die al aanwezig is in de dockinglijn en vermijd het gelijktijdige gebruik van GFP (groen) / YFP (geel) en GFP (groen) / CFP (cyaan) omdat ze zeer moeilijk betrouwbaar te onderscheiden zijn. Donorplasmiden die als voorbeeld in dit protocol worden gebruikt, zijn gemarkeerd met DsRed of YFP omdat ze moeten worden geïntegreerd in een dockinglijn gemarkeerd met CFP.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
attB recombinatieplaats(en)<ol>
<li>Gebruik één attB-site voor de integratie van een transgene cassette (single-attB-ontwerp) (figuur 3A).</li>
			<li>Gebruik twee omgekeerde attB-locaties voor RMCE (double-attB-ontwerp ) waarbij de sites omgekeerd ten opzichte van elkaar liggen en omsluit het donor-DNA-sjabloon (figuur 3B). OPMERKING: De oriëntatie van de attB-locatie (s) moet(en) compatibel zijn met die van de attP-site (s) die in de dockinglijn aanwezig zijn.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Gewenste transgene lading<ol>
<li>Gebruik alle andere gewenste functies die in het muggengenoom moeten worden geïntegreerd op basis van het specifieke doel van het experiment. Hier beschrijven we de integratie van een antimalaria-effectormolecuul in het genoom van An. stephensi en de integratie van de componenten van het GAL4/UAS-systeem in An. gambiae muggen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Plasmide backbone componenten<ol>
<li>Omvatten, naast andere essentiële componenten voor plasmidereplicatie in bacteriën, een marker voor plasmideselectie in vitro (d.w.z. een antibioticaresistentiegen). OPMERKING: De plasmide-backbone zal worden geïntegreerd in het muggengenoom in het single-attB-ontwerp voor integratie (figuur 3A), terwijl het niet zal worden ingevoegd in het double-attB-ontwerp voor RMCE (figuur 3B).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Bereiding van plasmiden voor het micro-injectiemengsel
OPMERKING: Het hier geïllustreerde protocol omvat het gebruik van twee plasmiden: een attB-gelabeld donorplasmide dat het transgen van belang draagt, en een helperplasmide dat het φC31-integrase tot expressie brengt onder de regulatie van de Drosophila Hsp70 promoter40.
<ol><li>Zuiver donor- en helperplasmiden met behulp van een endotoxinevrije plasmidezuiveringskit. OPMERKING: Sequentieer het laatste plasmidepreparaat dat wordt gebruikt voor injectie om de integriteit van alle componenten te verifiëren.</li>
	<li>Combineer de juiste hoeveelheden van de twee plasmiden om een mengsel te verkrijgen met een eindconcentratie van 350 ng/μL van het donorplasmide en 150 ng/μL van het helperplasmide wanneer het in de injectiebuffer wordt geresuspendeerd. OPMERKING: Houd er bij het berekenen van het benodigde volume van de mix rekening mee dat 10-15 μL voldoende is voor elke dag geplande injecties en DNA kan van tevoren worden bereid en opgeslagen bij -20 °C. Integrase helper plasmideconcentraties van 60-500 ng/μL en donorplasmideconcentraties van 85-200 ng/μL zijn ook gemeld21,22,26,41.</li>
	<li>Precipiteer het DNA door 0,1 volumes 3 M natriumacetaat (pH 5,2) en 2,5 volumes ijskoude 100% EtOH en vortex toe te voegen. Een wit neerslag moet onmiddellijk zichtbaar zijn. Het hebben van sterk geconcentreerde initiële plasmidepreparaten (d.w.z. ~ 1 μg / μL) verbetert de neerslagefficiëntie. OPMERKING: Stoppunt - Het neerslag kan 's nachts bij -20 °C worden bewaard.</li>
	<li>Centrifugeer bij 15.000 x g gedurende 20 min bij 4 °C, gooi het supernatant weg en was de pellet met 1 ml ijskoude 70% EtOH.</li>
	<li>Was de pellet met 1 ml ijskoude 70% EtOH en centrifugeer op 15.000 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Gooi het supernatant weg zonder de pellet te verstoren en droog aan de lucht.</li>
	<li>Resuspend de pellet in 1x injectiebuffer (0,1 mM Na3PO4, 5 mM KCl, pH 7,2, 0,22 μm filter gesteriliseerd) om een totale eindconcentratie van 500 ng/μL te bereiken. OPMERKING: Ga ervan uit dat er wat DNA verloren gaat tijdens het precipitatieproces; voeg daarom eerst een kleiner volume injectiebuffer toe, controleer de concentratie op een spectrofotometer (bijv. Nanodrop) en voeg vervolgens een geschikt restvolume toe om 500 ng/μL te bereiken.</li>
	<li>Zorg ervoor dat het DNA grondig wordt geresuspendeerd, bereid aliquots van elk 10-15 μL en bewaar ze bij -20 °C.</li>
	<li>Ontdooi op de dag van injectie één aliquot en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 15.000 x g om eventuele deeltjesresten te verwijderen. OPMERKING: Een alternatieve methode voor deeltjesverwijdering is om de oplossing te filteren door een filter van 0,22 μm. Vermijd de aanwezigheid van deeltjesresiduen in het injectiemengsel omdat deze leiden tot naaldblokkade tijdens embryonale micro-injectie.</li>
</ol>3. Micro-injectie van embryo's van een Anopheles docking lijn
<ol><li>Bloedvoer 4-7 dagen oude muggen van de gewenste dockinglijn 72 uur voorafgaand aan micro-injectie (d.w.z. voor injectie op maandag en dinsdag voeden vrouwtjes op de vorige vrijdag; voor injectie op donderdag en vrijdag voeden vrouwtjes op maandag van dezelfde week).</li>
	<li>Bloed voedt wild-type (WT) muggen (d.w.z. muggen met dezelfde genomische achtergrond van de dockinglijn) op dezelfde dag; deze zullen nodig zijn voor outcrossing. OPMERKING: De grootte en kwaliteit van het bloedmeel beïnvloeden de eikwaliteit, dus het wordt aanbevolen om altijd vers bloed te gebruiken (d.w.z. bloed dat in de voorgaande 7 dagen is afgenomen). Armvoeding of voeding op muizen kan de kwaliteit en kwantiteit van eieren verhogen, maar deze methoden worden niet aangemoedigd. Voor menselijk en dierlijk gebruik zijn specifieke goedgekeurde protocollen nodig.</li>
	<li>Embryo micro-injecties uitvoeren<ol>
<li>Voer an. gambiae embryo micro-injecties uit in 25 mM NaCl42 door de achterste pool van het embryo in een hoek van 45 graden te richten. Voor een gedetailleerd protocol voor embryoverzameling, uitlijning en micro-injectie verwijzen we naar Pondeville et al.43 en Lobo et al.44.</li>
		<li>Voer an. stephensi embryo-micro-injecties uit in halocarbon olie 700:27 (2:1) door de achterste pool van het embryo in een hoek van 30 graden te richten. Een gedetailleerd protocol voor het verzamelen, uitlijnen en micro-injectie van embryo's is te vinden in Terenius et al.45 en Lobo et al.44.</li>
		<li>Breng de eieren onmiddellijk na injectie over in een petrischaaltje gevuld met steriel gedestilleerd water (pH 7,2) en breng ze terug naar insectenachtige omstandigheden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Breng bij het uitkomen dagelijks G0-larven over in een bak met gezouten gedestilleerd water (0,1% tonisch zout) en breng terug naar poppen.</li>
	<li>Registreer de uitkomstsnelheid (d.w.z. het aantal larven dat is uitgekomen / het aantal geïnjecteerde embryo's). OPMERKING: Embryobeweging helpt bij het uitkomen, dus zacht wervelen is wenselijk. Het uitkomen moet ~ 48 uur na injectie beginnen. Omdat injectie een lichte ontwikkelingsachterstand kan veroorzaken, is het raadzaam om gedurende 3-4 dagen te blijven controleren op laat uitbroedende larven.</li>
</ol>4. Kruising en screening van getransformeerde individuen
<ol><li>[OPTIONELE STAP] Screen G0 (geïnjecteerd) 1e of 2e instarlarven (L1-L2) voor voorbijgaande expressie van de fluorescerende marker.<ol>
<li>Gebruik een fijnpuntige glazen pipet om G0 L1-L2-larven over te brengen naar een microscoopglaasjes met putjes. Plaats één larve in elke put.</li>
		<li>Gebruik een fluorescentieserop met het juiste filter om te screenen op de aanwezigheid van voorbijgaande expressie van de fluorescerende marker. OPMERKING: Het patroon van voorbijgaande expressie wordt gedicteerd door de gebruikte promotor. Bij gebruik van de 3xP3 promotor is de voorbijgaande expressie van de fluorescerende marker zichtbaar in de anale papillen (zie figuur 6 in Pondeville et al.43)</li>
		<li>Achterste G0 positieve individuen afzonderlijk.</li>
	</ol></li>
	<li>Sorteer G0-poppen op geslacht onder een stereoscoop52.</li>
	<li>Laat mannetjes in aparte kooien tevoorschijn komen in groepen van 3-5 (oprichtersfamilies) en voeg een 10-voudig overschot aan leeftijdsgematchte WT-vrouwtjes toe. OPMERKING: Aangezien mannetjes meerdere keren paren, is het belangrijk om een overmaat aan WT-vrouwtjes te bieden om de paringskansen van elk mannetje te maximaliseren.</li>
	<li>Laat vrouwtjes in aparte kooien tevoorschijn komen in groepen van 10-15 (oprichtersfamilies) en voeg een gelijk aantal op leeftijd afgestemde WT-mannetjes toe. OPMERKING: Als er beperkte ruimte is in het insectarium, kunnen vrouwtjes allemaal samen in één kooi tevoorschijn komen. De verhouding tussen vrouw en man kan zo laag zijn als 1 man tot 3 vrouwtjes.</li>
	<li>Laat volwassenen 4-5 dagen paren en voorzie vrouwtjes van een bloedmaaltijd. OPMERKING: Bloed voedt en verzamelt eieren van G0-vrouwtjes meerdere keren om de kans op het krijgen van transformanten uit meerdere gonotrofe cycli te maximaliseren.</li>
	<li>Bloed voedT WT-individuen tegelijkertijd voor outcrossing.</li>
	<li>Verzamel eieren en fok opkomende G1's van de volgende generatie.</li>
	<li>Screen G1 L3-L4 larven op geschikte fluorescentie om transformanten te identificeren.<ol>
<li>Verzamel larven in een petrischaaltje bekleed met filterpapier of op een microscoopglaasje en scherm met behulp van een fluorescerende stereoscoop met geschikte filters voor de aanwezigheid van de marker die met de attB-gelabelde lading is geïntroduceerd. OPMERKING: Fluorescentie aangedreven door de 3xP3-promotor is zichtbaar in alle postembryonische stadia en de screening kan worden uitgevoerd op jongere larven, maar deze zijn kwetsbaarder en moeten relatief voorzichtig worden behandeld. Poppen kunnen ook worden gescreend.<ol>
<li>Voor single-attB-ontwerpen voor integratiescherm voor de aanwezigheid van de nieuwe en reeds bestaande marker; ze moeten beide aanwezig zijn, aangezien de nieuwe cassette naast de originele is geplaatst (figuur 3A, figuur 4).  OPMERKING: Screeningsuitzondering voor afzonderlijke attB-ontwerpen: Wanneer u markeringsloze koppelingslijnen22 gebruikt, moet u alleen op de aanwezigheid van de nieuwe markering screenen. Bij het gebruik van dockinglijnen waarbij integratie resulteert in de inactivering van de reeds bestaande marker21, screent u op de aanwezigheid van de nieuwe marker en het verlies van de reeds bestaande marker.</li>
			<li>Voor dubbel-attB-ontwerpen voor RMCE, scherm voor de aanwezigheid van de nieuwe marker en het verlies van de reeds bestaande marker, mag alleen de nieuw geïntroduceerde marker aanwezig zijn, aangezien de nieuwe cassette de originele vervangt (figuur 3B, figuur 5). OPMERKING: Incidentele integratiegebeurtenissen kunnen worden hersteld in RMCE-experimenten waarbij slechts één attP opnieuw wordt gecombineerd en dus beide markers aanwezig zijn. De screening van G1-individuen kan ook in het popstadium worden uitgevoerd volgens dezelfde procedure52.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Breng getransformeerde G1-individuen over in een larvale lade en achterste naar poppen. Gooi niet-fluorescerende personen en personen met een onverwacht markerexpressiepatroon weg.</li>
	<li>Sorteer getransformeerde G1-poppen op geslacht en kruis ze massaal met WT-individuen van het andere geslacht.</li>
	<li>Laat volwassenen 4-5 dagen paren, zorg voor een bloedmaaltijd, verzamel de eieren en fok de volgende generatie G2-nakomelingen .<ol>
<li>Voor enkelvoudige integratie-experimenten, verzamel eieren rechtstreeks van het en masse kruis, omdat de integratieplaats identiek is in alle individuen.</li>
		<li>Verzamel voor RMCE-experimenten eieren van enkele vrouwtjes en houd nakomelingen gescheiden totdat de moleculaire beoordeling is voltooid vanwege de mogelijke aanwezigheid van twee alternatieve cassetteoriëntaties (figuur 3B).</li>
	</ol></li>
	<li>Screen het G2-nageslacht (in het larve- of popstadium) op de aanwezigheid van de fluorescerende marker (50% van de individuen zal naar verwachting positief zijn), gooi niet-fluorescerende nakomelingen weg.</li>
	<li>Zet een subset van G2-positieve individuen opzij voor moleculaire analyse, breng de rest naar volwassenheid. OPMERKING: Als alle G2-individuen in leven moeten worden gehouden, kan moleculaire analyse worden uitgevoerd op de benen van één volwassene46 of DNA-extracties van popgevallen (L. Grigoraki persoonlijke communicatie). Als alternatief kan moleculaire analyse worden uitgevoerd nadat alle G2-individuen oviposited en eieren zijn uitgekomen.</li>
	<li>Laat volwassen mannetjes en vrouwtjes elkaar kruisen in dezelfde kooi om de nieuwe transgene lijn tot stand te brengen. OPMERKING: Voor RMCE-experimenten moet volwassen kruising plaatsvinden tussen broers en zussen die afkomstig zijn van een enkele vrouw totdat de oriëntatie van het inbrengen wordt bepaald door moleculaire analyse.</li>
</ol>5. Moleculaire validatie van de inbrengplaats door DNA-amplificatie (PCR)
<ol><li>Maak een kaart van de voorspelde insertieplaats in het genoom van de dockinglijn na transformatie.<ol>
<li>Enkele integratie: Zorg ervoor dat de voorspelde insertieplaats de oorspronkelijke dockingconstructie draagt plus de hele sequentie van het donorplasmide tussen de twee hybride locaties attL en attR (figuur 3A).</li>
		<li>RMCE: Zorg ervoor dat de voorspelde invoegplaats identiek is aan die van de dockinglijn, waar hybride omgekeerde attL-sites de oorspronkelijke omgekeerde attP-sites vervangen en de uitwisselingssjabloon de cassette vervangt die er oorspronkelijk tussen aanwezig was (figuur 3B).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ontwerp oligonucleotideprimers om de insertie-junctie aan weerszijden van de integratielocus te versterken.<ol>
<li>Enkele integratie: Ontwerp oligonucleotideprimerparen die zich over de attR - en/of attL-locaties uitstrekken. Eén primer moet binden aan de eerder geïntegreerde dockingconstructie en de andere aan het nieuw geïntegreerde transgen (figuur 3A).</li>
		<li>RMCE: Cassettevervanging kan plaatsvinden in twee verschillende oriëntaties met betrekking tot het chromosoom (aangeduid als A en B). Ontwerp alternatieve combinaties van 4 oligonucleotideprimers om een discreet product in slechts één van de oriëntaties te geven, waarbij één paar diagnostisch is voor oriëntatie A en het andere voor oriëntatie B (figuur 3B, figuur 6).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Extraheer genomisch DNA van G2-positieve individuen en voer de diagnostische PCR- en gel-elektroforese uit om de aanwezigheid van verwachte diagnostische ampliconen van de voorspelde integratieplaatskaarten te visualiseren. OPMERKING: DNA kan ook worden geëxtraheerd uit de benen van een enkele volwassene46 of popgevallen (L. Grigoraki persoonlijke communicatie).</li>
	<li>Sequence PCR-producten om verwachte sequenties te bevestigen.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig02.jpg"> Figuur 2. Werkstroomdiagram voor locatiegerichte φC31-genoommodificatie bij Anopheles-muggen . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig03.jpg"> Figuur 3. Moleculaire basis van φC31-gemedieerde enkelvoudige integratie (A) en RMCE (B). A) Schematische kaarten van de genomische insertie in een An. stephensi docking lijn (80.9, Tabel 1) met een enkele attP-site en gemarkeerd met CFP (boven), een single-attB design donor plasmide gemarkeerd met DsRed (midden), en de verwachte insertieplaats die resulteert na succesvolle integratie (onder). B) Schematische kaarten van de genomische insertie in een An. gambiae docking lijn (A11, Tabel 1) met twee omgekeerde attP-locaties en gemarkeerd met CFP (boven), een dubbel-attB ontwerp donorplasmide gemarkeerd met YFP (midden), en de verwachte insertieplaats resulterend na succesvolle RMCE (onder). Golvende lijn: muggengenoom; Gestreepte pijlen: piggyBac transposon armen; 3xP3: promotor van de fluorescerende marker; SV40: virale terminator; Ori: oorsprong van replicatie; AmpR: ampicillineresistentiegen. Kruisingslijnen vertegenwoordigen de site(s) van recombinatie tussen attP- en attB-sites. Genummerde zwarte pijlen vertegenwoordigen primerbindingsplaatsen voor de moleculaire validatie van de insertielocus (stap 5 van het protocol). Volledig geannoteerde enkele en dubbele attB-gelabelde plasmiden zijn op aanvraag verkrijgbaar bij de auteurs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het nauwkeurige ontwerp van attB-gelabelde plasmiden die compatibel zijn met de dockinglijn van keuze is van het grootste belang voor het succes van het experiment. Er moet zorgvuldig worden nagedacht over de keuze van de marker die wordt gebruikt voor het screenen van transformanten, inclusief de fluorescentiekleur en het expressiepatroon, dat onderhevig is aan het patroon dat al in de koppelingslijn aanwezig is. Het is noodzakelijk om fluorescerende markers te gebruiken die gemakkelijk te onderscheiden zijn: goede markercombinaties omvatten RFP (rood) / CFP (cyaan), RFP (rood) / GFP (groen), RFP (rood) / YFP (geel) en YFP (geel) / CFP (cyaan), terwijl combinaties om te vermijden YFP (geel) / GFP (groen) en CFP (cyaan) / GFP (groen) zijn. De 3xP3 promoter39, specifiek voor de ogen en zenuwstreng, wordt het meest gebruikt om de expressie van fluorescerende markers voor muggentransgenese aan te sturen. Inderdaad, alle Anopheles-dockinglijnen die momenteel beschikbaar zijn, maken gebruik van deze promotor. Alternatieve regulerende regio's zijn die van het An. gambiae polyubiquitine-gen (PUBc)5 of de virale promotor IE120, die de expressie in meerdere weefsels stimuleren. Bij gebruik samen met 3xP3 zouden deze promotors de mogelijke kleurencombinaties en zelfs het gebruik van dezelfde fluorofoor uitbreiden. De aangegeven promotors zijn actief gedurende de hele levenscyclus van muggen, waardoor screening en fluorescentiemonitoring in alle levensfasen mogelijk zijn. Een extra overweging bij het ontwerpen van plasmide is de grootte van de te integreren of te verwisselen lading. Hoewel het φC31-systeem opmerkelijke draagvermogens heeft18, moet er rekening mee worden gehouden dat de grootte van het donorplasmide over het algemeen negatief correleert met de transformatie-efficiëntie22.
In het beschreven protocol is de bron van integrase een helperplasmide dat het enzym alomtegenwoordig tot expressie brengt40. De alomtegenwoordige aanwezigheid van het integrase kan leiden tot de transformatie van somatische cellen als micro-injecties niet precies worden gericht op het gebied waar de kiembaan zich vormt. Hoewel dergelijke transformatiegebeurtenissen verloren zullen gaan omdat ze niet erfelijk zijn, kunnen somatische effecten de fitheid van geïnjecteerde individuen verminderen. Om dit te voorkomen en de transformatie-efficiëntie te verhogen, kan de expressie van integrase worden beperkt tot de kiembaan, bijvoorbeeld door gebruik te maken van de vasa promoter22,26. Andere protocollen beschrijven het gebruik van in vitro getranscribeerd boodschapper-RNA (mRNA) als bron van φC31 integrase19,24,43. Dit omvat echter de moeizame bereiding van mRNA en vereist een zorgvuldige behandeling van het injectiemengsel en het gebruik van RNase-vrije reagentia om afbraak te voorkomen. Plasmide bronnen van integrase zijn aangetoond in zowel An. gambiae9,21,22,26,33,37 en An. stephensi (A.A. persoonlijke communicatie) betrouwbaar te zijn en leiden tot efficiënte transformatie, en zijn daarom onze voorkeursoptie. Een andere optie voor integraseafgifte is de in vivo productie in zelfdockinghulplijnen. Dergelijke lijnen werden gecreëerd in An. gambiae die de φC31 integrase uitdrukken onder de regulatie van de kiembaanspecifieke promotor nano's en bleken te leiden tot een verbeterde overleving en transformatie-efficiëntie20. Er moet echter rekening worden gehouden met mogelijke fitheidsbelastingen die worden opgelegd door de in vivo productie van het integrase-enzym op de hulplijn.
Net als bij andere transgene technieken moet speciale aandacht worden besteed aan het fokken en kruisen van personen die afkomstig zijn van geïnjecteerde embryo's om de kansen op herstel van transformanten te maximaliseren. Individuen die het transgen stabiel hebben geërfd, kunnen eerst worden hersteld bij het G1-nageslacht. Vroege tekenen van potentiële transformatie kunnen echter worden geëvalueerd door de aanwezigheid van voorbijgaande episomale expressie van de fluorescerende marker in de anale papillen en/of zenuwstreng van G0 eerste en tweede instarlarven bij gebruik van de 3xP3 promotor43. Hoewel de aanwezigheid van voorbijgaande fluorescentie een succesvolle plasmideafgifte suggereert, garandeert het geen erfelijke kiembaantransformatie. Evenzo sluit het gebrek aan voorbijgaande expressie een succesvolle transformatie niet uit. Niettemin is waargenomen dat tijdelijk positieve individuen meer kans hebben om transgene nakomelingen op te leveren in vergelijking met voorbijgaand negatieve personen43,48. In deskundige handen kan het fokken en kruisen van alleen positieve individuen een optie zijn om het aantal muggen te verminderen. Gezien het belang en de kwetsbaarheid van kleine G0-larven is de minste hoeveelheid manipulatie echter nog steeds aan te raden en wordt het fokken van alle G0-individuen altijd aanbevolen.
Het paringsschema dat in dit protocol wordt gerapporteerd, is ontworpen om de kans op paring te maximaliseren en om onafhankelijke transformatiegebeurtenissen te isoleren. Als insectenruimte of beschikbaarheid van personeel echter een probleem is, kunnen G0-volwassenen per geslacht in enkele kooien worden samengevoegd als er voldoende individuen van het andere geslacht worden verstrekt. Een dergelijke opstelling zal geen discriminatie toestaan tussen meerdere transformatiegebeurtenissen die zich voordoen bij individuen uit dezelfde kooi. Afhankelijk van de experimentele opstelling wordt de aanwezigheid van een dubbele (enkele integratie) of enkele (RMCE) marker verwacht tijdens het screeningsproces. In experimenten met enkele integratie is het belangrijk om de aanwezigheid van de oorspronkelijke marker van de dockinglijn te verifiëren, terwijl het in RMCE belangrijk is om het verlies van de eerder geïntegreerde marker te verifiëren. Het is inderdaad niet ongebruikelijk in RMCE-ontwerpen om transformanten te herstellen waarin enkele integratie in plaats van uitwisseling plaatsvond als gevolg van de recombinatie van een enkele attP-site9,33. Bij dergelijke personen zijn beide fluorescerende markers aanwezig, evenals de hele donorplasmide-ruggengraat, wat het belang benadrukt van het uitvoeren van een grondige screening voor beide fluorescerende markers.
Hoewel de aanwezigheid van verwachte fluorescentiepatronen wijst op een succesvolle transformatie, moet moleculaire karakterisering van de insertieplaats worden uitgevoerd. Om dit te doen, is de voorbereiding van nauwkeurige kaarten van de voorspelde insertielocus, inclusief de flankerende genomische gebieden van de dockinglijn, cruciaal voor het ontwerp van adequate diagnostische oligonucleotideprimers voor gen-amplificatieanalyses. Enkele integratiegebeurtenissen resulteren in de vorming van attR - en attL-hybride locaties op de kruising tussen het nieuw geïntegreerde DNA en de eerder ingebrachte cassette. Deze sites kunnen worden getarget voor validatie van de invoegsite. In RMCE-ontwerpen kan het inbrengen van de donorcassette plaatsvinden in twee alternatieve oriëntaties ten opzichte van de genomische locus, dus vier primers kunnen worden gebruikt in alternatieve PCR-combinaties om te detecteren welke oriëntatie de lijn draagt. Aangezien de oriëntatie van het inbrengen van cassettes van invloed kan zijn op transgenexpressie,is het bij vergelijkende genexpressieanalyse belangrijk om lijnen te gebruiken die dezelfde oriëntatie van insertie hebben.
Bij het werken met lage aantallen transformanten is het misschien niet wenselijk om hele individuen op te offeren voor moleculaire analyse. Een optie hiervoor is het uitvoeren van moleculaire analyse op DNA geëxtraheerd uit de benen van een enkele volwassene46, omdat beenverlies geen invloed heeft op het vermogen van een volwassen vrouw om te paren en oviposit49. Er is echter een risico op beschadiging van het individu tijdens het verwijderen van de benen. Succes is verkregen met behulp van afgedankte popgevallen (L. Grigoraki persoonlijke communicatie), maar de veiligste aanpak is om moleculaire analyse uit te voeren op G2-ouders na het verkrijgen van levensvatbare G3-nakomelingen.
In de afgelopen jaren heeft CRISPR/Cas9 een revolutie teweeggebracht in de manier van het uitvoeren van site-specifieke genoombewerking26,41,50,51. In tegenstelling tot locatiegerichte RMCE zijn CRISPR/Cas9-gemedieerde genintegraties (knock-ins) onafhankelijk van de aanwezigheid van vooraf ingebrachte recombinatieplaatsen met slechts een transformatiegebeurtenis in één stap nodig. Niettemin vertrouwt het CRISPR/Cas9-systeem op de aanwezigheid van grote bekende genomische sequenties die de gewenste insertieplaats flankeren voor succesvol homologisch gericht herstel en op de efficiënte siteherkenning gemedieerd door gids-RNA's. Aan deze voorwaarden kan niet altijd worden voldaan of kan het moeizaam zijn om problemen op te lossen en, gezien de beschikbaarheid van meerdere dockinglijnen in An. gambiae en An. stephensi en lijnen die daarvan zijn afgeleid, blijft het φC31-systeem een zeer waardevol hulpmiddel om directe fenotypische vergelijkingen uit te voeren tussen transgenen op dezelfde genomische locaties.

Het vermogen om het genoom van muggenvectoren van ziekten betrouwbaar en reproduceerbaar te wijzigen, heeft de in vivo functionele validatie van genen versterkt en de deuren geopend voor realiseerbare genetische vectorcontrolestrategieën, zoals die gericht op Anopheles-muggen die malaria overbrengen1.
Vroege muggengenoombewerking was uitsluitend gebaseerd op transponeerbare element (TE)-gemedieerde transformatie, waarbij piggyBac het meest gebruikte transposon was in Anopheles2,3,4. De willekeurige aard van TE-integratie kan echter leiden tot ongewenste modificaties zoals gen knock-outs (insertional mutagenese) en significante positie-effecten op transgene expressie5,6,7,8. Meerdere inserties komen ook vaak voor bij het gebruik van piggyBac5,9, wat de validatie en de isolatie van transgene lijnen met enkele inserties bewerkelijk maakt. Andere nadelen zijn hun potentiële remobilisatie, zoals waargenomen in de kiembaan van Anopheles stephensi bij het leveren van een bron van piggyBac transposase10,11,12, en hun beperkte grootte van DNA-lading (10-15 kb lang) met transformatie-efficiëntie afnemend met toenemende grootte van het donorplasmide13,14.
Site-gerichte integratiebenaderingen werden geïntroduceerd om deze problemen te omzeilen. De meest voorkomende site-directed genoommodificatie bij muggen is die gemedieerd door het φC31-systeem (figuur 1a). Dit wordt aangedreven door een viraal integrase dat de recombinatie katalyseert tussen twee heterospecifieke hechtingsplaatsen (att) die van nature voorkomen in het genoom van de bacteriofaag φC31 (attP) en in de Streptomyces-bacterie gastheer (attB)15. Recombinatie van de twee sites is unidirectioneel en resulteert in de vorming van hybride sites (attL en attR). De recombinatie van dergelijke hybride sites (wat leidt tot DNA-excisie) zou niet alleen de aanwezigheid van een actief viraal integrase vereisen, maar ook een andere faag-gecodeerde recombinatiefactor16,17. Zo wordt een stabiele integratiesite gegenereerd die het probleem van mogelijke ongewenste remobilisatie ontlast15. Bovendien maakt het systeem de integratie van grote ladingen mogelijk (bijv. Integratie van >100 kb constructies werd gerapporteerd in D. melanogaster18), waardoor de draagkracht aanzienlijk toeneemt. Integratie vindt plaats in een enkele vooraf gedefinieerde genomische locus die de validatie van insertie en het paringsschema om een stabiele transgene lijn te verkrijgen aanzienlijk vereenvoudigt. Ten slotte maakt de site-gerichte aard van de integratie normalisatie van expressie mogelijk, aangezien alternatieve transgenen zich op dezelfde locatie bevinden en daarom binnen dezelfde naburige genomische context worden gereguleerd. Inderdaad, een van de belangrijkste toepassingen van de techniek is de directe vergelijking van fenotypen die door verschillende transgenen worden verleend na het inbrengen in een identieke locus.
Het bereiken van φC31-gemedieerde integratie omvat twee fasen: fase I is het creëren van transgene dockinglijnen met attP-site(s) en fase II is de locatiegerichte integratie van een attB-geflankeerde lading in het genoom van de dockinglijn19. De creatie van fase I-koppelingslijnen is gebaseerd op de TE-gemedieerde willekeurige integratie van attP-gelabelde constructies en omvatte dus een initieel moeizaam proces (inclusief southern blot en inverse PCR-analyses op single-female nakomelingen) om transgene lijnen met een enkele integratiegebeurtenis te isoleren en te valideren op unieke, transcriptioneel actieve en fitnessneutrale genomische locaties. Niettemin zijn verschillende koppelingslijnen voor φC31-gemedieerde enkelvoudige integratie ontwikkeld en gevalideerd in An. gambiae19,20,21,22 en in An. stephensi23,24,25 (tabel 1). Elk van deze lijnen varieert in termen van de genomische locatie van de docking site en de stamspecifieke genetische achtergrond en daaruit kan een grote verscheidenheid aan nieuwe transgene lijnen worden gecreëerd. De complexe validatie van TE-gemedieerde integraties voor het produceren van dockinglijnen kan nu worden omzeild door de CRISPR/Cas9-technologie26; dit is echter gebaseerd op de a priori kennis van neutrale loci die moeten worden gericht en hun omringende sequenties.
φC31-gemedieerde integratie is uitgebreid toegepast op het bewerken van het insectengenoom van het modelorganisme D. melanogaster27, tot de muggen Aedes aegypti13,28, Ae. albopictus29, An. gambiae19 en An. stephensi24, evenals andere insecten waaronder Ceratitis capitata30 en Bombyx mori31.
Een beperking van φC31-gemedieerde integratie, vooral met het oog op mogelijke veldafgifte voor vectorcontrole, is de integratie in het muggengenoom van het gehele attB-dragende donorplasmide, inclusief ongewenste sequenties zoals antibioticaresistentie-genmarkers en plasmide-ruggengraatcomponenten van bacteriële oorsprong. Om dit aan te pakken, werd een modificatie van het standaardsysteem, recombinase-gemedieerde cassette-uitwisseling (RMCE), geïmplementeerd die de precieze vervanging van een eerder geïntegreerde transgene cassette door een nieuw donor-DNA mogelijk maakt (figuur 1b). Dit wordt bereikt door gebruik te maken van twee omgekeerde att-locaties die de donor- en ontvangercassettes aan elk uiteinde flankeren, waardoor twee onafhankelijke recombinatiegebeurtenissen tegelijkertijd plaatsvinden, wat resulteert in cassette-uitwisseling zonder integratie van de plasmide-backbone. Dit verbeterde ontwerp omzeilt de integratie van ongewenste sequenties en breidt de toepassing van φC31-systemen uit met bijvoorbeeld de integratie van ongemarkeerde DNA-ladingen door screening op het verlies van een eerder geïntegreerde fluorescerende marker32.
RMCE werd eerst bereikt met D. melanogaster32 en later met succes toegepast op niet-modelinsecten, waaronder An. gambiae9,26,33, Ae. aegypti34, Plutella xylostella34 en B. mori35. Verschillende dockinglijnen voor RMCE zijn ontwikkeld en gevalideerd in An. gambiae5,9,26 (tabel 1). Voor zover wij weten, moet RMCE nog worden onderzocht in andere Anopheles vectoren soorten.
Tot op heden is het φC31-systeem op grote schaal gebruikt in Anopheles-muggen om een verscheidenheid aan moleculen te introduceren en te bestuderen, waaronder antimalaria-effectoren19,24,36, componenten van het GAL4 / UAS-systeem om genen te overexpressie en knockdown voor insecticideresistentiestudies9,33, regulerende elementen, reportergenen5,21,37 en gene-drive elementen26 38.
Dit protocol beschrijft hoe 1) site-gerichte integratie van een attB-geflankeerde lading en 2) RMCE van een construct geflankeerd door omgekeerde attB-sites in het genoom van Anopheles docking lijnen kan worden uitgevoerd. Dit wordt bereikt door twee plasmiden te gebruiken: een donor attB-gelabeld plasmide dat het transgen van belang draagt, en een helperplasmide dat het φC31-integrase tot expressie brengt. De belangrijkste malariavectoren An. gambiae en An. stephensi worden als specifieke voorbeelden gebruikt, maar deze protocollen zijn van toepassing op andere Anopheles-soorten .
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig01.jpg"> Figuur 1. Site-directed genome modifications, single integration and recombinase-mediated cassette exchange (RMCE) , met behulp van het φC31 systeem. Het φC31-integrase (INT, grijze dubbele pijl) katalyseert de recombinatie tussen de attB-site(s) (paars gestreept) aanwezig in een donorplasmide en de attP-site(s) (blauw gestreept) aanwezig in een ontvangende dockinglijn, wat resulteert in de vorming van hybride sites attL en attR. A) Integratie wordt bereikt wanneer afzonderlijke attB- en attP-sites recombineren en resulteert in de aanwezigheid van twee geïntegreerde markers (blauw en rood). B) RMCE treedt op wanneer twee attB/P-locaties gelijktijdig recombineren en resulteert in de vervanging van de cassette tussen de att-plaatsen van de dockinglijn (blauwe marker) door die van het donorplasmide (rode marker). C) Partiële nucleotidesequenties van attP (blauw) en attB (paars) en de hybride locaties attL/R. Recombinatie vindt plaats tussen de 'TT'-kernsequenties die vetgedrukt zwart zijn gemarkeerd. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL eppendorf tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well microslides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MARI1216690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree&#160;Plasmid&#160;Maxi&#160;Kit (10)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Absolute, Molecular Biology Grade</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter set CFP for Leica MZ FLIII Excitation 436/20 nm, extinction 480/40 nm</td>
			<td>Leica</td>
			<td>10446363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter set dsRED for Leica MZ FLIII Excitation 545/30 nm, extinction 620/60 nm</td>
			<td>Leica</td>
			<td>10447079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter set YFP customised for Leica MZ FLIII</td>
			<td>Omega Optical</td>
			<td>500QM25, 500QM35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 27</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 700</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium&#160;chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium&#160;Acetate&#160;Solution (3 M),&#160;pH&#160;5.2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Life Technologies)</td>
			<td>R1181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stable brush Size 0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

site-directed &#966;c31-mediated integration and cassette exchange in anopheles vectors of malaria

Functionele genomische analyse en gerelateerde strategieën voor genetische controle van malaria vertrouwen op gevalideerde en reproduceerbare methoden om het genoom van Anopheles-muggen nauwkeurig te wijzigen. Onder deze methoden maakt het φC31-systeem een nauwkeurige en stabiele locatiegerichte integratie van transgenen mogelijk, of de vervanging van geïntegreerde transgene cassettes via recombinase-gemedieerde cassette-uitwisseling (RMCE). Deze methode is gebaseerd op de werking van de Streptomyces φC31 bacteriofaagintegrase om recombinatie te katalyseren tussen twee specifieke aanhechtingsplaatsen die zijn aangewezen attP (afgeleid van de faag) en attB (afgeleid van de gastheerbacterie). Het systeem maakt gebruik van een of twee attP-sites die eerder zijn geïntegreerd in het muggengenoom en attB-site (s) in het donorsjabloon-DNA. Hier illustreren we hoe het genoom van attP-dragende Anopheles-koppelingslijnen stabiel kan worden gewijzigd met behulp van twee plasmiden: een attB-gelabelde donor met de integratie- of uitwisselingssjabloon en een helperplasmide dat codeert voor het φC31-integrase. We rapporteren twee representatieve resultaten van φC31-gemedieerde site-directed modificatie: de enkele integratie van een transgene cassette in An. stephensi en RMCE in An. gambiae muggen. φC31-gemedieerde genoommanipulatie biedt het voordeel van reproduceerbare transgenexpressie van gevalideerde, fitnessneutrale genomische sites, waardoor vergelijkende kwalitatieve en kwantitatieve analyses van fenotypen mogelijk zijn. Het locatiegerichte karakter van de integratie vereenvoudigt ook aanzienlijk de validatie van de enkele inbrengplaats en het paringsschema om een stabiele transgene lijn te verkrijgen. Deze en andere kenmerken maken het φC31-systeem een essentieel onderdeel van de genetische toolkit voor de transgene manipulatie van malariamuggen en andere insectenvectoren.

Het hier geïllustreerde protocol maakt het mogelijk om een stabiele Anopheles transgene lijn te genereren in ~ 10 weken (uitgaande van een 21-daagse muggenlevenscyclus).
Na injectie larvale broedsnelheden in An. gambiae zullen naar verwachting over het algemeen lager zijn dan An. stephensi, maar broedsnelheden tussen 10-50% zijn gemeld9,20,24,26,33,43,47. Bij de juiste injectietechniek zijn de broedsnelheden van ≥20% over het algemeen voldoende om transformanten op te leveren. Dna-opname door de embryo's kan worden beoordeeld door jonge larven te screenen op voorbijgaande expressie van de fluorescerende marker. In succesvolle RMCE-experimenten in An. gambiae met behulp van de 3xP3-promotor vertoonden tot 50% van de overlevende G0-larven episomale expressie van de marker in de anale papillen48.
Gegeneraliseerde schattingen van transformatie-efficiëntie zijn moeilijk te evalueren tussen laboratoria en zelfs tussen experimenten, omdat transformatie afhankelijk is van een complex samenspel van variabelen, waaronder zuiverheid, concentratie, grootte en potentiële toxiciteit van het geïnjecteerde DNA, kwaliteit van eieren, pre- en post-injectiebehandeling van eieren, muggenopfok en vooral de ervaring van de operator. Transformatiepercentages tot 7% zijn verkregen voor RMCE in An. gambiae (berekend als het aantal onafhankelijke transformatiegebeurtenissen in de totale G0-individuen)9,26,33, en tot 2,2% transformatiesnelheid voor integratie in An. stephensi. We raden aan om ten minste 500 embryo's te injecteren, wat moet leiden tot het uitkomen van ten minste 100 G0-larven en tot 2-7 G0 volwassen stichters waaruit stabiel getransformeerde nakomelingen kunnen worden verkregen. Bij screening op voorbijgaande expressie in G0-larven kunnen tot 40 positieve larven worden verwacht.
Voorbeelden van fenotypische validatie van transformatie via de screening van fluorescerende markers gereguleerd door de 3xP3 promotor zijn gerapporteerd in figuur 4 en  figuur 5. Figuur 4 toont een nieuwe An. stephensi-lijn die wordt verkregen door het inbrengen van een DsRed-gemarkeerde cassette in een dockinglijn gemarkeerd met CFP (80.9, tabel 1), wat resulteert in G1-nakomelingen die beide markers tot expressie brengen zoals aangegeven door de rode en blauwe fluorescentie die in de ogen wordt gedetecteerd.
Rmce-ontwerpen zullen naar verwachting resulteren in de vervanging van de marker die oorspronkelijk in de dockinglijn is ingebracht door die van het donorplasmide. Figuur 5A en  figuur B illustreren deze markeruitwisseling in een met CFP gemarkeerde An. gambiae dockinglijn (A11, Tabel 1) waar na succesvolle RMCE de CFP marker verloren gaat en de YFP marker wordt verkregen resulterend in gele (maar niet blauwe) oog- en zenuwstrengfluorescentie33. Af en toe kan RMCE resulteren in een enkele integratiegebeurtenis in plaats van de uitwisseling van de gewenste transgene cassette zoals geïllustreerd in figuur 5C, waar een larve wordt weergegeven die is gemarkeerd met zowel het oorspronkelijke GVB als de nieuwe YFP-markers. Naar verluidt bestaat tot 50% van het totale aantal transformatiegebeurtenissen uit afzonderlijke integraties9,33.
Bij het screenen op de aanwezigheid van een fluorescerende marker is het cruciaal om het signaal te onderscheiden van mogelijke achtergrondautofluorescentie. Dit is met name belangrijk bij het gebruik van CFP, omdat Anopheles-larven natuurlijke blauwe autofluorescentie vertonen (figuur 6A). Het verhogen van de vergroting en het focussen op de weefsels en organen waar fluorescentie naar verwachting door de promotor zal worden aangedreven, is noodzakelijk om echte CFP-positieve individuen te identificeren, zoals geïllustreerd in figuur 6B met behulp van de 3xP3-CFP-marker.
Individuele transformanten worden uiteindelijk moleculair beoordeeld via PCR om de verwachte insertieplaats te bevestigen. Figuur 7 toont de PCR-validatie bij individuen uit een uitwisselingslijn die de twee potentiële oriëntaties van insertie in het muggengenoom laat zien33.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig04.jpg"> Figuur 4. Validatie van φC31 enkele integratie in An. stephensi larven (dorsale weergave). A) De koppelingslijn (80.9, tabel 1) drukt GVB uit in de ogen onder de regulering van de 3xP3-promotor . B) Succesvolle integratie resulteert in de expressie van de nieuw verworven DsRed en de originele CFP-marker in de ogen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig05.jpg"> Figuur 5. Validatie van φC31 RMCE in An. gambiae larven (ventral view). A) De koppelingslijn (A10, tabel 1) drukt CFP uit onder de regeling van de 3xP3-promotor in de ogen (e) en de zenuwstreng (nc)5. B) Succesvolle RMCE resulteert in de omschakeling van fluorescerende marker van CFP naar YFP33. C) Een enkele integratiegebeurtenis vond plaats tijdens het RMCE-experiment waarbij de transformatieve larve zowel de CFP- als de YFP-markers tot expressie brengt. Deze larve draagt GAL4/UAS componenten die een breed expressiepatroon van YFP veroorzaken, bijzonder sterk in de buikspieren (am). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig06.jpg"> Figuur 6. CFP autofluorescentie bij An. gambiae larven (dorsale weergave). A) Zij-aan-zij afbeelding van een positieve (CFP+) en een negatieve (CFP-) L4 larve met behulp van het CFP-filter. B) Close-up beeld van de larvale ogen die een CFP+ versus CFP-individu onthult. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig07.jpg"> Figuur 7. Moleculaire validatie van de oriëntatie van cassette-inbrenging in representatieve transgene An. gambiae gecreëerd door φC31 RMCE. De transgene cassette kan in een van de twee alternatieve oriëntaties (A of B) worden ingebracht met betrekking tot de inbrengplaats. Elke PCR-reactie (I - IV) maakt gebruik van een combinatie van primers (5-8)33 die zijn ontworpen om een diagnostisch versterkingsfragment te geven voor elke oriëntatie zoals aangegeven in de schematische plasmidekaarten. T1: representatieve transgene persoon die de oriëntatie van het inbrengen van A draagt; T2: representatieve transgene individuele draagrichting van insertie B; WT: wild type; DL: docking lijn; -: reactienegatieve controle waarbij water als sjabloon werd gebruikt. Dit cijfer is aangepast ten opzichte van Adolfi et al. (2019)33. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig07large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Soort</td>
			<td>Zeven</td>
			<td>Naam</td>
			<td>attP(s)</td>
			<td>Chromo-sommige</td>
			<td>Promotor-marker</td>
			<td>Instelling van herkomst</td>
			<td>Referentie</td>
		</tr>
<tr>
<td>An. stephensi</td>
			<td>Indiana
</td>
			<td>26,10b
</td>
			<td>Ongetrouwd</td>
			<td>2e ronde</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>Universiteit van Californië Irvine</td>
			<td>25</td>
		</tr>
<tr>
<td>An. stephensi</td>
			<td>Indiana
</td>
			<td>44Cb
</td>
			<td>Ongetrouwd</td>
			<td>X</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>Universiteit van Californië Irvine</td>
			<td>23, 24</td>
		</tr>
<tr>
<td>An. stephensi</td>
			<td>Indiana
</td>
			<td>80,9b
</td>
			<td>Ongetrouwd</td>
			<td>2l</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>Universiteit van Californië Irvine</td>
			<td>Dit onderzoek</td>
		</tr>
<tr>
<td>An. gambiae</td>
			<td>G3</td>
			<td>113</td>
			<td>Ongetrouwd</td>
			<td>2e ronde</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>Universiteit van Californië Irvine</td>
			<td>Dit onderzoek</td>
		</tr>
<tr>
<td>An. gambiae</td>
			<td>KIL</td>
			<td>EC
</td>
			<td>Ongetrouwd</td>
			<td>3r</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>Keele Univ.</td>
			<td>19, 43</td>
		</tr>
<tr>
<td>An. gambiae</td>
			<td>G3</td>
			<td>x1</td>
			<td>Ongetrouwd</td>
			<td>2l</td>
			<td>Geen marker</td>
			<td>Universiteit Straatsburg</td>
			<td>22</td>
		</tr>
<tr>
<td>An. gambiae</td>
			<td>G3</td>
			<td>YAttP</td>
			<td>Ongetrouwd</td>
			<td>Y</td>
			<td>3xP3-RFP</td>
			<td>Imperial College Londen</td>
			<td>21</td>
		</tr>
<tr>
<td>An. gambiae</td>
			<td>G3</td>
			<td>A10b
</td>
			<td>Dubbel</td>
			<td>2e ronde</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>Liverpool School Trop. Med.</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>An. gambiae</td>
			<td>G3</td>
			<td>A11b
</td>
			<td>Dubbel</td>
			<td>2e ronde</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>Liverpool School Trop. Med.</td>
			<td>9</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="8">een. Stam van johns Hopkins University (gift van M. Jacobs-Lorena) en in cultuur aan de Universiteit van Californië Irvine voor >20 jaar.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="8">b. Deze regels zijn op redelijk verzoek verkrijgbaar bij de auteurs.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="8">c. Deze regel is beschikbaar in de BEI-repository www.beiresources.org als MRA-1163.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1. Anopheles attP docking lijnen.

Watch this Scientific Journal Video about Site-Directed Ãâ€ C31-Mediated Integration and Cassette Exchange in Anopheles Vectors of Malaria at JoVE.com

Site-Directed ÃƒÂÃ¢â‚¬Â C31-Mediated Integration and Cassette Exchange in Anopheles Vectors of Malaria

Het protocol beschrijft hoe locatiegerichte modificaties in het genoom van Anopheles malariamuggen kunnen worden bereikt met behulp van het φC31-systeem . De beschreven modificaties omvatten zowel de integratie als de uitwisseling van transgene cassettes in het genoom van attP-dragende koppelingslijnen.

Site-Directed φC31-gemedieerde integratie en cassette-uitwisseling in Anopheles Vectors of Malaria

Functional genomic analysis and related strategies for genetic control of malaria rely on validated and reproducible methods to accurately modify the ...

Dit protocol ondersteunt de karakterisering van de rol van muggengenen die betrokken zijn bij een verscheidenheid aan fysiologische routes, waaronder bijvoorbeeld insectenresistentie en de ontwikkeling van malariaparasieten. De methode drijft transgene insertie in enkele vooraf gegekarakteriseerde locaties en maakt het daarom mogelijk om fenotypes die het gevolg zijn van alternatieve transgenen direct te vergelijken, waardoor het probleem van positioneel effect effectief wordt vermeden. Deze methode kan worden toegepast op een verscheidenheid aan insectensoorten van volksgezondheid en agrarisch belang en de toepassingen ervan strekken zich uit van bacteriën tot zoogdiercellen.Begin met het ontwerpen van attB-donorplasmiden met de dominante fluorescerende marker, attB-recombinatieplaatsen en de gewenste transgene lading. Gebruik een enkele attB-site voor de integratie van het hele plasmide dat de transgene cassette draagt of twee omgekeerde attB-locaties voor cassette-uitwisseling. Zuiver donor- en helperplasmiden met behulp van een endotoxinevrije zuiveringskit.Combineer het attB-gelabelde donorplasmide dat het transgen van belang draagt en het helperplasmide dat het integrase draagt om een mix te verkrijgen met een uiteindelijke concentratie van 350 nanogram per microliter van het donorplasmide en 150 nanogram per microliter van het helperplasmide. Precipiteer het DNA door 0,1 volume van drie molaire natriumacetaat en 2,5 volumes ijskoude 100% ethanol toe te voegen, en vervolgens vortex. Een wit neerslag moet onmiddellijk zichtbaar zijn.Was de pellet en resuspend in injectiebuffer om een totale eindconcentratie van 500 nanogram per microliter te bereiken. Bereid vervolgens aliquots van elk 10-15 microliter en bewaar ze bij negatieve 20 graden Celsius. Bloed voedt vier tot zeven dagen oude muggen van de gewenste dockinglijn en hun wilde tegenhangers 72 uur voorafgaand aan micro-injectie.Voer Anopheles gambiae embryo micro-injecties uit in 25 millimolair natriumchloride door de achterste pool van het embryo in een hoek van 45 graden te richten. Voer Anopheles stephensi embryo-micro-injecties uit in halocarbon-olie door de achterste pool in een hoek van 30 graden te richten. Breng de eieren onmiddellijk na injectie over in een petrischaal gevuld met steriel gedestilleerd water en breng ze terug naar insectenachtige omstandigheden.Breng bij het uitkomen de G0-larve dagelijks over in een bak met gezouten gedestilleerd water en breng de poppen terug. Sorteer G0-poppen op geslacht onder een stereoscoop. Laat de mannetjes in aparte kooien in groepen van drie tot vijf tevoorschijn komen en voeg een tienvoudige overmaat aan leeftijdsgematchte wilde type vrouwtjes toe.Laat de vrouwtjes in aparte kooien tevoorschijn komen in groepen van 10 tot 15 en voeg een gelijk aantal leeftijdsgematchte wilde type mannetjes toe. Laat volwassenen vier tot vijf dagen paren en voorzie vrouwtjes van een bloedmaaltijd. Verzamel de eieren en fok opkomende G1's van de volgende generatie.Verzamel G1-, L3- en L4-larven in een petrischaaltje bekleed met nat filterpapier of op een microscoopglaasje en screen ze met een fluorescerende stereoscoop op de aanwezigheid van de marker die is geïntroduceerd met de attB-gelabelde lading. Voor enkele attB-ontwerpen, scherm voor de aanwezigheid van de nieuwe en reeds bestaande marker. Voor dubbele attB-ontwerpen voor cassette-uitwisseling, scherm voor de aanwezigheid van de nieuwe marker en het verlies van de reeds bestaande marker.Sorteer getransformeerde G1-poppen op geslacht en kruis ze massaal met leeftijdsgematchte individuen van het andere geslacht. Laat volwassenen vier tot vijf dagen paren en zorg voor een bloedmaaltijd. Verzamel voor enkelvoudige integratie-experimenten eieren rechtstreeks van het en masse kruis.Verzamel voor cassette-uitwisselingsexperimenten eieren van enkele vrouwtjes en houd nakomelingen gescheiden totdat de moleculaire beoordeling is voltooid vanwege de mogelijke aanwezigheid van twee alternatieve cassetteoriëntaties. Screen het G2-nageslacht op de aanwezigheid van de fluorescerende marker en zet een subset van G2-positieve individuen opzij voor moleculaire analyse. Breng de rest terug naar volwassenheid.Voer moleculaire validatie uit van de invoegplaatsen met PCR zoals beschreven in het tekstmanuscript. Voor enkele integratie moet u ervoor zorgen dat de voorspelde insertieplaats de oorspronkelijke dockingconstructie draagt, plus de hele volgorde van het donorplasmide tussen de twee hybride locaties attL en attR. Zorg er voor cassette-uitwisseling voor dat de voorspelde invoegplaats identiek is aan die van de dockinglijn, waar hybride omgekeerde attL-sites de oorspronkelijke omgekeerde attP-sites vervangen en de uitwisselingssjabloon de cassette vervangt die er oorspronkelijk tussen aanwezig was.Het protocol werd gebruikt om een stabiele Anopheles transgene lijn te genereren in ongeveer 10 weken. Fenotypische validatie van transformatie werd uitgevoerd door screening op fluorescerende markers gereguleerd door de 3xP3-promotor worden hier getoond. Een nieuwe Anopheles stephensi-lijn werd verkregen door het inbrengen van een DS-rood gemarkeerde cassette in een dockinglijn gemarkeerd met CFP, wat resulteerde in G1-nakomelingen die beide markers uitdrukten zoals aangegeven door de rode en blauwe fluorescentie in de ogen.Cassette-uitwisselingsontwerpen resulteren in de vervanging van de marker die oorspronkelijk in de dockinglijn is ingebracht door die van het donorplasmide. Deze markeruitwisseling werd gedemonstreerd in een Anopheles gambiae docking lijn waar de CFP marker verloren ging en de YFP marker werd verkregen wat resulteerde in gele oog- en zenuwstrengfluorescentie. Af en toe kan RMCE resulteren in een enkele integratiegebeurtenis in plaats van de uitwisseling van de gewenste transgene cassette waarbij een larve wordt gemarkeerd met zowel het oorspronkelijke GVB als de nieuwe YFP-markers.Bij het screenen op de aanwezigheid van een fluorescerende marker is het cruciaal om het signaal te onderscheiden van mogelijke autofluorescentie op de achtergrond. Het verhogen van de vergroting en het focussen op de weefsels en organen waar fluorescentie naar verwachting door de promotor zal worden aangedreven, is noodzakelijk om echte CFP-positieve individuen te identificeren. Individuele transformanten werden ook moleculair beoordeeld via PCR om de verwachte insertieplaats te bevestigen.PCR validatie bij personen uit een exchange Anopheles gambiae lijn wordt hier getoond. Zelfs de juiste micro-injectietechniek, het nauwkeurige ontwerp en de voorbereiding van de donor- en helperplasmiden, evenals het volgen van het juiste muggenteeltschema zijn de sleutel tot het verkrijgen van transgene personen. Deze procedure kan worden gebruikt om elementen in te voegen die genoverexpressie of -uitschakeling veroorzaken, bijvoorbeeld het GAL4 / UAS-systeem, evenals gene drive-elementen en antipathogene moleculen voor genetische controle van muggen.

Research

JoVE Journal

Genetics

Site-Directed &#966;C31-Mediated Integration and Cassette Exchange in Anopheles Vectors of Malaria

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

siRNA Transfectie en EMSA Analyses op vers geïsoleerde Human Villous cytotrofoblasten

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Parallel Meting van de circadiane klok genexpressie en hormoon in Human primaire celculturen

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetische willekeurige mutagenese met behulp van histon-miniSOG in<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Grootbrengen en Double-stranded RNA-gemedieerde gen knock-down in het verbergen Kever,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

Tweerichtings retrovirale integratie site PCR methodologie en kwantitatieve data analyse werkstroom

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions

Retrovirale Scanning: Mapping MLV Integration Sites om de specifieke codespecifieke regio&#39;s te definiëren

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-gemedieerde gerichte integratie In Vivo met behulp van een homologie-gemedieerde einde deelname aan gebaseerde strategie

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

Een Protocol voor de productie van Integrase-deficiënte lentivirale vectoren voor CRISPR/Cas9-gemedieerde Gene knock-out in cellen verdelen

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene bewerken te maken voorwaardelijke mutanten van menselijke malariaparasiet P. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Karakterisering van Histone posttranslationele wijziging wijzigingen in gist neurodegeneratieve Proteinopathy modellen

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...