Nous sommes reconnaissants à Kiona Parker (UCI) d’avoir fourni des images de larves transgéniques d’An. stephensi , et à Fraser Colman (LSTM) et Beth Poulton (LSTM) d’avoir fourni des larves transgéniques d’An. gambiae . Beth Poulton (LSTM) a également fourni une aide précieuse lors de l’imagerie des larves d’An. gambiae . Ce travail a été financé par le Tata Institute for Genetics and Society (TIGS) et le Director Catalyst Fund du LSTM décerné aux AA (DCF2014AA). A.A.J. est professeur Donald Bren à l’Université de Californie à Irvine.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La conception précise de plasmides marqués attB qui sont compatibles avec la ligne d’amarrage de choix est primordiale pour le succès de l’expérience. Une attention particulière doit être accordée au choix du marqueur utilisé pour le criblage des transformants, y compris la couleur de fluorescence et son motif d’expression, qui sera soumis au motif déjà présent dans la ligne d’amarrage. Il est nécessaire d’utiliser des marqueurs fluorescents qui se distinguent facilement : les bonnes combinaisons de marqueurs comprennent RFP (rouge)/CFP (cyan), RFP (rouge)/GFP (vert), RFP (rouge)/YFP (jaune) et YFP (jaune)/CFP (cyan), tandis que les combinaisons à éviter sont YFP (jaune)/GFP (vert) et CFP (cyan)/GFP (vert). Le promoteur 3xP33, spécifique aux yeux et au cordon nerveux, est le plus fréquemment utilisé pour stimuler l’expression de marqueurs fluorescents pour la transgénèse des moustiques. En effet, toutes les lignes d’amarrage Anopheles actuellement disponibles utilisent ce promoteur. Les régions régulatrices alternatives sont celles du gène de la polyubiquitine An. gambiae (PUBc)5 ou du promoteur viral IE120, qui déterminent l’expression dans plusieurs tissus. Lorsqu’ils sont utilisés avec 3xP3, ces promoteurs élargiraient les combinaisons de couleurs possibles et même l’utilisation du même fluorophore. Les promoteurs indiqués sont actifs tout au long du cycle de vie des moustiques, ce qui permet le dépistage et la surveillance de la fluorescence à tous les stades de la vie. Une considération supplémentaire lors de la conception du plasmide est la taille de la cargaison à intégrer ou à échanger. Bien que le système φC31 ait des capacités de charge remarquables18, il faut considérer que la taille du plasmide donneur est généralement en corrélation négative avec l’efficacité de la transformation22.
Dans le protocole décrit, la source d’intégrase est un plasmide auxiliaire exprimant l’enzyme de manière omniprésente40. La présence omniprésente de l’intégrase peut conduire à la transformation des cellules somatiques si les microinjections ne sont pas dirigées avec précision vers la zone où la lignée germinale se forme. Bien que de tels événements de transformation soient perdus car ils ne sont pas héréditaires, les effets somatiques peuvent diminuer la condition physique des individus injectés. Pour éviter cela et augmenter l’efficacité de la transformation, l’expression de l’intégrase peut être limitée à la lignée germinale, par exemple en utilisant le promoteur vasa22,26. D’autres protocoles décrivent l’utilisation de l’ARN messager transcrit in vitro (ARNm) comme source d’intégrase φC311119,24,43. Cependant, cela implique la préparation laborieuse de l’ARNm et nécessite une manipulation prudente du mélange d’injection et l’utilisation de réactifs sans RNase pour éviter la dégradation. Les sources plasmidiques d’intégrase ont été démontrées à la fois dans An. gambiae9,21,22,26,33,37 et An. stephensi (communication personnelle A.A.) pour être fiables et conduire à une transformation efficace, et sont donc notre option préférée. Une autre option pour la livraison d’intégrase est sa production in vivo dans des lignes d’assistance auto-amarrées. De telles lignées ont été créées à An. gambiae qui expriment l’intégrase φC31 sous la régulation des nanos promoteurs spécifiques de la lignée germinale et se sont avérées conduire à une amélioration de la survie et de l’efficacité de la transformation20. Cependant, les charges d’aptitude potentielles imposées par la production in vivo de l’enzyme intégrase sur la ligne d’assistance doivent être prises en compte.
Comme pour les autres techniques transgéniques, un soin particulier doit être réservé à l’élevage et au croisement d’individus issus d’embryons injectés afin de maximiser les chances de récupérer des transformants. Les individus qui ont hérité de manière stable du transgène peuvent d’abord être récupérés à la progéniture G1. Cependant, les premiers signes de transformation potentielle peuvent être évalués par la présence d’une expression épisomique transitoire du marqueur fluorescent dans les papilles anales et/ou le cordon nerveux des larves du premier et du deuxième stade G0 lors de l’utilisation du promoteur 3xP343. Bien que la présence d’une fluorescence transitoire suggère une livraison réussie de plasmides, elle ne garantit pas une transformation germinale héréditaire. De même, l’absence d’expression transitoire n’exclut pas une transformation réussie. Néanmoins, il a été observé que les individus transitoirement positifs sont plus susceptibles de produire une progéniture transgénique que les individus transitoirement négatifs43,48. Entre des mains expertes, l’élevage et le croisement d’individus positifs uniquement peuvent être une option pour réduire le nombre de moustiques. Cependant, compte tenu de l’importance et de la fragilité des petites larves de G0, le moins de manipulation est encore conseillé et l’élevage de tous les individus de G0 est toujours recommandé.
Le schéma d’accouplement rapporté dans ce protocole est conçu pour maximiser les chances d’accouplement et pour isoler les événements de transformation indépendants. Cependant, si l’espace insectaire ou la disponibilité du personnel est un problème, les adultes G0 peuvent être regroupés par sexe dans des cages individuelles si suffisamment d’individus de sexe opposé sont fournis. Une telle configuration ne permettra pas la discrimination entre plusieurs événements de transformation se produisant chez des individus de la même cage. Selon la configuration expérimentale, la présence d’un marqueur double (intégration simple) ou simple (RMCE) est attendue pendant le processus de dépistage. Dans les expériences d’intégration unique, il est important de vérifier la présence du marqueur d’origine de la ligne d’amarrage, tandis que dans RMCE, il est important de vérifier la perte du marqueur précédemment intégré. En effet, il n’est pas rare dans les conceptions RMCE de récupérer des transformants dans lesquels une seule intégration au lieu d’un échange s’est produite en raison de la recombinaison d’un seul site attP9,33. Chez ces personnes, les deux marqueurs fluorescents sont présents ainsi que l’ensemble de l’épine dorsale plasmidique du donneur, ce qui souligne l’importance d’effectuer un dépistage approfondi des deux marqueurs fluorescents.
Alors que la présence de modèles de fluorescence attendus indique une transformation réussie, la caractérisation moléculaire du site d’insertion doit être entreprise. Pour ce faire, la préparation de cartes précises du locus d’insertion prédit, y compris les régions génomiques flanquantes de la ligne d’amarrage, est cruciale pour la conception d’amorces d’oligonucléotides diagnostiques adéquates pour les analyses d’amplification génique. Des événements d’intégration uniques entraînent la formation de sites hybrides attR et attL à la jonction entre l’ADN nouvellement intégré et la cassette précédemment insérée. Ces sites peuvent être ciblés pour la validation des sites d’insertion. Dans les conceptions RMCE, l’insertion de la cassette donneuse peut se produire dans deux orientations alternatives par rapport au locus génomique, de sorte que quatre amorces peuvent être utilisées dans d’autres combinaisons de PCR pour détecter l’orientation de la ligne. Comme l’orientation de l’insertion de la cassette peut affecter l’expression transgénique, dans l’analyse comparative de l’expression génique, il est important d’utiliser des lignes portant la même orientation d’insertion.
Lorsque vous travaillez avec un faible nombre de transformants, il peut ne pas être souhaitable de sacrifier des individus entiers pour l’analyse moléculaire. Une option consiste à effectuer une analyse moléculaire de l’ADN extrait des jambes d’un seul adulte46, car la perte de jambes n’affecte pas la capacité d’une femelle adulte à s’accoupler et à ovipositer49. Cependant, il existe un risque d’endommager l’individu dans le processus de retrait de la jambe. Le succès a été obtenu en utilisant des cas de nymphes écartés (communication personnelle de L. Grigoraki), mais l’approche la plus sûre consiste à effectuer une analyse moléculaire sur les parents G2 après avoir obtenu une progéniture G3 viable.
Ces dernières années, CRISPR/Cas9 a révolutionné la façon d’effectuer l’édition du génome spécifique au site26,41,50,51. Contrairement au RMCE dirigé par le site, les intégrations géniques médiées par CRISPR/Cas9 (knock-ins) sont indépendantes de la présence de sites de recombinaison pré-insérés avec un seul événement de transformation en une étape nécessaire. Néanmoins, le système CRISPR/Cas9 repose sur la présence de grandes séquences génomiques connues flanquant le site d’insertion souhaité pour une réparation dirigée par homologie réussie ainsi que sur la reconnaissance efficace du site médiée par les ARN guides. Ces conditions ne peuvent pas toujours être remplies ou peuvent être laborieuses à dépanner et, compte tenu de la disponibilité de plusieurs lignes d’amarrage à An. gambiae et An. stephensi et de lignées dérivées de celles-ci, le système φC31 reste un outil très précieux pour effectuer des comparaisons phénotypiques directes entre transgènes aux mêmes emplacements génomiques.

La capacité de modifier le génome des moustiques vecteurs de maladies de manière fiable et reproductible a renforcé la validation fonctionnelle in vivo des gènes et ouvert les portes à des stratégies de lutte antivectorielle réalisables, telles que celles ciblant les moustiques anophèles qui transmettent le paludisme1.
L’édition précoce du génome des moustiques reposait uniquement sur une transformation médiée par des éléments transposables (TE), piggyBac étant le transposon le plus couramment utilisé chez Anopheles2,3,4. Cependant, la nature aléatoire de l’intégration te peut entraîner des modifications indésirables telles que des knockouts de gènes (mutagénèse insertionnelle) et des effets de position significatifs sur l’expression du transgène5,6,7,8. Les insertions multiples sont également courantes lors de l’utilisation de piggyBac5,9, ce qui rend laborieux la validation et l’isolement des lignées transgéniques avec des insertions uniques. D’autres inconvénients incluent leur remobilisation potentielle, comme observé dans la lignée germinale d’Anopheles stephensi lorsqu’il fournit une source de transposase piggyBac10,11,12, et leur taille limitée de cargaison d’ADN (10-15 kb de longueur) avec une efficacité de transformation diminuant avec l’augmentation de la taille du plasmide donneur13,14.
Des approches d’intégration dirigées vers le site ont été introduites pour contourner ces problèmes. La modification du génome dirigée par le site la plus courante chez les moustiques est celle médiée par le système φC31 (figure 1a). Ceci est entraîné par une intégrase virale qui catalyse la recombinaison entre deux sites d’attachement hétérospécifique (att) présents naturellement dans le génome du bactériophage φC31 (attP) et dans l’hôte de la bactérie Streptomyces (attB)15. La recombinaison des deux sites est unidirectionnelle et entraîne la formation de sites hybrides (attL et attR). La recombinaison de tels sites hybrides (conduisant à l’excision de l’ADN) nécessiterait non seulement la présence d’une intégrase virale active, mais aussi d’un autre facteur de recombinaison codé par les phages16,17. Un site d’intégration stable est ainsi généré qui soulage la question d’une éventuelle remobilisation indésirable15. De plus, le système permet l’intégration de cargaisons volumineuses (par exemple, l’intégration de constructions de 100 kb > a été signalée dans D. melanogaster18), ce qui augmente considérablement les capacités de charge. L’intégration se produit dans un seul locus génomique prédéfini qui simplifie grandement la validation de l’insertion et du schéma d’accouplement pour obtenir une lignée transgénique stable. Enfin, la nature orientée site de l’intégration permet la normalisation de l’expression car les transgènes alternatifs sont situés dans le même locus et sont donc régulés dans le même contexte génomique voisin. En effet, l’une des principales applications de la technique est la comparaison directe des phénotypes conférés par différents transgènes suite à l’insertion dans un locus identique.
La réalisation de l’intégration médiée par φC31 implique deux phases: la phase I est la création de lignes d’amarrage transgéniques transportant un ou plusieurs sites attP, et la phase II est l’intégration dirigée par le site d’une cargaison flanquée d’attB dans le génome de la ligne d’amarrage19. La création de lignes d’amarrage de phase I s’est appuyée sur l’intégration aléatoire médiée par TE de constructions marquées attP et a donc impliqué un processus laborieux initial (y compris des analyses de transfert de sud et de PCR inverse sur une progéniture mono-femelle) pour isoler et valider des lignées transgéniques portant un seul événement d’intégration dans des emplacements génomiques uniques, transcriptionnellement actifs et neutres en termes de condition physique. Néanmoins, plusieurs lignes d’amarrage pour l’intégration unique médiée par φC31 ont été développées et validées dans An. gambiae19,20,21,22 et dans An. stephensi23,24,25 (tableau 1). Chacune de ces lignées varie en termes d’emplacement génomique du site d’amarrage et de fond génétique spécifique à la souche et à partir d’elles, une grande variété de nouvelles lignées transgéniques peuvent être créées. La validation complexe des intégrations médiées par TE pour la production de lignes d’amarrage peut désormais être contournée par la technologie CRISPR/Cas926 ; cependant cela repose sur la connaissance a priori des loci neutres à cibler et de leurs séquences environnantes.
L’intégration médiée par φC31 a été largement appliquée à l’édition du génome des insectes à partir de l’organisme modèle D. melanogaster27, aux moustiques Aedes aegypti13,28, Ae. albopictus29, An. gambiae19 et An. stephensi24, ainsi qu’à d’autres insectes, notamment Ceratitis capitata30 et Bombyx mori31.
Une limitation de l’intégration médiée par φC31, en particulier compte tenu des rejets potentiels sur le terrain pour la lutte antivectorielle, est l’intégration dans le génome du moustique de l’ensemble du plasmide donneur porteur d’attB, y compris les séquences indésirables telles que les marqueurs géniques de résistance aux antibiotiques et les composants de l’épine dorsale plasmidique d’origine bactérienne. Pour y remédier, une modification du système standard, l’échange de cassettes à médiation recombinase (RMCE), a été mise en œuvre pour permettre le remplacement précis d’une cassette transgénique précédemment intégrée par un nouvel ADN donneur (Figure 1b). Ceci est réalisé en utilisant deux sites att inversés flanquant les cassettes donneuse et receveuse à chaque extrémité, ce qui entraîne deux événements de recombinaison indépendants à se produire simultanément, ce qui entraîne un échange de cassettes sans intégration de l’épine dorsale plasmidique. Cette conception améliorée contourne l’intégration de séquences indésirables et élargit l’application des systèmes φC31 pour inclure, par exemple, l’intégration de cargaisons d’ADN non marquées par dépistage de la perte d’un marqueur fluorescent précédemment intégré32.
RMCE a d’abord été obtenu avec D. melanogaster32 et plus tard appliqué avec succès à des insectes non modèles, y compris An. gambiae9,26,33, Ae. aegypti34, Plutella xylostella34 et B. mori35. Plusieurs lignes d’amarrage pour RMCE ont été développées et validées en Gambie5,9,26 (Tableau 1). À notre connaissance, le RMCE n’a pas encore été exploré chez d’autres espèces de vecteurs d’Anophèles.
À ce jour, le système φC31 a été largement utilisé chez les moustiques anophèles pour introduire et étudier une variété de molécules, y compris les effecteurs antimalaires19,24,36, les composants du système GAL4/UAS pour surexprimer et détruire les gènes pour les études de résistance aux insecticides9,33, les éléments régulateurs, les gènes rapporteurs5,21,37 et les éléments de forçage génétique26 ,38.
Ce protocole décrit comment effectuer 1) l’intégration dirigée par le site d’une cargaison flanquée d’attB et 2) le RMCE d’une construction flanquée de sites attB inversés dans le génome des lignes d’amarrage d’Anophèles . Ceci est réalisé en utilisant deux plasmides: un plasmide marqué attB du donneur portant le transgène d’intérêt, et un plasmide auxiliaire exprimant l’intégrase φC31 . Les principaux vecteurs du paludisme An. gambiae et An. stephensi sont utilisés comme exemples spécifiques, mais ces protocoles sont applicables à d’autres espèces d’Anophèles .
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig01.jpg"> Graphique 1. Modifications du génome dirigées par le site, intégration unique et échange de cassettes médié par la recombinase (RMCE), à l’aide du système φC31. L’intégrase φC31 (INT, double flèche grise) catalyse la recombinaison entre le(s) site(s) attB (rayé violet) présent(s) dans un plasmide donneur et le(s) site(s) attP (rayé bleu) présent(s) dans une ligne d’amarrage réceptrice, ce qui entraîne la formation de sites hybrides attL et attR. A) L’intégration est réalisée lorsque les sites attB et attP uniques se recombinent et aboutissent à la présence de deux marqueurs intégrés (bleu et rouge). B) Le RMCE se produit lorsque deux sites attB/P se recombinent simultanément et entraîne le remplacement de la cassette entre les sites att de la ligne d’amarrage (marqueur bleu) par celle portée par le plasmide donneur (marqueur rouge). C) Séquences nucléotidiques partielles d’attP (bleu) et d’attB (violet) et les sites hybrides attL/R. La recombinaison se produit entre les séquences de base « TT » surlignées en noir gras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL eppendorf tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well microslides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MARI1216690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree&#160;Plasmid&#160;Maxi&#160;Kit (10)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Absolute, Molecular Biology Grade</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter set CFP for Leica MZ FLIII Excitation 436/20 nm, extinction 480/40 nm</td>
			<td>Leica</td>
			<td>10446363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter set dsRED for Leica MZ FLIII Excitation 545/30 nm, extinction 620/60 nm</td>
			<td>Leica</td>
			<td>10447079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter set YFP customised for Leica MZ FLIII</td>
			<td>Omega Optical</td>
			<td>500QM25, 500QM35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 27</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 700</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium&#160;chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium&#160;Acetate&#160;Solution (3 M),&#160;pH&#160;5.2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Life Technologies)</td>
			<td>R1181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stable brush Size 0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

site-directed &#966;c31-mediated integration and cassette exchange in anopheles vectors of malaria

L’analyse génomique fonctionnelle et les stratégies connexes de lutte génétique contre le paludisme reposent sur des méthodes validées et reproductibles pour modifier avec précision le génome des moustiques anophèles. Parmi ces méthodes, le système φC31 permet une intégration précise et stable dirigée par site des transgènes, ou la substitution de cassettes transgéniques intégrées par échange de cassettes médiées par recombinase (RMCE). Cette méthode repose sur l’action de l’intégrase bactériophage Streptomyces φC31 pour catalyser la recombinaison entre deux sites d’attachement spécifiques désignés attP (dérivé du phage) et attB (dérivé de la bactérie hôte). Le système utilise un ou deux sites attP qui ont été intégrés précédemment dans le génome du moustique et le(s) site(s) attB dans l’ADN du modèle de donneur. Nous illustrons ici comment modifier de manière stable le génome des lignes d’amarrage des anophèles portant attP à l’aide de deux plasmides: un donneur marqué attB portant le modèle d’intégration ou d’échange et un plasmide auxiliaire codant pour l’intégrase φC31. Nous rapportons deux résultats représentatifs de la modification dirigée par le site médiée par φC31 : l’intégration unique d’une cassette transgénique chez an. stephensi et rmCE chez les moustiques An. gambiae. La manipulation du génome médiée par φC31 offre l’avantage d’une expression transgénique reproductible à partir de sites génomiques validés et neutres en termes de condition physique, permettant des analyses qualitatives et quantitatives comparatives des phénotypes. La nature de l’intégration dirigée par site simplifie également considérablement la validation du site d’insertion unique et du schéma d’accouplement pour obtenir une lignée transgénique stable. Ces caractéristiques et d’autres font du système φC31 un composant essentiel de la boîte à outils génétique pour la manipulation transgénique des moustiques du paludisme et d’autres insectes vecteurs.

Le protocole illustré ici permet de générer une lignée transgénique Anopheles stable en ~ 10 semaines (en supposant un cycle de vie de moustique de 21 jours).
Les taux d’éclosion des larves post-injection chez An. gambiae devraient être généralement inférieurs à ceux d’An. stephensi, mais des taux d’éclosion compris entre 10 et 50 % ont été signalés9,20,24,26,33,43,47. Avec une technique d’injection appropriée, des taux d’éclosion de ≥20% sont généralement suffisants pour produire des transformants. L’absorption de l’ADN par les embryons peut être évaluée en criblant les jeunes larves pour l’expression transitoire du marqueur fluorescent. Dans des expériences RMCE réussies à An. gambiae utilisant le promoteur 3xP3, jusqu’à 50% des larves G0 survivantes ont montré une expression épisomique du marqueur dans les papilles anales48.
Les estimations généralisées de l’efficacité de la transformation sont difficiles à évaluer entre les laboratoires et même parmi les expériences, car la transformation dépend d’une interaction complexe de variables, notamment la pureté, la concentration, la taille et la toxicité potentielle de l’ADN injecté, la qualité des œufs, la manipulation des œufs avant et après injection, l’élevage des moustiques et, surtout, l’expérience de l’opérateur. Des taux de transformation allant jusqu’à 7% ont été obtenus pour RMCE en An. gambiae (calculés comme le nombre d’événements de transformation indépendants dans le total des individus G0)9,26,33, et jusqu’à 2,2% de taux de transformation pour l’intégration dans An. stephensi. Nous suggérons d’injecter au moins 500 embryons, ce qui devrait conduire à l’éclosion d’au moins 100 larves de G0 et à 2 à 7 fondateurs adultes G0 à partir desquels une progéniture transformée de manière stable peut être obtenue. En cas de dépistage de l’expression transitoire chez les larves de G0, on peut s’attendre à ce que jusqu’à 40 larves positives soient détectées.
Des exemples de validation phénotypique de la transformation via le criblage de marqueurs fluorescents régulés par le promoteur 3xP3 sont présentés à la figure 4 et  à la figure 5. La figure 4 montre une nouvelle ligne d’An. stephensi obtenue par insertion d’une cassette marquée DsRed dans une ligne d’accueil marquée CFP (80.9, tableau 1), ce qui donne une descendance G1 exprimant les deux marqueurs comme indiqué par la fluorescence rouge et bleue détectée dans les yeux.
On s’attend plutôt à ce que les conceptions RMCE entraînent le remplacement du marqueur inséré à l’origine dans la ligne d’amarrage par celui du plasmide donneur. La figure 5A et  la figure B illustrent cet échange de marqueurs dans une ligne d’amarrage An. gambiae marquée avec CFP (A11, tableau 1) où, après un RMCE réussi, le marqueur CFP est perdu et le marqueur YFP est acquis, ce qui entraîne une fluorescence jaune (mais pas bleue) des yeux et du cordon nerveux33. Parfois, le RMCE peut entraîner un seul événement d’intégration au lieu de l’échange de la cassette transgénique souhaitée, comme illustré à la figure 5C, où une larve marquée à la fois avec la CFP d’origine et les nouveaux marqueurs YFP est montrée. Il est rapporté que jusqu’à 50 % du nombre total d’événements de transformation sont des intégrations uniques9,33.
Lors du dépistage de la présence d’un marqueur fluorescent, il est crucial de distinguer son signal d’une éventuelle autofluorescence de fond. Ceci est particulièrement important lors de l’utilisation de la PCP, car les larves d’anophèles présentent une autofluorescence bleue naturelle (figure 6A). Il est nécessaire d’augmenter le grossissement et de se concentrer sur les tissus et les organes où la fluorescence devrait être entraînée par le promoteur pour identifier les véritables individus positifs à la CFP, comme illustré à la figure 6B , à l’aide du marqueur 3xP3-CFP.
Les transformants individuels sont finalement évalués moléculairement par PCR pour confirmer le site d’insertion attendu. La figure 7 rend compte de la validation par PCR chez des individus d’une lignée d’échange An. gambiae montrant les deux orientations potentielles d’insertion dans le génome du moustique33.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig04.jpg"> Graphique 4. Validation de l’intégration unique de φC31 chez les larves d’An. stephensi (vue dorsale). A) La ligne d’amarrage (80.9, tableau 1) exprime la PCP aux yeux sous la réglementation du promoteur 3xP3 . B) Une intégration réussie se traduit par l’expression du DsRed nouvellement acquis ainsi que du marqueur CFP d’origine dans les yeux. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig05.jpg"> Graphique 5. Validation de φC31 RMCE chez les larves d’An. gambiae (vue ventrale). A) La ligne d’amarrage (A10, tableau 1) exprime la PCP sous la régulation du promoteur 3xP3 dans les yeux (e) et le cordon nerveux (nc)5. B) Le succès du RMCE entraîne l’échange de marqueurs fluorescents de CFP à YFP33. C) Un seul événement d’intégration s’est produit au cours de l’expérience RMCE où la larve transformante exprime à la fois les marqueurs CFP et YFP. Cette larve porte des composants GAL4 / UAS qui provoquent un large modèle d’expression de YFP, particulièrement fort dans les muscles abdominaux (am). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig06.jpg"> Graphique 6. Autofluorescence de la PCF chez les larves d’An. gambiae (vue dorsale). A) Image côte à côte d’une larve L4 positive (CFP+) et négative (CFP-) à l’aide du filtre CFP. B) Image en gros plan des yeux larvaires qui révèle un individu CFP+ vs CFP-. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig07.jpg"> Graphique 7. Validation moléculaire de l’orientation de l’insertion de cassettes dans l’An. gambiae transgénique représentatif créée par φC31 RMCE. La cassette transgénique peut être insérée dans l’une des deux orientations alternatives (A ou B) par rapport au site d’insertion. Chaque réaction PCR (I - IV) utilise une combinaison d’amorces (5-8)33 conçues pour donner un fragment d’amplification diagnostique pour chaque orientation comme indiqué dans les cartes plasmidiques schématiques. T1: orientation de transport individuelle transgénique représentative de l’insertion A; T2: orientation de transport individuelle transgénique représentative de l’insertion B; WT: type sauvage; DL: ligne d’accueil; -: contrôle négatif de la réaction où l’eau a été utilisée comme modèle. Ce chiffre a été modifié par rapport à Adolfi et al. (2019)33. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig07large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Espèce</td>
			<td>Filtrer</td>
			<td>Nom</td>
			<td>attP(s)</td>
			<td>Chromo-certains</td>
			<td>Marqueur promoteur</td>
			<td>Institution d’origine</td>
			<td>Référence</td>
		</tr>
<tr>
<td>An. stephensi</td>
			<td>Indiana
</td>
			<td>26.10b
</td>
			<td>Célibataire</td>
			<td>2R</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>Université de Californie Irvine</td>
			<td>25</td>
		</tr>
<tr>
<td>An. stephensi</td>
			<td>Indiana
</td>
			<td>44Cb
</td>
			<td>Célibataire</td>
			<td>X</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>Université de Californie Irvine</td>
			<td>23, 24</td>
		</tr>
<tr>
<td>An. stephensi</td>
			<td>Indiana
</td>
			<td>80,9b
</td>
			<td>Célibataire</td>
			<td>2L</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>Université de Californie Irvine</td>
			<td>Cette étude</td>
		</tr>
<tr>
<td>An. gambie</td>
			<td>G3</td>
			<td>113</td>
			<td>Célibataire</td>
			<td>2R</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>Université de Californie Irvine</td>
			<td>Cette étude</td>
		</tr>
<tr>
<td>An. gambie</td>
			<td>KIL</td>
			<td>Ec
</td>
			<td>Célibataire</td>
			<td>3R</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>Keele Univ.</td>
			<td>19, 43</td>
		</tr>
<tr>
<td>An. gambie</td>
			<td>G3</td>
			<td>X1</td>
			<td>Célibataire</td>
			<td>2L</td>
			<td>Pas de marqueur</td>
			<td>Université de Strasbourg</td>
			<td>22</td>
		</tr>
<tr>
<td>An. gambie</td>
			<td>G3</td>
			<td>YAttP</td>
			<td>Célibataire</td>
			<td>Y</td>
			<td>3xP3-RFP</td>
			<td>Imperial College Londres</td>
			<td>21</td>
		</tr>
<tr>
<td>An. gambie</td>
			<td>G3</td>
			<td>A10b
</td>
			<td>Double</td>
			<td>2R</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>Liverpool School Trop. Med.</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>An. gambie</td>
			<td>G3</td>
			<td>A11b
</td>
			<td>Double</td>
			<td>2R</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>Liverpool School Trop. Med.</td>
			<td>9</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="8">un. Souche de l’Université Johns Hopkins (don de M. Jacobs-Lorena) et dans la culture à l’Université de Californie Irvine pour >20 ans.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="8">b. Ces lignes sont disponibles auprès des auteurs sur demande raisonnable.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="8">c. Cette ligne est disponible dans le dépôt BEI www.beiresources.org sous le nom de MRA-1163.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1. Anopheles attP docking lines.

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Site-Directed ÃƒÂÃ¢â‚¬Â C31-Mediated Integration and Cassette Exchange in Anopheles Vectors of Malaria

Le protocole décrit comment obtenir des modifications dirigées par le site dans le génome des moustiques du paludisme anophèles en utilisant le système φC31 . Les modifications décrites comprennent à la fois l’intégration et l’échange de cassettes transgéniques dans le génome des lignes d’amarrage portant attP.

Intégration médiée par φC31 dirigée sur site et échange de cassettes chez les anophèles vecteurs du paludisme

Functional genomic analysis and related strategies for genetic control of malaria rely on validated and reproducible methods to accurately modify the ...

Ce protocole soutient la caractérisation du rôle des gènes des moustiques impliqués dans une variété de voies physiologiques, y compris, par exemple, la résistance aux insectes et le développement du parasite du paludisme. La méthode entraîne l’insertion de transgènes dans des emplacements génomiques précaractérisés uniques et permet donc de comparer directement les phénotypes résultant de transgènes alternatifs évitant efficacement la question de l’effet positionnel. Cette méthode peut être appliquée à une variété d’espèces d’insectes d’importance sanitaire et agricole et ses applications s’étendent largement des bactéries aux cellules de mammifères.Commencez par concevoir des plasmides donneurs attB transportant le marqueur fluorescent dominant, les sites de recombinaison attB et la cargaison de transgène souhaitée. Utilisez un seul site attB pour l’intégration de l’ensemble du plasmide transportant la cassette transgénique ou deux sites attB inversés pour l’échange de cassettes. Purifiez les plasmides donneurs et auxiliaires à l’aide d’un kit de purification sans endotoxines.Combinez le plasmide donneur marqué attB portant le transgène d’intérêt et le plasmide auxiliaire portant l’intégrase pour obtenir un mélange avec une concentration finale de 350 nanogrammes par microlitre du plasmide donneur et de 150 nanogrammes par microlitre du plasmide auxiliaire. Précipiter l’ADN en ajoutant 0,1 volume de trois molaires acétate de sodium et 2,5 volumes d’éthanol glacé à 100%, puis vortex. Un précipité blanc doit être immédiatement visible.Lavez la pastille et remettez-la en suspension dans un tampon d’injection pour atteindre une concentration finale totale de 500 nanogrammes par microlitre. Ensuite, préparez des aliquotes de 10 à 15 microlitres chacune et stockez-les à 20 degrés Celsius négatifs. Le sang nourrit les moustiques âgés de quatre à sept jours à partir de la ligne d’amarrage souhaitée et de leurs homologues de type sauvage 72 heures avant la micro-injection.Effectuer des micro-injections d’embryons d’Anophèles gambiae dans du chlorure de sodium de 25 millimolaires en ciblant le pôle postérieur de l’embryon à un angle de 45 degrés. Effectuer des micro-injections d’embryons d’Aophèle stephensi dans de l’huile d’halocarbure en ciblant le pôle postérieur à un angle de 30 degrés. Immédiatement après l’injection, transférer les œufs dans une boîte de Pétri remplie d’eau distillée stérile et les remettre dans des conditions insectaires.À l’éclosion, transférer la larve de G0 dans un plateau avec de l’eau distillée salée tous les jours et l’élever jusqu’aux nymphes. Trier les pupes G0 par sexe sous un stéréoscope. Laissez les mâles émerger dans des cages séparées en groupes de trois à cinq et ajoutez dix fois plus de femelles de type sauvage appariées selon l’âge.Laissez les femelles émerger dans des cages séparées en groupes de 10 à 15 et ajoutez un nombre égal de mâles de type sauvage appariés selon l’âge. Laissez les adultes s’accoupler pendant quatre à cinq jours et fournissez aux femelles un repas de sang. Ramassez les œufs et élevez les G1 émergents de la prochaine génération.Recueillir les larves G1, L3 et L4 dans une boîte de Pétri recouverte de papier filtre humide ou sur une lame de microscope et les filtrer à l’aide d’un stéréoscope fluorescent pour détecter la présence du marqueur introduit avec la cargaison étiquetée attB. Pour les conceptions à un seul attB, écran pour la présence du nouveau marqueur préexistant. Pour les conceptions à double attB pour l’échange de cassettes, écran pour la présence du nouveau marqueur et la perte du préexistant.Triez les nymphes G1 transformées par sexe et croisez-les en masse avec des individus de type sauvage de sexe opposé correspondant à l’âge. Laissez les adultes s’accoupler pendant quatre à cinq jours et fournissez un repas de sang. Pour les expériences d’intégration unique, collectez les œufs directement à partir de la croix en masse.Pour les expériences d’échange de cassettes, collectez les œufs de femelles individuelles et maintenez la progéniture séparée jusqu’à ce que l’évaluation moléculaire soit terminée en raison de la présence potentielle de deux orientations de cassette alternatives. Dépister la descendance G2 pour la présence du marqueur fluorescent et réserver un sous-ensemble d’individus G2 positifs pour l’analyse moléculaire. Élevez le reste à l’âge adulte.Effectuer la validation moléculaire des sites d’insertion avec la PCR comme décrit dans le manuscrit textuel. Pour une intégration unique, assurez-vous que le site d’insertion prévu porte la construction d’amarrage d’origine, ainsi que toute la séquence du plasmide donneur entre les deux sites hybrides attL et attR. Pour l’échange de cassettes, assurez-vous que le site d’insertion prévu est identique à celui de la ligne d’accueil où les sites attL inversés hybrides remplacent les sites attP inversés d’origine et le modèle d’échange remplace la cassette initialement présente entre eux.Le protocole a été utilisé pour générer une lignée transgénique Anopheles stable en environ 10 semaines. La validation phénotypique de la transformation a été réalisée par criblage de marqueurs fluorescents régulés par le promoteur 3xP3 sont montrés ici. Une nouvelle ligne Anopheles stephensi a été obtenue par l’insertion d’une cassette marquée en rouge DS dans une ligne d’amarrage marquée avec CFP, ce qui a permis à la progéniture G1 d’exprimer les deux marqueurs, comme l’indique la fluorescence rouge et bleue dans les yeux.Les conceptions d’échange de cassettes entraînent le remplacement du marqueur inséré à l’origine dans la ligne d’amarrage par celui du plasmide donneur. Cet échange de marqueurs a été démontré dans une ligne d’amarrage d’Anopheles gambiae où le marqueur CFP a été perdu et le marqueur YFP acquis, ce qui a entraîné une fluorescence jaune des yeux et du cordon nerveux. Parfois, le RMCE peut entraîner un seul événement d’intégration au lieu de l’échange de la cassette transgénique souhaitée où une larve est marquée à la fois avec le CFP d’origine et les nouveaux marqueurs YFP.Lors du dépistage de la présence d’un marqueur fluorescent, il est crucial de distinguer son signal de l’autofluorescence de fond possible. Il est nécessaire d’augmenter le grossissement et de se concentrer sur les tissus et les organes où la fluorescence devrait être entraînée par le promoteur pour identifier les véritables individus positifs à la CFP. Les transformants individuels ont également été évalués moléculairement par PCR pour confirmer le site d’insertion attendu.La validation par PCR chez les individus d’une ligne d’échange Anopheles gambiae est montrée ici. Même une technique de micro-injection appropriée, la conception et la préparation précises des plasmides donneurs et auxiliaires, ainsi que le suivi du schéma d’élevage de moustiques approprié sont essentiels pour obtenir des individus transgéniques. Cette procédure peut être utilisée pour insérer des éléments provoquant une surexpression ou un silence des gènes, par exemple, le système GAL4 / UAS, ainsi que des éléments de forçage génétique et des molécules anti-pathogènes pour le contrôle génétique des moustiques.

Research

JoVE Journal

Genetics

Site-Directed &#966;C31-Mediated Integration and Cassette Exchange in Anopheles Vectors of Malaria

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

siRNA Transfection et EMSA Analyses sur fraîchement isolés villosités cytotrophoblastes humaines

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

Recherche

Génétique

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Mesure parallèle d&#39;expression Circadian Clock génique et la sécrétion d&#39;hormones dans des cultures de cellules humaines primaires

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

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Optogénétiques mutagenèse aléatoire Utilisation Histone-miniSOG dans<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

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L&#39;élevage et d&#39;ARN double brin médiée Gene Knockdown dans le Hide Beetle,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

Site d&#39;intégration bidirectionnel Retroviral Méthodologie PCR et analyse de données quantitatives Workflow

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CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

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Un protocole pour la Production de vecteurs LENTIVIRAUX intégrase déficient pour CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout dans les cellules en Division

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CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 gène édition à faire conditionnel Mutants de Human Parasite du paludisme à P. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Caractériser l’Histone modifications post-traductionnelles levure neurodégénératives Proteinopathy modèles

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...