Wir danken Kiona Parker (UCI) für die Bereitstellung von Bildern von transgenen An. stephensi-Larven und Fraser Colman (LSTM) und Beth Poulton (LSTM) für die Bereitstellung transgener An. gambiae-Larven . Beth Poulton (LSTM) leistete auch wertvolle Hilfe bei der Bildgebung von An. gambiae-Larven . Diese Arbeit wurde vom Tata Institute for Genetics and Society (TIGS) und dem Director Catalyst Fund des LSTM finanziert, der an A.A. (DCF2014AA) vergeben wurde. A.A.J. ist Donald Bren Professor an der University of California, Irvine.

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Das genaue Design von attB-markierten Plasmiden, die mit der Docking-Linie ihrer Wahl kompatibel sind, ist für den Erfolg des Experiments von größter Bedeutung. Die Wahl des Markers, der für das Screening von Transformationsmitteln verwendet wird, einschließlich der Fluoreszenzfarbe und ihres Expressionsmusters, die dem bereits in der Andocklinie vorhandenen Muster unterliegen, muss sorgfältig geprüft werden. Es ist notwendig, fluoreszierende Marker zu verwenden, die leicht unterscheidbar sind: Gute Markerkombinationen umfassen RFP (rot) / CFP (cyan), RFP (rot) / GFP (grün), RFP (rot) / YFP (gelb) und YFP (gelb) / CFP (cyan), während kombinationen, die vermieden werden sollten, YFP (gelb) / GFP (grün) und CFP (cyan) / GFP (grün) sind. Der 3xP3-Promotor39, spezifisch für die Augen und das Nervenstrang, wird am häufigsten verwendet, um die Expression von fluoreszierenden Markern für die Mückentransgenese zu steuern. Tatsächlich nutzen alle derzeit verfügbaren Anopheles-Dockinglinien diesen Promoter. Alternative regulatorische Regionen sind die des An. gambiae-Polyubiquitin-Gens (PUBc)5 oder des viralen Promotors IE120, die die Expression in mehreren Geweben antreiben. Wenn sie zusammen mit 3xP3 verwendet werden, würden diese Promotoren die möglichen Farbkombinationen und sogar die Verwendung desselben Fluorophors erweitern. Die angegebenen Promotoren sind während des gesamten Lebenszyklus der Mücke aktiv, was ein Screening und eine Fluoreszenzüberwachung in allen Lebensstadien ermöglicht. Eine zusätzliche Überlegung beim Plasmiddesign ist die Größe der zu integrierenden oder auszutauschenden Ladung. Während das φC31-System bemerkenswerte Tragfähigkeiten hat18, sollte berücksichtigt werden, dass die Größe des Donorplasmids im Allgemeinen negativ mit der Transformationseffizienz korreliert22.
Im beschriebenen Protokoll ist die Quelle der Integrase ein Helferplasmid, das das Enzym ubiquitär exprimiert40. Das ubiquitäre Vorhandensein der Integrase kann zur Umwandlung von Körperzellen führen, wenn Mikroinjektionen nicht genau auf den Bereich gerichtet sind, in dem sich die Keimbahn bildet. Während solche Transformationsereignisse verloren gehen, da sie nicht vererbbar sind, können somatische Effekte die Fitness injizierter Individuen verringern. Um dies zu vermeiden und die Umwandlungseffizienz zu erhöhen, kann die Integraseexpression auf die Keimbahn beschränkt werden, beispielsweise durch Verwendung des Vasapromotors22,26. Andere Protokolle beschreiben die Verwendung von in vitro transkribierter Boten-RNA (mRNA) als Quelle der φC31-Integrase19,24,43. Dies beinhaltet jedoch die mühsame Herstellung von mRNA und erfordert einen sorgfältigen Umgang mit der Injektionsmischung und die Verwendung von RNase-freien Reagenzien, um einen Abbau zu vermeiden. Plasmidquellen der Integrase haben sich sowohl in An. gambiae9,21,22,26,33,37 als auch in An. stephensi (A.A. persönliche Kommunikation) als zuverlässig erwiesen und führen zu einer effizienten Transformation und sind daher unsere bevorzugte Option. Eine weitere Option für die Integrase-Abgabe ist die In-vivo-Produktion in selbstdockenden Helferleinen. Solche Linien wurden in An. gambiae erzeugt, die die φC31-Integrase unter der Regulation der keimbahnspezifischen Promotor-Nanos exprimieren und zu einer verbesserten Überlebens- und Transformationseffizienz führen20. Es müssen jedoch mögliche Fitnessbelastungen durch die In-vivo-Produktion des Integrase-Enzyms an der Hilfslinie berücksichtigt werden.
Wie bei anderen transgenen Techniken muss der Aufzucht und Kreuzung von Individuen, die aus injizierten Embryonen stammen, besondere Aufmerksamkeit gewidmet werden, um die Chancen auf die Gewinnung von Transformationsmitteln zu maximieren. Personen, die das Transgen stabil geerbt haben, können zunächst an den G1-Nachkommen gewonnen werden. Frühe Anzeichen einer möglichen Transformation können jedoch durch das Vorhandensein einer vorübergehenden episomalen Expression des fluoreszierenden Markers in den Analpapillen und/oder Nervensträngen der ersten und zweiten Larven von G0 unter Verwendung des 3xP3-Promotors43 bewertet werden. Während das Vorhandensein von vorübergehender Fluoreszenz auf eine erfolgreiche Plasmidabgabe hindeutet, garantiert sie keine vererbbare Keimbahntransformation. Ebenso schließt das Fehlen eines transienten Ausdrucks eine erfolgreiche Transformation nicht aus. Dennoch wurde beobachtet, dass vorübergehend positive Individuen eher transgene Nachkommen hervorbringen als vorübergehend negative43,48. In fachkundigen Händen kann die Aufzucht und Kreuzung von nur positiven Individuen eine Option sein, um die Anzahl der Mücken zu reduzieren. Angesichts der Bedeutung und Zerbrechlichkeit kleiner G0-Larven ist jedoch immer noch die geringste Manipulation ratsam und die Aufzucht aller G0-Individuen wird immer empfohlen.
Das in diesem Protokoll beschriebene Paarungsschema wurde entwickelt, um die Wahrscheinlichkeit der Paarung zu maximieren und unabhängige Transformationsereignisse zu isolieren. Wenn jedoch Insektenraum oder Personalverfügbarkeit ein Problem darstellt, können G0-Erwachsene nach Geschlecht in Einzelkäfigen zusammengefasst werden, wenn genügend gegengeschlechtliche Personen zur Verfügung gestellt werden. Ein solches Setup ermöglicht keine Unterscheidung zwischen mehreren Transformationsereignissen, die bei Individuen aus demselben Käfig auftreten. Je nach Versuchsaufbau wird während des Screening-Prozesses mit dem Vorhandensein eines doppelten (einfache Integration) oder eines einfachen (RMCE) Markers gerechnet. In einzelnen Integrationsexperimenten ist es wichtig, das Vorhandensein des ursprünglichen Markers von der Andocklinie zu überprüfen, während es in RMCE wichtig ist, den Verlust des zuvor integrierten Markers zu überprüfen. In der Tat ist es in RMCE-Designs nicht ungewöhnlich, Transformationsmittel zurückzugewinnen, bei denen aufgrund der Rekombination eines einzelnen attP-Standorts eine einzelne Integration anstelle eines Austauschs stattfand9,33. Bei solchen Individuen sind sowohl fluoreszierende Marker als auch das gesamte Spenderplasmid-Rückgrat vorhanden, was die Bedeutung eines gründlichen Screenings für beide Fluoreszenzmarker unterstreicht.
Während das Vorhandensein von erwarteten Fluoreszenzmustern auf eine erfolgreiche Transformation hinweist, muss eine molekulare Charakterisierung der Insertionsstelle vorgenommen werden. Dazu ist die Erstellung genauer Karten des vorhergesagten Insertionsortes, einschließlich der flankierenden genomischen Regionen der Andocklinie, entscheidend für das Design adäquater diagnostischer Oligonukleotid-Primer für Genamplifikationsanalysen. Einzelne Integrationsereignisse führen zur Bildung von attR - und attL-Hybridstellen an der Verbindung zwischen der neu integrierten DNA und der zuvor eingefügten Kassette. Diese Websites können für die Validierung der Einfügewebsite als Ziel festgelegt werden. In RMCE-Designs kann das Einsetzen der Donorkassette in zwei alternativen Orientierungen in Bezug auf den genomischen Locus erfolgen, so dass vier Primer in alternativen PCR-Kombinationen verwendet werden können, um zu erkennen, welche Orientierung die Linie trägt. Da die Orientierung der Kassetteneinfügung die Transgenexpression beeinflussen kann, ist es bei der vergleichenden Genexpressionsanalyse wichtig, Linien mit der gleichen Ausrichtung der Insertion zu verwenden.
Bei der Arbeit mit einer geringen Anzahl von Transformationsmitteln ist es möglicherweise nicht wünschenswert, ganze Individuen für die molekulare Analyse zu opfern. Eine Option dazu ist die Durchführung einer molekularen Analyse von DNA, die aus den Beinen eines einzelnen Erwachsenen extrahiert wurde46 , da der Beinverlust die Fähigkeit eines erwachsenen Weibchens, sich zu paaren und zu ovipositieren, nicht beeinträchtigt49. Es besteht jedoch die Gefahr, dass die Person bei der Beinentfernung beschädigt wird. Der Erfolg wurde mit verworfenen Puppenfällen (L. Grigoraki persönliche Kommunikation) erzielt, aber der sicherste Ansatz besteht darin, eine molekulare Analyse an G2-Eltern durchzuführen, nachdem sie lebensfähige G3-Nachkommen erhalten haben.
In den letzten Jahren hat CRISPR/Cas9 die Art und Weise der ortsspezifischen Genom-Editierung revolutioniert26,41,50,51. Im Gegensatz zu ortsgerichtetem RMCE sind CRISPR/Cas9-vermittelte Genintegrationen (Knock-Ins) unabhängig vom Vorhandensein von vorinstallierten Rekombinationsstellen, wobei nur ein einstufiges Transformationsereignis erforderlich ist. Dennoch beruht das CRISPR/Cas9-System auf dem Vorhandensein großer bekannter genomischer Sequenzen, die die gewünschte Insertionsstelle für eine erfolgreiche homologiegerichtete Reparatur flankieren, sowie auf der effizienten Standorterkennung, die durch Leit-RNAs vermittelt wird. Diese Bedingungen können nicht immer erfüllt werden oder können mühsam zu beheben sein, und angesichts der Verfügbarkeit mehrerer Andocklinien in An. gambiae und An. stephensi und der von ihnen abgeleiteten Leitungen bleibt das φC31-System ein sehr wertvolles Werkzeug, um direkte phänotypische Vergleiche zwischen Transgenen an denselben genomischen Standorten durchzuführen.

Die Fähigkeit, das Genom von Mückenvektoren von Krankheiten zuverlässig und reproduzierbar zu modifizieren, hat die in vivo funktionelle Validierung von Genen gestärkt und die Türen zu realisierbaren genetischen Vektorkontrollstrategien geöffnet, wie sie auf Anopheles-Mücken abzielen, die Malaria übertragen1.
Die frühe Mücken-Genom-Editierung stützte sich ausschließlich auf die transponierbare Elementtransformation (TE), wobei PiggyBac das am häufigsten verwendete Transposon in Anopheles war2,3,4. Die zufällige Natur der TE-Integration kann jedoch zu unerwünschten Modifikationen wie Gen-Knockouts (Insertionsmutagenese) und signifikanten Positionseffekten auf die Transgenexpression führen5,6,7,8. Mehrfacheinfügungen kommen auch bei der Verwendung von piggyBac5,9 häufig vor, was die Validierung und Isolierung transgener Linien mit einzelnen Einfügungen mühsam macht. Weitere Nachteile sind ihre potenzielle Remobilisierung, wie sie in der Keimbahn von Anopheles stephensi beobachtet wird, wenn eine Quelle für PiggyBac-Transposase10,11,12 bereitgestellt wird, und ihre begrenzte Größe der DNA-Ladung (10-15 kb Länge), wobei die Transformationseffizienz mit zunehmender Größe des Spenderplasmids abnimmt13,14.
Um diese Probleme zu umgehen, wurden standortgesteuerte Integrationsansätze eingeführt. Die häufigste ortsgerichtete Genommodifikation bei Moskitos ist diejenige, die durch das φC31-System vermittelt wird (Abbildung 1a). Dies wird durch eine virale Integrase angetrieben, die die Rekombination zwischen zwei heterospezifischen Bindungsstellen (att) katalysiert, die natürlich im Genom des Bakteriophagen φC31 (attP) und im Streptomyces-Bakterium-Wirt (attB)15 vorkommen. Die Rekombination der beiden Standorte ist unidirektional und führt zur Bildung von Hybridstellen (attL und attR). Die Rekombination solcher Hybridstellen (die zur DNA-Exzision führt) würde nicht nur das Vorhandensein einer aktiven viralen Integrase, sondern auch eines anderen Phagen-kodierten Rekombinationsfaktors erfordern16,17. So wird ein stabiler Integrationsstandort generiert, der das Problem einer möglichen unerwünschten Remobilisierung entlastet15. Darüber hinaus ermöglicht das System die Integration großer Ladungen (z. B. integration von >100 kb-Konstrukten wurde in D. melanogaster18 berichtet), wodurch die Tragfähigkeiten erheblich erhöht werden. Die Integration erfolgt in einem einzigen vordefinierten genomischen Locus, was die Validierung der Insertion und des Paarungsschemas erheblich vereinfacht, um eine stabile transgene Linie zu erhalten. Schließlich ermöglicht die ortsgerichtete Natur der Integration eine Normalisierung der Expression, da sich alternative Transgene am selben Ort befinden und daher im selben benachbarten genomischen Kontext reguliert werden. In der Tat ist eine der Hauptanwendungen der Technik der direkte Vergleich von Phänotypen, die von verschiedenen Transgenen nach der Insertion in einen identischen Locus verliehen werden.
Das Erreichen einer φC31-vermittelten Integration umfasst zwei Phasen: Phase I ist die Schaffung transgener Andocklinien, die attP-Standorte transportieren, und Phase II ist die standortgerichtete Integration einer attB-flankierten Ladung in das Genom der Andocklinie19. Die Erstellung von Phase-I-Dockinglinien stützte sich auf die TE-vermittelte zufällige Integration von attP-markierten Konstrukten und beinhaltete daher einen ersten mühsamen Prozess (einschließlich Southern Blot- und inverser PCR-Analysen an einzelnen weiblichen Nachkommen), um transgene Linien zu isolieren und zu validieren, die ein einziges Integrationsereignis an einzigartigen, transkriptionell aktiven und fitnessneutralen genomischen Orten tragen. Dennoch wurden in An. gambiae1,20,21,22 und in An. stephensi23,24,25 mehrere Andocklinien für die φC31-vermittelte Einzelintegration entwickelt und validiert (Tabelle 1). Jede dieser Linien variiert in Bezug auf die genomische Lage der Andockstelle und den stammspezifischen genetischen Hintergrund und aus ihnen kann eine Vielzahl neuer transgener Linien geschaffen werden. Die komplexe Validierung von TE-vermittelten Integrationen zur Herstellung von Docking-Linien kann nun durch die CRISPR/Cas9-Technologie umgangen werden26; Dies beruht jedoch auf dem A-priori-Wissen über neutrale Loci, die anvisiert werden sollen, und ihre umgebenden Sequenzen.
Die φC31-vermittelte Integration wurde umfassend auf die Genom-Editierung von Insekten aus dem Modellorganismus D. melanogaster27, den Moskitos Aedes aegypti13,28, Ae. albopictus29, An. gambiae19 und An. stephensi24 sowie anderen Insekten wie Ceratitis capitata30 und Bombyx mori31 angewendet.
Eine Einschränkung der φC31-vermittelten Integration, insbesondere im Hinblick auf mögliche Feldfreisetzungen zur Vektorkontrolle, ist die Integration des gesamten attB-tragenden Spenderplasmids in das Mückengenom, einschließlich unerwünschter Sequenzen wie Antibiotikaresistenz-Genmarker und Plasmid-Backbone-Komponenten bakteriellen Ursprungs. Um dies zu adressieren, wurde eine Modifikation des Standardsystems, rekombinase-vermittelter Kassettenaustausch (RMCE), implementiert, die den präzisen Ersatz einer zuvor integrierten transgenen Kassette durch eine neue Donor-DNA ermöglicht (Abbildung 1b). Dies wird durch die Verwendung von zwei invertierten Att-Stellen erreicht, die die Spender- und Empfängerkassetten an jedem Ende flankieren, was dazu führt, dass zwei unabhängige Rekombinationsereignisse gleichzeitig stattfinden, was zu einem Kassettenaustausch ohne Integration des Plasmid-Backbones führt. Dieses verbesserte Design umgeht die Integration unerwünschter Sequenzen und erweitert die Anwendung von φC31-Systemen um beispielsweise die Integration von nicht markierten DNA-Ladungen durch Screening auf den Verlust eines zuvor integrierten Fluoreszenzmarkers32.
RMCE wurde zuerst mit D. melanogaster32 erreicht und später erfolgreich auf Nicht-Modellinsekten wie An. gambiae9,26,33, Ae. aegypti34, Plutella xylostella34 und B. mori35 angewendet. Mehrere Dockinglinien für RMCE wurden in An. gambiae5,9,26 entwickelt und validiert (Tabelle 1). Unseres Wissens muss RMCE noch in anderen Anopheles-Vektorarten erforscht werden.
Bisher wurde das φC31-System in anopheles-Mücken weit verbreitet eingesetzt, um eine Vielzahl von Molekülen einzuführen und zu untersuchen, darunter Malaria-Effektoren19,24,36, Komponenten des GAL4/UAS-Systems zur Überexpression und Knockdown-Gene für Insektizidresistenzstudien9,33, regulatorische Elemente, Reportergene5,21,37 und Gene-Drive-Elemente26 ,38.
Dieses Protokoll beschreibt, wie 1) die standortgerichtete Integration einer attB-flankierten Ladung und 2) rmCE eines von invertierten attB-Stellen flankierten Konstrukts in das Genom der Anopheles-Docking-Linien durchgeführt werden. Dies wird durch die Verwendung von zwei Plasmiden erreicht: einem Donor-attB-markierten Plasmid, das das transgen von Interesse trägt, und einem Helferplasmid, das die φC31-Integrase exprimiert. Die wichtigsten Malaria-Vektoren An. gambiae und An. stephensi werden als spezifische Beispiele verwendet, diese Protokolle sind jedoch auf andere Anopheles-Arten anwendbar.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig01.jpg"> Abbildung 1. Ortsgerichtete Genommodifikationen, Einzelintegration und Rekombinase-vermittelter Kassettenaustausch (RMCE) unter Verwendung des φC31-Systems. Die φC31-Integrase (INT, grauer Doppelpfeil) katalysiert die Rekombination zwischen der attB-Stelle(n) (violett gestreift), die in einem Donorplasmid vorhanden ist, und der attP-Stelle(n) (blau gestreift), die in einer aufnehmenden Andocklinie vorhanden ist, was zur Bildung von Hybridstellen attL und attR führt. A) Die Integration wird erreicht, wenn einzelne attB- und attP-Standorte rekombiniert werden und zu zwei integrierten Markern (blau und rot) führen. B) RMCE tritt auf, wenn zwei attB/P-Stellen gleichzeitig rekombinieren und dazu führen, dass die Kassette zwischen den Att-Stellen der Andocklinie (blauer Marker) durch die vom Donorplasmid (roter Marker) getragene ersetzt wird. C) Partielle Nukleotidsequenzen von attP (blau) und attB (violett) und die Hybridstellen attL/R. Die Rekombination erfolgt zwischen den schwarz hervorgehobenen "TT"-Kernsequenzen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL eppendorf tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well microslides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MARI1216690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree&#160;Plasmid&#160;Maxi&#160;Kit (10)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Absolute, Molecular Biology Grade</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter set CFP for Leica MZ FLIII Excitation 436/20 nm, extinction 480/40 nm</td>
			<td>Leica</td>
			<td>10446363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter set dsRED for Leica MZ FLIII Excitation 545/30 nm, extinction 620/60 nm</td>
			<td>Leica</td>
			<td>10447079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter set YFP customised for Leica MZ FLIII</td>
			<td>Omega Optical</td>
			<td>500QM25, 500QM35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 27</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 700</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium&#160;chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium&#160;Acetate&#160;Solution (3 M),&#160;pH&#160;5.2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Life Technologies)</td>
			<td>R1181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stable brush Size 0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

site-directed &#966;c31-mediated integration and cassette exchange in anopheles vectors of malaria

Die funktionelle Genomanalyse und verwandte Strategien zur genetischen Kontrolle von Malaria beruhen auf validierten und reproduzierbaren Methoden, um das Genom von Anopheles-Mücken genau zu modifizieren. Unter diesen Methoden ermöglicht das φC31-System eine präzise und stabile ortsgerichtete Integration von Transgenen oder die Substitution integrierter transgener Kassetten durch Rekombinase-vermittelten Kassettenaustausch (RMCE). Diese Methode beruht auf der Wirkung der Streptomyces φC31 Bakteriophagen-Integrase, um die Rekombination zwischen zwei spezifischen Bindungsstellen namens attP (abgeleitet vom Phagen) und attB (abgeleitet vom Wirtbakterium) zu katalysieren. Das System verwendet ein oder zwei attP-Stellen, die zuvor in das Mückengenom integriert wurden, und attB-Stellen in der Spendervorlagen-DNA. Hier veranschaulichen wir, wie das Genom von attP-tragenden Anopheles-Dockinglinien mit zwei Plasmiden stabil modifiziert werden kann: einem attB-markierten Spender, der die Integrations- oder Austauschvorlage trägt, und einem Helferplasmid, das für die φC31-Integrase kodiert. Wir berichten über zwei repräsentative Ergebnisse der φC31-vermittelten ortsgerichteten Modifikation: die einmalige Integration einer transgenen Kassette in An. stephensi und RMCE in An. gambiae-Mücken. φC31-vermittelte Genommanipulation bietet den Vorteil einer reproduzierbaren Transgenexpression aus validierten, fitnessneutralen genomischen Stellen, die vergleichende qualitative und quantitative Analysen von Phänotypen ermöglicht. Die standortorientierte Natur der Integration vereinfacht auch die Validierung der einzelnen Einfügestelle und des Paarungsschemas erheblich, um eine stabile transgene Linie zu erhalten. Diese und weitere Eigenschaften machen das φC31-System zu einem wesentlichen Bestandteil des genetischen Werkzeugkastens für die transgene Manipulation von Malariamücken und anderen Insektenvektoren.

Das hier dargestellte Protokoll ermöglicht es, eine stabile transgene Anopheles-Linie in ~ 10 Wochen zu erzeugen (unter der Annahme eines 21-tägigen Mückenlebenszyklus).
Es wird erwartet, dass die Larvenbrutraten nach der Injektion in An. gambiae im Allgemeinen niedriger sind als bei An. stephensi, jedoch wurden Schlüpfraten zwischen 10-50% berichtet9,20,24,26,33,43,47. Bei entsprechender Injektionstechnik reichen Schlüpfraten von ≥20% im Allgemeinen aus, um Transformanten zu erhalten. Die DNA-Aufnahme durch die Embryonen kann durch Screening junger Larven auf vorübergehende Expression des fluoreszierenden Markers beurteilt werden. In erfolgreichen RMCE-Experimenten an An. gambiae mit dem 3xP3-Promotor zeigten bis zu 50% der überlebenden G0-Larven eine episomale Expression des Markers in der Analpapille48.
Verallgemeinerte Schätzungen der Transformationseffizienz sind zwischen Labors und sogar zwischen Experimenten schwer zu bewerten, da die Transformation von einem komplexen Zusammenspiel von Variablen abhängt, darunter Reinheit, Konzentration, Größe und potenzielle Toxizität der injizierten DNA, Qualität der Eier, Handhabung von Eiern vor und nach der Injektion, Mückenaufzucht und vor allem die Erfahrung des Bedieners. Transformationsraten von bis zu 7% wurden für RMCE in An. gambiae (berechnet als die Anzahl der unabhängigen Transformationsereignisse in der Gesamtzahl der G0-Individuen)9,26,33 und bis zu 2,2% Transformationsrate für die Integration in An. stephensi erhalten. Wir schlagen vor, mindestens 500 Embryonen zu injizieren, was zum Schlüpfen von mindestens 100 G0-Larven und zu 2-7 G0 erwachsenen Gründern führen sollte, aus denen stabil transformierte Nachkommen gewonnen werden können. Beim Screening auf vorübergehende Expression bei G0-Larven können bis zu 40 positive Larven erwartet werden.
Beispiele für die phänotypische Validierung der Transformation durch das Screening von fluoreszierenden Markern, die durch den 3xP3-Promotor reguliert werden, sind in Abbildung 4 und  Abbildung 5 dargestellt. Abbildung 4 zeigt eine neue An. stephensi-Linie, die durch Einsetzen einer DsRed-markierten Kassette in eine mit CFK markierte Andocklinie erhalten wurde (80.9, Tabelle 1), was dazu führt, dass G1-Nachkommen beide Marker exprimieren, wie durch die in den Augen nachgewiesene rote und blaue Fluoreszenz angezeigt.
Es wird stattdessen erwartet, dass RMCE-Designs dazu führen, dass der marker, der ursprünglich in die Docking-Linie eingeführt wurde, durch den des Donorplasmids ersetzt wird. Abbildung 5A und  Abbildung B veranschaulichen diesen Markeraustausch in einer mit CFK gekennzeichneten An. gambiae-Andocklinie (A11, Tabelle 1), wo nach erfolgreicher RMCE der CFP-Marker verloren geht und der YFP-Marker erfasst wird, was zu einer gelben (aber nicht blauen) Augen- und Nervenstrangfluoreszenz führt33. Gelegentlich kann RMCE zu einem einzigen Integrationsereignis anstelle des Austauschs der gewünschten transgenen Kassette führen, wie in Abbildung 5C dargestellt, wo eine Larve gezeigt wird, die sowohl mit dem ursprünglichen CFP als auch mit den neuen YFP-Markern markiert ist. Es wird berichtet, dass bis zu 50% der Gesamtzahl der Transformationsereignisse einzelne Integrationen sind9,33.
Beim Screening auf das Vorhandensein eines fluoreszierenden Markers ist es entscheidend, sein Signal von einer möglichen Hintergrundautofluoreszenz zu unterscheiden. Dies ist besonders wichtig bei der Verwendung von CFP, da Anopheles-Larven eine natürliche blaue Autofluoreszenz aufweisen (Abbildung 6A). Die Erhöhung der Vergrößerung und die Konzentration auf die Gewebe und Organe, bei denen die Fluoreszenz voraussichtlich vom Promotor angetrieben wird, ist notwendig, um echte CFP-positive Individuen zu identifizieren, wie in Abbildung 6B unter Verwendung des 3xP3-CFP-Markers dargestellt.
Einzelne Transformanten werden schließlich molekular mittels PCR untersucht, um die erwartete Insertionsstelle zu bestätigen. Abbildung 7 zeigt die PCR-Validierung bei Individuen aus einer Austausch-An. gambiae-Linie , die die beiden möglichen Orientierungen der Insertion im Mückengenom zeigt33.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig04.jpg"> Abbildung 4. Validierung der φC31-Einzelintegration in An. stephensi-Larven (dorsale Ansicht). A) Die Andocklinie (80.9, Tabelle 1) drückt die GFP in den Augen unter der Regulierung des 3xP3-Promotors aus. B) Eine erfolgreiche Integration führt zur Expression des neu erworbenen DsRed sowie des ursprünglichen CFP-Markers in den Augen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig05.jpg"> Abbildung 5. Validierung von φC31 RMCE in An. gambiae Larven (ventrale Ansicht). A) Die Andocklinie (A10, Tabelle 1) drückt CFP unter der Regulation des 3xP3-Promotors in den Augen (e) und dem Nervenstrang (nc)5 aus. B) Erfolgreiche RMCE führt zum Wechsel des Fluoreszenzmarkers von CFP zu YFP33. C) Während des RMCE-Experiments trat ein einzelnes Integrationsereignis auf, bei dem die transformierende Larve sowohl die CFP- als auch die YFP-Marker exprimiert. Diese Larve trägt GAL4/UAS-Komponenten, die ein breites Expressionsmuster von YFP verursachen, besonders stark in den Bauchmuskeln (am). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig06.jpg"> Abbildung 6. CFP-Autofluoreszenz in An. gambiae-Larven (dorsale Ansicht). A) Side-by-Side-Bild einer positiven (CFP+) und einer negativen (CFP-) L4-Larve mit dem CFP-Filter. B) Nahaufnahme der Larvenaugen, die ein CFP+ vs CFP - Individuum zeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig07.jpg"> Abbildung 7. Molekulare Validierung der Orientierung der Kassetteneinfügung in repräsentativer transgener An. gambiae erstellt durch φC31 RMCE. Die transgene Kassette kann in einer von zwei alternativen Ausrichtungen (A oder B) in Bezug auf die Einfügestelle eingesetzt werden. Jede PCR-Reaktion (I - IV) verwendet eine Kombination von Primern (5-8)33 , die entwickelt wurden, um ein diagnostisches Amplifikationsfragment für jede Orientierung zu erhalten, wie in den schematischen Plasmidkarten angegeben. T1: repräsentatives transgenes Individuum, das die Orientierung der Insertion A trägt; T2: repräsentatives transgenes Individuum, das die Orientierung der Insertion B trägt; WT: Wildtyp; DL: Docking-Linie; -: Reaktionsnegativkontrolle, bei der Wasser als Vorlage verwendet wurde. Diese Zahl wurde von Adolfi et al. (2019)33 modifiziert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig07large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Spezies</td>
			<td>Dehnung</td>
			<td>Name</td>
			<td>attP(s)</td>
			<td>Chromo-some</td>
			<td>Promoter-Marker</td>
			<td>Herkunftsinstitution</td>
			<td>Referenz</td>
		</tr>
<tr>
<td>An. stephensi</td>
			<td>Indiana
</td>
			<td>26,10 b
</td>
			<td>Ledig</td>
			<td>2R</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>Univ. von Kalifornien Irvine</td>
			<td>25</td>
		</tr>
<tr>
<td>An. stephensi</td>
			<td>Indiana
</td>
			<td>44Cb
</td>
			<td>Ledig</td>
			<td>X</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>Univ. von Kalifornien Irvine</td>
			<td>23, 24</td>
		</tr>
<tr>
<td>An. stephensi</td>
			<td>Indiana
</td>
			<td>80,9 Mrd.
</td>
			<td>Ledig</td>
			<td>2L</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>Univ. von Kalifornien Irvine</td>
			<td>Diese Studie</td>
		</tr>
<tr>
<td>An. gambiae</td>
			<td>G3</td>
			<td>113</td>
			<td>Ledig</td>
			<td>2R</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>Univ. von Kalifornien Irvine</td>
			<td>Diese Studie</td>
		</tr>
<tr>
<td>An. gambiae</td>
			<td>KIL</td>
			<td>Ec
</td>
			<td>Ledig</td>
			<td>3R</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>Keele Univ.</td>
			<td>19, 43</td>
		</tr>
<tr>
<td>An. gambiae</td>
			<td>G3</td>
			<td>X1</td>
			<td>Ledig</td>
			<td>2L</td>
			<td>Keine Markierung</td>
			<td>Universität Straßburg</td>
			<td>22</td>
		</tr>
<tr>
<td>An. gambiae</td>
			<td>G3</td>
			<td>YAttP</td>
			<td>Ledig</td>
			<td>Y</td>
			<td>3xP3-Ausschreibung</td>
			<td>Imperial Hochschule London</td>
			<td>21</td>
		</tr>
<tr>
<td>An. gambiae</td>
			<td>G3</td>
			<td>A10b
</td>
			<td>Doppelt</td>
			<td>2R</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>Liverpool Schule Trop. Med.</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>An. gambiae</td>
			<td>G3</td>
			<td>A11b
</td>
			<td>Doppelt</td>
			<td>2R</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>Liverpool Schule Trop. Med.</td>
			<td>9</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="8">ein. Stamm von der Johns Hopkins University (Schenkung von M. Jacobs-Lorena) und in Kultur an der Univ. of California Irvine für >20 Jahre.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="8">b. Diese Zeilen sind auf begründeten Wunsch bei den Autoren erhältlich.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="8">c. Diese Zeile ist im BEI-Repository www.beiresources.org als MRA-1163 verfügbar.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1. Anopheles attP Docking-Linien.

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Site-Directed ÃƒÂÃ¢â‚¬Â C31-Mediated Integration and Cassette Exchange in Anopheles Vectors of Malaria

Das Protokoll beschreibt, wie mit dem φC31-System ortsgerichtete Modifikationen im Genom von Anopheles-Malariamücken erreicht werden können. Zu den beschriebenen Modifikationen gehören sowohl die Integration als auch der Austausch transgener Kassetten im Genom von attP-tragenden Andockleitungen.

Ortsgerichtete φC31-vermittelte Integration und Kassettenaustausch in Anopheles-Vektoren der Malaria

Functional genomic analysis and related strategies for genetic control of malaria rely on validated and reproducible methods to accurately modify the ...

Dieses Protokoll unterstützt die Charakterisierung der Rolle von Mückengenen, die an einer Vielzahl von physiologischen Signalwegen beteiligt sind, einschließlich beispielsweise Insektenresistenz und Malariaparasitenentwicklung. Die Methode treibt die Transgeninsertion in einzelne vorcharakterisierte genomische Stellen voran und ermöglicht daher den direkten Vergleich von Phänotypen, die aus alternativen Transgenen resultieren, wodurch das Problem des Positionseffekts effektiv vermieden wird. Diese Methode kann auf eine Vielzahl von Insektenarten von öffentlicher Gesundheit und landwirtschaftlicher Bedeutung angewendet werden, und ihre Anwendungen erstrecken sich weit von Bakterien bis hin zu Säugetierzellen.Beginnen Sie mit der Entwicklung von attB-Donorplasmiden, die den dominanten Fluoreszenzmarker, attB-Rekombinationsstellen und die gewünschte Transgenfracht tragen. Verwenden Sie eine einzelne attB-Stelle für die Integration des gesamten Plasmids, das die transgene Kassette trägt, oder zwei invertierte attB-Stellen für den Kassettenaustausch. Reinigen Sie Spender- und Helferplasmide mit einem endotoxinfreien Reinigungskit.Kombinieren Sie das attB-markierte Spenderplasmid, das das transgen von Interesse trägt, und das Helferplasmid, das die Integrase trägt, um eine Mischung mit einer Endkonzentration von 350 Nanogramm pro Mikroliter des Spenderplasmids und 150 Nanogramm pro Mikroliter des Helferplasmids zu erhalten. Niederschlagen Sie die DNA, indem Sie 0,1 Volumen von drei molaren Natriumacetat und 2,5 Volumen eiskaltes 100% Ethanol hinzufügen, dann Wirbel. Ein weißer Niederschlag sollte sofort sichtbar sein.Waschen Sie das Pellet und versenken Sie es in Injektionspuffer, um eine Gesamtendkonzentration von 500 Nanogramm pro Mikroliter zu erreichen. Bereiten Sie dann Aliquots von je 10-15 Mikrolitern vor und lagern Sie sie bei minus 20 Grad Celsius. Blut füttern vier bis sieben Tage alte Moskitos aus der gewünschten Dockingline und ihre Wildtyp-Gegenstücke 72 Stunden vor der Mikroinjektion.Führen Sie Anopheles gambiae Embryo-Mikroinjektionen in 25 Millimolar-Natriumchlorid durch, indem Sie den hinteren Pol des Embryos in einem Winkel von 45 Grad anvisieren. Führen Sie Anopheles stephensi Embryo-Mikroinjektionen in Halocarbonöl durch, indem Sie den hinteren Pol in einem Winkel von 30 Grad anvisieren. Unmittelbar nach der Injektion die Eier in eine Petrischale geben, die mit sterilem destilliertem Wasser gefüllt ist, und sie in insektäre Bedingungen zurückbringen.Nach dem Schlüpfen die G0-Larve täglich in ein Tablett mit gesalzenem destilliertem Wasser geben und zu den Puppen aufziehen. Sortieren Sie G0-Puppen nach Geschlecht unter einem Stereoskop. Lassen Sie die Männchen in getrennten Käfigen in Gruppen von drei bis fünf auftauchen und fügen Sie einen zehnfachen Überschuss an altersgerechten Wildtypweibchen hinzu.Lassen Sie die Weibchen in getrennten Käfigen in Gruppen von 10 bis 15 auftauchen und fügen Sie eine gleiche Anzahl von altersgerechten Wildtypmännchen hinzu. Erlauben Sie Erwachsenen, sich für vier bis fünf Tage zu paaren und versorgen Sie die Weibchen mit einer Blutmahlzeit. Sammeln Sie die Eier und ziehen Sie aufstrebende G1s der nächsten Generation auf.Sammeln Sie G1-, L3- und L4-Larven in einer Petrischale, die mit nassem Filterpapier ausgekleidet ist, oder auf einem Objektträger und screenen Sie sie mit einem fluoreszierenden Stereoskop auf das Vorhandensein des Markers, der mit der attB-markierten Ladung eingeführt wurde. Bei einzelnen ATTB-Designs, überprüfen Sie das Vorhandensein des neuen und bereits vorhandenen Markers. Für Doppel-ATTB-Designs für den Kassettenwechsel, Bildschirm für das Vorhandensein des neuen Markers und den Verlust des bereits vorhandenen.Sortieren Sie transformierte G1-Puppen nach Geschlecht und kreuzen Sie sie massenhaft mit altersgerechten Wildtyp-Individuen des anderen Geschlechts. Lassen Sie Erwachsene sich vier bis fünf Tage paaren und geben Sie eine Blutmahlzeit. Sammeln Sie für einzelne Integrationsexperimente Eier direkt vom Massenkreuz.Sammeln Sie für Kassettenaustauschexperimente Eier von einzelnen Weibchen und halten Sie die Nachkommen getrennt, bis die molekulare Bewertung aufgrund des möglichen Vorhandenseins von zwei alternativen Kassettenorientierungen abgeschlossen ist. Screenen Sie die G2-Nachkommen auf das Vorhandensein des fluoreszierenden Markers und legen Sie eine Untergruppe von G2-positiven Individuen für die molekulare Analyse beiseite. Ziehen Sie den Rest ins Erwachsenenalter zurück.Führen Sie eine molekulare Validierung der Insertionsstellen mit PCR durch, wie im Textmanuskript beschrieben. Stellen Sie für eine einzelne Integration sicher, dass die vorhergesagte Insertionsstelle das ursprüngliche Docking-Konstrukt sowie die gesamte Sequenz des Donorplasmids zwischen den beiden Hybridstellen attL und attR trägt. Stellen Sie beim Kassettenaustausch sicher, daß die vorhergesagte Einfügestelle mit der der Andocklinie identisch ist, wobei hybride invertierte ATTL-Stellen die ursprünglichen invertierten ATTP-Standorte ersetzen und die Austauschvorlage die ursprünglich zwischen ihnen vorhandene Kassette ersetzt.Das Protokoll wurde verwendet, um in etwa 10 Wochen eine stabile transgene Anopheles-Linie zu erzeugen. Die phänotypische Validierung der Transformation wurde durch Screening auf fluoreszierende Marker durchgeführt, die durch den 3xP3-Promotor reguliert werden. Eine neue Anopheles stephensi-Linie wurde durch Einsetzen einer rot markierten DS-Kassette in eine mit CFP markierte Docking-Linie erhalten, was dazu führte, dass G1-Nachkommen beide Marker exprimierten, wie durch die rote und blaue Fluoreszenz in den Augen angezeigt.Kassettenaustauschdesigns führen dazu, dass der ursprünglich in die Dockingline eingeführte Marker durch den des Donorplasmids ersetzt wird. Dieser Markeraustausch wurde in einer Anopheles gambiae-Andocklinie demonstriert, bei der der CFP-Marker verloren ging und der YFP-Marker erworben wurde, was zu einer Fluoreszenz des gelben Auges und der Nervenschnur führte. Gelegentlich kann RMCE zu einem einzigen Integrationsereignis anstelle des Austauschs der gewünschten transgenen Kassette führen, bei der eine Larve sowohl mit dem ursprünglichen CFP als auch mit den neuen YFP-Markern markiert ist.Beim Screening auf das Vorhandensein eines Fluoreszenzmarkers ist es entscheidend, sein Signal von einer möglichen Hintergrund-Autofluoreszenz zu unterscheiden. Die Erhöhung der Vergrößerung und die Konzentration auf die Gewebe und Organe, bei denen die Fluoreszenz voraussichtlich vom Promotor angetrieben wird, ist notwendig, um echte CFP-positive Individuen zu identifizieren. Einzelne Transformanten wurden auch molekular mittels PCR untersucht, um die erwartete Insertionsstelle zu bestätigen.Die PCR-Validierung bei Individuen aus einer Anopheles gambiae-Austauschlinie ist hier dargestellt. Selbst eine geeignete Mikroinjektionstechnik, das genaue Design und die Herstellung der Spender- und Helferplasmide sowie die Einhaltung des entsprechenden Mückenhaltungsschemas sind der Schlüssel zur Gewinnung transgener Individuen. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um Elemente einzufügen, die eine Überexpression oder Stummschaltung von Genen verursachen, beispielsweise das GAL4 / UAS-System sowie Gene-Drive-Elemente und Antipathogenmoleküle für die genetische Kontrolle von Mücken.

Research

JoVE Journal

Genetics

Site-Directed &#966;C31-Mediated Integration and Cassette Exchange in Anopheles Vectors of Malaria

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

siRNA-Transfektion und EMSA-Analysen auf frisch isolierten menschlichen Villöse Cytotrophoblasten

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

Forschung

Genetik

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Parallel Messung von Circadian Clock Genexpression und Hormon-Sekretion in primären humanen Zellkulturen

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetische Zufallsmutagenese Mit Histon-miniSOG in<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Zucht- und RNA-vermittelte Gene Knockdown in der ausblenden Doppelstrang-Käfer,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

Bidirektionale Retrovirale Integrationsstelle PCR Methodik und quantitative Datenanalyse Workflow

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites zur Definition zellspezifischer Regulierungsregionen

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-vermittelten gezielte Integration In Vivo mit einer Homologie-vermittelte Ende verbinden-basierte Strategie

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

Ein Protokoll für die Produktion der Integrase-defizienten Lentivirale Vektoren für CRISPR/Cas9-vermittelte Gen Knockout in teilenden Zellen

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 gen Bearbeitung zu machen bedingte Mutanten der menschlichen Malaria-Parasiten p. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Charakterisierung von Histon Post-translationale Modifikation Veränderungen in Hefe Neurodegenerative Proteinopathy Modelle

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...