אנו מודים לקיונה פרקר (UCI) על שסיפקה תמונות של זחלים מהונדסים An. stephensi , ולפרייזר קולמן (LSTM) ולבת' פולטון (LSTM) על שסיפקו זחלי An. gambiae מהונדסים. בת ' פולטון (LSTM) גם סיפקה סיוע יקר במהלך ההדמיה של זחלי An. gambiae . עבודה זו מומנה על ידי מכון טאטא לגנטיקה וחברה (TIGS) וקרן Catalyst המנהלת של LSTM שהוענקה ל- A.A. (DCF2014AA). איי.איי.ג'יי הוא פרופסור לדונלד ברן באוניברסיטת קליפורניה, אירווין.

למחברים אין מה לחשוף.

העיצוב המדויק של פלסמידים מתויגים attB התואמים לקו העגינה של בחירה הוא בעל חשיבות עליונה להצלחת הניסוי. יש לשקול היטב את הבחירה של הסמן המשמש לסינון של שנאים, כולל צבע פלואורסצנטיות ודפוס הביטוי שלה, אשר יהיה כפוף לתבנית שכבר קיימת בקו העגינה. יש צורך להשתמש סמנים פלואורסצנטיים שניתן להבחין בקלות: שילובי סמן טובים כוללים RFP (אדום)/CFP (ציאן), RFP (אדום)/GFP (ירוק), RFP (אדום)/YFP (צהוב) ו- YFP (צהוב)/CFP (ציאן), בעוד שילובים שיש להימנע מהם הם YFP (צהוב)/GFP (ירוק) ו- CFP (ציאן)/GFP (ירוק). מקדם 3xP33, ספציפי לעיניים ולחוט העצבים, הוא הנפוץ ביותר להנעת הביטוי של סמנים פלואורסצנטיים עבור טרנסגנזה יתושים. ואכן, כל קווי העגינה של אנופלס הזמינים כיום משתמשים במקדם זה. אזורי רגולציה חלופיים הם של הגן פוליוביקוויטין An. gambiae (PUBc)5 או מקדם הנגיף IE120, אשר מניעים ביטוי ברקמות מרובות. כאשר נעשה שימוש יחד עם 3xP3, מקדמים אלה ירחיבו את שילובי הצבעים האפשריים ואפילו את השימוש באותו פלואורופור. היזמים המצוינים פעילים לאורך מחזור החיים של היתושים ומאפשרים סינון וניטור פלואורסצנטיות בכל שלבי החיים. שיקול נוסף במהלך תכנון הפלסמיד הוא גודל המטען שיש לשלב או להחליף. בעוד שלמערכת φC31 יש יכולות נשיאה יוצאות דופן18, יש לקחת בחשבון כי גודל הפלסמיד התורם בדרך כלל מתואם באופן שלילי עם יעילות טרנספורמציה22.
בפרוטוקול המתואר מקור האינטגראז הוא פלסמיד עוזר המבטא את האנזים בכל מקום40. הנוכחות בכל מקום של integrase עלול להוביל טרנספורמציה של תאים סומטיים אם microinjections אינם מכוונים במדויק לאזור שבו נוצר נבט. בעוד אירועי טרנספורמציה כאלה יאבדו כפי שהם אינם תורשתיים, אפקטים סומטיים יכולים להפחית את הכושר של אנשים מוזרקים. כדי למנוע זאת ולהגדיל את יעילות הטרנספורמציה, ביטוי integrase יכול להיות מוגבל לקו הנבט, למשל באמצעות מקדם vasa2,26. פרוטוקולים אחרים מתארים את השימוש ב- RNA שליח מתומלל במבחנה (mRNA) כמקור של φC31 integrase19,24,43. עם זאת, זה כרוך הכנה מייגעת של mRNA ודורש טיפול זהיר של תערובת ההזרקה ושימוש ריאגנטים חינם RNase כדי למנוע השפלה. מקורות פלסמיד של אינטגראס הוכחו הן An. gambiae9,21,22,26,33,37 ו An. stephensi (A.A. תקשורת אישית) להיות אמין ולהוביל טרנספורמציה יעילה, ולכן הם האפשרות המועדפת עלינו. אפשרות נוספת לאספקת integrase היא ייצור in vivo שלה בקווי עוזר עגינה עצמית. קווים כאלה נוצרו An. gambiae המבטאים את φC31 integrase תחת הרגולציה של ננו מקדם ספציפי נבטים ונמצאו להוביל להישרדות משופרת ויעילות טרנספורמציה20. עם זאת, יש לקחת בחשבון עומסי כושר פוטנציאליים המוטלים על ידי ייצור in vivo של האנזים integrase בקו המסייע.
כמו בטכניקות מהונדסות אחרות, טיפול מיוחד חייב להיות שמור לגידול וחצייה של אנשים הנובעים עוברים מוזרקים כדי למקסם את הסיכויים לשחזר טרנספורמציה. אנשים שירשו ביציבות את הטרנסג'ן ניתן לשחזר תחילה בצאצאי G1. עם זאת, סימנים מוקדמים של טרנספורמציה פוטנציאלית ניתן להעריך על ידי נוכחות של ביטוי אפיזומי חולף של סמן פלואורסצנטי בפפילות אנאלי ו / או חוט עצב של G0 הראשון והשני זחלי instar בעת שימוש 3xP3 מקדם43. בעוד נוכחות של פלואורסצנטיות חולפת מרמזת על משלוח פלסמיד מוצלח, זה לא מבטיח טרנספורמציה נבטית תורשתית. באופן דומה, היעדר ביטוי ארעי אינו שולל טרנספורמציה מוצלחת. עם זאת, נצפתה כי אנשים חיוביים חולפים נוטים יותר להניב צאצאים מהונדסים לעומת אלה שליליים חולפים43,48. בידיים מומחים, גידול וחצייה של אנשים חיוביים בלבד עשוי להיות אופציה להפחית את מספר היתושים. עם זאת, בהתחשב בחשיבות ובשבריריות של זחלי G0 קטנים, כמות המניפולציה הנמוכה ביותר עדיין מומלצת וגידול כל האנשים G0 מומלץ תמיד.
ערכת ההזדווגות המדווחת בפרוטוקול זה נועדה למקסם את הסיכוי להזדווגות ולבודד אירועי טרנספורמציה עצמאיים. עם זאת, אם מרחב חרקים או זמינות כוח אדם הוא בעיה, G0 מבוגרים יכולים להיות משולבים על ידי סקס בכלובים בודדים אם מספיק אנשים בני המין השני מסופקים. התקנה כזו לא תאפשר אפליה בין אירועי טרנספורמציה מרובים המתרחשים אצל אנשים מאותו כלוב. בהתאם להתקנה הניסיונית, נוכחות של סמן כפול (אינטגרציה יחידה) או יחיד (RMCE) צפויה במהלך תהליך ההקרנה. בניסויי אינטגרציה בודדים חשוב לאמת את נוכחותו של הסמן המקורי מקו העגינה, ואילו ב- RMCE חשוב לאמת את אובדן הסמן המשולב בעבר. אכן, זה לא נדיר בעיצובים RMCE לשחזר טרנספורמציה שבה אינטגרציה אחת במקום חילופי התרחש עקב recombination של אתר attP יחיד9,33. אצל אנשים כאלה שני סמנים פלואורסצנטיים נוכחים, כמו גם את כל עמוד השדרה plasmid התורם המדגיש את החשיבות של ביצוע הקרנה יסודית עבור שני סמנים פלואורסצנטיים.
בעוד שנוכחותם של דפוסי פלואורסצנטיות צפויים מצביעה על טרנספורמציה מוצלחת, יש לבצע אפיון מולקולרי של אתר ההחדרה. כדי לעשות זאת, הכנת מפות מדויקות של מוקד ההחדרה החזוי, כולל האזורים הגנומיים האגפים של קו העגינה, חיונית לתכנון פריימרים לאוליגונוקלאוטידים אבחנתיים נאותים לניתוחי הגברה גנטית. אירועי אינטגרציה בודדים גורמים להיווצרות אתרים היברידיים attR ו - attL בצומת שבין הדנ"א המשולב החדש לבין הקלטת שהוכנסה בעבר. ניתן לייעד אתרים אלה לאימות אתר הכנסה. בעיצובי RMCE, החדרת קלטת התורם יכולה להתרחש בשתי אוריינטציות חלופיות ביחס למוקוס הגנומי, ולכן ניתן להשתמש בארבעה פריימרים בשילובי PCR חלופיים כדי לזהות איזו כיוון הקו נושא. מכיוון שהכיוון של החדרת קלטות עשוי להשפיע על ביטוי טרנסג'ן, בניתוח ביטוי גנים השוואתי חשוב להשתמש בקווים הנושאים את אותו כיוון הכנסה.
כאשר עובדים עם מספר נמוך של שנאים זה לא יכול להיות רצוי להקריב אנשים שלמים לניתוח מולקולרי. אפשרות לכך היא ביצוע ניתוח מולקולרי על DNA המופק מרגליו של מבוגר יחיד46 כמו אובדן רגל אינו משפיע על יכולת נשית בוגרת להזדווג oviposit49. עם זאת, קיים סיכון של פגיעה באדם בתהליך של הסרת הרגל. ההצלחה הושגה באמצעות מקרים pupal זרוק (L. Grigoraki תקשורת אישית), אולם הגישה הבטוחה ביותר היא לבצע ניתוח מולקולרי על הורים G2 לאחר קבלת צאצאי G3 קיימא.
בשנים האחרונות, CRISPR/Cas9 חוללה מהפכה באופן ביצוע עריכת הגנום הספציפי לאתר26,41,50,51.51. שלא כמו RMCE המופנה על ידי האתר, שילובי גנים בתיווך CRISPR/Cas9 (נוק-אין) אינם תלויים בנוכחותם של אתרי רקומבינציה שהוכנסו מראש עם אירוע טרנספורמציה של שלב אחד בלבד. עם זאת, מערכת CRISPR/Cas9 מסתמכת על נוכחותם של רצפים גנומיים ידועים גדולים המאגפים את אתר הכניסה הרצוי לתיקון מכוון הומולוגי מוצלח, כמו גם על זיהוי האתר היעיל בתיווך RNAs מדריך. תנאים אלה לא תמיד ניתן לעמוד או עשוי להיות מייגע כדי לפתור בעיות, בהתחשב בזמינות של קווי עגינה מרובים An. gambiae ו An. stephensi וקווים הנגזרים מהם, מערכת φC31 נשאר כלי בעל ערך רב כדי לבצע השוואות פנוטיפיות ישירות בין טרנסג'נים באותם מיקומים גנומיים.

היכולת לשנות את הגנום של וקטורים יתושים של מחלות באופן אמין ורבייה חיזקה את האימות התפקודי של vivo של גנים ופתחה את הדלתות לאסטרטגיות בקרה וקטוריות גנטיות הניתנות למימוש, כגון אלה המתמקדות יתושי אנופלס המעבירים מלריה1.
עריכת גנום יתושים מוקדמת הסתמכה אך ורק על טרנספורמציה בתיווך אלמנטים הניתנים להחלפה (TE), כאשר piggyBac היה הטרנספוזון הנפוץ ביותר באנופלס2,3,4. עם זאת, האופי האקראי של שילוב TE יכול להוביל לשינויים בלתי רצויים כגון נוקאאוטים גנטיים (מוטגנזה של הכנסה) והשפעות מיקום משמעותיות על ביטוי טרנסג'ן5,6,7,8. כניסות מרובות הן גם תופעה שכיחה בעת שימוש piggyBac5,9, מה שהופך את האימות ואת הבידוד של קווים מהונדסים עם הוספות בודדות מייגע. חסרונות אחרים כוללים את הגיוס הפוטנציאלי שלהם, כפי שנצפה בנבט של אנופלס סטיבנסי בעת מתן מקור של piggyBac transposase10,11,12, ואת הגודל המוגבל שלהם של מטען DNA (10-15 kb אורך) עם יעילות טרנספורמציה יורדת עם הגדלת גודלו של פלסמיד התורם13,14.
גישות אינטגרציה מכוונות אתר הוצגו כדי לעקוף בעיות אלה. שינוי הגנום הנפוץ ביותר בהכוונת האתר יתושים הוא זה בתיווך מערכת φC31 (איור 1a). זה מונע על ידי אינטגרז ויראלי שמזרז את הרקומבינציה בין שני אתרי התקשרות הטרוספיפית (att) המתרחשים באופן טבעי בגנום של הבקטריופאג ' φC31 (attP) ובפונדקאי החיידק סטרפטומיצ'ס (attB)15. שילוב מחדש של שני האתרים הוא חד כיווני וכתוצאה מכך היווצרות של אתרים היברידיים (attL ו- attR). שילוב מחדש של אתרים היברידיים כאלה (המוביל לכריתת DNA) ידרוש לא רק נוכחות של אינטגראס ויראלי פעיל, אלא גם גורם רקומבינציה מקודד פאג 'אחר 16,17. כך נוצר אתר אינטגרציה יציב שמקל על נושא הגיוס מחדש הפוטנציאלי לא רצוי15. יתר על כן, המערכת מאפשרת שילוב של מטענים גדולים (למשל, שילוב של מבנים >100 kb דווח ב D. melanogaster18), להגדיל באופן משמעותי את יכולות הנשיאה. האינטגרציה מתרחשת בלוקוס גנומי מוגדר מראש יחיד אשר מפשט מאוד את אימות הכניסה ואת ערכת ההזדווגות כדי להשיג קו מהונדס יציב. לבסוף, האופי המכוון לאתר של השילוב מאפשר נורמליזציה של הביטוי כמו טרנסג'נים חלופיים ממוקמים באותו לוקוס ולכן מוסדר בתוך אותו הקשר גנומי שכן. ואכן, אחד היישומים העיקריים של הטכניקה הוא השוואה ישירה של פנוטיפים המוענקים על ידי טרנסגנים שונים לאחר החדרה לתוך לוקוס זהה.
השגת אינטגרציה בתיווך φC31 כרוכה בשני שלבים: שלב I הוא יצירת קווי עגינה מהונדסים הנושאים אתרי attP( ים), ושלב II הוא שילוב מכוון אתר של מטען אגף attB בגנום של קו העגינה19. יצירת קווי עגינה שלב I הסתמכה על השילוב האקראי בתיווך TE של מבנים מתויגים על-ידי ATTP ולכן כללה תהליך מייגע ראשוני (כולל כתמים דרומיים וניתוחי PCR הפוכים בצאצאים חד-נשיים) כדי לבודד ולאמת קווים מהונדסים הנושאים אירוע אינטגרציה יחיד במיקומים גנומיים ייחודיים, פעילים בתמלול וכושר נייטרלי. עם זאת, מספר קווי עגינה לאינטגרציה יחידה בתיווך φC31 פותחו ואומתו ב- An. gambiae19,20,21,22 וב- An. stephensi23,24,25 (טבלה 1). כל אחד מהקווים האלה משתנה מבחינת המיקום הגנומי של אתר העגינה והרקע הגנטי הספציפי לזן וממנו ניתן ליצור מגוון גדול של קווים מהונדסים חדשים. כעת ניתן לעקוף את האימות המורכב של אינטגרציות בתיווך TE להפקת קווי עגינה באמצעות טכנולוגיית CRISPR/Cas926; עם זאת, זה מסתמך על ידע מראש של loci נייטרלי להיות ממוקד ורצפים הסובבים אותם.
φC31-בתיווך אינטגרציה הוחלה בהרחבה על עריכת גנום חרקים מן האורגניזם המודל D. melanogaster27, כדי יתושים Aedes aegypti13,28, Ae. albopictus29, An. gambiae19, ו An. stephensi24, כמו גם חרקים אחרים כולל Ceratitis capitata30 ו Bombyx mori31.
מגבלה של אינטגרציה בתיווך φC31, במיוחד לאור שחרורי שדה פוטנציאליים לבקרה וקטורית, היא שילוב בגנום היתושים של כל הפלסמיד התורם נושא ה- ATTB, כולל רצפים לא רצויים כגון סמני גנים עמידים לאנטיביוטיקה ורכיבי עמוד שדרה פלסמיד ממקור חיידקי. כדי לטפל בכך, יושם שינוי של המערכת הסטנדרטית, חילופי קלטות בתיווך רקומבינאז (RMCE), המאפשר החלפה מדויקת של קלטת מהונדסת ששולבה בעבר בדנ"א תורם חדש (איור 1b). זה מושג על ידי שימוש בשני אתרי att הפוכים מאגפים את קלטות התורם והנמען בכל קצה, מה שמניע שני אירועי רקומבינציה עצמאיים להתקיים בו זמנית וכתוצאה מכך חילופי קלטות ללא שילוב של עמוד השדרה הפלסמיד. עיצוב משופר זה עוקף את השילוב של רצפים לא רצויים ומרחיב את היישום של מערכות φC31 לכלול למשל שילוב של מטעני DNA לא מסומנים על ידי הקרנה לאובדן סמן פלואורסצנטי משולב בעבר32.
RMCE הושגה תחילה עם D. melanogaster32 ומאוחר יותר הוחלה בהצלחה על חרקים שאינם מודל כולל An. gambiae9,26,33, Ae. aegypti34, Plutella xylostella34, ו- B. mori35. מספר קווי עגינה עבור RMCE פותחו ואומתו ב- An. gambiae5,9,26 (טבלה 1). למיטב ידיעתנו, RMCE עדיין לא נחקרה במינים אחרים של וקטורים של אנופלס.
עד כה, מערכת φC31 שימשה באופן נרחב יתושים אנופלס כדי להציג וללמוד מגוון רחב של מולקולות כולל מפעילי antimalaria19,24,36, רכיבים של מערכת GAL4 / UAS כדי overexpress ו להפיל גנים למחקרי עמידות לחומרי הדברה9,33, אלמנטים רגולטוריים, גנים עיתונאיים 5,21,37, ואלמנטים כונן גנים26 38.
פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע 1) שילוב מכוון אתר של מטען אגף attB ו 2) RMCE של מבנה מוקף על ידי אתרי attB הפוכים לתוך הגנום של קווי עגינה אנופלס . זה מושג באמצעות שני plasmids: פלסמיד מתויג attB תורם הנושא את הטרנסג'ן של עניין, ו plasmid עוזר המבטא את φC31 integrase. וקטורים המלריה העיקריים An. gambiae ו An. stephensi משמשים כדוגמאות ספציפיות, אולם פרוטוקולים אלה חלים על מינים אחרים של אנופלס .
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig01.jpg"> איור 1. שינויי גנום מכווני אתר, אינטגרציה יחידה והחלפת קלטות בתיווך רקומבינאז (RMCE) , באמצעות מערכת φC31. ה- φC31 integrase (INT, חץ כפול אפור) מזרז את השילוב בין אתרי attB (פסים סגולים) הנמצאים בפלסמיד תורם לבין אתרי ה- ATTP (פסים כחולים) הנמצאים בקו עגינה מקבל, מה שמביא להיווצרות אתרים היברידיים attL ו- attR. A) אינטגרציה מושגת כאשר אתרי attB ו- attP בודדים מתאחדים מחדש ומביאים לנוכחות של שני סמנים משולבים (כחול ואדום). ב) RMCE מתרחשת כאשר שני אתרי attB / P מתאחדים בו זמנית וכתוצאה מכך החלפת הקלטת בין אתרי ה- att של קו העגינה (סמן כחול) עם זה שנושא פלסמיד התורם (סמן אדום). ג) רצפי נוקלאוטידים חלקיים של attP (כחול) ו- attB (סגול) ואתרים היברידיים attL / R. רקומבינציה מתרחשת בין רצפי הליבה 'TT' המסומנים בשחור מודגש. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL eppendorf tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well microslides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MARI1216690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree&#160;Plasmid&#160;Maxi&#160;Kit (10)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Absolute, Molecular Biology Grade</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter set CFP for Leica MZ FLIII Excitation 436/20 nm, extinction 480/40 nm</td>
			<td>Leica</td>
			<td>10446363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter set dsRED for Leica MZ FLIII Excitation 545/30 nm, extinction 620/60 nm</td>
			<td>Leica</td>
			<td>10447079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter set YFP customised for Leica MZ FLIII</td>
			<td>Omega Optical</td>
			<td>500QM25, 500QM35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 27</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 700</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium&#160;chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium&#160;Acetate&#160;Solution (3 M),&#160;pH&#160;5.2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Life Technologies)</td>
			<td>R1181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stable brush Size 0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

site-directed &#966;c31-mediated integration and cassette exchange in anopheles vectors of malaria

ניתוח גנומי פונקציונלי ואסטרטגיות נלוות לשליטה גנטית במלריה מסתמכים על שיטות מאומתות וניתנות לשחזור כדי לשנות במדויק את הגנום של יתושי אנופלס. בין שיטות אלה, מערכת φC31 מאפשרת שילוב מדויק ויציב של טרנסג'נים, או החלפת קלטות מהונדסות משולבות באמצעות חילופי קלטות בתיווך רקומבינאז (RMCE). שיטה זו מסתמכת על הפעולה של Streptomyces φC31 בקטריופג integrase כדי לזרז recombination בין שני אתרי התקשרות ספציפיים המיועדים attP (נגזר phage) ו- attB (נגזר החיידק המארח). המערכת משתמשת באתר attP אחד או שניים ששולבו בעבר בגנום היתושים ואתרי attB בדנ"א של תבנית התורם. כאן אנו ממחישים כיצד לשנות ביציבות את הגנום של קווי עגינה אנופלס נושאי attP באמצעות שני פלסמידים: תורם מתויג attB הנושא את תבנית האינטגרציה או ההחלפה ופלטסמיד עוזר המקודד את ה- φC31 integrase. אנו מדווחים על שתי תוצאות מייצגות של שינוי φC31 בתיווך האתר: שילוב יחיד של קלטת מהונדסת ב An. stephensi ו RMCE יתושים An. gambiae. מניפולציית הגנום בתיווך φC31 מציעה את היתרון של ביטוי טרנסג'ן לשחזור מאתרים גנומיים ניטרליים מאומתים, ומאפשרת ניתוחים איכותיים וכמותיים השוואתיים של פנוטיפים. האופי המכוון לאתר של האינטגרציה גם מפשט באופן משמעותי את האימות של אתר הכניסה היחיד ואת ערכת ההזדווגות כדי לקבל קו מהונדס יציב. מאפיינים אלה ואחרים הופכים את מערכת φC31 למרכיב חיוני בערכת הכלים הגנטית למניפולציה מהונדסת של יתושי מלריה וקטורים אחרים של חרקים.

הפרוטוקול המודגם כאן מאפשר ליצור קו מהונדס אנופלס יציב בתוך ~ 10 שבועות (בהנחה מחזור חיים יתוש 21 יום).
שיעורי הבקיעה לאחר הזרקה של זחלים ב An. gambiae צפויים להיות בדרך כלל נמוכים יותר מאשר An. stephensi, אולם שיעורי הבקיעה בין 10-50% דווחו 9,20,20,24,26,33,43,47. בהינתן טכניקת הזרקה מתאימה, שיעורי הבקיעה של ≥20% מספיקים בדרך כלל כדי להניב שנאים. ניתן להעריך את ספיגת הדנ"א על ידי העוברים על ידי סינון זחלים צעירים לביטוי חולף של הסמן הפלואורסצנטי. בניסויי RMCE מוצלחים ב An. gambiae באמצעות מקדם 3xP3 עד 50% של זחלי G0 ששרדו הראו ביטוי אפיזומי של הסמן פפיאלי48 אנאלי.
הערכות כלליות של יעילות טרנספורמציה קשה להעריך בקרב מעבדות ואפילו בקרב ניסויים כמו טרנספורמציה תלויה ביחסי גומלין מורכבים של משתנים כולל טוהר, ריכוז, גודל, גודל, רעילות פוטנציאלית של ה- DNA המוזרק, איכות הביצים, טיפול לפני ואחרי הזרקה של ביצים, גידול יתושים, והכי חשוב את החוויה של המפעיל. שיעורי טרנספורמציה עד 7% הושגו עבור RMCE ב An. gambiae (מחושב כמספר אירועי טרנספורמציה עצמאיים בסך הכל G0 אנשים)9,26,33, ועד 2.2% שיעור טרנספורמציה לאינטגרציה An. stephensi. אנו מציעים הזרקת לפחות 500 עוברים, אשר אמור להוביל לבקוע של לפחות 100 G0 זחלים ול 2-7 G0 מייסדים בוגרים שממנו ניתן להשיג צאצאים שהשתנו ביציבות. אם ניתן לצפות להקרנה לביטוי ארעי בזחלי G0, ניתן לצפות לעד 40 זחלים חיוביים.
דוגמאות לאימות פנוטיפי של טרנספורמציה באמצעות הקרנה של סמנים פלואורסצנטיים המווסתים על ידי מקדם 3xP3 מדווחות באיור 4 ובפיגור  5. איור 4 מציג קו חדש של An. stephensi המתקבל על ידי החדרת קלטת מסומנת DsRed לקו עגינה המסומן ב- CFP (80.9, טבלה 1), וכתוצאה מכך צאצאי G1 מבטאים את שני הסמנים כפי שצוין על ידי הפלואורסצנטיות האדומה והכחולה שזוהתה בעיניים.
עיצובי RMCE צפויים במקום זאת לגרום להחלפת הסמן שהוכנס במקור לקו העגינה עם זה של פלסמיד התורם. איור 5A ו-Figure  B ממחישים חילופי סמן אלה בקו עגינה מסוג An. gambiae המסומן ב- CFP (A11, טבלה 1) כאשר לאחר RMCE מוצלח סמן ה- CFP אובד וסמן YFP נרכש וכתוצאה מכך פלואורסצנטיות צהובה (אך לא כחולה) של העין וכבל העצב33. מדי פעם, RMCE יכול לגרום לאירוע אינטגרציה יחיד במקום לחילופי הקלטת הטרנסגנית הרצויה כפי שמודגם באיור 5C, שם מוצג זחל המסומן הן ב- CFP המקורי והן בסמני YFP החדשים. הוא דיווח כי עד 50% מכלל אירועי טרנספורמציה הם שילובים בודדים9,33.
בעת הקרנה לנוכחות של סמן פלואורסצנטי זה חיוני כדי להבחין האות שלה מן autofluorescence רקע אפשרי. הדבר חשוב במיוחד בעת שימוש ב-CFP כאשר זחלי Anopheles מציגים אוטופלואורסצנטיות כחולה טבעית (איור 6A). הגדלת ההגדלה וההתמקדות ברקמות ובאיברים שבהם פלואורסצנטיות צפויה להיות מונעת על ידי האמרגן נחוצה כדי לזהות אנשים חיוביים אמיתיים של CFP כפי שמודגם באיור 6B באמצעות סמן 3xP3-CFP.
שנאים בודדים מוערכים סוף סוף מולקולרית באמצעות PCR כדי לאשר את אתר הכניסה הצפוי. איור 7 מדווח על אימות PCR ביחידים מקו חילופי An. gambiae המציג את שתי הכיוונים הפוטנציאליים של החדרה בגנום היתושים33.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig04.jpg"> איור 4. אימות של אינטגרציה יחידה φC31 בזחלי An. stephensi (תצוגת גב). א) קו העגינה (80.9, טבלה 1) מבטא CFP בעיניים תחת הרגולציה של מקדם 3xP3 . ב) אינטגרציה מוצלחת גורמת לביטוי של DsRed שנרכש לאחרונה, כמו גם את סמן CFP המקורי בעיניים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig04large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig05.jpg"> איור 5. אימות של φC31 RMCE בזחלי An. gambiae (נוף גחון). A) קו העגינה (A10, טבלה 1) מבטא CFP תחת הרגולציה של מקדם 3xP3 בעיניים (ה) ואת כבל העצבים (nc)5. ב) תוצאות RMCE מוצלחות בהחלפת סמן פלואורסצנטי מ- CFP ל- YFP33. C) אירוע אינטגרציה יחיד התרחש במהלך ניסוי RMCE שבו זחל טרנספורמטיבי מבטא הן את סמני CFP והן את סמני YFP. זחל זה נושא רכיבי GAL4/UAS הגורמים לתבנית ביטוי רחבה של YFP, חזקה במיוחד בשרירי הבטן (am). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig05large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig06.jpg"> איור 6. CFP autofluorescence בזחלי An. gambiae (נוף הגב). A) תמונה זה לצד זה של זחל L4 חיובי (CFP+) ושלילי (CFP-) L4 באמצעות מסנן CFP. ב) תמונת תקריב של העיניים הזחליות החושפת CFP + לעומת CFP- אדם. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig06large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig07.jpg"> איור 7. אימות מולקולרי של הכיוון של החדרת קלטות ב- An. gambiae מהונדס מייצג שנוצר על ידי φC31 RMCE. ניתן להוסיף את הקלטת המהונדסת לאחת משתי כיוונים חלופיים (A או B) ביחס לאתר ההוספה. כל תגובת PCR (I - IV) משתמשת בשילוב של פריימרים (5-8)33 שנועדו לתת קטע הגברה אבחוני עבור כל כיוון כפי שצוין במפות הפלסמיד הסכמטיות. T1: אדם מהונדס מייצג הנושא אוריינטציה של הכנסה A; T2: אדם מהונדס מייצג הנושא אוריינטציה של הכנסה B; WT: סוג פראי; DL: קו עגינה; -: בקרת תגובה שלילית שבה מים שימשו כתבנית. נתון זה שונה מאדולפי ואח' (2019)33. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig07large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>מינים</td>
			<td>זן</td>
			<td>שם</td>
			<td>attP(ים)</td>
			<td>כרומו-כמה</td>
			<td>מקדם-סמן</td>
			<td>מוסד המוצא</td>
			<td>הפניה</td>
		</tr>
<tr>
<td>א. סטיבנסי</td>
			<td>אינדיאנה
</td>
			<td>26.10b
</td>
			<td>סינגל</td>
			<td>2R</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>יוניב מקליפורניה אירווין</td>
			<td>25</td>
		</tr>
<tr>
<td>א. סטיבנסי</td>
			<td>אינדיאנה
</td>
			<td>44Cb
</td>
			<td>סינגל</td>
			<td>X</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>יוניב מקליפורניה אירווין</td>
			<td>23, 24</td>
		</tr>
<tr>
<td>א. סטיבנסי</td>
			<td>אינדיאנה
</td>
			<td>80.9b
</td>
			<td>סינגל</td>
			<td>2L</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>יוניב מקליפורניה אירווין</td>
			<td>מחקר זה</td>
		</tr>
<tr>
<td>א. גמביה</td>
			<td>G3</td>
			<td>113</td>
			<td>סינגל</td>
			<td>2R</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>יוניב מקליפורניה אירווין</td>
			<td>מחקר זה</td>
		</tr>
<tr>
<td>א. גמביה</td>
			<td>קיל</td>
			<td>Ec
</td>
			<td>סינגל</td>
			<td>3R</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>קיל יוניב.</td>
			<td>19, 43</td>
		</tr>
<tr>
<td>א. גמביה</td>
			<td>G3</td>
			<td>X1</td>
			<td>סינגל</td>
			<td>2L</td>
			<td>אין סמן</td>
			<td>יוניב, מלך שטרסבורג</td>
			<td>22</td>
		</tr>
<tr>
<td>א. גמביה</td>
			<td>G3</td>
			<td>YAttp</td>
			<td>סינגל</td>
			<td>Y</td>
			<td>3xP3-RFP</td>
			<td>אימפריאל קולג' לונדון</td>
			<td>21</td>
		</tr>
<tr>
<td>א. גמביה</td>
			<td>G3</td>
			<td>A10b
</td>
			<td>כפול</td>
			<td>2R</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>בית הספר ליברפול Trop. Med.</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>א. גמביה</td>
			<td>G3</td>
			<td>A11b
</td>
			<td>כפול</td>
			<td>2R</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>בית הספר ליברפול Trop. Med.</td>
			<td>9</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="8">a. זן מאוניברסיטת ג'ונס הופקינס (מתנתו של מ 'ג'ייקובס-לורנה) ובתרבות באוניברסיטת קליפורניה אירוויין במשך >20 שנה.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="8">b. שורות אלה זמינות מהמחברים על פי בקשה סבירה.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="8">ג. קו זה זמין במאגר BEI www.beiresources.org כ- MRA-1163.</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1. אנופלס attP קווי עגינה.

Watch this Scientific Journal Video about Site-Directed Ãâ€ C31-Mediated Integration and Cassette Exchange in Anopheles Vectors of Malaria at JoVE.com

Site-Directed ÃƒÂÃ¢â‚¬Â C31-Mediated Integration and Cassette Exchange in Anopheles Vectors of Malaria

הפרוטוקול מתאר כיצד להשיג שינויים מכווני אתר בגנום של יתושי מלריה אנופלס באמצעות מערכת φC31 . השינויים המתוארים כוללים הן את האינטגרציה והן את חילופי הקלטות מהונדסות בגנום של קווי עגינה נושאי attP.

אתר φC31-בתיווך אינטגרציה וחילופי קלטות בוקטורים אנופלס של מלריה

Functional genomic analysis and related strategies for genetic control of malaria rely on validated and reproducible methods to accurately modify the ...

פרוטוקול זה תומך באפיון תפקידם של גני יתושים המעורבים במגוון מסלולים פיזיולוגיים, כולל, למשל, עמידות בפני חרקים והתפתחות טפיל מלריה. השיטה מניעה הכנסת טרנסג'ן למקומות גנומיים בודדים מאופיינים מראש ולכן מאפשרת להשוות ישירות פנוטיפים הנובעים מטרנסג'נים חלופיים ובכך נמנעת ביעילות מבעיית אפקט המיקום. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על מגוון רחב של מיני חרקים בעלי חשיבות בריאותית וחקלאית ציבורית ויישומיה משתרעים באופן נרחב מחיידקים לתאי יונקים.התחילו בתכנון פלסמידים תורמים של ATTB הנושאים את סמן הפלורסצנטי הדומיננטי, אתרי רקומבינציה של ATTB ומטען הטרנסג'ן הרצוי. השתמש באתר attB יחיד לשילוב של הפלסמיד כולו הנושא את הקלטת המהונדסת או שני אתרי attB הפוכים להחלפת קלטות. טיהור פלסמידים של תורמים ועוזרים באמצעות ערכת טיהור נטולת אנדוטוקסין.שלבו את הפלסמיד התורם המתויג ATTB הנושא את הטרנסג'ן של עניין ואת פלסמיד העוזר הנושא את האינטגרה כדי לקבל תערובת עם ריכוז סופי של 350 ננוגרם לכל מיקרוליטר של פלסמיד התורם ו 150 ננוגרם לכל מיקרוליטר של פלסמיד עוזר. לזרז את ה- DNA על ידי הוספת 0.1 נפח של שלושה אצטט נתרן טוחן ו 2.5 כרכים של קר כקרח 100% אתנול, אז מערבולת. משקעים לבנים צריכים להיות גלויים מיד.לשטוף את הכדור ולנצל אותו מחדש במאגר הזרקה כדי להגיע לריכוז סופי כולל של 500 ננוגרם לכל מיקרוליטר. לאחר מכן להכין aliquots של 10-15 microliters כל אחד ולאחסן אותם במינוס 20 מעלות צלזיוס. דם מזין יתושים בני ארבעה עד שבעה ימים מקו העגינה הרצוי ומקביליהם הפראיים 72 שעות לפני הזרקת המיקרו.בצע Anopheles gambiae עובר זריקות מיקרו ב 25 מילימולרי נתרן כלורי על ידי מיקוד הקוטב האחורי של העובר בזווית של 45 מעלות. בצע Anopheles stephensi עובר זריקות מיקרו בשמן halocarbon על ידי מיקוד הקוטב האחורי בזווית של 30 מעלות. מיד לאחר ההזרקה, מעבירים את הביצים לצלחת פטרי מלאה במים מזוקקים סטריליים ומחזירים אותן לתנאי החרקים.עם הבקיעה, מעבירים זחלי G0 למגש עם מים מזוקקים מלוחים מדי יום ומאחור לגלמים. מיין ג'י-0 גולם לפי מין תחת סטריאוסקופ. אפשר לזכרים להופיע בכלובים נפרדים בקבוצות של שלושה עד חמישה ולהוסיף עודף של פי עשרה של נקבות מסוג בר תואמות גיל.אפשר לנקבות להופיע בכלובים נפרדים בקבוצות של 10 עד 15 ולהוסיף מספר שווה של זכרים מסוג בר תואמי גיל. אפשר למבוגרים להזדווג במשך ארבעה עד חמישה ימים ולספק לנקבות ארוחת דם. לאסוף את הביצים ואת האחורי המתעוררים הדור הבא G1s.לאסוף G1, L3, ו L4 זחלים בצלחת פטרי מרופד בנייר מסנן רטוב או על שקופית מיקרוסקופ ולהקרין אותם באמצעות סטריאוסקופ פלואורסצנטי לנוכחות הסמן שהוצג עם המטען מתויג attB. עבור עיצובי attB בודדים, מסך לנוכחות של הסמן החדש והקיים מראש. עבור עיצובי attB כפולים להחלפת קלטות, מסך לנוכחות הסמן החדש ואובדן הסמן הקיים.מיין את גולם G1 השתנה על ידי מין ולחצות אותם בהמוניהם עם בני המין השני מותאם גיל אנשים פראיים תואמים. אפשר למבוגרים להזדווג במשך ארבעה עד חמישה ימים ולספק ארוחת דם. לניסויי אינטגרציה בודדים, אספו ביצים ישירות מהצלב ההמוני.לניסויי החלפת קלטות, לאסוף ביצים מנקבות בודדות ולשמור על צאצאים נפרדים עד שההערכה המולקולרית תושלם בשל נוכחות פוטנציאלית של שתי כיווני קלטות חלופיים. מסננים את צאצאי G2 לנוכחות הסמן הפלואורסצנטי ומניחים בצד תת-קבוצה של אנשים חיוביים G2 לניתוח מולקולרי. תרים את השאר לבגרות.בצע אימות מולקולרי של אתרי ההכנסה עם PCR כמתואר בכתב היד של הטקסט. לאינטגרציה יחידה, ודא כי אתר הכניסה החזוי נושא את מבנה העגינה המקורי, בתוספת כל הרצף של פלסמיד התורם בין שני האתרים ההיברידיים attL ו- attR. עבור חילופי קלטות, ודא כי אתר ההוספה החזוי זהה לזה של קו העגינה שבו אתרי attL היברידיים הפוכים מחליפים את אתרי ה- ATTP ההפוכים המקוריים ותבנית החליפין מחליפה את הקלטת הקיימת במקור ביניהם.הפרוטוקול שימש ליצירת קו מהונדס אנופלס יציב בתוך כ -10 שבועות. אימות פנוטיפי של טרנספורמציה בוצע על ידי הקרנה עבור סמנים פלואורסצנטיים מוסדר על ידי מקדם 3xP3 מוצגים כאן. קו חדש של אנופלס סטיבנסי הושג על ידי החדרת קלטת מסומנת אדומה DS לקו עגינה המסומן ב- CFP אשר הביא לצאצאי G1 המבטאים את שני הסמנים כפי שצוין על ידי פלואורסצנטיות אדומה וכחולה בעיניים.עיצובים של החלפת קלטות גורמים להחלפת הסמן שהוכנס במקור לקו העגינה עם זה של הפלסמיד התורם. חילופי סמן זה הודגם בקו עגינה אנופלס גמביאה שבו סמן CFP אבד ואת סמן YFP שנרכש וכתוצאה מכך פלואורסצנטיות עין צהובה חוט עצב. מדי פעם, RMCE יכול לגרום לאירוע אינטגרציה יחיד במקום חילופי של הקלטת הטרנסגנית הרצויה שבה זחל מסומן הן עם CFP המקורי והן סמני YFP החדשים.בעת הקרנה לנוכחות של סמן פלואורסצנטי, חשוב להבחין האות שלה מן פלואורסצנטיות אוטומטית רקע אפשרית. הגדלת ההגדלה והתמקדות ברקמות ובאיברים שבהם פלואורסצנטיות צפויה להיות מונעת על ידי האמרגן יש צורך לזהות אנשים חיוביים CFP אמיתי. שנאים בודדים נבדקו גם מולקולרית באמצעות PCR כדי לאשר את אתר הכניסה הצפוי.אימות PCR אצל אנשים מקו חילופי אנופלס גמביה מוצג כאן. אפילו טכניקת הזרקת מיקרו מתאימה, תכנון מדויק והכנה של פלסמידים התורם והעוזר, כמו גם בעקבות תוכנית גידול יתושים המתאימה הם המפתח להשגת אנשים מהונדסים. הליך זה יכול לשמש כדי להוסיף אלמנטים הגורמים ביטוי יתר של גנים או השתקה, למשל, מערכת GAL4 / UAS, כמו גם אלמנטים כונן גנים ומולקולות אנטי פתוגן לשליטה גנטית יתושים.

Research

JoVE Journal

Genetics

Site-Directed &#966;C31-Mediated Integration and Cassette Exchange in Anopheles Vectors of Malaria

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

ניתוח Transfection siRNA ו Emsa על Cytotrophoblasts Villous אדם המבודד טרי

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

מדידה במקביל של ביטוי גנים השעון הביולוגי ואת הפרשת הורמון בתרביות תאים ראשוניים אדם

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic mutagenesis אקראי באמצעות היסטון-miniSOG ב<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

התרומם על רגליו אחורי פעמים תקועות מציאת גן בתיווך רנ&quot;א סתר החיפושית,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

דו כיווני Retroviral אינטגרציה אתר PCR מתודולוגיה וניתוח נתונים כמותיים זרימת עבודה

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions

Retroviral סריקה: מיפוי MLV אתרי אינטגרציה להגדרת אזורים רגולטוריים ספציפיים לתא

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-מתווכת אינטגרציה יישוב In Vivo באמצעות אסטרטגיה מבוסס על הצטרפות סוף בתיווך הומולוגיה

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

פרוטוקול עבור הייצור של וקטורים Lentiviral חשוכת-Integrase עבור CRISPR/Cas9-מתווכת נוקאאוט גנטי חלוקת תאים

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 ג'ין עריכה כדי להפוך מותנה מוטציות של בני אדם טפיל המלריה falciparum פ

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

אפיון שינויים Post-translational שינוי היסטון במודלים ניווניות Proteinopathy שמרים

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...