Siamo grati a Kiona Parker (UCI) per aver fornito immagini di larve transgeniche di An. stephensi e a Fraser Colman (LSTM) e Beth Poulton (LSTM) per aver fornito larve transgeniche di An. gambiae . Beth Poulton (LSTM) ha anche fornito una preziosa assistenza durante l'imaging delle larve di An. gambiae . Questo lavoro è stato finanziato dal Tata Institute for Genetics and Society (TIGS) e dal Director Catalyst Fund di LSTM assegnato ad A.A. (DCF2014AA). A.A.J. è un Donald Bren Professor presso l'Università della California, Irvine.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La progettazione accurata di plasmidi marcati con attB che sono compatibili con la linea di attracco scelta è fondamentale per il successo dell'esperimento. Un'attenta considerazione deve essere data alla scelta del marcatore utilizzato per lo screening dei trasformanti, compreso il colore di fluorescenza e il suo modello di espressione, che sarà soggetto al modello già presente nella linea di attracco. È necessario utilizzare marcatori fluorescenti facilmente distinguibili: le buone combinazioni di marcatori includono RFP (rosso) / CFP (ciano), RFP (rosso) / GFP (verde), RFP (rosso) / YFP (giallo) e YFP (giallo) / CFP (ciano), mentre le combinazioni da evitare sono YFP (giallo) / GFP (verde) e CFP (ciano) / GFP (verde). Il promoter 3xP339, specifico per gli occhi e il cordone nervoso, è il più frequentemente utilizzato per guidare l'espressione di marcatori fluorescenti per la transgenesi delle zanzare. In effetti, tutte le linee di attracco Anopheles attualmente disponibili utilizzano questo promotore. Regioni regolatorie alternative sono quella del gene An. gambiae polyubiquitin (PUBc)5 o del promotore virale IE120, che guidano l'espressione in più tessuti. Se usati insieme a 3xP3, questi promotori espanderebbero le possibili combinazioni di colori e persino l'uso dello stesso fluoroforo. I promotori indicati sono attivi durante tutto il ciclo di vita della zanzara consentendo lo screening e il monitoraggio della fluorescenza in tutte le fasi della vita. Un'ulteriore considerazione durante la progettazione del plasmide è la dimensione del carico da integrare o scambiare. Mentre il sistema φC31 ha notevoli capacità di carico18, va considerato che la dimensione del plasmide donatore è generalmente correlata negativamente con l'efficienza di trasformazione22.
Nel protocollo descritto la fonte di integrasi è un plasmide helper che esprime l'enzima ubiquitariamente40. La presenza ubiquitaria dell'integrasi può portare alla trasformazione delle cellule somatiche se le microiniezioni non sono dirette con precisione verso l'area in cui si forma la linea germinale. Mentre tali eventi di trasformazione andranno persi in quanto non sono ereditabili, gli effetti somatici possono ridurre la forma fisica degli individui iniettati. Per evitare questo e aumentare l'efficienza di trasformazione, l'espressione dell'integrasi può essere limitata alla linea germinale, ad esempio utilizzando il promotore vasa22,26. Altri protocolli descrivono l'uso dell'RNA messaggero trascritto in vitro (mRNA) come fonte di φC31 integrasi19,24,43. Tuttavia, ciò comporta la laboriosa preparazione dell'mRNA e richiede un'attenta gestione della miscela di iniezione e l'uso di reagenti privi di RNasi per evitare la degradazione. Le fonti di integrasi plasmidica hanno dimostrato sia in An. gambiae9,21,22,26,33,37 che in An. stephensi (A.A. personal communication) di essere affidabili e portare a una trasformazione efficiente, e sono quindi la nostra opzione preferita. Un'ulteriore opzione per la consegna integrasi è la sua produzione in vivo in linee di supporto auto-docking. Tali linee sono state create in An. gambiae che esprimono l'integrasi φC31 sotto la regolazione del promotore nanos specifico della linea germinale e sono state trovate per portare a una migliore efficienza di sopravvivenza e trasformazione20. Tuttavia, devono essere considerati i potenziali carichi di fitness imposti dalla produzione in vivo dell'enzima integrasi sulla linea helper.
Come per altre tecniche transgeniche, particolare attenzione deve essere riservata all'allevamento e all'incrocio di individui derivanti da embrioni iniettati per massimizzare le possibilità di recupero dei trasformanti. Gli individui che hanno ereditato stabilmente il transgene possono essere prima recuperati alla progenie G1. Tuttavia, i primi segni di potenziale trasformazione possono essere valutati dalla presenza di espressione episomiale transitoria del marcatore fluorescente nelle papille anali e/o nel cordone nervoso delle larve G0 prima e seconda instar quando si utilizza il promotore 3xP343. Mentre la presenza di fluorescenza transitoria suggerisce una consegna positiva del plasmide, non garantisce la trasformazione ereditaria della linea germinale. Allo stesso modo, la mancanza di espressione transitoria non esclude una trasformazione di successo. Tuttavia, è stato osservato che gli individui transitoriamente positivi hanno maggiori probabilità di produrre progenie transgenica rispetto a quelli transitoriamente negativi43,48. In mani esperte, l'allevamento e l'incrocio di individui solo positivi può essere un'opzione per ridurre il numero di zanzare. Tuttavia, data l'importanza e la fragilità delle piccole larve G0, la minima quantità di manipolazione è ancora consigliabile e l'allevamento di tutti gli individui G0 è sempre raccomandato.
Lo schema di accoppiamento riportato in questo protocollo è progettato per massimizzare la possibilità di accoppiamento e per isolare eventi di trasformazione indipendenti. Tuttavia, se lo spazio insetticida o la disponibilità di personale è un problema, gli adulti G0 possono essere raggruppati per sesso in gabbie singole se vengono forniti abbastanza individui di sesso opposto. Tale configurazione non consentirà la discriminazione tra più eventi di trasformazione che si verificano in individui della stessa gabbia. A seconda della configurazione sperimentale, durante il processo di screening è prevista la presenza di un marcatore doppio (integrazione singola) o singolo (RMCE). Nei singoli esperimenti di integrazione è importante verificare la presenza del marcatore originale dalla linea di attracco, mentre in RMCE è importante verificare la perdita del marcatore precedentemente integrato. In effetti, non è raro nei progetti RMCE recuperare trasformanti in cui si è verificata una singola integrazione anziché uno scambio a causa della ricombinazione di un singolo sito attP9,33. In tali individui sono presenti sia marcatori fluorescenti che l'intera spina dorsale plasmidica del donatore evidenziando l'importanza di condurre uno screening approfondito per entrambi i marcatori fluorescenti.
Mentre la presenza di modelli di fluorescenza attesi indica una trasformazione di successo, deve essere intrapresa la caratterizzazione molecolare del sito di inserimento. Per fare ciò, la preparazione di mappe accurate del locus di inserzione previsto, comprese le regioni genomiche fiancheggianti della linea di attracco, è fondamentale per la progettazione di adeguati primer diagnostici di oligonucleotidi per le analisi di amplificazione genica. Singoli eventi di integrazione provocano la formazione di siti ibridi attR e attL alla giunzione tra il DNA appena integrato e la cassetta precedentemente inserita. Questi siti possono essere destinati alla convalida del sito di inserimento. Nei progetti RMCE, l'inserimento della cassetta del donatore può avvenire in due orientamenti alternativi rispetto al locus genomico, quindi quattro primer possono essere utilizzati in combinazioni PCR alternative per rilevare quale orientamento porta la linea. Poiché l'orientamento dell'inserimento della cassetta può influenzare l'espressione transgenica, nell'analisi comparativa dell'espressione genica è importante utilizzare linee che portano lo stesso orientamento di inserimento.
Quando si lavora con un basso numero di trasformanti potrebbe non essere desiderabile sacrificare interi individui per l'analisi molecolare. Un'opzione per questo è condurre analisi molecolari sul DNA estratto dalle gambe di un singolo adulto46 poiché la perdita delle gambe non influisce sulla capacità di una femmina adulta di accoppiarsi e oviposit49. Tuttavia, esiste il rischio di danneggiare l'individuo nel processo di rimozione delle gambe. Il successo è stato ottenuto utilizzando casi di pupa scartati (comunicazione personale di L. Grigoraki), tuttavia l'approccio più sicuro è quello di eseguire analisi molecolari su genitori G2 dopo aver ottenuto una progenie G3 vitale.
Negli ultimi anni, CRISPR/Cas9 ha rivoluzionato il modo di eseguire l'editing del genoma site-specific26,41,50,51. A differenza dell'RMCE diretto al sito, le integrazioni geniche mediate da CRISPR/Cas9 (knock-in) sono indipendenti dalla presenza di siti di ricombinazione pre-inseriti con un solo evento di trasformazione in un solo passaggio. Tuttavia, il sistema CRISPR/Cas9 si basa sulla presenza di grandi sequenze genomiche note che fiancheggiano il sito di inserimento desiderato per una riparazione diretta all'omologia di successo, nonché sull'efficiente riconoscimento del sito mediato da RNA guida. Queste condizioni non possono sempre essere soddisfatte o possono essere laboriose da risolvere e, data la disponibilità di più linee di attracco in An. gambiae e An. stephensi e linee da esse derivate, il sistema φC31 rimane uno strumento molto prezioso per eseguire confronti fenotipici diretti tra transgeni nelle stesse posizioni genomiche.

La capacità di modificare il genoma delle zanzare vettori di malattie in modo affidabile e riproducibile ha rafforzato la convalida funzionale in vivo dei geni e ha aperto le porte a strategie di controllo dei vettori genetici realizzabili, come quelle che prendono di mira le zanzare Anopheles che trasmettono la malaria1.
L'editing precoce del genoma delle zanzare si basava esclusivamente sulla trasformazione mediata da elementi trasponibili (TE), con piggyBac che era il trasposone più comunemente usato in Anopheles2,3,4. Tuttavia, la natura casuale dell'integrazione di TE può portare a modifiche indesiderate come knockout genici (mutagenesi inserzionale) e significativi effetti di posizione sull'espressione transgenica5,6,7,8. Gli inserimenti multipli sono anche un evento comune quando si utilizza piggyBac5,9, il che rende laboriosa la convalida e l'isolamento di linee transgeniche con singole inserzioni. Altri inconvenienti includono la loro potenziale rimobilitazione, come osservato nella linea germinale di Anopheles stephensi quando si fornisce una fonte di trasposasi piggyBac10,11,12, e la loro dimensione limitata del carico di DNA (10-15 kb di lunghezza) con l'efficienza di trasformazione che diminuisce con l'aumentare delle dimensioni del plasmide donatore13,14.
Sono stati introdotti approcci di integrazione diretti al sito per aggirare questi problemi. La modificazione del genoma più comune nelle zanzare è quella mediata dal sistema φC31 (Figura 1a). Questo è guidato da un'integrasi virale che catalizza la ricombinazione tra due siti di attaccamento eterospecifico (att) che si verificano naturalmente nel genoma del batteriofago φC31 (attP) e nel batterio streptomyces ospite (attB)15. La ricombinazione dei due siti è unidirezionale e provoca la formazione di siti ibridi (attL e attR). La ricombinazione di tali siti ibridi (che porta all'escissione del DNA) richiederebbe non solo la presenza di un'integrasi virale attiva, ma anche di un altro fattore di ricombinazione codificato con fagi16,17. Viene così generato un sito di integrazione stabile che allevia il problema della potenziale rimobilitazione indesiderata15. Inoltre, il sistema consente l'integrazione di carichi di grandi dimensioni (ad esempio, l'integrazione di >costrutti da 100 kb è stata riportata in D. melanogaster18), aumentando significativamente le capacità di carico. L'integrazione avviene in un unico locus genomico predefinito che semplifica notevolmente la validazione dell'inserzione e lo schema di accoppiamento per ottenere una linea transgenica stabile. Infine, la natura site-directed dell'integrazione consente la normalizzazione dell'espressione in quanto i transgeni alternativi si trovano nello stesso locus e quindi sono regolati all'interno dello stesso contesto genomico vicino. Infatti, una delle principali applicazioni della tecnica è il confronto diretto di fenotipi conferiti da diversi transgeni a seguito dell'inserimento in un locus identico.
Il raggiungimento dell'integrazione mediata da φC31 comporta due fasi: la fase I è la creazione di linee di attracco transgeniche che trasportano siti attP e la fase II è l'integrazione diretta dal sito di un carico affiancato da attB nel genoma della linea di attP19. La creazione di linee di attracco di fase I si è basata sull'integrazione casuale mediata da TE di costrutti con tag attP e quindi ha comportato un processo laborioso iniziale (tra cui analisi southern blot e PCR inversa su progenie monoparentale) per isolare e convalidare linee transgeniche che trasportano un singolo evento di integrazione in posizioni genomiche uniche, trascrizionalmente attive e neutre per il fitness. Tuttavia, diverse linee di attracco per l'integrazione singola mediata da φC31 sono state sviluppate e convalidate in An. gambiae19,20,21,22 e in An. stephensi23,24,25 (Tabella 1). Ognuna di queste linee varia in termini di posizione genomica del sito di attracco e del background genetico specifico del ceppo e da esse può essere creata una grande varietà di nuove linee transgeniche. La complessa convalida delle integrazioni mediate da TE per la produzione di linee di attracco può ora essere aggirata dalla tecnologia CRISPR/Cas926; tuttavia questo si basa sulla conoscenza a priori dei loci neutri da prendere di mira e delle loro sequenze circostanti.
L'integrazione mediata da φC31 è stata ampiamente applicata all'editing del genoma degli insetti dall'organismo modello D. melanogaster27, alle zanzare Aedes aegypti13,28, Ae. albopictus29, An. gambiae19 e An. stephensi24, così come ad altri insetti tra cui Ceratitis capitata30 e Bombyx mori31.
Una limitazione dell'integrazione mediata da φC31, soprattutto in vista di potenziali rilasci di campo per il controllo dei vettori, è l'integrazione nel genoma della zanzara dell'intero plasmide donatore portatore di attB, comprese sequenze indesiderate come marcatori genici di resistenza agli antibiotici e componenti della spina dorsale plasmidica di origine batterica. Per risolvere questo problema, è stata implementata una modifica del sistema standard, lo scambio di cassette mediato dalla ricombinasi (RMCE), che consente la sostituzione precisa di una cassetta transgenica precedentemente integrata con un nuovo DNA donatore (Figura 1b). Ciò si ottiene utilizzando due siti att invertiti che fiancheggiano le cassette del donatore e del ricevente a ciascuna estremità, che guidano due eventi di ricombinazione indipendenti che avvengono simultaneamente con conseguente scambio di cassette senza integrazione della spina dorsale del plasmide. Questo design migliorato aggira l'integrazione di sequenze indesiderate ed espande l'applicazione dei sistemi φC31 per includere, ad esempio, l'integrazione di carichi di DNA non marcati mediante screening per la perdita di un marcatore fluorescente precedentemente integrato32.
RMCE è stato raggiunto prima con D. melanogaster32 e successivamente applicato con successo a insetti non modello tra cui An. gambiae9,26,33, Ae. aegypti34, Plutella xylostella34 e B. mori35. Diverse linee di attracco per RMCE sono state sviluppate e convalidate in An. gambiae5,9,26 (Tabella 1). Per quanto ne sappiamo, RMCE deve ancora essere esplorato in altre specie di vettori di Anopheles.
Ad oggi, il sistema φC31 è stato ampiamente utilizzato nelle zanzare Anopheles per introdurre e studiare una varietà di molecole tra cui effettori antimalaria19,24,36, componenti del sistema GAL4/UAS per sovraesprimere e abbattere geni per studi di resistenza agli insetticidi9,33, elementi regolatori, geni reporter5,21,37 ed elementi gene-drive26 ,38.
Questo protocollo descrive come eseguire 1) l'integrazione diretta dal sito di un carico affiancato da attB e 2) RMCE di un costrutto affiancato da siti attB invertiti nel genoma delle linee di attracco di Anopheles . Ciò si ottiene utilizzando due plasmidi: un plasmide donatore con tag attB che trasporta il transgene di interesse e un plasmide helper che esprime l'integrasi φC31 . I principali vettori della malaria An. gambiae e An. stephensi sono usati come esempi specifici, tuttavia questi protocolli sono applicabili ad altre specie di Anopheles .
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig01.jpg"> Figura 1. Modificazioni del genoma site-directed, integrazione singola e scambio di cassette mediato dalla ricombinasi (RMCE), utilizzando il sistema φC31. L'integrasi φC31 (INT, freccia doppia grigia) catalizza la ricombinazione tra i siti attB (a strisce viola) presenti in un plasmide donatore e i siti attP (a strisce blu) presenti in una linea di aggancio ricevente, il che si traduce nella formazione di siti ibridi attL e attR. A) L'integrazione si ottiene quando singoli siti attB e attP si ricombinano e si traduce nella presenza di due marcatori integrati (blu e rosso). B) RMCE si verifica quando due siti attB/P si ricombinano simultaneamente e comporta la sostituzione della cassetta tra i siti att della linea di att (marcatore blu) con quello trasportato dal plasmide donatore (marcatore rosso). C) Sequenze nucleotidiche parziali di attP (blu) e attB (viola) e dei siti ibridi attL/R. La ricombinazione avviene tra le sequenze core 'TT' evidenziate in grassetto nero. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL eppendorf tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well microslides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MARI1216690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree&#160;Plasmid&#160;Maxi&#160;Kit (10)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Absolute, Molecular Biology Grade</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter set CFP for Leica MZ FLIII Excitation 436/20 nm, extinction 480/40 nm</td>
			<td>Leica</td>
			<td>10446363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter set dsRED for Leica MZ FLIII Excitation 545/30 nm, extinction 620/60 nm</td>
			<td>Leica</td>
			<td>10447079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter set YFP customised for Leica MZ FLIII</td>
			<td>Omega Optical</td>
			<td>500QM25, 500QM35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 27</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 700</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium&#160;chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium&#160;Acetate&#160;Solution (3 M),&#160;pH&#160;5.2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Life Technologies)</td>
			<td>R1181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stable brush Size 0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

site-directed &#966;c31-mediated integration and cassette exchange in anopheles vectors of malaria

L'analisi genomica funzionale e le relative strategie per il controllo genetico della malaria si basano su metodi convalidati e riproducibili per modificare con precisione il genoma delle zanzare Anopheles. Tra questi metodi, il sistema φC31 consente l'integrazione precisa e stabile diretta al sito dei transgeni, o la sostituzione di cassette transgeniche integrate tramite scambio di cassette mediato dalla ricombinasi (RMCE). Questo metodo si basa sull'azione della batteriofago integrasi streptomyces φC31 per catalizzare la ricombinazione tra due specifici siti di attacco designati attP (derivato dal fago) e attB (derivato dal batterio ospite). Il sistema utilizza uno o due siti attP che sono stati precedentemente integrati nel genoma della zanzara e nei siti attB nel DNA del modello donatore. Qui illustriamo come modificare stabilmente il genoma delle linee di atnopheles portanti attP usando due plasmidi: un donatore con tag attB che porta il modello di integrazione o scambio e un plasmide helper che codifica l'integrasi φC31. Riportiamo due risultati rappresentativi della modifica diretta dal sito mediata da φC31: la singola integrazione di una cassetta transgenica in An. stephensi e RMCE nelle zanzare An. gambiae. φ La manipolazione del genoma mediata da C31 offre il vantaggio di un'espressione transgenica riproducibile da siti genomici convalidati e neutri per l'idoneità, consentendo analisi comparative qualitative e quantitative dei fenotipi. La natura site-directed dell'integrazione semplifica inoltre sostanzialmente la validazione del singolo sito di inserimento e lo schema di accoppiamento per ottenere una linea transgenica stabile. Queste e altre caratteristiche rendono il sistema φC31 un componente essenziale del toolkit genetico per la manipolazione transgenica delle zanzare della malaria e di altri insetti vettori.

Il protocollo qui illustrato consente di generare una linea transgenica stabile di Anopheles in ~ 10 settimane (assumendo un ciclo di vita della zanzara di 21 giorni).
I tassi di schiusa larvale post-iniezione in An. gambiae dovrebbero essere generalmente inferiori a quelli di An. stephensi, tuttavia sono stati riportati tassi di schiusa tra il 10-50%9,20,24,26,33,43,47. Data un'appropriata tecnica di iniezione, i tassi di schiusa di ≥20% sono generalmente sufficienti per produrre trasformanti. L'assorbimento del DNA da parte degli embrioni può essere valutato mediante lo screening delle giovani larve per l'espressione transitoria del marcatore fluorescente. In esperimenti RMCE di successo in An. gambiae utilizzando il promotore 3xP3 fino al 50% delle larve G0 sopravvissute ha mostrato espressione episomiale del marcatore nelle papille anali48.
Le stime generalizzate dell'efficienza della trasformazione sono difficili da valutare tra i laboratori e anche tra gli esperimenti, poiché la trasformazione dipende da una complessa interazione di variabili tra cui purezza, concentrazione, dimensioni e potenziale tossicità del DNA iniettato, qualità delle uova, manipolazione pre e post-iniezione delle uova, allevamento di zanzare e, soprattutto, l'esperienza dell'operatore. Tassi di trasformazione fino al 7% sono stati ottenuti per RMCE in An. gambiae (calcolato come il numero di eventi di trasformazione indipendenti nel totale degli individui G0)9,26,33 e fino al 2,2% tasso di trasformazione per l'integrazione in An. stephensi. Suggeriamo di iniettare almeno 500 embrioni, che dovrebbero portare alla schiusa di almeno 100 larve G0 e a 2-7 G0 fondatori adulti da cui si può ottenere una progenie stabilmente trasformata. Se lo screening per l'espressione transitoria nelle larve G0, ci si può aspettare fino a 40 larve positive.
Esempi di validazione fenotipica della trasformazione tramite lo screening di marcatori fluorescenti regolati dal promotore 3xP3 sono riportati in Figura 4 e  Nella Figura 5. La Figura 4 mostra una nuova linea An. stephensi ottenuta mediante l'inserimento di una cassetta marcata DsRed in una linea di attracco contrassegnata con CFP (80.9, Tabella 1), con conseguente progenie G1 che esprime entrambi i marcatori come indicato dalla fluorescenza rossa e blu rilevata negli occhi.
I progetti RMCE dovrebbero invece comportare la sostituzione del marcatore originariamente inserito nella linea di attracco con quello del plasmide donatore. La Figura 5A e  la Figura B illustrano questo scambio di marcatori in una linea di aggancio An. gambiae contrassegnata con CFP (A11, Tabella 1) dove dopo il successo RMCE il marcatore CFP viene perso e il marcatore YFP viene acquisito con conseguente fluorescenza gialla (ma non blu) dell'occhio e del cordone nervoso33. Occasionalmente, RMCE può provocare un singolo evento di integrazione invece dello scambio della cassetta transgenica desiderata come illustrato nella Figura 5C, dove viene mostrata una larva contrassegnata sia con la CFP originale che con i nuovi marcatori YFP. È stato riferito che fino al 50% del numero totale di eventi di trasformazione sono singole integrazioni9,33.
Quando si esegue lo screening per la presenza di un marcatore fluorescente è fondamentale distinguere il suo segnale da una possibile autofluorescenza di fondo. Ciò è particolarmente importante quando si utilizza la CFP poiché le larve di Anopheles mostrano un'autofluorescenza blu naturale (Figura 6A). Aumentare l'ingrandimento e concentrarsi sui tessuti e gli organi in cui si prevede che la fluorescenza sia guidata dal promotore è necessario per identificare veri individui CFP-positivi come illustrato nella Figura 6B utilizzando il marcatore 3xP3-CFP.
I singoli trasformanti vengono infine valutati molecolarmente tramite PCR per confermare il sito di inserimento atteso. La Figura 7 riporta la validazione pcr in individui da una linea di scambio An. gambiae che mostra i due potenziali orientamenti di inserimento nel genoma della zanzara33.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig04.jpg"> Figura 4. Validazione della singola integrazione di φC31 in larve di An. stephensi (vista dorsale). A) La linea di attracco (80.9, Tabella 1) esprime CFP agli occhi sotto la regolazione del promotore 3xP3 . B) L'integrazione di successo si traduce nell'espressione del DsRed appena acquisito e del marcatore CFP originale negli occhi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig05.jpg"> Figura 5. Validazione di φC31 RMCE in larve di An. gambiae (vista ventrale). A) La linea di attracco (A10, Tabella 1) esprime la CFP sotto la regolazione del promotore 3xP3 negli occhi (e) e nel cordone nervoso (nc)5. B) Il successo di RMCE comporta lo scambio di marcatori fluorescenti da CFP a YFP33. C) Un singolo evento di integrazione si è verificato durante l'esperimento RMCE in cui la larva trasformante esprime sia i marcatori CFP che YFP. Questa larva trasporta componenti GAL4 / UAS che causano un ampio modello di espressione di YFP, particolarmente forte nei muscoli addominali (am). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig06.jpg"> Figura 6. Autofluorescenza CFP nelle larve di An. gambiae (vista dorsale). A) Immagine affiancata di una larva L4 positiva (CFP+) e negativa (CFP-) utilizzando il filtro CFP. B) Immagine ravvicinata degli occhi larvali che rivela un individuo CFP+ vs CFP-. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig06large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig07.jpg"> Figura 7. Validazione molecolare dell'orientamento dell'inserzione della cassetta in An. gambiae transgenico rappresentativo creato da φC31 RMCE. La cassetta transgenica può essere inserita in uno dei due orientamenti alternativi (A o B) rispetto al sito di inserimento. Ogni reazione PCR (I - IV) utilizza una combinazione di primer (5-8)33 progettati per fornire un frammento di amplificazione diagnostica per ciascun orientamento come indicato nelle mappe plasmidiche schematiche. T1: individuo transgenico rappresentativo che porta l'orientamento dell'inserzione A; T2: individuo transgenico rappresentativo che porta l'orientamento dell'inserzione B; WT: tipo selvatico; DL: linea di attracco; -: controllo negativo della reazione in cui l'acqua è stata utilizzata come modello. Questa cifra è stata modificata da Adolfi et al. (2019)33. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig07large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Specie</td>
			<td>Sforzo</td>
			<td>Nome</td>
			<td>attP(i)</td>
			<td>Cromo-alcuni</td>
			<td>Promotore-marcatore</td>
			<td>Istituzione di origine</td>
			<td>Riferimento</td>
		</tr>
<tr>
<td>An. stephensi</td>
			<td>Indiana ·
</td>
			<td>26,10b
</td>
			<td>Singolo</td>
			<td>2R</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>Università della California Irvine</td>
			<td>25</td>
		</tr>
<tr>
<td>An. stephensi</td>
			<td>Indiana ·
</td>
			<td>44Cb
</td>
			<td>Singolo</td>
			<td>X</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>Università della California Irvine</td>
			<td>23, 24</td>
		</tr>
<tr>
<td>An. stephensi</td>
			<td>Indiana ·
</td>
			<td>80,9b
</td>
			<td>Singolo</td>
			<td>2L</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>Università della California Irvine</td>
			<td>Questo studio</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gambiae</td>
			<td>G3 ·</td>
			<td>113</td>
			<td>Singolo</td>
			<td>2R</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>Università della California Irvine</td>
			<td>Questo studio</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gambiae</td>
			<td>KIL</td>
			<td>Ec
</td>
			<td>Singolo</td>
			<td>3R</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>Keele Univ.</td>
			<td>19, 43</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gambiae</td>
			<td>G3 ·</td>
			<td>X1 ·</td>
			<td>Singolo</td>
			<td>2L</td>
			<td>Nessun marcatore</td>
			<td>Università di Strasburgo</td>
			<td>22</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gambiae</td>
			<td>G3 ·</td>
			<td>YAttP</td>
			<td>Singolo</td>
			<td>Y</td>
			<td>3xP3-RFP</td>
			<td>Imperial College di Londra</td>
			<td>21</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gambiae</td>
			<td>G3 ·</td>
			<td>A10b
</td>
			<td>Doppio</td>
			<td>2R</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>Liverpool School Trop. Med.</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gambiae</td>
			<td>G3 ·</td>
			<td>A11b
</td>
			<td>Doppio</td>
			<td>2R</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>Liverpool School Trop. Med.</td>
			<td>9</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="8">un. Ceppo della Johns Hopkins University (dono di M. Jacobs-Lorena) e nella cultura presso l'Università della California Irvine per >20 anni.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="8">b. Queste righe sono disponibili presso gli autori su ragionevole richiesta.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="8">c. Questa linea è disponibile presso il repertorio BEI www.beiresources.org come MRA-1163.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1. Linee di attracco Anopheles attP .

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Site-Directed ÃƒÂÃ¢â‚¬Â C31-Mediated Integration and Cassette Exchange in Anopheles Vectors of Malaria

Il protocollo descrive come ottenere modifiche dirette al sito nel genoma delle zanzare Anopheles malaria utilizzando il sistema φC31 . Le modifiche descritte includono sia l'integrazione che lo scambio di cassette transgeniche nel genoma di linee di attP..

Integrazione mediata dal sito φC31 e scambio di cassette in Anopheles Vettori della malaria

Functional genomic analysis and related strategies for genetic control of malaria rely on validated and reproducible methods to accurately modify the ...

Questo protocollo supporta la caratterizzazione del ruolo dei geni delle zanzare coinvolti in una varietà di percorsi fisiologici, tra cui, ad esempio, la resistenza agli insetti e lo sviluppo di parassiti della malaria. Il metodo guida l'inserimento transgenico in singole posizioni genomiche pre-caratterizzate e quindi consente di confrontare direttamente i fenotipi risultanti da transgeni alternativi evitando efficacemente il problema dell'effetto posizionale. Questo metodo può essere applicato a una varietà di specie di insetti di salute pubblica e importanza agricola e le sue applicazioni si estendono ampiamente dai batteri alle cellule di mammifero.Inizia progettando plasmidi donatori attB che trasportano il marcatore fluorescente dominante, i siti di ricombinazione attB e il carico transgenico desiderato. Utilizzare un singolo sito attB per l'integrazione dell'intero plasmide che trasporta la cassetta transgenica o due siti attB invertiti per lo scambio di cassette. Purificare i plasmidi donatori e aiutanti utilizzando un kit di purificazione privo di endotossine.Combinare il plasmide donatore con tag attB che trasporta il transgene di interesse e il plasmide helper che trasporta l'integrasi per ottenere una miscela con una concentrazione finale di 350 nanogrammi per microlitro del plasmide donatore e 150 nanogrammi per microlitro del plasmide helper. Precipitare il DNA aggiungendo 0,1 volumi di tre molari di acetato di sodio e 2,5 volumi di etanolo ghiacciato al 100%, quindi vortice. Un precipitato bianco dovrebbe essere immediatamente visibile.Lavare il pellet e risospesarlo nel tampone di iniezione per raggiungere una concentrazione finale totale di 500 nanogrammi per microlitro. Quindi preparare aliquote di 10-15 microlitri ciascuna e conservarle a 20 gradi Celsius negativi. Il sangue alimenta le zanzare da quattro a sette giorni dalla linea di attracco desiderata e le loro controparti selvatiche 72 ore prima della microiniezione.Eseguire microiniezioni embrionali di Anopheles gambiae in cloruro di sodio 25 millimolari prendendo di mira il polo posteriore dell'embrione con un angolo di 45 gradi. Eseguire microiniezioni embrionali di Anopheles stephensi in olio di alocarbonio prendendo di mira il polo posteriore con un angolo di 30 gradi. Immediatamente dopo l'iniezione, trasferire le uova in una capsula di Petri piena di acqua distillata sterile e riportarle in condizioni insetticide.Alla schiusa, trasferire la larva G0 in un vassoio con acqua distillata salata ogni giorno e retro alle pupe. Ordina le pupe G0 per sesso sotto uno stereoscopio. Lascia che i maschi emergano in gabbie separate in gruppi da tre a cinque e aggiungi un eccesso di dieci volte di femmine selvatiche di tipo selvatico abbinate all'età.Consenti alle femmine di emergere in gabbie separate in gruppi da 10 a 15 e aggiungi un numero uguale di maschi selvatici di tipo abbinato all'età. Consentire agli adulti di accoppiarsi per quattro o cinque giorni e fornire alle femmine un pasto di sangue. Raccogli le uova e alleva i G1 emergenti di prossima generazione.Raccogli le larve G1, L3 e L4 in una capsula di Petri rivestita con carta da filtro bagnata o su un vetrino per microscopio e schermale usando uno stereoscopio fluorescente per la presenza del marcatore introdotto con il carico etichettato attB. Per i singoli disegni attB, schermo per la presenza del marcatore nuovo e preesistente. Per i progetti a doppio attB per lo scambio di cassette, schermo per la presenza del nuovo marcatore e la perdita di quello preesistente.Ordina le pupe G1 per sesso e incrociale in massa con individui di tipo selvatico di sesso opposto abbinati all'età. Consentire agli adulti di accoppiarsi per quattro o cinque giorni e fornire un pasto di sangue. Per esperimenti di integrazione singola, raccogliere le uova direttamente dalla croce in massa.Per gli esperimenti di scambio di cassette, raccogliere le uova da singole femmine e mantenere la progenie separata fino al completamento della valutazione molecolare a causa della potenziale presenza di due orientamenti alternativi della cassetta. Esaminare la progenie G2 per la presenza del marcatore fluorescente e mettere da parte un sottoinsieme di individui G2 positivi per l'analisi molecolare. Allevare il resto fino all'età adulta.Eseguire la validazione molecolare dei siti di inserimento con PCR come descritto nel manoscritto di testo. Per una singola integrazione, assicurarsi che il sito di inserimento previsto porti il costrutto di attracco originale, oltre all'intera sequenza del plasmide donatore tra i due siti ibridi attL e attR. Per lo scambio di cassette, assicurarsi che il sito di inserimento previsto sia identico a quello della linea di aggancio in cui i siti attL ibridi invertiti sostituiscono i siti attP invertiti originali e il modello di scambio sostituisce la cassetta originariamente presente tra di loro.Il protocollo è stato utilizzato per generare una linea transgenica stabile di Anopheles in circa 10 settimane. La validazione fenotipica della trasformazione è stata eseguita mediante screening per i marcatori fluorescenti regolati dal promotore 3xP3 sono mostrati qui. Una nuova linea Anopheles stephensi è stata ottenuta inserendo una cassetta marcata in rosso DS in una linea di aggancio contrassegnata con CFP che ha portato la progenie G1 ad esprimere entrambi i marcatori come indicato dalla fluorescenza rossa e blu negli occhi.I progetti di scambio di cassette comportano la sostituzione del marcatore originariamente inserito nella linea di aggancio con quello del plasmide donatore. Questo scambio di marcatori è stato dimostrato in una linea di aggancio di Anopheles gambiae in cui il marcatore CFP è stato perso e il marcatore YFP acquisito con conseguente fluorescenza dell'occhio giallo e del cordone nervoso. Occasionalmente, RMCE può provocare un singolo evento di integrazione invece dello scambio della cassetta transgenica desiderata in cui una larva viene contrassegnata sia con la CFP originale che con i nuovi marcatori YFP.Quando si esegue lo screening per la presenza di un marcatore fluorescente, è fondamentale distinguere il suo segnale da una possibile autofluorescenza di fondo. Aumentare l'ingrandimento e concentrarsi sui tessuti e sugli organi in cui ci si aspetta che la fluorescenza sia guidata dal promotore è necessario per identificare veri individui positivi alla CFP. I singoli trasformatori sono stati anche valutati molecolarmente tramite PCR per confermare il sito di inserimento atteso.La convalida PCR in individui da una linea di scambio Anopheles gambiae è mostrata qui. Anche un'appropriata tecnica di microiniezione, la progettazione e la preparazione accurate dei plasmidi donatori e aiutanti, nonché il seguire lo schema di allevamento delle zanzare appropriato sono fondamentali per ottenere individui transgenici. Questa procedura può essere utilizzata per inserire elementi che causano sovraespressione genica o silenziamento, ad esempio il sistema GAL4 / UAS, nonché elementi di gene drive e molecole anti-patogeno per il controllo genetico delle zanzare.

Research

JoVE Journal

Genetics

Site-Directed &#966;C31-Mediated Integration and Cassette Exchange in Anopheles Vectors of Malaria

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

siRNA Transfection e l&#39;EMSA Analisi su appena isolate umani dei villi citotrofoblasti

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

Ricerca

Genetica

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Misura parallela di circadiano Clock espressione genica e la secrezione dell&#39;ormone in colture cellulari primarie umane

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic caso Mutagenesi Utilizzando istone-miniSOG in<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Allevamento e RNA a doppio filamento mediata silenziamento genico nel Hide Beetle,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

Sistema di integrazione bidirezionale retrovirale Metodo PCR e flusso di lavoro analitico dei dati quantitativi

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions

Scansione retrovirale: Mappatura dei siti di integrazione MLV per definire regioni regolatori specifiche per le cellule

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

Integrazione mirata CRISPR/Cas9-mediata In Vivo usando una strategia basata su unendo fine omologia-mediata

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

Un protocollo per la produzione di vettori lentivirali integrasi-carenti per CRISPR/Cas9-mediata Knockout del Gene nelle cellule in divisione

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing per rendere la mutanti condizionali del parassita di Malaria umana da p. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Alterazioni di modificazione post-traduzionale istone caratterizzante nel lievito Neurodegenerative Proteinopathy modelli

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...