トランスジェニック のAn. stephensi 幼虫の画像を提供してくれたKiona Parker(UCI)と、トランスジェニック An. gambiae 幼虫を提供してくれたFraser Colman(LSTM)とBeth Poulton(LSTM)に感謝しています。ベス・ポールトン(LSTM)はまた、 アン・ガンビア科 の幼虫のイメージング中に貴重な支援を提供しました。この研究は、Tata Institute for Genetics and Society(TIGS)とLSTMのDirector Catalyst FundがA.A.(DCF2014AA)に授与した。A.A.J.はカリフォルニア大学アーバイン校のドナルド・ブレン教授です。

著者らは開示するものは何もありません。

選択したドッキングラインと互換性のあるattBタグ付きプラスミドの正確な設計は、実験の成功にとって最も重要です。形質転換体のスクリーニングに使用されるマーカーの選択には、ドッキングラインに既に存在するパターンの対象となる蛍光色およびその発現パターンを含め、慎重に考慮しなければならない。適切なマーカーの組み合わせには、RFP(赤)/CFP(シアン)、RFP(赤)/GFP(緑)、RFP(赤)/YFP(黄)、YFP(黄)/CFP(シアン)などがありますが、避けるべき組み合わせはYFP(黄)/GFP(緑)とCFP(シアン)/GFP(緑)です。3xP3プロモーター39は、眼および神経索に特異的であり、蚊のトランスジェネシスのための蛍光マーカーの発現を駆動するために最も頻繁に使用される。実際、現在利用可能なすべてのアノフェレスドッキングラインは、このプロモーターを利用しています。代替調節領域は、アン・ガンビアエ・ポリユビキチン遺伝子(PUBc)5またはウイルスプロモーターIE120の調節領域であり、複数の組織における発現を駆動する。3xP3と一緒に使用すると、これらのプロモーターは可能な色の組み合わせを拡大し、同じ蛍光色素分子の使用さえも拡大します。示されたプロモーターは、蚊のライフサイクル全体を通じて活性であり、すべてのライフステージでのスクリーニングおよび蛍光モニタリングを可能にする。プラスミド設計時のもう1つの考慮事項は、統合または交換する貨物のサイズです。φC31系は顕著な運搬能力18を有するが、ドナープラスミドのサイズは一般に形質転換効率と負の相関関係にあると考えるべきである22。
記載されたプロトコールにおいて、インテグラーゼの供給源は、酵素を遍在的に発現するヘルパープラスミドである40。インテグラーゼの遍在的な存在は、マイクロインジェクションが生殖細胞系列が形成される領域に正確に向けられていない場合、体細胞の形質転換につながる可能性がある。このような変換イベントは遺伝性ではないため失われますが、体細胞効果は注射された個人の適応度を低下させる可能性があります。これを回避し、形質転換効率を高めるために、インテグラーゼ発現を、例えば、vasaプロモーター22,26を使用することによって、生殖細胞系列に制限することができる。他のプロトコールは、φC31インテグラーゼ19、24、43の供給源としてのインビトロ転写メッセンジャーRNA(mRNA)の使用を記載している。しかし、これにはmRNAの煩雑な調製が含まれ、分解を避けるためにインジェクションミックスの慎重な取り扱いとRNaseフリー試薬の使用が必要です。インテグラーゼのプラスミド源は、An. gambiae9,21,22,26,33,37およびAn. stephensi(A.A .パーソナルコミュニケーション)の両方で信頼性が高く、効率的な形質転換につながることが実証されており、したがって、当社の好ましい選択肢です。インテグラーゼ送達のためのさらなる選択肢は、セルフドッキングヘルパーラインにおけるインビボ生産である。このような系統は、生殖細胞系列特異的プロモーターナノの調節下でφC31インテグラーゼを発現するアン・ガンビア科で作成され、生存および形質転換効率の向上につながることが見出された20。しかしながら、ヘルパーライン上のインテグラーゼ酵素のインビボ産生によって課される潜在的な適合負荷は考慮されなければならない。
他のトランスジェニック技術と同様に、形質転換体を回収する機会を最大化するために、注射された胚に由来する個体の飼育および交配に特別な注意が払われなければならない。導入遺伝子を安定に継承した個体は、まずG1子孫で回収することができる。しかしながら、潜在的な形質転換の早期徴候は、3xP3プロモーターを使用する場合、G0第1および第2齢幼虫の肛門乳頭および/または神経索における蛍光マーカーの一過性のエピソーム発現の存在によって評価することができる43。一過性蛍光の存在はプラスミド送達の成功を示唆するが、遺伝性生殖細胞系列形質転換を保証するものではない。同様に、一過性表現の欠如は、変換の成功を排除するものではない。それにもかかわらず、一過性陽性の個体は、一過性陰性の個体と比較してトランスジェニック子孫を産む可能性がより高いことが観察されている43,48。専門家の手では、陽性者のみの飼育と交配は、蚊の数を減らすための選択肢かもしれません。しかし、小さなG0幼虫の重要性と脆弱性を考えると、最小限の操作が依然として推奨され、すべてのG0個体の飼育が常に推奨される。
このプロトコルで報告される交配スキームは、交配の可能性を最大化し、独立した変換イベントを分離するように設計されています。しかし、昆虫のスペースや人員の可用性が問題である場合、十分な異性の個体が提供されていれば、G0の成人は単一のケージに性別によってプールすることができます。このような設定では、同じケージの個体で発生する複数の変換イベント間の識別は許可されません。実験セットアップに応じて、スクリーニングプロセス中に二重(単一統合)または単一(RMCE)マーカーの存在が予想される。単一の統合実験では、ドッキングラインからの元のマーカーの存在を検証することが重要であり、RMCEでは、以前に統合されたマーカーの損失を検証することが重要です。実際、RMCEの設計では、単一のattPサイトの組換えにより交換の代わりに単一の統合が生じた形質転換体を回収することは珍しくありません9,33。このような個体では、両方の蛍光マーカーが、ドナープラスミド骨格全体と同様に存在し、両方の蛍光マーカーについて徹底的なスクリーニングを実施することの重要性を強調する。
予想される蛍光パターンの存在は形質転換の成功を示すが、挿入部位の分子特性評価を行わなければならない。そのためには、ドッキングラインの隣接するゲノム領域を含む、予測された挿入遺伝子座の正確なマップの作成が、遺伝子増幅解析のための適切な診断用オリゴヌクレオチドプライマーの設計にとって極めて重要である。単一の組み込み事象は、新たに組み込まれたDNAと以前に挿入されたカセットとの間の接合部における attR および attL ハイブリッド部位の形成をもたらす。これらのサイトは、挿入サイトの検証の対象にすることができます。RMCE設計では、ドナーカセットの挿入はゲノム遺伝子座に対して2つの代替配向で起こり得るため、4つのプライマーを代替PCRの組み合わせで使用して、ラインがどの向きを運ぶかを検出することができます。カセット挿入の向きは導入遺伝子発現に影響を与える可能性があるため、比較遺伝子発現解析では同じ挿入方位を持つラインを使用することが重要です。
少数の形質転換体を扱う場合、分子分析のために個体全体を犠牲にすることは望ましくないかもしれません。これに対する選択肢は、単身成人の脚から抽出されたDNAの分子分析を行うことであり46、脚の損失は成人女性の交配能力および産卵能力に影響を及ぼさない49。しかし、脚の除去の過程で個人を損傷する危険性がある。廃棄された蛹の症例(L. Grigorakiの個人的なコミュニケーション)を使用して成功が得られましたが、最も安全なアプローチは、生存可能なG3子孫を得た後にG2の両親に分子分析を行うことです。
近年、CRISPR/Cas9は部位特異的ゲノム編集の方法に革命をもたらしました26,41,50,51。部位特異的RMCEとは異なり、CRISPR/Cas9媒介遺伝子組込み(ノックイン)は、ワンステップの形質転換イベントのみを必要とする、予め挿入された組換え部位の存在とは無関係である。それにもかかわらず、CRISPR/Cas9システムは、相同性指向性修復を成功させるために、所望の挿入部位に隣接する大きな既知のゲノム配列の存在、ならびにガイドRNAによって媒介される効率的な部位認識に依存する。これらの条件が常に満たされるとは限らず、トラブルシューティングに手間がかかる可能性があり、An. gambiaeとAn. stephensiの複数のドッキングラインとそれらから派生したラインが利用可能であることを考えると、φC31システムは、同じゲノム位置にある導入遺伝子間の直接表現型比較を実行するための非常に貴重なツールのままです。

病気の蚊ベクターのゲノムを確実かつ再現性よく改変する能力は、遺伝子の in vivo 機能検証を強化し、マラリアを媒介する アノフェレス 蚊を標的とするような、実現可能な遺伝子ベクター制御戦略への扉を開きました1。
初期の蚊のゲノム編集は、トランスポーザブルエレメント(TE)媒介形質転換にのみ依存しており、piggyBacはAnophelesで最も一般的に使用されているトランスポゾンでした2,3,4。しかし、TE統合のランダムな性質は、遺伝子ノックアウト(挿入突然変異誘発)や導入遺伝子発現に対する有意な位置効果などの望ましくない改変につながる可能性があります5、6、7、8。piggyBac5,9を使用する場合、複数の挿入も一般的に発生するため、単一の挿入によるトランスジェニックラインの検証と単離が面倒になります。他の欠点には、piggyBacトランスポザーゼ10,11,12の供給源を提供する際のAnopheles stephensiの生殖細胞系列で観察されるような潜在的な再動員、およびドナープラスミドのサイズの増加とともに形質転換効率が低下するDNA貨物のサイズ(長さ10〜15kb)が限られている13,14が含まれる。
これらの問題を回避するために、サイト指向の統合アプローチが導入されました。蚊における最も一般的な部位特異的ゲノム改変は、φC31系によって媒介されるものである(図1a)。これは、バクテリオファージφC31(attP)およびストレプトマイセス細菌宿主(attB)のゲノム中に天然に存在する2つのヘテロ特異的結合(att)部位間の組換えを触媒するウイルスインテグラーゼによって駆動される15。2つの部位の組換えは一方向であり、ハイブリッド部位(attLおよびattR)の形成をもたらす。このようなハイブリッド部位の組換え(DNA切除につながる)には、活性ウイルスインテグラーゼの存在だけでなく、ファージにコードされた別の組換え因子も必要となる16,17。したがって、潜在的な望ましくない再動員の問題を緩和する安定した統合サイトが生成されます15。さらに、このシステムは、大型貨物の統合(例えば、D. melanogaster18で報告された>100kb構築物の統合)を可能にし、運搬能力を有意に増加させる。統合は、単一の事前定義されたゲノム遺伝子座で起こり、安定したトランスジェニックラインを得るための挿入および交配スキームの検証を大幅に簡素化する。最後に、統合の部位特異的性質は、代替導入遺伝子が同じ遺伝子座に位置し、したがって同じ隣接するゲノムコンテキスト内で調節されるため、発現の正常化を可能にする。実際、この技術の主な用途の1つは、同一の遺伝子座への挿入後に異なる導入遺伝子によって付与される表現型の直接比較である。
φC31媒介性集積を達成するには、フェーズIはattP部位を運ぶトランスジェニックドッキングラインの作成であり、フェーズIIはドッキングラインのゲノムにおけるattB側面貨物の部位特異的統合である19。第I相ドッキングラインの作成は、attPタグ付きコンストラクトのTE媒介性ランダム統合に依存していたため、単一の統合事象を有するトランスジェニックラインを一意で転写活性で適応度中立のゲノム位置で単離および検証するために、初期の面倒なプロセス(単一女性の子孫に対するサザンブロットおよびインバースPCR分析を含む)が必要でした。それにもかかわらず、φC31媒介単一集積のためのいくつかのドッキングラインが、An. gambiae19,20,21,22およびAn. stephensi23,24,25において開発され、検証されている(表1)。これらの系統の各々は、ドッキング部位のゲノム位置および株特異的な遺伝的背景の点で異なり、それらから多種多様な新しいトランスジェニック系統を創り出すことができる。ドッキング ラインを製造するための TE を介した統合の複雑な検証は、CRISPR/Cas9 テクノロジによって回避できるようになりました26。しかし、これは標的となる中性遺伝子座とその周囲の配列に関する先験的な知識に依存している。
φC31媒介の統合は、モデル生物D. melanogaster27から、蚊Aedes aegypti13,28、Ae. albopictus29、An. gambiae19、およびAn. stephensi24、ならびに頭蓋炎capitata30およびBombyx mori31を含む他の昆虫への昆虫ゲノム編集に広く適用されている。
φC31媒介性組み込みの制限は、特にベクター制御のための潜在的な電界放出の観点から、抗生物質耐性遺伝子マーカーおよび細菌起源のプラスミド骨格成分などの望ましくない配列を含む、attB含有ドナープラスミド全体の蚊ゲノムへの組み込みである。これに対処するために、標準系の改変であるリコンビナーゼ媒介カセット交換(RMCE)が実施され、以前に統合されたトランスジェニックカセットを新しいドナーDNAで正確に置換することを可能にする(図1b)。これは、両端でドナーおよびレシピエントカセットに隣接する2つの反転att部位を使用することによって達成され、これは2つの独立した組換え事象を同時に起こし、プラスミド骨格の統合なしにカセット交換をもたらす。この改良された設計は、望ましくない配列の統合を回避し、例えば、以前に統合された蛍光マーカー32の損失をスクリーニングすることによって、マークされていないDNA貨物の統合を含むようにφC31システムの適用を拡大します。
RMCEは最初にD. melanogaster32で達成され、後にAn. gambiae9,26,33、Ae. aegypti34、Plutella xylostella34、およびB. mori35を含む非モデル昆虫に首尾よく適用された。RMCE用のいくつかのドッキングラインが開発され、An. gambiae5,9,26で検証されています(表1)。我々の知る限り、RMCEは他のアノフェレスベクター種ではまだ探索されていない。
今日まで、φC31システムは、抗マラリアエフェクター19,24,36、殺虫剤耐性研究のための遺伝子を過剰発現およびノックダウンするGAL4/UASシステムの構成要素9,33、調節要素、レポーター遺伝子5,21,37、および遺伝子駆動要素を含む様々な分子の導入および研究のために、アノフェレス蚊において広く使用されてきた26。,38.
このプロトコルは、1) attB側面貨物の部位指向統合および2)逆 attB 部位に挟まれた構築物のRMCEを Anopheles ドッキングラインのゲノムに組み込む方法を記述している。これは、目的の導入遺伝子を保持する ドナーattBタグ付きプラスミドと、 φC31 インテグラーゼを発現するヘルパープラスミドの2つのプラスミドを使用することによって達成される。主要なマラリアベクターであるAn. gambiae と An. stephensi が具体例として使用されていますが、これらのプロトコルは他の Anopheles 種にも適用可能です。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig01.jpg"> 図1.部位特異的ゲノム改変は、単一組込みおよびリコンビナーゼ媒介カセット交換(RMCE)、φC31系を使用した。φC31インテグラーゼ(INT、灰色の二重矢印)は、ドナープラスミド中に存在するattBサイト(紫色の縞模様)と受容ドッキングラインに存在するattP部位(青色の縞模様)との間の組換えを触媒し、その結果、attLおよびattRのハイブリッド部位が形成される。A) 統合は、単一のattBおよびattPサイトが再結合し、2つの統合マーカー(青および赤)の存在をもたらすときに達成される。B) RMCEは、2つのattB/P部位が同時に再結合し、ドッキングラインのatt部位(青色マーカー)間のカセットがドナープラスミドによって運ばれる部位(赤色マーカー)と交換されるときに生じる。C) attP(青色)およびattB(紫色)の部分塩基配列、ならびにハイブリッド部位attL/R。組換えは、太字の黒で強調表示された「TT」コアシーケンス間で発生します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL eppendorf tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well microslides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MARI1216690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree&#160;Plasmid&#160;Maxi&#160;Kit (10)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Absolute, Molecular Biology Grade</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter set CFP for Leica MZ FLIII Excitation 436/20 nm, extinction 480/40 nm</td>
			<td>Leica</td>
			<td>10446363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter set dsRED for Leica MZ FLIII Excitation 545/30 nm, extinction 620/60 nm</td>
			<td>Leica</td>
			<td>10447079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter set YFP customised for Leica MZ FLIII</td>
			<td>Omega Optical</td>
			<td>500QM25, 500QM35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 27</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 700</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium&#160;chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium&#160;Acetate&#160;Solution (3 M),&#160;pH&#160;5.2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Life Technologies)</td>
			<td>R1181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stable brush Size 0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

site-directed &#966;c31-mediated integration and cassette exchange in anopheles vectors of malaria

マラリアの遺伝的制御のための機能的ゲノム解析および関連する戦略は、アノフェレス蚊のゲノムを正確に改変するための検証済みで再現可能な方法に依存しています。これらの方法の中でも、φC31システムは、導入遺伝子の正確で安定した部位特異的集積、またはリコンビナーゼ媒介カセット交換(RMCE)を介した集積トランスジェニックカセットの置換を可能にする。この方法は、ストレプトマイセスφC31バクテリオファージインテグラーゼの作用に依存して、attP(ファージ由来)およびattB(宿主細菌由来)と命名された2つの特定の付着部位間の組換えを触媒する。このシステムは、以前に蚊ゲノムに組み込まれた1つまたは2つのattPサイトと、ドナーテンプレートDNA中のattBサイトを使用する。ここでは、組み込みまたは交換テンプレートを保持するattBタグ付きドナーとφC31インテグラーゼをコードするヘルパープラスミドの2つのプラスミドを使用して、attP含有アノフェレスドッキングラインのゲノムを安定的に改変する方法を示します。我々は、φC31媒介部位特異的修飾の2つの代表的な結果、すなわち、An. stephensiにおけるトランスジェニックカセットの単一統合と、An. gambiae蚊におけるRMCEの2つの代表的な結果を報告している。φC31媒介ゲノム操作は、検証済みの適応度中立ゲノム部位からの再現性のある導入遺伝子発現の利点を提供し、表現型の比較定性的および定量的分析を可能にする。集積の部位特異的性質はまた、単一の挿入部位および嵌合スキームの検証を実質的に簡素化し、安定したトランスジェニックラインを得る。これらの特性および他の特性により、φC31システムは、マラリア蚊および他の昆虫ベクターのトランスジェニック操作のための遺伝的ツールキットの必須コンポーネントとなっている。

ここに示すプロトコルは、〜10週間で安定した アノフェレス トランスジェニックラインを生成することを可能にする(21日間の蚊のライフサイクルを仮定する)。
アン・ガンビア科の注射後幼虫の孵化率は、一般的にアン・ステファンシよりも低いと予想されているが、10〜50%の孵化率が報告されている9、20、24、26、33、43、47。適切な注入技術が与えられれば、≥20%の孵化率は、一般に形質転換体を収穫するのに十分である。胚によるDNA取り込みは、蛍光マーカーの一過性発現について若い幼虫をスクリーニングすることによって評価することができる。生存しているG0幼虫の最大50%までの3xP3プロモーターを用いたアン・ガンビアにおける成功したRMCE実験では、肛門乳頭におけるマーカーのエピソーム発現を示した48。
形質転換効率の一般化された推定値は、注入されたDNAの純度、濃度、サイズ、および潜在的な毒性、卵の品質、卵の注入前および注射後の取り扱い、蚊の飼育、そして最も重要なのはオペレーターの経験を含む変数の複雑な相互作用に依存するため、実験室間および実験間でも評価することは困難である。アン・ガンビアにおけるRMCEでは最大7%の形質転換率(G0個体全体における独立した形質転換事象の数として計算)が9、26、33、およびアン・ステファンシにおける統合では最大2.2%の形質転換率が得られている。我々は、少なくとも500個の胚を注入することを提案するが、これは少なくとも100個のG0幼虫の孵化および安定的に形質転換された子孫を得ることができる2〜7個のG0成体の創設者につながるはずである。G0幼虫における一過性発現をスクリーニングすれば、最大40匹の陽性幼虫が期待できる。
3xP3プロモーターによって調節される蛍光マーカーのスクリーニングを介した形質転換の表現型検証の例は、図4および 図5に報告されている。図4は、CFPでマークされたドッキングラインにDsRedマークカセットを挿入した新しいAn. stephensiライン(80.9、表1)を示し、その結果、G1子孫は、目で検出された赤色および青色蛍光によって示されるように両方のマーカーを発現する。
RMCEデザインは、代わりに、もともとドッキングラインに挿入されたマーカーをドナープラスミドのマーカーと交換する結果をもたらすことが期待される。図5Aおよび図Bは、CFPでマークされたアン・ガンビアエ・ドッキング・ライン(A11、表1)におけるこのマーカー交換を示しており、RMCEが成功した後、CFPマーカーは失われ、YFPマーカーが獲得され、黄色(青色ではない)の眼および 神経索蛍光33が生じる。時折、RMCEは、図5Cに例示されるように所望のトランスジェニックカセットの交換の代わりに単一の統合事象をもたらし得、そこでは、元のCFPマーカーおよび新しいYFPマーカーの両方でマークされた幼虫が示される。変換イベントの総数の最大 50% が単一積分であると報告されています9,33。
蛍光マーカーの存在をスクリーニングする場合、そのシグナルをバックグラウンド自家蛍光と区別することが重要です。これは、アノフェレス幼虫が天然の青色自己蛍光を示すようにCFPを使用する場合に特に重要である(図6A)。3xP3-CFPマーカーを使用して図6Bに示すように、蛍光がプロモーターによって駆動されると予想される組織および器官に焦点を合わせることが必要である。
個々の形質転換体は、最終的にPCRを介して分子的に評価され、予想される挿入部位を確認する。 図7は 、交換 アン・ガンビアエ 系統からの個体におけるPCRバリデーションを報告し、蚊ゲノムにおける挿入の2つの潜在的な向きを示す33。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig04.jpg"> 図4.An. stephensi幼虫におけるφC31単一集積の検証(背側図)。A)ドッキングライン(80.9、表1)は、3xP3プロモーターの調節下で眼においてCFPを発現する。B)統合が成功すると、新たに取得したDsRedおよび元のCFPマーカーが眼に発現する。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig05.jpg"> 図5.アン・ガンビア科幼虫におけるφC31 RMCEのバリデーション(腹側図)。A)ドッキングライン(A10、表1)は、眼(e)および神経索(nc)5における3xP3プロモーターの調節下でCFPを発現する。B)RMCEが成功すると、蛍光マーカーがCFPからYFP33に交換される。C)形質転換体幼虫がCFPマーカーおよびYFPマーカーの両方を発現するRMCE実験中に単一の統合事象が生じた。この幼虫は、YFPの広範な発現パターンを引き起こすGAL4 / UAS成分を運び、特に腹筋(am)に強い。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig06.jpg"> 図6. アン・ガンビア科 幼虫におけるCFP自家蛍光(背部図)。 A) CFPフィルターを用いたポジ型(CFP+)とネガ型(CFP-)L4 幼虫のサイドバイサイド画像。B)CFP+ 対 CFP-個体を明らかにする幼虫の目のクローズアップ画像。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig07.jpg"> 図7.φC31 RMCEによって作成された代表的なトランスジェニックアン・ガンビアエにおけるカセット挿入の配向の分子検証。トランスジェニックカセットは、挿入部位に対して2つの代替配向(AまたはB)のうちの1つに挿入することができる。各PCR反応(I−IV)は、概略プラスミドマップに示されるように各配向のための診断増幅断片を与えるように設計されたプライマー(5〜8)33の組み合わせを使用する。T1:挿入Aの代表的なトランスジェニック個体担持配向;T2:挿入Bの代表的なトランスジェニック個体担持配向;WT:野生型;DL:ドッキングライン;-:水を鋳型として用いた反応陰性対照。この図は、Adolfi et al. (2019)33から修正されたものである。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig07large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>種</td>
			<td>濾す</td>
			<td>名前</td>
			<td>attP(s)</td>
			<td>染色体</td>
			<td>プロモーターマーカー</td>
			<td>原産地機関</td>
			<td>参考</td>
		</tr>
<tr>
<td>スティーブンシ</td>
			<td>インディアナ
</td>
			<td>26.10b
</td>
			<td>単</td>
			<td>2R</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>カリフォルニア大学アーバイン校</td>
			<td>25</td>
		</tr>
<tr>
<td>スティーブンシ</td>
			<td>インディアナ
</td>
			<td>44カビット
</td>
			<td>単</td>
			<td>X</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>カリフォルニア大学アーバイン校</td>
			<td>23, 24</td>
		</tr>
<tr>
<td>スティーブンシ</td>
			<td>インディアナ
</td>
			<td>80.9b
</td>
			<td>単</td>
			<td>2L</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>カリフォルニア大学アーバイン校</td>
			<td>本研究</td>
		</tr>
<tr>
<td>アン・ガンビア</td>
			<td>G3 ·</td>
			<td>113</td>
			<td>単</td>
			<td>2R</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>カリフォルニア大学アーバイン校</td>
			<td>本研究</td>
		</tr>
<tr>
<td>アン・ガンビア</td>
			<td>キル</td>
			<td>ティッカー
</td>
			<td>単</td>
			<td>3R</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>キール大学</td>
			<td>19, 43</td>
		</tr>
<tr>
<td>アン・ガンビア</td>
			<td>G3 ·</td>
			<td>×1 ·</td>
			<td>単</td>
			<td>2L</td>
			<td>マーカーなし</td>
			<td>ストラスブール大学</td>
			<td>22</td>
		</tr>
<tr>
<td>アン・ガンビア</td>
			<td>G3 ·</td>
			<td>ティッカー</td>
			<td>単</td>
			<td>Y</td>
			<td>3xP3-RFP</td>
			<td>インペリアル・カレッジ・ロンドン</td>
			<td>21</td>
		</tr>
<tr>
<td>アン・ガンビア</td>
			<td>G3 ·</td>
			<td>A10b
</td>
			<td>複</td>
			<td>2R</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>リバプールスクールトロップメッド。</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>アン・ガンビア</td>
			<td>G3 ·</td>
			<td>A11b
</td>
			<td>複</td>
			<td>2R</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>リバプールスクールトロップメッド。</td>
			<td>9</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="8">ある。ジョンズ・ホプキンス大学(M・ジェイコブス・ロレナの贈り物)とカリフォルニア大学アーバイン校の文化で>20年間。</td>
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<td colspan="8">b.これらの行は、合理的な要求に応じて著者から入手できます。</td>
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<td colspan="8">c. この行は、MRA-1163 として www.beiresources.org BEI リポジトリで利用できます。</td>
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</tbody></table>表 1. Anopheles attP ドッキングライン。

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Site-Directed ÃƒÂÃ¢â‚¬Â C31-Mediated Integration and Cassette Exchange in Anopheles Vectors of Malaria

このプロトコルは、φC31システムを使用してアノフェレスマラリア蚊のゲノムにおいて部位特異的修飾を達成する方法を記述している。記載される改変には、attP含有ドッキングラインのゲノムにおけるトランスジェニックカセットの統合および交換の両方が含まれる。

マラリアのアノフェレスベクターにおける部位特異的φC31媒介集積分とカセット交換

Functional genomic analysis and related strategies for genetic control of malaria rely on validated and reproducible methods to accurately modify the ...

このプロトコルは、例えば、昆虫抵抗性およびマラリア寄生虫の発生を含む様々な生理学的経路に関与する蚊遺伝子の役割の特性評価を支持する。この方法は、導入遺伝子を事前に特徴付けた単一のゲノム位置に挿入することを促進し、したがって、代替導入遺伝子から生じる表現型を直接比較することを可能にする。この方法は、公衆衛生上および農業上重要な様々な昆虫種に適用することができ、その用途は細菌から哺乳動物細胞まで幅広く及ぶ。まず、優性蛍光マーカー、attB組換え部位、および所望の導入遺伝子貨物を運ぶattBドナープラスミドを設計することから始めます。トランスジェニックカセットを保持するプラスミド全体の集積には単一のattB部位を使用するか、カセット交換には2つの逆性attB部位を使用する。エンドトキシンフリー精製キットを使用してドナープラスミドとヘルパープラスミドを精製します。目的の導入遺伝子を担持したattBタグ付きドナープラスミドとインテグラーゼを担持したヘルパープラスミドを組み合わせて、終濃度がドナープラスミド1マイクロリットルあたり350ナノグラム、ヘルパープラスミド1マイクロリットルあたり150ナノグラムの混合物を得た。0.1倍量の3モルの酢酸ナトリウムおよび2.5倍量の氷冷100%エタノールを加えてDNAを沈殿させ、次いでボルテックスを加える。白い沈殿物がすぐに見えるはずです。ペレットを洗浄し、注入バッファーに再懸濁して、マイクロリットルあたり500ナノグラムの総最終濃度に達する。次に、それぞれ10〜15マイクロリットルのアリコートを準備し、それらを摂氏マイナス20度で保存する。血液は、マイクロ注射の72時間前に、所望のドッキングラインおよびそれらの野生型の対応物から4〜7日齢の蚊に給餌する。Anopheles gambiae胚のマイクロ注射を25ミリモルの塩化ナトリウムで行い、胚の後極を45度の角度で標的とする。Anopheles stephensi胚をハロカーボン油にマイクロインジェクションし、後極を30度の角度で標的にすることによって行う。注射直後に、卵を滅菌蒸留水で満たされたペトリ皿に移し、昆虫状態に戻す。孵化したら、G0幼虫を塩漬けの蒸留水を入れたトレイに毎日移し、蛹に後方に移します。ステレオスコープの下で性別でG0の蛹をソートします。男性が3〜5人のグループで別々のケージに出現するのを許し、年齢に合った野生タイプの女性の10倍を超えるものを追加します。雌を10〜15人のグループで別々のケージに出現させ、年齢が一致した野生型の雄を同数加える。大人が4〜5日間交尾し、女性に血液の食事を提供することを許可します。卵を集めて、次世代のG1を育てましょう。G1、L3、およびL4の幼虫を、湿ったろ紙を敷いたペトリ皿または顕微鏡スライド上に集め、蛍光ステレオスコープを使用して、attBタグ付き貨物で導入されたマーカーの存在をスクリーニングする。単一の attB デザインの場合、新規マーカーと既存マーカーの有無をスクリーニングします。カセット交換用のダブルattBデザインの場合、新しいマーカーの存在と既存のマーカーの損失をスクリーニングします。G1の蛹を性別で分類し、異性の年齢に合った野生のタイプの個体と一斉に交差させる。大人が4〜5日間交尾し、血液の食事を提供するのを許してください。単一の統合実験では、塊状の十字架から直接卵を収集します。カセット交換実験では、単一の雌から卵子を収集し、2つの代替カセット配向の潜在的な存在のために分子評価が完了するまで子孫を別々に維持する。G2子孫に蛍光マーカーの存在をスクリーニングし、分子分析のためにG2陽性個体のサブセットを脇に置いておく。残りを大人に育てる。テキスト原稿に記載されているように、PCRで挿入部位の分子検証を行います。単一の組み込みの場合、予測された挿入部位が元のドッキング構築物に加えて、2つのハイブリッド部位attLおよびattR間のドナープラスミドの全配列を含むことを確認してください。カセット交換の場合、予測された挿入部位が、ハイブリッド反転 attL サイトが元の反転 attP サイトを置き換え、交換テンプレートがそれらの間に元々存在するカセットを置き換えるドッキングラインの挿入部位と同一であることを確認します。このプロトコルは、約10週間で安定したアノフェレストランスジェニックラインを生成するために使用された。形質転換の表現型検証は、3xP3プロモーターによって調節される蛍光マーカーのスクリーニングによって行われ、ここに示されている。新しいAnopheles stephensiラインは、CFPでマークされたドッキングラインにDS赤色のマークされたカセットを挿入することによって得られ、その結果、G1子孫は、眼内の赤色および青色の蛍光によって示されるように両方のマーカーを発現した。カセット交換設計は、もともとドッキングラインに挿入されたマーカーをドナープラスミドのマーカーと交換する結果となる。このマーカー交換は、CFPマーカーが失われ、YFPマーカーが獲得され、黄色の目および神経索蛍光をもたらしたAnopheles gambiaeドッキングラインで実証された。時折、RMCEは、幼虫が元のCFPマーカーと新しいYFPマーカーの両方でマークされている所望のトランスジェニックカセットの交換の代わりに、単一の統合事象をもたらす可能性がある。蛍光マーカーの存在をスクリーニングする場合、そのシグナルをバックグラウンド自己蛍光の可能性と区別することが重要です。真のCFP陽性個体を同定するには、倍率を高め、蛍光がプロモーターによって駆動されると予想される組織および器官に焦点を当てることが必要である。個々の形質転換体もまた、予想される挿入部位を確認するためにPCRを介して分子的に評価した。交換されたAnopheles gambiae系統からの個体におけるPCRバリデーションがここに示されている。適切なマイクロインジェクション技術であっても、ドナーおよびヘルパープラスミドの正確な設計および調製、ならびに適切な蚊飼育スキームに従うことは、トランスジェニック個体を得るための鍵である。この手順は、遺伝子の過剰発現またはサイレンシングを引き起こす要素、例えばGAL4/UASシステム、ならびに蚊の遺伝子制御のための遺伝子駆動要素および抗病原体分子を挿入するために使用することができる。

Research

JoVE Journal

Genetics

Site-Directed &#966;C31-Mediated Integration and Cassette Exchange in Anopheles Vectors of Malaria

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

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ヒト初代細胞培養物における概日時計遺伝子発現やホルモン分泌のパラレル測定

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

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でヒストンminiSOGを使用した光遺伝学ランダム突然変異誘発<em&gt; C。エレガンス</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

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