Vi er takknemlige til Kiona Parker (UCI) for å gi bilder av transgene An. stephensi larver, og til Fraser Colman (LSTM) og Beth Poulton (LSTM) for å gi transgene An. gambiae larver. Beth Poulton (LSTM) ga også dyrebar hjelp under avbildningen av An. gambiae larver. Dette arbeidet ble finansiert av Tata Institute for Genetics and Society (TIGS) og LSTMs Director Catalyst Fund tildelt A.A. (DCF2014AA). A.A.J. er professor Donald Bren ved University of California, Irvine.

MERK: En skjematisk arbeidsflyt for den illustrerte protokollen vises i figur 2.
1. Design av φC31 attB-merkede plasmider (figur 3)
<ol><li>Lag attB donorplasmider som bærer følgende viktige komponenter<ol>
<li>Dominerende fluorescerende markør<ol>
<li>Velg en promotor for å drive uttrykket til fluorescerende markør. MERK: For anopheles transgenese er fluorescerende markører vanligvis under regulering av 3xP3 promotør39, som driver uttrykk i øynene og nerveledningen. Alternativt kan PUBc promoter5 brukes når uttrykk i flere vev er ønsket. Donorplasmider og forankringslinjer som brukes som eksempler i denne protokollen, er merket med 3xP3-promotoren .</li>
			<li>Velg et fluorescerende protein (FP) som er kompatibelt med mottaksdokklinjen slik at de lett kan skilles fra hverandre. MERK: Ikke bruk den samme markøren som allerede finnes i dokkinglinjen, og unngå samtidig bruk av GFP (grønn)/YFP (gul) og GFP (grønn)/CFP (cyan) da de er svært vanskelige å skille mellom på en pålitelig måte. Donorplasmider som brukes som eksempler i denne protokollen er merket med enten DsRed eller YFP, da de skal integreres i en forankringslinje merket med CFP.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
attB rekombinasjonssted(er)<ol>
<li>Bruk ett enkelt attB-sted for integrering av en transgen kassett (enkelt-attB-design ) (figur 3A).</li>
			<li>Bruk to inverterte attB-steder for RMCE (dobbel-attB-design ) der anleggene lå invertert i forhold til hverandre og omslutter donor-DNA-malen (figur 3B). MERK: Retningen på attB-stedet (e) må være kompatibel med retningen(e) på attP-stedet (e) som finnes i forankringslinjen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Ønsket transgene last<ol>
<li>Bruk andre ønskede funksjoner som skal integreres i mygggenomet basert på eksperimentets spesifikke formål. Her beskriver vi integreringen av et antimalariaalt effektormolekyl i genomet til An. stephensi og integreringen av komponentene i GAL4 / UAS-systemet i An. gambiae mygg.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Plasmid ryggrad komponenter<ol>
<li>Inkluder blant annet essensielle komponenter for plasmidreplikasjon i bakterier, en markør for plasmid seleksjon in vitro (dvs. et antibiotikaresistensgen). MERK: Den plasmide ryggraden vil bli integrert i mygggenomet i enkelt-attB-designen for integrasjon (figur 3A), mens den ikke vil bli satt inn i dobbelt-attB-designen for RMCE (figur 3B).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Tilberedning av plasmider til mikroinjeksjonsblandingen
MERK: Protokollen illustrert her innebærer bruk av to plasmider: en attB-merket donorplasmid som bærer transgene av interesse, og en hjelperplasmid som uttrykker φC31 integrase under regulering av Drosophila Hsp70 promotør40.
<ol><li>Rens donor- og hjelperplasmider ved hjelp av et endotoksinfritt plasmidrensesett. MERK: Sekvenser det endelige plasmidpreparatet som brukes til injeksjon for å bekrefte integriteten til alle komponenter.</li>
	<li>Kombiner passende mengder av de to plasmidene for å oppnå en blanding med en sluttkonsentrasjon på 350 ng/μL av donorplasmid og 150 ng/μL av hjelperplasmidet når det er resuspendert i injeksjonsbuffer. MERK: Ved beregning av nødvendig blandingsvolum må du vurdere at 10-15 μL er tilstrekkelig for hver dag med planlagte injeksjoner, og DNA kan tilberedes på forhånd og lagres ved -20 °C. Integrase helper plasmidkonsentrasjoner på 60-500 ng/μL og donorplasmidkonsentrasjoner på 85-200 ng/μL er også rapportert21,22,26,41.</li>
	<li>Utfell DNA ved å tilsette 0,1 volumer 3 M natriumacetat (pH 5,2) og 2,5 bind iskaldt 100% EtOH og virvel. Et hvitt bunnfall skal være umiddelbart synlig. Å ha svært konsentrerte innledende plasmidpreparater (dvs. ~ 1 μg / μL) forbedrer nedbørseffektiviteten. MERK: Stoppested - Bunnfallet kan oppbevares ved -20 °C over natten.</li>
	<li>Sentrifuge ved 15.000 x g i 20 min ved 4 °C, kast supernatanten og vask pelletsen med 1 ml iskald 70 % EtOH.</li>
	<li>Vask pelletsen med 1 ml iskald 70% EtOH og sentrifuge ved 15.000 x g i 5 min ved romtemperatur.</li>
	<li>Kast supernatanten uten å forstyrre pellets og lufttørkhet.</li>
	<li>Resuspend pellet i 1x injeksjon buffer (0,1 mM Na3PO4, 5 mM KCl, pH 7.2, 0.22 μm filter sterilisert) for å nå en total sluttkonsentrasjon på 500 ng / μL. MERK: Anta at noe DNA vil gå tapt under nedbørsprosessen; Tilsett derfor et mindre volum injeksjonsbuffer først, kontroller konsentrasjonen på et spektrofotometer (f.eks. Nanodrop), og legg deretter til et passende gjenværende volum for å nå 500 ng / μL.</li>
	<li>Forsikre deg om at DNA-et er grundig resuspendert, lag aliquots på 10-15 μL hver og lagre dem ved -20 °C.</li>
	<li>På injeksjonsdagen tiner du en aliquot og sentrifuge ved 15.000 x g i 5 min for å fjerne eventuelle partikkelrester. MERK: En alternativ metode for fjerning av partikler er å filtrere løsningen gjennom et 0,22 μm filter. Unngå tilstedeværelse av svevestøvrester i injeksjonsblandingen, da de fører til nåleblokkering under embryomikroinjeksjon.</li>
</ol>3. Mikroinjeksjon av embryoer fra en Anopheles docking linje
<ol><li>Blodfôr 4-7-dagers mygg fra ønsket dokkinglinje 72 timer før mikroinjeksjon (dvs. til injeksjon på mandag og tirsdag mate kvinner på forrige fredag; til injeksjon på torsdag og fredag mate kvinner på mandag i samme uke).</li>
	<li>Blodfôr wild-type (WT) mygg (dvs. mygg med samme genomiske bakgrunn av dokkinglinjen) på samme dag; disse vil være nødvendige for outcrossing. MERK: Størrelsen og kvaliteten på blodmelet påvirker eggkvaliteten, så det anbefales alltid å bruke friskt blod (dvs. blod trukket i løpet av de siste 7 dagene). Armfôring eller fôring på mus kan øke kvaliteten og mengden egg, men disse metodene oppfordres ikke. Spesifikke godkjente protokoller vil være nødvendige for menneskelig og dyrebruk.</li>
	<li>Utfør embryomikroinjeksjoner<ol>
<li>Utfør An. gambiae embryomikroinjeksjoner i 25 mM NaCl42 ved å målrette embryoets bakre pol i en 45-graders vinkel. For en detaljert protokoll for embryoinnsamling, justering og mikroinjeksjon, se Pondeville et al.43 og Lobo et al.44.</li>
		<li>Utfør An. stephensi embryomikroinjeksjoner i halokarbonolje 700:27 (2:1) ved å målrette embryoets bakre pol i en 30-graders vinkel. En detaljert protokoll for embryosamling, justering og mikroinjeksjon finnes i Terenius et al.45 og Lobo et al.44.</li>
		<li>Overfør egg umiddelbart etter injeksjon i en Petri-tallerken fylt med sterilt destillert vann (pH 7.2) og returner dem til insektforhold.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ved klekking, overfør G0 larver til et brett med saltet destillert vann (0,1% tonic salt) daglig og bak til pupper.</li>
	<li>Rekordlukkingshastighet (dvs. antall larver klekket ut / antall embryoer injisert). MERK: Embryobevegelse hjelper klekking, så mild virvlende er ønskelig. Lukking skal starte ~48 timer etter injeksjon. Siden injeksjon kan forårsake en liten utviklingsforsinkelse, anbefales det å fortsette å overvåke for sen klekking larver i 3-4 dager.</li>
</ol>4. Kryssing og screening av transformerte individer
<ol><li>[VALGFRITT TRINN] Skjerm G0 (injisert) første eller andre instar larver (L1-L2) for forbigående uttrykk for fluorescerende markør.<ol>
<li>Bruk en finspissglasspipette for å overføre G0 L1-L2 larver til et mikroskop lysbilder med brønner. Plasser en larve i hver brønn.</li>
		<li>Bruk et fluorescensstereoskop med riktig filter for å screene for tilstedeværelsen av forbigående uttrykk for fluorescerende markør. MERK: Mønsteret for forbigående uttrykk dikterer av promotoren som brukes. Ved bruk av 3xP3-promotoren er forbigående uttrykk for fluorescerende markør synlig i anal papillen (se figur 6 i Pondeville et al.43)</li>
		<li>Bakre G0 positive individer separat.</li>
	</ol></li>
	<li>Sorter G0 pupper etter kjønn under et stereoskop52.</li>
	<li>La menn dukke opp i separate bur i grupper på 3-5 (grunnleggerfamilier) og legg til et 10 ganger overskudd av alderstilpassede WT-kvinner. MERK: Siden menn parrer seg flere ganger, er det viktig å gi et overskudd av WT-kvinner for å maksimere parringssjansene til hver mann.</li>
	<li>La kvinner dukke opp i separate bur i grupper på 10-15 (grunnleggerfamilier) og legge til et likt antall alderstilpassede WT-menn. MERK: Hvis det er begrenset plass i insektet, kan kvinner dukke opp sammen i et enkelt bur. Forholdet mellom kvinner og menn kan være så lavt som 1 mann til 3 kvinner.</li>
	<li>La voksne parre seg i 4-5 dager og gi kvinner et blodmåltid. MERK: Blodfôr og samle egg fra G0 kvinner flere ganger for å maksimere sjansene for å få transformanter fra flere gonotrofiske sykluser.</li>
	<li>Blod mate WT individer samtidig for outcrossing.</li>
	<li>Samle egg og bakre fremvoksende neste generasjon G1s.</li>
	<li>Skjerm G1 L3-L4 larver for passende fluorescens for å identifisere transformanter.<ol>
<li>Samle larver i en Petri-tallerken foret med filterpapir eller på et mikroskopsklie og skjerm ved hjelp av et fluorescerende stereoskop med passende filtre for tilstedeværelsen av markøren introdusert med attB-merket last. MERK: Fluorescens drevet av 3xP3-promotoren er synlig i alle postembryoniske stadier, og screeningen kan utføres på yngre larver, men disse er mer skjøre og må håndteres relativt nøye. Pupae kan også screenes.<ol>
<li>For enkelt-attB-design for integrasjonsskjerm for tilstedeværelsen av den nye og eksisterende markøren; Begge skal være til stede siden den nye kassetten settes inn ved siden av den opprinnelige (figur 3A, figur 4).  MERK: Screeningunntak for enkelt attB-design: Når du bruker markørløse forankringslinjer22, må du bare vise skjermen for tilstedeværelsen av den nye markøren. Når du bruker forankringslinjer der integrering resulterer i inaktivering av den eksisterende markøren21, skjermbilde for tilstedeværelsen av den nye markøren og tap av den eksisterende.</li>
			<li>For dobbelt-attB-design for RMCE, skjerm for tilstedeværelse av den nye markøren og tap av den eksisterende, bør bare den nylig introduserte markøren være til stede siden den nye kassetten erstatter den opprinnelige (figur 3B, figur 5). MERK: Sporadiske integrasjonshendelser kan gjenopprettes i RMCE-eksperimenter der bare en enkelt attP rekombinert og dermed vil begge markørene være til stede. Screeningen av G1-individer kan også utføres på puppetrinnet etter samme prosedyre52.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Overfør forvandlet G1 individer til en larvalbrett og bak til pupper. Kast ikke-fluorescerende individer og personer med et uventet markøruttrykksmønster.</li>
	<li>Sort forvandlet G1 pupper etter kjønn og kryss dem masse med motsatt kjønn alder-matchet WT individer.</li>
	<li>La voksne parre seg i 4-5 dager, gi et blodmåltid, samle eggene og bak neste generasjon G2 avkom.<ol>
<li>For enkeltintegrasjonseksperimenter, samle egg direkte fra massekorset , da integrasjonsstedet er identisk hos alle individer.</li>
		<li>For RMCE-eksperimenter samler du egg fra enslige kvinner og opprettholder avkom atskilt til molekylær vurdering er fullført på grunn av den potensielle tilstedeværelsen av to alternative kassettretninger (figur 3B).</li>
	</ol></li>
	<li>Screen G2 avkom (på enten larven eller pupa scenen) for tilstedeværelsen av fluorescerende markør (50% av individene forventes å være positiv), kast ikke-fluorescerende avkom.</li>
	<li>Sett til side en undergruppe av G2 positive individer for molekylær analyse, bak resten til voksen alder. MERK: Hvis alle G2-individer må holdes i live, kan molekylær analyse utføres på en voksens ben46 eller pupal tilfelle DNA-ekstraksjoner (L. Grigoraki personlig kommunikasjon). Alternativt kan molekylær analyse utføres etter at alle G2-individene har ovipositert og egg har klekket ut.</li>
	<li>La voksne menn og kvinner krysse i samme bur for å etablere den nye transgene linjen. MERK: For RMCE-eksperimenter må det forekomme intercross for voksne mellom søsken som stammer fra en enkelt kvinne til innsettingsretningen bestemmes via molekylær analyse.</li>
</ol>5. Molekylær validering av innsettingsstedet ved DNA-forsterkning (PCR)
<ol><li>Forbered et kart over det anslåtte innsettingsstedet i genomet til dokkinglinjen etter transformasjon.<ol>
<li>Enkel integrasjon: Forsikre deg om at det anslåtte innsettingsstedet bærer den opprinnelige forankringskonstruksjonen pluss hele sekvensen av donorplasmidet mellom de to hybridstedene attL og attR (figur 3A).</li>
		<li>RMCE: Kontroller at det predikerte innsettingsstedet er identisk med det for forankringslinjen der hybridinverterte attL-områder erstatter de opprinnelige inverterte attP-områdene , og at utvekslingsmalen erstatter kassetten som opprinnelig var til stede mellom dem (figur 3B).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Design oligonukleotidprimere for å forsterke innsettingskrysset på hver side av integrasjonslocus.<ol>
<li>Enkel integrasjon: Design oligonukleotidprimerpar som spenner over attR - og/eller attL-anleggene . Den ene primeren må binde seg til den tidligere integrerte forankringskonstruksjonen og den andre til den nylig integrerte transgene (figur 3A).</li>
		<li>RMCE: Kassetterstatning kan forekomme i to forskjellige retninger med hensyn til kromosomet (angitt A og B). Design alternative kombinasjoner av 4 oligonukleotidprimere for å gi et diskret produkt i bare en av retningene, der ett par er diagnostisk for orientering A, og det andre for orientering B (figur 3B, figur 6).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Trekk ut genomisk DNA fra G2 positive individer og utfør diagnostisk PCR og gelelektroforese for å visualisere tilstedeværelsen av forventede diagnostiske amplikoner fra de predikerte integrasjonsstedskartene. MERK: DNA kan alternativt ekstraheres fra enkelt voksnes ben46 eller pupal tilfeller (L. Grigoraki personlig kommunikasjon).</li>
	<li>SekvensER PCR-produkter for å bekrefte forventede sekvenser.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig02.jpg"> Figur 2. Arbeidsflytdiagram for stedsstyrt φC31 genommodifisering i Anopheles mygg. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig03.jpg"> Figur 3. Molekylært grunnlag for φC31-mediert enkeltintegrasjon (A) og RMCE (B). A) Skjematiske kart over den genomiske innsettingen i en An. stephensi-dokkinglinje (80.9, tabell 1) som bærer et enkelt attP-sted og merket med CFP (øverst), en enkelt-attB design donor plasmid merket med DsRed (midten), og det forventede innsettingsstedet som resulterer etter vellykket integrasjon (bunn). B) Skjematiske kart over genomisk innsetting i en An. gambiae docking linje (A11, Tabell 1) bærer to inverterte attP nettsteder og merket med CFP (topp), en dobbel-attB design donor plasmid merket med YFP (midten), og forventet innsettingssted som resulterer etter vellykket RMCE (bunn). Bølget linje: mygggenom; Stripete piler: piggyBac transposon armer; 3xP3: promotor av fluorescerende markør; SV40: viral terminator; Ori: opprinnelsen til replikering; Ampr: ampicillin motstand gen. Kryssende linjer representerer området(e) for rekombinasjon mellom attP- og attB-områder. Nummererte svarte piler representerer primerbindingssteder for molekylær validering av innsettingslocus (trinn 5 i protokollen). Fullt kommenterte enkelt- og dobbelt attB-merkede plasmider er tilgjengelig fra forfatterne på forespørsel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Den nøyaktige utformingen av attB-taggede plasmider som er kompatible med den valgte dokkinglinjen, er avgjørende for suksessen til eksperimentet. Det må tas nøye hensyn til valget av markøren som brukes til screening av transformanter, inkludert fluorescensfargen og uttrykksmønsteret, som vil være underlagt mønsteret som allerede finnes i dokkinglinjen. Det er nødvendig å bruke fluorescerende markører som lett kan skilles fra hverandre: gode markørkombinasjoner inkluderer RFP (rød)/CFP (cyan), RFP (rød)/GFP (grønn), RFP (rød)/YFP (gul) og YFP (gul)/CFP (cyan), mens kombinasjoner som skal unngås er YFP (gul)/GFP (grønn) og CFP (cyan)/GFP (grønn). 3xP3 promotør39, spesifikk for øynene og nerveledningen, er den mest brukte til å drive uttrykket av fluorescerende markører for myggtransgenese. Faktisk bruker alle Anopheles-dokkinglinjene som for øyeblikket er tilgjengelige denne promotoren. Alternative regulatoriske regioner er det av An. gambiae polyubiquitin gen (PUBc)5 eller viral promotør IE120, som driver uttrykk i flere vev. Når de brukes sammen med 3xP3, vil disse promotorene utvide de mulige fargekombinasjonene og til og med bruken av samme fluorofor. De angitte promotorene er aktive gjennom hele mygglivssyklusen, slik at screening og fluorescensovervåking i alle livsstadier. En ekstra vurdering under plasmiddesign er størrelsen på lasten som skal integreres eller byttes. Mens φC31-systemet har bemerkelsesverdig bæreevne18, bør det vurderes at størrelsen på donorplasmid generelt korrelerer negativt med transformasjonseffektivitet22.
I den beskrevne protokollen er kilden til integrase en hjelperplasmid som uttrykker enzymet allestedsnærværende40. Den allestedsnærværende tilstedeværelsen av integrasen kan føre til transformasjon av somatiske celler hvis mikroinjeksjoner ikke akkurat er rettet mot området der bakterien dannes. Mens slike transformasjonshendelser vil gå tapt, da de ikke er arvelige, kan somatiske effekter redusere kondisjonen til injiserte individer. For å unngå dette og øke transformasjonseffektiviteten, kan integraseuttrykk begrenses til bakterien, for eksempel ved å bruke vasapromotoren22,26. Andre protokoller beskriver bruken av in vitro transkribert messenger RNA (mRNA) som kilde til φC31 integrase19,24,43. Dette innebærer imidlertid den arbeidskrevende forberedelsen av mRNA og krever nøye håndtering av injeksjonsblandingen og bruk av RNase frie reagenser for å unngå nedbrytning. Plasmid kilder til integrase har blitt demonstrert i både An. gambiae9,21,22,26,33,37 og An. stephensi (A.A. personlig kommunikasjon) for å være pålitelig og føre til effektiv transformasjon, og er dermed vårt foretrukne alternativ. Et annet alternativ for integrase levering er dens in vivo produksjon i selv-docking hjelper linjer. Slike linjer ble opprettet i An. gambiae som uttrykker φC31 integrase under regulering av de germline-spesifikke promotor nanos og ble funnet å føre til en forbedret overlevelse og transformasjon effektivitet20. Imidlertid må potensielle treningsbelastninger pålagt av in vivo-produksjonen av integrase-enzymet på hjelpelinjen vurderes.
Som med andre transgene teknikker, må spesiell forsiktighet reserveres til oppdrett og kryssing av individer som stammer fra injiserte embryoer for å maksimere sjansene for å gjenopprette transformanter. Personer som har stabilt arvet transgene kan først gjenopprettes ved G1-avkom. Imidlertid kan tidlige tegn på potensiell transformasjon evalueres ved tilstedeværelse av forbigående episomalt uttrykk for fluorescerende markør i anal papillen og / eller nerveledningen til G0 første og andre instar larver når du bruker 3xP3 promotor43. Mens tilstedeværelsen av forbigående fluorescens antyder vellykket plasmid levering, garanterer det ikke arvelig bakterietransformasjon. På samme måte utelukker ikke mangelen på forbigående uttrykk vellykket transformasjon. Likevel har det blitt observert at forbigående positive individer er mer sannsynlig å gi forbigående avkom sammenlignet med forbigående negative 43,48. I eksperthender kan oppdrett og kryssing av bare positive individer være et alternativ for å redusere myggtall. Men gitt viktigheten og skjørheten til små G0 larver, er minst mulig manipulasjon fortsatt tilrådelig, og oppdrett av alle G0-individer anbefales alltid.
Paringsordningen som rapporteres i denne protokollen, er utformet for å maksimere sjansen for parring og isolere uavhengige transformasjonshendelser. Men hvis insektplass eller personelltilgjengelighet er et problem, kan G0 voksne samles etter kjønn i enkeltbur hvis nok motsatte kjønn blir gitt. Et slikt oppsett vil ikke tillate diskriminering mellom flere transformasjonshendelser som forekommer hos personer fra samme bur. Avhengig av det eksperimentelle oppsettet forventes tilstedeværelsen av en dobbel (enkel integrasjon) eller enkel (RMCE) markør under screeningprosessen. I enkeltintegrasjonseksperimenter er det viktig å verifisere tilstedeværelsen av den opprinnelige markøren fra forankringslinjen, mens i RMCE er viktig å verifisere tapet av den tidligere integrerte markøren. Faktisk er det ikke uvanlig i RMCE-design å gjenopprette transformanter der enkeltintegrasjon i stedet for utveksling skjedde på grunn av rekombinasjonen av et enkelt attP-nettsted9,33. I slike individer er både fluorescerende markører til stede, så vel som hele donorplasmid ryggraden som fremhever viktigheten av å gjennomføre en grundig screening for begge fluorescerende markører.
Mens tilstedeværelsen av forventede fluorescensmønstre indikerer vellykket transformasjon, må molekylær karakterisering av innsettingsstedet utføres. For å gjøre dette er utarbeidelsen av nøyaktige kart over det predikerte innsettingsbrødet, inkludert de flankende genomiske områdene i dokkinglinjen, avgjørende for utformingen av tilstrekkelige diagnostiske oligonukleotidprimere for genforsterkningsanalyser. Enkeltintegrasjonshendelser resulterer i dannelse av attR - og attL-hybridsteder i krysset mellom det nylig integrerte DNA-et og den tidligere innsatte kassetten. Disse områdene kan målrettes mot validering av innsettingsområde. I RMCE-design kan innsetting av donorkassetten forekomme i to alternative orienteringer med hensyn til det genomiske locus, og dermed kan fire primere brukes i alternative PCR-kombinasjoner for å oppdage hvilken orientering linjen bærer. Ettersom orienteringen av kassettinnsetting kan påvirke transgene uttrykk, er det i komparativ genuttrykksanalyse viktig å bruke linjer som har samme innsettingsretning.
Når du arbeider med lavt antall transformanter, kan det ikke være ønskelig å ofre hele individer for molekylær analyse. Et alternativ til dette er å gjennomføre molekylær analyse på DNA ekstrahert fra single voksen ben46 som bentap påvirker ikke en voksen kvinnelig evne til å mate og oviposit49. Det er imidlertid fare for å skade individet i prosessen med fjerning av ben. Suksess har blitt oppnådd ved hjelp av kasserte pupal tilfeller (L. Grigoraki personlig kommunikasjon), men den sikreste tilnærmingen er å utføre molekylær analyse på G2 foreldre etter å ha fått levedyktig G3 avkom.
De siste årene har CRISPR/Cas9 revolusjonert måten å utføre stedsspesifikk genomredigering på26,41,50,51. I motsetning til stedsstyrt RMCE, er CRISPR/Cas9-medierte genintegrasjoner (knock-ins) uavhengige av tilstedeværelsen av forhåndsinnsatt rekombinasjonssteder med bare en ett-trinns transformasjonshendelse som trengs. Crispr/Cas9-systemet er likevel avhengig av tilstedeværelsen av store kjente genomsekvenser som flankerer ønsket innsettingssted for vellykket homologistyrt reparasjon, så vel som på den effektive nettstedgjenkjenningen formidlet av guide RNAer. Disse betingelsene kan ikke alltid oppfylles eller kan være arbeidskrevende å feilsøke, og gitt tilgjengeligheten av flere dokkinglinjer i An. gambiae og An. stephensi og linjer avledet fra dem, forblir φC31-systemet et svært verdifullt verktøy for å utføre direkte fenotypiske sammenligninger mellom transgenes på de samme genomiske stedene.

Evnen til å modifisere genomet av myggvektorer av sykdommer pålitelig og reprodusert har styrket in vivo funksjonell validering av gener og åpnet dørene for realiserbare genetiske vektorkontrollstrategier, for eksempel de som er rettet mot Anopheles mygg som overfører malaria1.
Tidlig mygggenomredigering stolte utelukkende på transponerbart element (TE)-mediert transformasjon, med piggyBac som den mest brukte transposonen i Anopheles2,3,4. Te-integrasjonens tilfeldige karakter kan imidlertid føre til uønskede modifikasjoner som genutslag (innsettingsmutagenese) og signifikante posisjonseffekter på transgene uttrykk5,6,7,8. Flere innsettinger er også en vanlig forekomst når du bruker piggyBac5,9, noe som gjør valideringen og isolasjonen av transgene linjer med enkle innsettinger arbeidskrevende. Andre ulemper inkluderer deres potensielle remobilisering, som observert i bakterien av Anopheles stephensi når de gir en kilde til piggyBac transposase10,11,12, og deres begrensede størrelse på DNA-last (10-15 kb i lengde) med transformasjonseffektivitet avtagende med økende størrelse på donor plasmid13,14.
Stedsstyrte integrasjonsmetoder ble introdusert for å omgå disse problemene. Den vanligste stedsstyrte genommodifiseringen i mygg er den mediert av φC31-systemet (figur 1a). Dette er drevet av en viral integrase som katalyserer rekombinasjonen mellom to heterospesifikke festesteder (att) som forekommer naturlig i genomet til bakteriofage φC31 (attP) og i Streptomyces bakterievert (attB)15. Rekombinasjon av de to anleggene er enveis og resulterer i dannelse av hybridsteder (attL og attR). Rekombinasjonen av slike hybridsteder (som fører til DNA-eksisjon) ville kreve ikke bare tilstedeværelsen av en aktiv viral integrase, men også en annen phage-kodet rekombinasjonsfaktor16,17. Et stabilt integrasjonssted genereres dermed som avlaster spørsmålet om potensiell uønsket remobilisering15. Videre tillater systemet integrering av store last (f.eks. integrering av > 100 kb konstruksjoner ble rapportert i D. melanogaster18), noe som øker bæreevnen betydelig. Integrasjon skjer i et enkelt forhåndsdefinert genomisk locus som i stor grad forenkler valideringen av innsetting og parringsplanen for å oppnå en stabil transgen linje. Til slutt tillater integreringens stedsstyrte natur normalisering av uttrykk ettersom alternative transgenes ligger i samme locus og derfor reguleres innenfor samme nærliggende genomiske kontekst. Faktisk er en av de viktigste anvendelsene av teknikken den direkte sammenligningen av fenotyper som er gitt av forskjellige transgenes etter innsetting i et identisk locus.
Å oppnå φC31-mediert integrasjon innebærer to faser: fase I er opprettelsen av transgene dokkinglinjer som bærer attP-anlegg(er), og fase II er den stedsstyrte integrasjonen av en attB-flankert last i genomet til dokkinglinjen19. Opprettelsen av fase I-dokkinglinjer har stolt på TE-mediert tilfeldig integrasjon av attP-taggede konstruksjoner og involverte dermed en innledende arbeidskrevende prosess (inkludert sørlige flekker og omvendte PCR-analyser på en-kvinnelig avkom) for å isolere og validere transgene linjer som bærer en enkelt integrasjonshendelse i unike, transkripsjonelt aktive og fitness nøytrale genomiske steder. Likevel er flere dokkinglinjer for φC31-mediert enkeltintegrasjon utviklet og validert i An. gambiae19,20,21,22 og i An. stephensi23,24,25 (Tabell 1). Hver av disse linjene varierer når det gjelder den genomiske plasseringen av dokkingstedet og den belastningsspesifikke genetiske bakgrunnen, og fra dem kan et stort utvalg av nye transgene linjer opprettes. Den komplekse valideringen av TE-medierte integrasjoner for produksjon av forankringslinjer kan nå omgås av CRISPR/Cas9-teknologien26. Dette er imidlertid avhengig av at forkunnskapene om nøytral loci målrettes og deres omkringliggende sekvenser.
φC31-mediert integrasjon har blitt brukt mye på insektgenomredigering fra modellorganismen D. melanogaster27, til myggene Aedes aegypti13,28, Ae. albopictus29, An. gambiae19 og An. stephensi24, samt andre insekter, inkludert Ceratitis capitata30 og Bombyx mori31.
En begrensning av φC31-mediert integrasjon, spesielt i lys av potensielle feltutgivelser for vektorstyring, er integrasjonen i mygggenomet til hele attB-bærende donorplasmid, inkludert uønskede sekvenser som antibiotikaresistensgenmarkører og plasmid ryggradskomponenter av bakteriell opprinnelse. For å løse dette ble det implementert en modifikasjon av standardsystemet, rekombininasemediert kassettutveksling (RMCE), som gjør det mulig å erstatte en tidligere integrert transgen kassett med et nytt donor-DNA (figur 1b). Dette oppnås ved å bruke to inverterte attsteder som flankerer donor- og mottakerkassettene i hver ende, noe som driver to uavhengige rekombinasjonshendelser til å finne sted samtidig som det resulterer i kassettutveksling uten integrering av den plasmide ryggraden. Denne forbedrede designen omgår integreringen av uønskede sekvenser og utvider bruken av φC31-systemer til å omfatte for eksempel integrering av umerkede DNA-last ved å screene for tap av en tidligere integrert fluorescerende markør32.
RMCE ble oppnådd først med D. melanogaster32 og senere brukt med hell på ikke-modell insekter, inkludert An. gambiae9,26,33, Ae. aegypti34, Plutella xylostella34 og B. mori35. Flere forankringslinjer for RMCE er utviklet og validert i An. gambiae5,9,26 (tabell 1). Så vidt vi vet, er RMCE ennå ikke utforsket i andre Anopheles vektorarter.
Til dags dato har φC31-systemet blitt brukt mye i Anopheles mygg for å introdusere og studere en rekke molekyler, inkludert antimalaria effektorer19,24,36, komponenter i GAL4 / UAS-systemet for å overekspressere og knockdown gener for insektmiddelresistensstudier9,33, regulatoriske elementer, reportergener5,21,37, og gen-drive elementer26 ,38.
Denne protokollen beskriver hvordan man utfører 1) stedsstyrt integrasjon av en attB-flankert last og 2) RMCE av en konstruksjon flankert av inverterte attB-steder i genomet til Anopheles docking linjer. Dette oppnås ved å bruke to plasmider: en donor attB-merket plasmid som bærer transgene av interesse, og en hjelper plasmid som uttrykker φC31 integrase. De store malariavektorene An. gambiae og An. stephensi brukes som spesifikke eksempler, men disse protokollene gjelder for andre Anopheles-arter .
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig01.jpg"> Figur 1. Stedsstyrte genommodifikasjoner, enkel integrasjon og rekombininasemediert kassettutveksling (RMCE) , ved hjelp av φC31-systemet. φC31 integrase (INT, grå dobbeltpil) katalyserer rekombinasjonen mellom attB-stedet (lilla stripet) som er tilstede i en donorplasmid og attP-stedet (blå stripet) som er tilstede i en mottakende dokkinglinje, noe som resulterer i dannelse av hybridsteder attL og attR. A) Integrasjon oppnås når enkelt attB- og attP-anlegg rekombinerer og resulterer i tilstedeværelse av to integrerte markører (blå og rød). B) RMCE oppstår når to attB / P-anlegg rekombinerer samtidig og resulterer i utskifting av kassetten mellom attstedene på dokkinglinjen (blå markør) med det som bæres av donorplasmid (rød markør). C) Delvise nukleotidsekvenser av attP (blå) og attB (lilla) og hybridstedene attL/R. Rekombinasjon skjer mellom 'TT'-kjernesekvensene uthevet i fet svart. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL eppendorf tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well microslides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MARI1216690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree&#160;Plasmid&#160;Maxi&#160;Kit (10)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Absolute, Molecular Biology Grade</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter set CFP for Leica MZ FLIII Excitation 436/20 nm, extinction 480/40 nm</td>
			<td>Leica</td>
			<td>10446363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter set dsRED for Leica MZ FLIII Excitation 545/30 nm, extinction 620/60 nm</td>
			<td>Leica</td>
			<td>10447079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter set YFP customised for Leica MZ FLIII</td>
			<td>Omega Optical</td>
			<td>500QM25, 500QM35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 27</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 700</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium&#160;chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium&#160;Acetate&#160;Solution (3 M),&#160;pH&#160;5.2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Life Technologies)</td>
			<td>R1181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stable brush Size 0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

site-directed &#966;c31-mediated integration and cassette exchange in anopheles vectors of malaria

Funksjonell genomisk analyse og relaterte strategier for genetisk kontroll av malaria er avhengig av validerte og reproduserbare metoder for å nøyaktig modifisere genomet til Anopheles mygg. Blant disse metodene tillater φC31-systemet presis og stabil stedsstyrt integrasjon av transgenes, eller erstatning av integrerte transgene kassetter via rekombininasemediert kassettutveksling (RMCE). Denne metoden er avhengig av virkningen av Streptomyces φC31 bakteriofage integrase for å katalysere rekombinasjon mellom to spesifikke festesteder utpekt attP (avledet fra phage) og attB (avledet fra vertsbakterien). Systemet bruker ett eller to attP-anlegg som tidligere er integrert i mygggenomet og attB-stedet(e) i donormalen DNA. Her illustrerer vi hvordan man stabilt modifiserer genomet til attP-bærende Anopheles-dokkinglinjer ved hjelp av to plasmider: en attB-merket donor som bærer integrasjons- eller utvekslingsmalen og en hjelperplasmid som koder φC31-integrasen. Vi rapporterer to representative resultater av φC31-mediert stedsstyrt modifikasjon: den enkle integrasjonen av en transgen kassett i An. stephensi og RMCE i An. gambiae mygg. φC31-mediert genommanipulering gir fordelen av reproduserbart transgene uttrykk fra validerte, fitnessnøytrale genomiske steder, noe som muliggjør komparative kvalitative og kvantitative analyser av fenotyper. Integreringens stedsstyrte karakter forenkler også valideringen av enkeltinnsettingsstedet og paringsordningen betydelig for å oppnå en stabil transgen linje. Disse og andre egenskaper gjør φC31-systemet til en viktig komponent i det genetiske verktøysettet for transgenisk manipulering av malaria mygg og andre insektvektorer.

Protokollen illustrert her gjør det mulig å generere en stabil Anopheles transgen linje i ~ 10 uker (forutsatt en 21-dagers mygg livssyklus).
Etter injeksjon larval klekking rater i An. gambiae forventes å være generelt lavere enn An. stephensi, men klekking rater mellom 10-50% er rapportert9,20,24,26,33,43,47. Gitt passende injeksjonsteknikk er klekkingshastigheter på ≥20% generelt tilstrekkelig til å gi transformanter. DNA-opptak av embryoene kan vurderes ved å screene unge larver for forbigående uttrykk for fluorescerende markør. I vellykkede RMCE-eksperimenter i An. gambiae ved hjelp av 3xP3-promotoren viste opptil 50% av de overlevende G0 larver episomalt uttrykk for markøren i anal papillae48.
Generaliserte estimater for transformasjonseffektivitet er vanskelig å evaluere blant laboratorier og til og med blant eksperimenter som transformasjon avhenger av et komplekst samspill mellom variabler, inkludert renhet, konsentrasjon, størrelse og potensiell toksisitet av injisert DNA, kvalitet på egg, pre- og postinjeksjonshåndtering av egg, myggoppdrett og viktigst av opplevelsen av operatøren. Transformasjonsrater opp til 7% er oppnådd for RMCE i An. gambiae (beregnet som antall uavhengige transformasjonshendelser i de totale G0-individene)9,26,33, og opptil 2,2% transformasjonshastighet for integrasjon i An. stephensi. Vi foreslår å injisere minst 500 embryoer, noe som skal føre til klekking av minst 100 G0 larver og til 2-7 G0 voksne grunnleggere hvorfra stabilt forvandlet avkom kan oppnås. Hvis screening for forbigående uttrykk i G0 larver, kan opptil 40 positive larver forventes.
Eksempler på fenotypisk validering av transformasjon via screening av fluorescerende markører regulert av 3xP3-promotoren er rapportert i figur 4 ogfigur  5. Figur 4 viser en ny An. stephensi-linje oppnådd ved innsetting av en DsRed-merket kassett i en dokkinglinje merket med CFP (80.9, tabell 1), noe som resulterer i at G1 avkom uttrykker begge markørene som angitt av den røde og blå fluorescensen som oppdages i øynene.
RMCE-design forventes i stedet å resultere i utskifting av markøren som opprinnelig ble satt inn i dokkinglinjen med donorplasmiden. Figur 5A ogFigurE  B illustrerer denne markørutvekslingen i en An. gambiae-dokkinglinje merket med CFP (A11, tabell 1) der CFP-markøren etter vellykket RMCE går tapt og YFP-markøren er anskaffet, noe som resulterer i gult (men ikke blått) øye- og nerveledningsfluorescens33. Av og til kan RMCE resultere i en enkelt integrasjonshendelse i stedet for utveksling av ønsket transgen kassett som illustrert i figur 5C, der en larve merket med både den opprinnelige CFP og de nye YFP-markørene vises. Det rapporteres at opptil 50% av det totale antallet transformasjonshendelser er enkeltintegrasjoner9,33.
Ved screening for tilstedeværelse av en fluorescerende markør er det avgjørende å skille signalet fra mulig bakgrunns autofluorescens. Dette er spesielt viktig når du bruker CFP da Anopheles larver viser naturlig blå autofluorescence (figur 6A). Å øke forstørrelsen og fokusere på vev og organer der fluorescens forventes å bli drevet av promotoren, er nødvendig for å identifisere sanne CFP-positive individer som illustrert i figur 6B ved hjelp av 3xP3-CFP-markøren.
Individuelle transformanter vurderes endelig molekylært via PCR for å bekrefte det forventede innsettingsstedet. Figur 7 rapporterer PCR-valideringen hos personer fra en utveksling An. gambiae linje som viser de to potensielle orienteringene for innsetting i mygggenomet33.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig04.jpg"> Figur 4. Validering av φC31 enkeltintegrasjon i An. stephensi larver (dorsal visning). A) Dokkinglinjen (80.9, tabell 1) uttrykker CFP i øynene under regulering av 3xP3-promotoren . B) Vellykket integrasjon resulterer i uttrykk for den nyervervede DsRed samt den opprinnelige CFP-markøren i øynene. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig04large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig05.jpg"> Figur 5. Validering av φC31 RMCE i An. gambia larver (ventral visning). A) Dokkinglinjen (A10, tabell 1) uttrykker CFP under regulering av 3xP3-promotoren i øynene (e) og nerveledningen (nc)5. B) Vellykket RMCE resulterer i bytte av fluorescerende markør fra CFP til YFP33. C) Enkeltintegrasjonshendelse oppstod under RMCE-eksperiment der transformant larven uttrykker både CFP- og YFP-markørene. Denne larven bærer GAL4 / UAS-komponenter som forårsaker et bredt uttrykksmønster av YFP, spesielt sterk i magemuskulaturen (am). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig05large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig06.jpg"> Figur 6. CFP autofluorescence i An. gambiae larver (dorsal visning). A) Side-ved-side bilde av en positiv (CFP +) og en negativ (CFP-) L4 larve ved hjelp av CFP-filteret. B) Nærbilde av larveøyne som avslører en CFP + vs CFP-person. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig06large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig07.jpg"> Figur 7. Molekylær validering av orientering av kassettinnsetting i representativ transgen An. gambiae opprettet av φC31 RMCE. Den transgene kassetten kan settes inn i en av to alternative retninger (A eller B) i forhold til innsettingsstedet. Hver PCR-reaksjon (I - IV) bruker en kombinasjon av primere (5-8)33 designet for å gi et diagnostisk forsterkningsfragment for hver orientering som angitt i de skjematiske plasmidkartene. T1: representativ transgen individuell bæreretning av innsetting A; T2: representativ transgen individuell bæreretning av innsetting B; WT: vill type; DL: forankringslinje; -: reaksjon negativ kontroll der vann ble brukt som mal. Denne figuren er endret fra Adolfi et al. (2019)33. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig07large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Art</td>
			<td>Belastning</td>
			<td>Navn</td>
			<td>attP(er)</td>
			<td>Chromo-noen</td>
			<td>Promotor-markør</td>
			<td>Opprinnelsesinstitusjon</td>
			<td>Referanse</td>
		</tr>
<tr>
<td>An. stephensi</td>
			<td>Indiana
</td>
			<td>26.10b
</td>
			<td>Enkelt</td>
			<td>2R</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>Univ. av California Irvine</td>
			<td>25</td>
		</tr>
<tr>
<td>An. stephensi</td>
			<td>Indiana
</td>
			<td>44Cb
</td>
			<td>Enkelt</td>
			<td>X</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>Univ. av California Irvine</td>
			<td>23, 24</td>
		</tr>
<tr>
<td>An. stephensi</td>
			<td>Indiana
</td>
			<td>80.9b
</td>
			<td>Enkelt</td>
			<td>2L</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>Univ. av California Irvine</td>
			<td>Denne studien</td>
		</tr>
<tr>
<td>An. gambiae</td>
			<td>G3</td>
			<td>113</td>
			<td>Enkelt</td>
			<td>2R</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>Univ. av California Irvine</td>
			<td>Denne studien</td>
		</tr>
<tr>
<td>An. gambiae</td>
			<td>KIL</td>
			<td>Ec
</td>
			<td>Enkelt</td>
			<td>3R</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>Keele Univ.</td>
			<td>19, 43</td>
		</tr>
<tr>
<td>An. gambiae</td>
			<td>G3</td>
			<td>X1</td>
			<td>Enkelt</td>
			<td>2L</td>
			<td>Ingen markør</td>
			<td>Univ. av Strasbourg</td>
			<td>22</td>
		</tr>
<tr>
<td>An. gambiae</td>
			<td>G3</td>
			<td>YAttP</td>
			<td>Enkelt</td>
			<td>Y</td>
			<td>3xP3-RFP</td>
			<td>Imperial College London</td>
			<td>21</td>
		</tr>
<tr>
<td>An. gambiae</td>
			<td>G3</td>
			<td>A10b
</td>
			<td>Dobbel</td>
			<td>2R</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>Liverpool skole Trop. Med.</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>An. gambiae</td>
			<td>G3</td>
			<td>A11b
</td>
			<td>Dobbel</td>
			<td>2R</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>Liverpool skole Trop. Med.</td>
			<td>9</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="8">en. Stamme fra Johns Hopkins University (gave av M. Jacobs-Lorena) og i kultur ved Univ. of California Irvine i >20 år.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="8">b. Disse linjene er tilgjengelige fra forfatterne på rimelig forespørsel.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="8">c. Denne linjen er tilgjengelig på BEI-repositoriet www.beiresources.org som MRA-1163.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1. Anopheles attP docking linjer.

Watch this Scientific Journal Video about Site-Directed Ãâ€ C31-Mediated Integration and Cassette Exchange in Anopheles Vectors of Malaria at JoVE.com

Site-Directed ÃƒÂÃ¢â‚¬Â C31-Mediated Integration and Cassette Exchange in Anopheles Vectors of Malaria

Protokollen beskriver hvordan man oppnår stedsstyrte modifikasjoner i genomet til Anopheles malaria mygg ved hjelp av φC31-systemet . Modifikasjoner beskrevet inkluderer både integrasjon og utveksling av transgene kassetter i genomet av attP-bærende dokkinglinjer.

Stedsstyrt φC31-mediert integrasjon og kassettutveksling i anopheles-vektorer av malaria

Functional genomic analysis and related strategies for genetic control of malaria rely on validated and reproducible methods to accurately modify the ...

Denne protokollen støtter karakterisering av mygggeners rolle involvert i en rekke fysiologiske veier, inkludert for eksempel insektresistens og malariaparasittutvikling. Metoden driver transgene innsetting til enkelt pre-karakteriserte genomiske steder og gjør det derfor mulig å sammenligne fenotyper direkte som følge av alternative transgenes effektivt unngå spørsmålet om posisjonseffekt. Denne metoden kan brukes på en rekke insektarter av folkehelse og landbruksmessig betydning, og dens applikasjoner strekker seg mye fra bakterier til pattedyrceller.Begynn med å designe attB donor plasmider som bærer den dominerende fluorescerende markøren, attB rekombinasjonssteder og ønsket transgene last. Bruk et enkelt attB-sted for integrering av hele plasmidet som bærer den transgene kassetten eller to inverterte attB-steder for kassettutveksling. Rens donor- og hjelperplasmider ved hjelp av et endotoksinfritt rensesett.Kombiner attB-merket donorplasmid som bærer transgene av interesse og hjelperplasmid som bærer integrasen for å få en blanding med en sluttkonsentrasjon på 350 nanogram per mikroliter av donorplasmid og 150 nanogram per mikroliter av hjelperplasmidet. Utfell DNA ved å tilsette 0,1 volum tre molar natriumacetat og 2,5 volumer iskaldt 100% etanol, deretter virvel. Et hvitt bunnfall skal være umiddelbart synlig.Vask pelletsen og resuspend den i injeksjonsbuffer for å nå en total sluttkonsentrasjon på 500 nanogram per mikroliter. Forbered deretter aliquots på 10-15 mikroliter hver og lagre dem på negative 20 grader Celsius. Blodfôr fire til syv dager gamle mygg fra ønsket dokkinglinje og deres ville type kolleger 72 timer før mikroinjeksjon.Utfør Anopheles gambiae embryo mikroinjeksjoner i 25 millimolar natriumklorid ved å målrette embryoets bakre pol i en 45 graders vinkel. Utfør Anopheles stephensi embryo mikroinjeksjoner i halokarbonolje ved å målrette den bakre polen i en 30 graders vinkel. Umiddelbart etter injeksjon, overfør eggene til en Petri-tallerken fylt med sterilt destillert vann og returner dem til insektforhold.Ved klekking, overfør G0 larve til et brett med saltet destillert vann daglig og bak til pupper. Sorter G0 pupper etter kjønn under et stereoskop. La hannene dukke opp i separate bur i grupper på tre til fem og legg til et ti ganger overskudd av alderstilpassede villtype kvinner.La hunnene dukke opp i separate bur i grupper på 10 til 15 år og legg til et likt antall alderstilpassede villtype menn. La voksne parre seg i fire til fem dager og gi kvinner et blodmåltid. Samle eggene og bakre fremvoksende neste generasjon G1s.Samle G1, L3 og L4 larve i en Petri-tallerken foret med vått filterpapir eller på et mikroskop og screen dem ved hjelp av et fluorescerende stereoskop for tilstedeværelsen av markøren introdusert med attB-merket last. For enkelt attB-design, skjerm for tilstedeværelsen av den nye og eksisterende markøren. For dobbel attB-design for kassettutveksling, skjerm for tilstedeværelse av den nye markøren og tap av den eksisterende.Sort forvandlet G1 pupper etter kjønn og kryss dem masse med motsatt kjønn alder-matchet vill type individer. La voksne parre seg i fire til fem dager og gi et blodmåltid. For enkeltintegrasjonseksperimenter, samle egg direkte fra en massekorset.For kassettutvekslingsforsøk, samle egg fra enslige kvinner og hold avkom separat til molekylær vurdering er fullført på grunn av potensiell tilstedeværelse av to alternative kassettretninger. Screen G2-avkom for tilstedeværelsen av fluorescerende markør og sett til side en undergruppe av G2 positive individer for molekylær analyse. Bak resten til voksen alder.Utfør molekylær validering av innsettingsstedene med PCR som beskrevet i tekstmanuskriptet. For enkel integrasjon, sørg for at det predikerte innsettingsstedet bærer den opprinnelige forankringskonstruksjonen, pluss hele sekvensen av donorplasmid mellom de to hybridstedene attL og attR. For kassettbytte må du kontrollere at det predikerte innsettingsstedet er identisk med det for forankringslinjen der hybridinverterte attL-områder erstatter de opprinnelige inverterte attP-områdene, og at utvekslingsmalen erstatter kassetten som opprinnelig var til stede mellom dem.Protokollen ble brukt til å generere en stabil Anopheles transgen linje i ca 10 uker. Fenotypisk validering av transformasjon ble utført ved screening for fluorescerende markører regulert av 3xP3-promotoren er vist her. En ny Anopheles stephensi-linje ble oppnådd ved å sette inn en DS rødmerket kassett i en dokkinglinje merket med CFP, noe som resulterte i at G1-avkom uttrykte begge markørene som angitt av den røde og blå fluorescensen i øynene.Kassettutvekslingsdesign resulterer i utskifting av markøren som opprinnelig ble satt inn i dokkinglinjen med donorplasmiden. Denne markørutvekslingen ble demonstrert i en Anopheles gambisk dokkinglinje der CFP-markøren gikk tapt og YFP-markøren ble anskaffet, noe som resulterte i gul øye- og nerveledningfluorescens. Av og til kan RMCE resultere i en enkelt integrasjonshendelse i stedet for utveksling av ønsket transgen kassett der en larve er merket med både den opprinnelige CFP og de nye YFP-markørene.Ved screening for tilstedeværelse av en fluorescerende markør er det avgjørende å skille signalet fra mulig bakgrunnsfluorescens. Å øke forstørrelsen og fokusere på vev og organer der fluorescens forventes å bli drevet av promotoren, er nødvendig for å identifisere sanne CFP-positive individer. Individuelle transformanter ble også vurdert molekylært via PCR for å bekrefte det forventede innsettingsstedet.PCR-validering hos enkeltpersoner fra en utveksling Anopheles gambiae linje vises her. Selv passende mikroinjeksjonsteknikk, nøyaktig design og forberedelse av donor og hjelperplasmider, samt å følge riktig myggholdningsordning er nøkkelen for å skaffe transgene individer. Denne prosedyren kan brukes til å sette inn elementer som forårsaker genovertrykk eller silencing, for eksempel GAL4 / UAS-systemet, samt gendrivelementer og antipatogenmolekyler for mygggenetiske kontroller.

Research

JoVE Journal

Genetics

Site-Directed &#966;C31-Mediated Integration and Cassette Exchange in Anopheles Vectors of Malaria

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

siRNA Transfeksjon og EMSA Analyser på nylig isolerte humane villøse Cytotrophoblasts

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Parallell Måling av biologiske klokke genekspresjon og hormon i Human primære cellekulturer

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenese Bruke Histone-miniSOG i<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Oppdrett og Double-stranded RNA-mediert Gene knockdown i Hide Beetle,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

Toveis retroviral integrasjonssted PCR-metodikk og kvantitativ dataanalyse arbeidsflyt

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions

Retroviral skanning: Mapping MLV Integrering Sites for å definere Cell-spesifikke Regulatory Regioner

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediert målrettet integrering i Vivo med en homologi-mediert slutten begynte-basert strategi

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

En protokoll for produksjon av Integrase dårlig Lentiviral vektorer for CRISPR/Cas9-mediert Gene Knockout i dele celler

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene redigering gjør betinget mutanter av menneskelig malariaparasitten P. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Karakterisere Histone post-translasjonell modifikasjon endringer i gjær nevrodegenerative Proteinopathy modeller

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...