Мы благодарны Кионе Паркер (UCI) за предоставление изображений трансгенных личинок An. stephensi , а также Фрейзеру Колману (LSTM) и Бет Полтон (LSTM) за предоставление трансгенных личинок An. gambiae . Бет Полтон (LSTM) также оказала ценную помощь во время визуализации личинок An. gambiae . Эта работа финансировалась Институтом генетики и общества Тата (TIGS) и Фондом катализаторов LSTM, присужденным A.A. (DCF2014AA). A.A.J. является профессором Дональда Брена в Калифорнийском университете в Ирвине.

Авторам нечего раскрывать.

Точный дизайн плазмид с метками attB, совместимых с линией стыковки, имеет первостепенное значение для успеха эксперимента. Необходимо тщательно рассмотреть выбор маркера, используемого для экранирования трансформантов, включая цвет флуоресценции и его рисунок выражения, который будет зависеть от рисунка, уже присутствующего в стыковочной линии. Необходимо использовать флуоресцентные маркеры, которые легко различимы: хорошие комбинации маркеров включают RFP (красный) / CFP (голубой), RFP (красный) / GFP (зеленый), RFP (красный) / YFP (желтый) и YFP (желтый) / CFP (голубой), в то время как комбинации, которых следует избегать, - это YFP (желтый) / GFP (зеленый) и CFP (голубой) / GFP (зеленый). Промотор 3xP39, специфичный для глаз и нервного канатика, наиболее часто используется для управления экспрессией флуоресцентных маркеров для трансгенеза комаров. Действительно, все доступные в настоящее время стыковочные линии Anopheles используют этот промоутер. Альтернативными регуляторными областями являются ген полиубиквитина An. gambiae (PUBc)5 или вирусный промотор IE120, которые стимулируют экспрессию в нескольких тканях. При использовании вместе с 3xP3 эти промоторы расширят возможные цветовые комбинации и даже использование одного и того же флуорофора. Указанные промоторы активны на протяжении всего жизненного цикла комара, что позволяет проводить скрининг и мониторинг флуоресценции на всех этапах жизни. Дополнительным соображением при проектировании плазмид является размер груза, который должен быть интегрирован или обменен. Хотя система φC31 обладает замечательной несущей способностью18, следует учитывать, что размер донорской плазмиды обычно отрицательно коррелирует с эффективностью трансформации22.
В описанном протоколе источником интегразы является плазмида-помощник, экспрессирующая фермент повсеместно40. Повсеместное присутствие интегразы может привести к трансформации соматических клеток, если микроинъекции не направлены точно в область, где образуется зародышевая линия. Хотя такие трансформационные события будут потеряны, поскольку они не наследуются, соматические эффекты могут снизить пригодность инъекционных людей. Чтобы избежать этого и повысить эффективность трансформации, экспрессия интегразы может быть ограничена зародышевой линией, например, с помощью промотора ваза22,26. Другие протоколы описывают использование in vitro транскрибированной матричной РНК (мРНК) в качестве источника интегразы φC311111111. Однако это связано с трудоемким приготовлением мРНК и требует осторожного обращения с инъекционной смесью и использования реагентов, свободных от РНКазы, чтобы избежать деградации. Плазмидные источники интегразы были продемонстрированы как в An. gambiae9,21,22,26,33,37, так и в An. stephensi (A.A. personal communication) как надежные и ведущие к эффективной трансформации, и, таким образом, являются нашим предпочтительным вариантом. Еще одним вариантом доставки интегразы является ее производство in vivo в самостыковывающихся вспомогательных линиях. Такие линии были созданы в An. gambiae, которые экспрессируют интегразу φC31 под регуляцией специфического для зародышевой линии промоторных нано и, как было установлено, приводят к улучшению выживаемости и эффективности трансформации20. Однако необходимо учитывать потенциальные нагрузки на приспособленность, налагаемые выработкой in vivo фермента интегразы на хелперную линию.
Как и в случае с другими трансгенными методами, особое внимание должно быть уделено выращиванию и скрещиванию лиц, полученных из инъекционных эмбрионов, чтобы максимизировать шансы на восстановление трансформантов. Лица, которые стабильно унаследовали трансген, могут быть сначала восстановлены в потомстве G1. Однако ранние признаки потенциальной трансформации могут быть оценены по наличию преходящей эписомальной экспрессии флуоресцентного маркера в анальных сосочках и/или нервном канатике G0 первой и второй звезды при использовании промотора 3xP343. Хотя наличие переходной флуоресценции предполагает успешную доставку плазмид, это не гарантирует наследственную трансформацию зародышевой линии. Точно так же отсутствие переходного выражения не исключает успешного преобразования. Тем не менее, было замечено, что транзиторно положительные индивидуумы с большей вероятностью дают трансгенное потомство по сравнению с транзиторно отрицательными43,48. В руках экспертов выращивание и скрещивание только положительных особей может быть вариантом сокращения численности комаров. Однако, учитывая важность и хрупкость мелких личинок G0, наименьшее количество манипуляций все же целесообразно, и всегда рекомендуется выращивание всех особей G0.
Схема спаривания, описанная в этом протоколе, предназначена для максимизации вероятности спаривания и изоляции независимых событий трансформации. Однако, если наличие инсектарного пространства или персонала является проблемой, взрослые особи G0 могут быть объединены по полу в одиночные клетки, если предусмотрено достаточное количество разнополых особей. Такая установка не позволит различать множественные события трансформации, происходящие у людей из одной клетки. В зависимости от экспериментальной установки во время процесса скрининга ожидается наличие двойного (одинарная интеграция) или одинарного (RMCE) маркера. В экспериментах по одиночной интеграции важно проверить наличие исходного маркера из стыковочной линии, в то время как в RMCE важно проверить потерю ранее интегрированного маркера. Действительно, в конструкциях RMCE нередко восстанавливается трансформаторы, в которых единичная интеграция вместо обмена произошла из-за рекомбинации одного сайта attP9,33. У таких людей присутствуют как флуоресцентные маркеры, так и вся донорская плазмидная основа, что подчеркивает важность проведения тщательного скрининга на оба флуоресцентных маркера.
Хотя наличие ожидаемых флуоресцентных паттернов указывает на успешное преобразование, необходимо провести молекулярную характеристику места вставки. Для этого подготовка точных карт прогнозируемого локуса вставки, включая фланговые геномные области стыковочной линии, имеет решающее значение для разработки адекватных диагностических олигонуклеотидных праймеров для анализа амплификации генов. Одиночные события интеграции приводят к образованию гибридных сайтов attR и attL на стыке между вновь интегрированной ДНК и ранее вставленной кассетой. Эти сайты могут быть предназначены для проверки сайта вставки. В конструкциях RMCE вставка донорской кассеты может происходить в двух альтернативных ориентациях по отношению к геномному локусу, таким образом, четыре праймера могут быть использованы в альтернативных комбинациях ПЦР для определения того, какую ориентацию несет линия. Поскольку ориентация вставки кассеты может влиять на экспрессию трансгенов, в сравнительном анализе экспрессии генов важно использовать линии, несущие одинаковую ориентацию вставки.
При работе с низким количеством трансформантов может быть нежелательно жертвовать целыми особями для молекулярного анализа. Вариантом этого является проведение молекулярного анализа ДНК, извлеченной из ног одного взрослого человека46, поскольку потеря ног не влияет на способность взрослой женщины спариваться и яйцекладу49. Тем не менее, существует риск повреждения человека в процессе удаления ноги. Успех был достигнут с использованием выброшенных случаев куколки (личное общение Л. Григораки), однако самым безопасным подходом является проведение молекулярного анализа родителей G2 после получения жизнеспособного потомства G3.
В последние годы CRISPR/Cas9 произвел революцию в способе выполнения редактирования генома для конкретного сайта26,41,50,51. В отличие от RMCE, направленных на сайт, CRISPR/Cas9-опосредованные интеграции генов (knock-ins) не зависят от наличия предварительно вставленных сайтов рекомбинации, при этом требуется только одноэтапное событие трансформации. Тем не менее, система CRISPR/Cas9 опирается на наличие больших известных геномных последовательностей, фланкирующих желаемый сайт вставки, для успешного гомологического направленного восстановления, а также на эффективное распознавание сайта, опосредованное направляющими РНК. Эти условия не всегда могут быть выполнены или могут быть трудоемкими для устранения неполадок, и, учитывая наличие нескольких стыковочных линий в An. gambiae и An. stephensi и линий, полученных из них, система φC31 остается очень ценным инструментом для выполнения прямых фенотипических сравнений между трансгенами в одних и тех же геномных местоположениях.

Способность надежно и воспроизводимо модифицировать геном комаров-переносчиков болезней укрепила функциональную валидацию генов in vivo и открыла двери для реализуемых стратегий борьбы с генетическими переносчиками, таких как стратегии борьбы с комарами Anopheles, передающими малярию1.
Раннее редактирование генома комара основывалось исключительно на транспонируемой трансформации, опосредованной элементами (TE), причем piggyBac является наиболее часто используемым транспозоном в Anopheles2,3,4. Однако случайный характер интеграции ТЭ может привести к нежелательным модификациям, таким как нокауты генов (вставочный мутагенез) и значительное влияние позиции на экспрессию трансгенов5,6,7,8. Множественные вставки также являются распространенным явлением при использовании piggyBac5,9, что делает валидацию и изоляцию трансгенных линий с одиночными вставками трудоемкими. Другие недостатки включают их потенциальную ремобилизацию, наблюдаемую в зародышевой линии Anopheles stephensi при обеспечении источника транспозазы piggyBac10,11,12, и их ограниченный размер груза ДНК (10-15 кб в длину) с уменьшением эффективности трансформации с увеличением размера донорской плазмиды13,14.
Для обхода этих проблем были внедрены подходы к интеграции, ориентированные на сайты. Наиболее распространенной сайт-направленной модификацией генома у комаров является модификация, опосредованная системой φC31 (рисунок 1a). Это обусловлено вирусной интегразой, которая катализирует рекомбинацию между двумя гетероспецифическими участками присоединения (att), встречающимися естественным образом в геноме бактериофага φC31 (attP) и в хозяине бактерии Streptomyces (attB)15. Рекомбинация двух участков является однонаправленной и приводит к образованию гибридных сайтов (attL и attR). Рекомбинация таких гибридных участков (приводящая к иссечению ДНК) потребует не только наличия активной вирусной интегразы, но и другого фагового фактора рекомбинации16,17. Таким образом, создается стабильный сайт интеграции, который снимает проблему потенциальной нежелательной ремобилизации15. Кроме того, система позволяет интегрировать крупногабаритные грузы (например, в D. melanogaster18 сообщалось об интеграции конструкций >100 кб), что значительно увеличивает грузоподъемность. Интеграция происходит в одном предопределенном геномном локусе, что значительно упрощает валидацию вставки и схемы спаривания для получения стабильной трансгенной линии. Наконец, сайт-ориентированный характер интеграции позволяет нормализовать экспрессию, поскольку альтернативные трансгены расположены в одном локусе и, следовательно, регулируются в одном и том же соседнем геномном контексте. Действительно, одним из основных применений метода является прямое сравнение фенотипов, присвоенных различными трансгенами после введения в идентичный локус.
Достижение φC31-опосредованной интеграции включает в себя две фазы: фаза I - создание трансгенных стыковочных линий, несущих attP-сайт(ы), а фаза II - это направленная на сайт интеграция attB-флангового груза в геном стыковочной линии19. Создание стыковочных линий фазы I основывалось на TE-опосредованной случайной интеграции конструкций, помеченных attP, и, таким образом, включало начальный трудоемкий процесс (включая анализ южного пятна и обратный ПЦР на потомстве одной самки) для выделения и проверки трансгенных линий, несущих одно событие интеграции в уникальных, транскрипционно активных и нейтральных к фитнесу геномных местах. Тем не менее, несколько стыковочных линий для φC31-опосредованной одиночной интеграции были разработаны и проверены в An. gambiae19,20,21,22 и в An. stephensi23,24,25 (таблица 1). Каждая из этих линий варьируется с точки зрения геномного местоположения места стыковки и генетического фона, специфичного для штамма, и из них может быть создано большое разнообразие новых трансгенных линий. Сложная валидация ИНТЕГРАЦИЙ, опосредованных TE, для создания стыковочных линий теперь может быть обойдена технологией CRISPR/Cas926; однако это опирается на априорное знание нейтральных локусов, которые должны быть нацелены, и окружающих их последовательностей.
φC31-опосредованная интеграция широко применяется для редактирования генома насекомых от модельного организма D. melanogaster27, до комаров Aedes aegypti13,28, Ae. albopictus29, An. gambiae19 и An. stephensi24, а также других насекомых, включая Ceratitis capitata30 и Bombyx mori31.
Ограничением φC31-опосредованной интеграции, особенно с учетом потенциальных полевых высвобождений для борьбы с переносчиками, является интеграция в геном комара всей донорской плазмиды, несущей attB, включая нежелательные последовательности, такие как маркеры генов устойчивости к антибиотикам и компоненты позвоночника плазмиды бактериального происхождения. Для решения этой проблемы была реализована модификация стандартной системы, рекомбиназно-опосредованный кассетный обмен (RMCE), которая позволяет точно заменить ранее интегрированную трансгенную кассету новой донорской ДНК (рисунок 1b). Это достигается путем использования двух перевернутых атт-сайтов , фланкирующих донорские и реципиентные кассеты на каждом конце, что приводит к одновременному проведению двух независимых событий рекомбинации, что приводит к кассетному обмену без интеграции плазмидной магистрали. Эта улучшенная конструкция обходит интеграцию нежелательных последовательностей и расширяет применение систем φC31 , включая, например, интеграцию немаркированных грузов ДНК путем скрининга на потерю ранее интегрированного флуоресцентного маркера32.
RMCE был достигнут сначала с D. melanogaster32, а затем успешно применен к немодельным насекомым, включая An. gambiae9,26,33, Ae. aegypti34, Plutella xylostella34 и B. mori35. Несколько стыковочных линий для RMCE были разработаны и проверены в An. gambiae5,9,26 (таблица 1). Насколько нам известно, RMCE еще предстоит исследовать на других видах переносчиков Anopheles.
На сегодняшний день система φC31 широко используется у комаров Anopheles для введения и изучения различных молекул, включая противомалярийные эффекторы19,24,36, компоненты системы GAL4/UAS для сверхэкспрессии и нокдауна генов для исследований устойчивости к инсектицидам9,33, регуляторные элементы, гены-репортеры5,21,37 и элементы генного драйва26 ,38.
Этот протокол описывает, как выполнить 1) направленную на сайт интеграцию attB-флангового груза и 2) RMCE конструкции, окруженной перевернутыми участками attB , в геном стыковочных линий Anopheles . Это достигается с помощью двух плазмид: донорской плазмиды с меткой attB, несущей интересующий трансген, и вспомогательной плазмиды, экспрессирующей интегразу φC31 . Основные переносчики малярии An. gambiae и An. stephensi используются в качестве конкретных примеров, однако эти протоколы применимы к другим видам Anopheles .
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig01.jpg"> Рисунок 1. Site-направленные модификации генома, единичная интеграция и рекомбиназно-опосредованный кассетный обмен (RMCE) с использованием системы φC31. Интеграза φC31 (INT, серая двойная стрелка) катализирует рекомбинацию между сайтом (сайтами) attB (фиолетовым полосатым), присутствующим в донорской плазмиде, и сайтом (сайтами) attP (синими полосатыми), присутствующими в приемной стыковочной линии, что приводит к образованию гибридных сайтов attL и attR. A) Интеграция достигается, когда одиночные участки attB и attP рекомбинируют и приводят к наличию двух интегрированных маркеров (синего и красного). B) RMCE возникает, когда два сайта attB/P рекомбинируют одновременно и приводит к замене кассеты между att-участками стыковочной линии (синий маркер) на сайт, переносимый плазмидой донора (красный маркер). C) Частичные нуклеотидные последовательности attP (синий) и attB (фиолетовый) и гибридные сайты attL/R. Рекомбинация происходит между последовательностями ядра «TT», выделенными жирным черным шрифтом. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL eppendorf tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well microslides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MARI1216690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree&#160;Plasmid&#160;Maxi&#160;Kit (10)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Absolute, Molecular Biology Grade</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter set CFP for Leica MZ FLIII Excitation 436/20 nm, extinction 480/40 nm</td>
			<td>Leica</td>
			<td>10446363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter set dsRED for Leica MZ FLIII Excitation 545/30 nm, extinction 620/60 nm</td>
			<td>Leica</td>
			<td>10447079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter set YFP customised for Leica MZ FLIII</td>
			<td>Omega Optical</td>
			<td>500QM25, 500QM35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 27</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 700</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium&#160;chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium&#160;Acetate&#160;Solution (3 M),&#160;pH&#160;5.2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Life Technologies)</td>
			<td>R1181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stable brush Size 0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

site-directed &#966;c31-mediated integration and cassette exchange in anopheles vectors of malaria

Функциональный геномный анализ и связанные с ним стратегии генетического контроля малярии основаны на проверенных и воспроизводимых методах для точной модификации генома комаров Anopheles. Среди этих методов система φC31 обеспечивает точную и стабильную интеграцию трансгенов, направленную на сайт, или замену интегрированных трансгенных кассет с помощью опосредованного рекомбиназой кассетного обмена (RMCE). Этот метод опирается на действие бактериофагов Streptomyces φC31 integrase для катализа рекомбинации между двумя специфическими сайтами присоединения, обозначенными attP (полученным из фага) и attB (полученным из бактерии-хозяина). Система использует один или два участка attP, которые были ранее интегрированы в геном комара, и сайт (сайты) attB в ДНК донорского шаблона. Здесь мы иллюстрируем, как стабильно модифицировать геном attP-несущих линий стыковки Anopheles с использованием двух плазмид: донора с меткой attB, несущего шаблон интеграции или обмена, и вспомогательной плазмиды, кодирующей интегразу φC31. Мы сообщаем о двух репрезентативных результатах модификации, направленной на сайт φC31: единая интеграция трансгенной кассеты у комаров An. stephensi и RMCE у комаров An. gambiae. φC31-опосредованная манипуляция геномом предлагает преимущество воспроизводимой экспрессии трансгенов из проверенных, нейтральных к приспособленности геномных сайтов, что позволяет проводить сравнительный качественный и количественный анализ фенотипов. Ориентированный на участок характер интеграции также существенно упрощает валидацию единого места вставки и схемы сопряжения для получения стабильной трансгенной линии. Эти и другие характеристики делают систему φC31 важным компонентом генетического инструментария для трансгенного манипулирования малярийными комарами и другими насекомыми-переносчиками.

Протокол, проиллюстрированный здесь, позволяет генерировать стабильную трансгенную линию Anopheles за ~ 10 недель (при условии 21-дневного жизненного цикла комара).
Ожидается, что показатели вылупления личинок после инъекции у An. gambiae будут в целом ниже, чем у An. stephensi, однако сообщалось о показателях вылупления между 10-50%, 9,20,24,26,33,43,47. При соответствующей технике впрыска скорость вылупления ≥20%, как правило, достаточна для получения трансформаторов. Поглощение ДНК эмбрионами может быть оценено путем скрининга молодых личинок на преходящую экспрессию флуоресцентного маркера. В успешных экспериментах RMCE в An. gambiae с использованием промотора 3xP3 до 50% выживших личинок G0 показали эписомальную экспрессию маркера в анальных сосочках48.
Обобщенные оценки эффективности трансформации трудно оценить среди лабораторий и даже среди экспериментов, поскольку трансформация зависит от сложного взаимодействия переменных, включая чистоту, концентрацию, размер и потенциальную токсичность вводимой ДНК, качество яйцеклеток, обработку яиц до и после инъекции, выращивание комаров и, самое главное, опыт оператора. Коэффициенты трансформации до 7% были получены для RMCE в An. gambiae (рассчитывается как количество независимых трансформационных событий в общем количестве G0 индивидов)9,26,33, и до 2,2% коэффициент трансформации для интеграции в An. stephensi. Мы предлагаем ввести не менее 500 эмбрионов, что должно привести к вылуплению не менее 100 личинок G0 и к 2-7 взрослым основателям G0, из которых можно получить стабильно трансформированное потомство. При скрининге на преходящую экспрессию у личинок G0 можно ожидать до 40 положительных личинок.
Примеры фенотипической валидации трансформации посредством скрининга флуоресцентных маркеров, регулируемых промотором 3xP3, приведены на рисунке 4 и  рисунке 5. На рисунке 4 показана новая линия An. stephensi, полученная путем вставки кассеты с маркировкой DsRed в стыковочную линию, помеченную CFP (80.9, таблица 1), в результате чего потомство G1 выражает оба маркера, о чем свидетельствует красная и синяя флуоресценция, обнаруженная в глазах.
Вместо этого ожидается, что конструкции RMCE приведут к замене маркера, первоначально вставленного в линию стыковки, на маркер донорской плазмиды. Рисунок 5A и  рисунок B иллюстрируют этот обмен маркерами в стыковочной линии An. gambiae, обозначенной CFP (A11, таблица 1), где после успешного RMCE маркер CFP теряется и приобретается маркер YFP, что приводит к флуоресценции желтого (но не синего) глаз и нервного канатика33. Иногда RMCE может привести к одному событию интеграции вместо обмена желаемой трансгенной кассетой, как показано на рисунке 5C, где показана личинка, помеченная как исходным CFP, так и новыми маркерами YFP. Сообщается, что до 50% от общего числа событий трансформации составляют единичные интеграции9,33.
При скрининге на наличие флуоресцентного маркера крайне важно отличить его сигнал от возможной фоновой автофлуоресценции. Это особенно важно при использовании CFP в качестве личинок Anopheles , демонстрирующих естественную синюю автофлуоресценцию (рисунок 6A). Увеличение и фокусировка на тканях и органах, где флуоресценция, как ожидается, будет управляться промотором, необходимы для идентификации истинных CFP-положительных людей, как показано на рисунке 6B с использованием маркера 3xP3-CFP.
Отдельные трансформанты, наконец, оцениваются молекулярно с помощью ПЦР для подтверждения ожидаемого места введения. На рисунке 7 показана валидация ПЦР у отдельных лиц из обменной линии An. gambiae , показывающей две потенциальные ориентации вставки в геном комара33.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig04.jpg"> Рисунок 4. Валидация одиночной интеграции φC31 в личинках An. stephensi (дорсальный вид). A) Стыковочная линия (80.9, таблица 1) выражает CFP в глазах в соответствии с регулированием промоутера 3xP3 . B) Успешная интеграция приводит к выражению недавно приобретенного DsRed, а также оригинального маркера CFP в глазах. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig04large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig05.jpg"> Рисунок 5. Валидация φC31 RMCE у личинок An. gambiae (вентральный вид). A) Стыковочная линия (A10, таблица 1) экспрессирует CFP в соответствии с регулированием промотора 3xP3 в глазах (e) и нервном канатике (nc)5. B) Успешный RMCE приводит к обмену флуоресцентного маркера с CFP на YFP33. C) Единичное событие интеграции произошло во время эксперимента RMCE, когда личинка трансформанта экспрессирует маркеры CFP и YFP. Эта личинка несет компоненты GAL4 / UAS, которые вызывают широкую экспрессию YFP, особенно сильную в мышцах живота (am). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig05large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig06.jpg"> Рисунок 6. Автофлуоресценция CFP у личинок An. gambiae (дорсальный вид). A) Параллельное изображение положительной (CFP+) и отрицательной (CFP-) личинки L4 с использованием фильтра CFP. Б) Крупное изображение личиночных глаз, которое показывает CFP+ против CFP- индивидуума. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig06large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig07.jpg"> Рисунок 7. Молекулярная валидация ориентации вставки кассеты в репрезентативном трансгенном An. gambiae , созданная φC31 RMCE. Трансгенная кассета может быть вставлена в одну из двух альтернативных ориентаций (A или B) по отношению к месту вставки. Каждая реакция ПЦР (I - IV) использует комбинацию праймеров (5-8)33 , предназначенных для получения фрагмента диагностической амплификации для каждой ориентации, как указано в схематических плазмидных картах. Т1: репрезентативная трансгенная индивидуальная несущая ориентация вставки А; Т2: репрезентативная трансгенная индивидуальная несущая ориентация вставки В; WT: дикий тип; DL: стыковочная линия; -: реакция отрицательного контроля, где вода использовалась в качестве шаблона. Эта цифра была изменена с Adolfi et al. (2019)33. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig07large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Вид</td>
			<td>Напряжение</td>
			<td>Имя</td>
			<td>аттП(ы)</td>
			<td>Хромо-некоторые</td>
			<td>Промоутер-маркер</td>
			<td>Учреждение происхождения</td>
			<td>Ссылка</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ан. Стивенси</td>
			<td>Индиана
</td>
			<td>26.10б
</td>
			<td>Единственный</td>
			<td>2Р</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>Калифорнийский университет в Ирвине</td>
			<td>25</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ан. Стивенси</td>
			<td>Индиана
</td>
			<td>44Сб
</td>
			<td>Единственный</td>
			<td>X</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>Калифорнийский университет в Ирвине</td>
			<td>23, 24</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ан. Стивенси</td>
			<td>Индиана
</td>
			<td>80.9б
</td>
			<td>Единственный</td>
			<td>2л</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>Калифорнийский университет в Ирвине</td>
			<td>Это исследование</td>
		</tr>
<tr>
<td>An. gambiae</td>
			<td>Г3</td>
			<td>113</td>
			<td>Единственный</td>
			<td>2Р</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>Калифорнийский университет в Ирвине</td>
			<td>Это исследование</td>
		</tr>
<tr>
<td>An. gambiae</td>
			<td>КИЛЬ</td>
			<td>Эк
</td>
			<td>Единственный</td>
			<td>3Р</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>Килский университет.</td>
			<td>19, 43</td>
		</tr>
<tr>
<td>An. gambiae</td>
			<td>Г3</td>
			<td>Х1</td>
			<td>Единственный</td>
			<td>2л</td>
			<td>Нет маркера</td>
			<td>Страсбургский университет</td>
			<td>22</td>
		</tr>
<tr>
<td>An. gambiae</td>
			<td>Г3</td>
			<td>ЙаттП</td>
			<td>Единственный</td>
			<td>Y</td>
			<td>3xP3-RFP</td>
			<td>Имперский колледж Лондона</td>
			<td>21</td>
		</tr>
<tr>
<td>An. gambiae</td>
			<td>Г3</td>
			<td>А10б
</td>
			<td>Двойной</td>
			<td>2Р</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>Ливерпульская школа Троп. Мед.</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>An. gambiae</td>
			<td>Г3</td>
			<td>А11б
</td>
			<td>Двойной</td>
			<td>2Р</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>Ливерпульская школа Троп. Мед.</td>
			<td>9</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="8">a. Штамм из Университета Джона Хопкинса (подарок М. Джейкобса-Лорены) и в культуре Калифорнийского университета в Ирвине в течение >20 лет.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="8">b. Эти строки доступны от авторов по разумному запросу.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="8">c. Эта линия доступна в репозитории BEI www.beiresources.org как MRA-1163.</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 1. Стыковочные линии Anopheles attP .

Watch this Scientific Journal Video about Site-Directed Ãâ€ C31-Mediated Integration and Cassette Exchange in Anopheles Vectors of Malaria at JoVE.com

Site-Directed ÃƒÂÃ¢â‚¬Â C31-Mediated Integration and Cassette Exchange in Anopheles Vectors of Malaria

Протокол описывает, как достичь направленных на сайт модификаций в геноме малярийных комаров Anopheles с использованием системы φC31 . Описанные модификации включают как интеграцию, так и обмен трансгенными кассетами в геноме attP-несущих стыковочных линий.

Ориентированная на сайт φC31-опосредованная интеграция и кассетный обмен в переносчиках малярии Anopheles

Functional genomic analysis and related strategies for genetic control of malaria rely on validated and reproducible methods to accurately modify the ...

Этот протокол поддерживает характеристику роли генов комаров, участвующих в различных физиологических путях, включая, например, устойчивость насекомых и развитие малярийных паразитов. Метод управляет вставкой трансгенов в отдельные предварительно охарактеризованные геномные местоположения и, следовательно, позволяет напрямую сравнивать фенотипы, полученные из альтернативных трансгенов, эффективно избегая проблемы позиционного эффекта. Этот метод может быть применен к различным видам насекомых, имеющим значение для общественного здравоохранения и сельского хозяйства, и его применение широко распространяется от бактерий до клеток млекопитающих.Начните с проектирования донорских плазмид attB, несущих доминирующий флуоресцентный маркер, участки рекомбинации attB и желаемый трансгенный груз. Используйте один сайт attB для интеграции всей плазмиды, несущей трансгенную кассету, или двух перевернутых сайтов attB для кассетного обмена. Очистите донорские и вспомогательные плазмиды с помощью набора для очистки без эндотоксинов.Объедините помеченную attB донорскую плазмиду, несущую интересующий трансген, и вспомогательную плазмиду, несущую интегразу, чтобы получить смесь с конечной концентрацией 350 нанограмм на микролитр донорской плазмиды и 150 нанограммов на микролитр плазмиды-помощника. Осаждение ДНК путем добавления 0,1 объема трех молярных ацетатов натрия и 2,5 объемов ледяного холодного 100% этанола, затем вихрь. Белый осадок должен быть сразу виден.Вымойте гранулу и повторно суспендируйте ее в буфере для инъекций, чтобы достичь общей конечной концентрации 500 нанограмм на микролитр. Затем подготовьте аликвоты по 10-15 микролитров в каждой и храните их при отрицательных 20 градусах Цельсия. Кровь питает четырех-семидневных комаров из нужной стыковочной линии и их собратьев дикого типа за 72 часа до микроинъекции.Выполняйте микроинъекции эмбриона Anopheles gambiae в 25 миллимоляров хлорида натрия, нацеливаясь на задний полюс эмбриона под углом 45 градусов. Выполняйте микроинъекции эмбриона Anopheles stephensi в галогенуглеродном масле, нацеливаясь на задний полюс под углом 30 градусов. Сразу после инъекции переложите яйца в чашку Петри, наполненную стерильной дистиллированной водой, и верните их в инсектарные условия.После вылупления ежедневно перекладывайте личинку G0 в лоток с подсоленной дистиллированной водой и задним ходом к куколкам. Сортируйте куколок G0 по полу под стереоскопом. Позвольте самцам появиться в отдельных клетках в группах от трех до пяти человек и добавьте десятикратное превышение по возрасту самок дикого типа.Позвольте самкам появиться в отдельных клетках в группах от 10 до 15 человек и добавьте равное количество самцов дикого типа. Позвольте взрослым спариваться в течение четырех-пяти дней и обеспечьте самок кровяной пищей. Собирайте яйца и выращивайте G1 следующего поколения.Соберите личинки G1, L3 и L4 в чашке Петри, выстланной влажной фильтровальной бумагой, или на слайде микроскопа и просейте их с помощью флуоресцентного стереоскопа на наличие маркера, введенного с грузом с меткой attB. Для конструкций с одним attB экран для наличия нового и уже существующего маркера. Для двойных attB конструкций для кассетного обмена, экрана для наличия нового маркера и потери ранее существовавшего.Сортируйте преобразованных куколок G1 по полу и массово скрещивайте их с разнополыми по возрасту особями дикого типа. Позвольте взрослым спариваться в течение четырех-пяти дней и обеспечьте кровяную пищу. Для одиночных интеграционных экспериментов собирайте яйца непосредственно из массового креста.Для экспериментов по кассетному обмену собирайте яйца у одиночных самок и поддерживайте потомство отдельно до тех пор, пока молекулярная оценка не будет завершена из-за потенциального присутствия двух альтернативных ориентаций кассет. Скрининг потомства G2 на наличие флуоресцентного маркера и выделение подмножества G2-положительных людей для молекулярного анализа. Доведите остальных до зрелого возраста.Выполнить молекулярную валидацию сайтов введения с помощью ПЦР, как описано в текстовой рукописи. Для одиночной интеграции убедитесь, что прогнозируемый сайт вставки несет исходную конструкцию стыковки, а также всю последовательность донорской плазмиды между двумя гибридными сайтами attL и attR. Для обмена кассетами убедитесь, что прогнозируемый сайт вставки идентичен сайту стыковочной линии, где гибридные инвертированные сайты attL заменяют исходные инвертированные сайты ATTP, а шаблон обмена заменяет кассету, первоначально присутствующую между ними.Протокол использовался для генерации стабильной трансгенной линии Anopheles примерно через 10 недель. Фенотипическая валидация трансформации проводилась путем скрининга на флуоресцентные маркеры, регулируемые промотором 3xP3, показаны здесь. Новая линия Anopheles stephensi была получена путем вставки кассеты с красной маркировкой DS в стыковочную линию, помеченную CFP, в результате чего потомство G1 выражало оба маркера, о чем свидетельствует красная и синяя флуоресценция в глазах.Кассетные обменные конструкции приводят к замене маркера, первоначально вставленного в стыковочную линию, маркером донорской плазмиды. Этот обмен маркерами был продемонстрирован в стыковочной линии Anopheles gambiae, где маркер CFP был потерян, а маркер YFP приобрел, что привело к флуоресценции желтого глаза и нервного канатика. Иногда RMCE может привести к одному событию интеграции вместо обмена желаемой трансгенной кассетой, где личинка помечена как исходным CFP, так и новыми маркерами YFP.При скрининге на наличие флуоресцентного маркера крайне важно отличить его сигнал от возможной фоновой автофлуоресценции. Увеличение увеличения и сосредоточение внимания на тканях и органах, где флуоресценция, как ожидается, будет управляться промотором, необходимы для выявления истинных CFP-положительных людей. Отдельные трансформанты также оценивались молекулярно с помощью ПЦР для подтверждения ожидаемого места введения.Валидация ПЦР у лиц из обменной линии Anopheles gambiae показана здесь. Даже соответствующая техника микроинъекций, точный дизайн и подготовка донорских и вспомогательных плазмид, а также следование соответствующей схеме разведения комаров являются ключевыми для получения трансгенных особей. Эта процедура может быть использована для вставки элементов, вызывающих чрезмерную экспрессию генов или заглушение, например, системы GAL4 / UAS, а также элементов генного драйва и молекул антипатогенов для генетического контроля комаров.

Research

JoVE Journal

Genetics

Site-Directed &#966;C31-Mediated Integration and Cassette Exchange in Anopheles Vectors of Malaria

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

миРНК Трансфекция и EMSA Анализы на свежеизолированных ворсинок Cytotrophoblasts человека

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Параллельное измерение циркадных часов экспрессии генов и гормональную секрецией человека первичных клеточных культур

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Оптогенетика Случайные мутагенеза Использование гистона-miniSOG в<em&gt; C. Элеганс</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Разведению и двухцепочечную РНК-опосредованный нокдаун гена в Скрыть Beetle,<em&gt; Кожеед пятнистый</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

Двунаправленная ретровирусная интеграция сайта Методология ПЦР и количественный анализ данных

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions

Ретровирусное сканирование: определение сайтов интеграции MLV для определения регуляторных областей, специфичных для клеток

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

ТРИФОСФАТЫ/Cas9-опосредованной целенаправленной интеграции в естественных условиях с помощью стратегию на основе присоединения гомологии опосредованной конец

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

Протокол для производства интеграза недостаточным лентивирусные векторы для ТРИФОСФАТЫ/Cas9-опосредованной нокаут генов в делящихся клетках

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

ТРИФОСФАТЫ/Cas9 гена редактирования чтобы сделать условное мутантов из человека малярийного паразита P. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Характеризуя гистона столб-поступательные изменения изменения в моделях Neurodegenerative Proteinopathy дрожжей

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...