Vi är tacksamma mot Kiona Parker (UCI) för att ha tillhandahållit bilder av transgena An. stephensi larver, och till Fraser Colman (LSTM) och Beth Poulton (LSTM) för att tillhandahålla transgena An. gambiae larver. Beth Poulton (LSTM) gav också värdefull hjälp under avbildningen av An. gambiae larver. Detta arbete finansierades av Tata Institute for Genetics and Society (TIGS) och LSTM: s Director Catalyst Fund tilldelad A.A. (DCF2014AA). A.A.J. är en Donald Bren professor vid University of California, Irvine.

Obs: Ett schematiskt arbetsflöde för det illustrerade protokollet visas i bild 2.
1. Utformning av φC31 attB-märkta plasmider (figur 3)
<ol><li>Skapa attB donatorplasmider som bär följande väsentliga komponenter<ol>
<li>Dominerande fluorescerande markör<ol>
<li>Välj en promotor för att driva uttrycket av fluorescerande markör. OBS: För Anopheles transgenes är fluorescerande markörer vanligtvis under regleringen av 3xP3 promotorn39, som driver uttryck i ögonen och nervsladden. Alternativt kan PUBc promotorn5 användas när uttryck i flera vävnader önskas. Donatorplasmider och dockningslinjer som används som exempel i detta protokoll markeras med hjälp av 3xP3-promotorn .</li>
			<li>Välj ett fluorescerande protein (FP) som är kompatibelt med det mottagande dockningslinjen så att de lätt kan särskiljas. OBS: Använd inte samma markör som redan finns i dockningslinjen och undvik samtidig användning av GFP (grön)/YFP (gul) och GFP (grön)/CFP (cyan) eftersom de är mycket svåra att på ett tillförlitligt sätt skilja. Donatorplasmider som används som exempel i detta protokoll är märkta med antingen DsRed eller YFP eftersom de ska integreras i en dockningslinje märkt med CFP.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
attB rekombinationsställe/rekombinationsställe(er)<ol>
<li>Använd en enda attB-plats för integrering av en transgen kassett (design med en enda attB ) (figur 3A).</li>
			<li>Använd två inverterade attB-platser för RMCE (dubbel-attB-design ) där platserna låg inverterade i förhållande till varandra och omsluter donatorns DNA-mall (figur 3B). OBS: Orienteringen på attB-platserna måste vara kompatibel med orienteringen för de attP-platser som finns i dockningslinjen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Önskad transgene last<ol>
<li>Använd andra önskade funktioner för att integreras i mygggenomet baserat på experimentets specifika syfte. Här beskriver vi integrationen av en antimalarial effektormolekyl i genomet av An. stephensi och integrationen av komponenterna i GAL4/ UAS-systemet i An. gambiae myggor.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Plasmid stamnät komponenter<ol>
<li>Inkludera bland andra viktiga komponenter för plasmidreplikering i bakterier en markör för plasmidval in vitro (dvs. en antibiotikaresistensgen). OBS: Plasmidstommen kommer att integreras i mygggenomet i single-attB-designen för integration (figur 3A), medan den inte kommer att införas i dubbel-attB-designen för RMCE (figur 3B).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Beredning av plasmider för mikroinjektionsblandningen
OBS: Protokollet som illustreras här innebär användning av två plasmider: en attB-märkt donatorplasmid som bär transgenen av intresse och en hjälpare plasmid som uttrycker φC31 integrase under regleringen av Drosophila Hsp70 promotorn40.
<ol><li>Rena donator- och hjälpplasmider med hjälp av ett endotoxinfritt plasmidreningskit. OBS: Sekvensera det slutliga plasmidpreparatet som används för injektion för att kontrollera integriteten hos alla komponenter.</li>
	<li>Kombinera lämpliga mängder av de två plasmiderna för att få en blandning med en slutlig koncentration på 350 ng/μL donatorplasmiden och 150 ng/μL av hjälpplasmiden när den återanvänds i injektionsbuffert. OBS: Vid beräkning av den nödvändiga blandningen, tänk på att 10-15 μL är tillräckliga för varje dag av planerade injektioner och DNA kan beredas i förväg och lagras vid -20 °C. Integrase helper plasmid koncentrationer av 60-500 ng/μL och givaren plasmid koncentrationer av 85-200 ng/μL har också rapporterats21,22,26,41.</li>
	<li>Fäll ut DNA genom att tillsätta 0,1 volymer 3 M natriumacetat (pH 5.2) och 2,5 volymer iskall 100% EtOH och virvel. En vit fällning ska vara omedelbart synlig. Att ha högkoncentrerade initiala plasmidpreparat (dvs. ~1 μg/μL) förbättrar nederbördseffektiviteten. OBS: Stopppunkt - Fällningen kan förvaras vid -20 °C över natten.</li>
	<li>Centrifugera vid 15 000 x g i 20 min vid 4 °C, kassera supernatanten och tvätta pelleten med 1 ml iskall 70% EtOH.</li>
	<li>Tvätta pelleten med 1 ml iskall 70% EtOH och centrifugera vid 15 000 x g i 5 min vid rumstemperatur.</li>
	<li>Kassera supernatanten utan att störa pelleten och lufttorka.</li>
	<li>Återanvänd pelleten i 1x injektionsbuffert (0,1 mM Na3PO4, 5 mM KCl, pH 7,2, 0,22 μm filter steriliserat) för att uppnå en total slutlig koncentration på 500 ng/μL. OBS: Anta att en del DNA kommer att gå förlorat under nederbördsprocessen; Tillsätt därför en mindre injektionsbuffert först, kontrollera koncentrationen på en spektrofotometer (t.ex. Nanodrop) och tillsätt sedan en lämplig återstående volym för att nå 500 ng/μL.</li>
	<li>Se till att DNA:t är ordentligt omsuspenderat, förbered alikvoter på 10-15 μL vardera och förvara dem vid -20 °C.</li>
	<li>På injektionsdagen tinar du upp en alikvot och centrifugerar vid 15 000 x g i 5 minuter för att avlägsna eventuella partikelrester. OBS: En alternativ metod för partikelborttagning är att filtrera lösningen genom ett 0,22 μm-filter. Undvik förekomst av partikelrester i injektionsblandningen eftersom de leder till nålblockering under embryomikroinjektion.</li>
</ol>3. Mikroinjektion av embryon från en anopheles dockningslinje
<ol><li>Blod matar 4-7-dagars gamla myggor från önskad dockningslinje 72 h före mikroinjektion (dvs. för injektion på måndag och tisdag matar kvinnor föregående fredag; för injektion på torsdag och fredag matar kvinnor på måndag samma vecka).</li>
	<li>Blod matar vilda myggor (WT) (dvs. myggor med samma genomiska bakgrund av dockningslinjen) samma dag; dessa kommer att behövas för att korsa. OBS: Storleken och kvaliteten på blodmjölet påverkar äggkvaliteten, så det rekommenderas att alltid använda färskt blod (dvs. blod som dras under de föregående 7 dagarna). Armmatning eller utfodring på möss kan öka kvaliteten och kvantiteten av ägg, men dessa metoder uppmuntras inte. Särskilda godkända protokoll kommer att vara nödvändiga för användning av människor och djur.</li>
	<li>Utföra embryomikroinjektioner<ol>
<li>Utför an. gambiae embryo mikroinjektioner i 25 mM NaCl42 genom att rikta in sig på embryots bakre pol i en 45-graders vinkel. För ett detaljerat protokoll för embryosamling, inriktning och mikroinjektion hänvisas till Pondeville et al.43 och Lobo et al.44.</li>
		<li>Utför an. stephensi embryomikroinjektioner i halokarbonolja 700:27 (2:1) genom att rikta in sig på embryots bakre pol i 30 graders vinkel. Ett detaljerat protokoll för embryosamling, inriktning och mikroinjektion finns i Terenius et al.45 och Lobo et al.44.</li>
		<li>Överför ägg omedelbart efter injektion i en Petriskål fylld med sterilt destillerat vatten (pH 7.2) och återför dem till insektsförhållanden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vid kläckning, överför G0 larver till en bricka med saltat destillerat vatten (0,1% toniskt salt) dagligen och bakre till puppar.</li>
	<li>Registrera kläckningshastigheten (dvs. antalet kläckta larver/antal embryon som injicerats). OBS: Embryorörelser hjälper kläckning, så mild virvling är önskvärt. Kläckning ska påbörjas ~48 h efter injektion. Eftersom injektion kan orsaka en liten utvecklingsfördröjning är det lämpligt att fortsätta övervaka för senkläckningslarver i 3-4 dagar.</li>
</ol>4. Korsning och screening av transformerade individer
<ol><li>[VALFRITT STEG] Skärm G0 (injicerad) 1: a eller 2: a instar larverna (L1-L2) för övergående uttryck av fluorescerande markör.<ol>
<li>Använd en glaspipett med fin spets för att överföra G0 L1-L2 larver till ett mikroskopglas med brunnar. Placera en larva i varje brunn.</li>
		<li>Använd ett fluorescensstereoskop med lämpligt filter för att screena för förekomst av övergående uttryck av fluorescerande markör. OBS: Mönstret för tillfälliga uttryck dikteras av den promotor som används. Vid användning av 3xP3-promotorn syns övergående uttryck av fluorescerande markör i analpapilerna (se figur 6 i Pondeville et al.43)</li>
		<li>Bakre G0-positiva individer separat.</li>
	</ol></li>
	<li>Sortera G0-puppar efter kön under ett stereoskop52.</li>
	<li>Låt män dyka upp i separata burar i grupper om 3-5 (grundarfamiljer) och lägg till ett 10-faldigt överskott av åldersmatchade WT-honor. OBS: Eftersom män parar sig flera gånger är det viktigt att ge ett överskott av WT-honor för att maximera parningschanserna för varje man.</li>
	<li>Låt kvinnor dyka upp i separata burar i grupper om 10-15 (grundarfamiljer) och lägg till lika många åldersmatchade WT-män. OBS: Om det finns begränsat utrymme i insektsrummet kan kvinnor dyka upp tillsammans i en enda bur. Förhållandet mellan kvinnor och män kan vara så lågt som 1 man till 3 honor.</li>
	<li>Låt vuxna kompisera i 4-5 dagar och ge kvinnor en blodmåltid. OBS: Blodmata och samla ägg från G0-honor flera gånger för att maximera chanserna att få transformanter från flera gonotrofa cykler.</li>
	<li>Blod matar WT-individer samtidigt för outcrossing.</li>
	<li>Samla ägg och föda upp framväxande nästa generations G1: or.</li>
	<li>Skärm G1 L3-L4 larver för lämplig fluorescens för att identifiera transformanter.<ol>
<li>Samla larver i en Petri-skål fodrad med filterpapper eller på ett mikroskopglas och skärm med hjälp av ett fluorescerande stereoskop med lämpliga filter för närvaron av markören som införs med den attB-märkta lasten. OBS: Fluorescens som drivs av 3xP3-promotorn är synlig i alla postembryonic stadier och screeningen kan utföras på yngre larver, men dessa är mer ömtåliga och måste hanteras relativt noggrant. Pupae kan också screenas.<ol>
<li>För enstaka B-konstruktioner för integrationsskärm för närvaro av den nya och befintliga markören; De bör båda vara närvarande eftersom den nya kassetten sätts in bredvid den ursprungliga (figur 3A, figur 4).  OBS: Screeningundantag för enskilda attB-konstruktioner : När du använder markörfria dockningslinjer22, skärm endast för närvaro av den nya markören. När du använder dockningsrader där integrering resulterar i inaktivering av den befintliga markören21, skärm för närvaron av den nya markören och förlusten av den befintliga.</li>
			<li>För dubbelutb-konstruktioner för RMCE, skärm för närvaro av den nya markören och förlust av den befintliga, bör endast den nyligen införda markören finnas eftersom den nya kassetten ersätter den ursprungliga (figur 3B, figur 5). OBS: Tillfälliga integrationshändelser kan återställas i RMCE-experiment där endast en enda attP rekombineras och därmed båda markörerna kommer att finnas. Screening av G1-individer kan utföras även i pupastadiet efter samma förfarande52.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Överföring omvandlade G1-individer till en larvbricka och tillbaka till puppar. Kassera icke-fluorescerande individer och individer med ett oväntat marköruttryckmönster.</li>
	<li>Sortera förvandlade G1-puppar efter kön och korsa dem en masse med åldersmatchade WT-individer av motsatt kön.</li>
	<li>Låt vuxna kompisera i 4-5 dagar, ge en blodmåltid, samla äggen och föda upp nästa generations G2-avkomma .<ol>
<li>För enstaka integrationsexperiment, samla ägg direkt från ett masse cross eftersom integrationsplatsen är identisk hos alla individer.</li>
		<li>För RMCE-experiment, samla ägg från enstaka honor och upprätthålla avkomman separat tills molekylär bedömning är klar på grund av den potentiella närvaron av två alternativa kassettorienteringar (figur 3B).</li>
	</ol></li>
	<li>Screena G2-avkomman (i antingen larv- eller pupastadiet) för närvaron av fluorescerande markör (50% av individerna förväntas vara positiva), kassera icke-fluorescerande avkomma.</li>
	<li>Avsätt en delmängd av G2-positiva individer för molekylär analys, upp resten till vuxen ålder. OBS: Om alla G2-individer måste hållas vid liv kan molekylär analys utföras på enstaka vuxna ben46 eller DNA-extraktioner (L. Grigoraki personlig kommunikation). Alternativt kan molekylär analys utföras efter att alla G2-individer har oviposited och ägg har kläckts.</li>
	<li>Låt vuxna män och kvinnor korsa i samma bur för att etablera den nya transgena linjen. OBS: För RMCE experiment, vuxna intercross måste uppstå mellan syskon som härrör från en enda kvinna tills orientering av införing bestäms via molekylär analys.</li>
</ol>5. Molekylär validering av insättningsstället genom DNA-förstärkning (PCR)
<ol><li>Förbered en karta över det förväntade insättningsstället i genomet på dockningslinjen efter omvandlingen.<ol>
<li>Enkel integration: Se till att det förväntade insättningsstället bär den ursprungliga dockningskonstruktionen plus hela sekvensen av donatorplasmiden mellan de två hybridplatserna attL och attR (figur 3A).</li>
		<li>RMCE: Se till att det förväntade insättningsstället är identiskt med dockningslinjen där hybrid inverterade attL-platser ersätter de ursprungliga inverterade attP-platserna och utbytesmallen ersätter kassetten som ursprungligen fanns mellan dem (bild 3B).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Designa oligonukleotidprimrar för att förstärka insättningspunkten på vardera sidan av integrationslocus.<ol>
<li>Enkel integration: Design oligonucleotide primer-par som sträcker sig över attR - och/eller attL-webbplatserna . Den ena primern måste binda till den tidigare integrerade dockningskonstruktionen och den andra till den nyligen integrerade transgenen (figur 3A).</li>
		<li>RMCE: Kassettbyte kan ske i två olika riktningar med avseende på kromosomen (betecknad A och B). Designa alternativa kombinationer av 4 oligonukleotidprimrar för att ge en diskret produkt i endast en av riktningarna, där ett par är diagnostiska för orientering A och det andra för orientering B (figur 3B, figur 6).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Extrahera genomisk DNA från G2 positiva individer och utföra diagnostiska PCR och gel elektrofores för att visualisera förekomsten av förväntade diagnostiska amplicons från den förutsagda integration webbplats kartor. OBS: DNA kan alternativt extraheras från enstaka vuxna ben46 eller pupal fall (L. Grigoraki personlig kommunikation).</li>
	<li>Sekvens PCR-produkter för att bekräfta förväntade sekvenser.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig02.jpg"> Figur 2. Arbetsflödesdiagram för platsstyrd φC31 genommodifiering i Anopheles myggor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig03.jpg"> Figur 3. Molekylär grund för φC31-medierad enkel integration (A) och RMCE (B). A) Schematiska kartor över den genomiska införandet i en An. stephensi dockningslinje (80.9, tabell 1) som bär en enda attP-plats och markerad med CFP (överst), en enda attB designdonatorplasmid märkt med DsRed (mitten) och den förväntade insättningsplatsen som resulterar efter framgångsrik integration (botten). B) Schematiska kartor över den genomiska införandet i en An. gambiae dockningslinje (A11, tabell 1) som bär två inverterade attP-platser och markeras med CFP (överst), en dubbel-attB designdonatorplasmid märkt med YFP (mitten) och det förväntade insättningsstället som resulterar efter framgångsrik RMCE (botten). Vågig linje: mygggenom; Randiga pilar: piggyBac transposon armar; 3xP3: promotor för fluorescerande markör; SV40: viral terminator; Ori: replikeringens ursprung; AmpR: ampicillinresistensgen. Korsningar representerar rekombinationsplatserna mellan attP- och attB-platser. Numrerade svarta pilar representerar primerbindningsplatser för molekylär validering av insättningslocus (steg 5 i protokollet). Helt kommenterade enkel- och dubbel attB-märkta plasmider är tillgängliga från författarna på begäran. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>

Författarna har inget att avslöja.

Den exakta utformningen av attB-märkta plasmider som är kompatibla med dockningslinjen är av största vikt för experimentets framgång. Man måste noga överväga valet av den markör som används för screening av transformanter, inklusive fluorescensfärgen och dess uttrycksmönster, som kommer att omfattas av det mönster som redan finns i dockningslinjen. Det är nödvändigt att använda fluorescerande markörer som är lätta att urskilja: bra markörkombinationer inkluderar RFP (röd)/CFP (cyan), RFP (röd)/GFP (grön), RFP (röd)/YFP (gul) och YFP (gul)/CFP (cyan), medan kombinationer att undvika är YFP (gul)/GFP (grön) och CFP (cyan)/GFP (grön). 3xP3 promotorn39, specifik för ögon och nervsladd, är den vanligaste för att driva uttrycket av fluorescerande markörer för myggtransgenes. Faktum är att alla Anopheles dockningslinjer som för närvarande är tillgängliga använder denna promotor. Alternativa regleringsregioner är den för An. gambiae polyubiquitin genen (PUBc)5 eller viral promotor IE120, som driver uttryck i flera vävnader. När de används tillsammans med 3xP3 skulle dessa promotorer utöka de möjliga färgkombinationerna och till och med användningen av samma fluorofor. De angivna promotorerna är aktiva under hela mygglivscykeln vilket möjliggör screening och fluorescensövervakning i alla livsstadier. En ytterligare faktor vid plasmidkonstruktion är storleken på den last som ska integreras eller bytas ut. Även om φC31-systemet har anmärkningsvärd bärförmåga18, bör det anses att storleken på donatorplasmiden i allmänhet korrelerar negativt med omvandlingseffektiviteten22.
I det beskrivna protokollet är källan till integrase en hjälpare plasmid som uttrycker enzymet allestädes närvarande40. Den allestädes närvarande närvaron av integrasen kan leda till omvandling av somatiska celler om mikroinjektioner inte exakt riktas till det område där könscellerna bildas. Medan sådana omvandlingshändelser kommer att gå förlorade eftersom de inte är ärftliga, kan somatiska effekter minska konditionen hos injicerade individer. För att undvika detta och öka omvandlingseffektiviteten kan integrasuttrycket begränsas till bakterien, till exempel genom att använda vasapromotorn22,26. Andra protokoll beskriver användningen av in vitro transkriberad budbärar-RNA (mRNA) som källa till φC31 integrase19,24,43. Detta innebär dock mödosam förberedelse av mRNA och kräver noggrann hantering av injektionsblandningen och användning av RNase fria reagenser för att undvika nedbrytning. Plasmid källor av integrase har visats i både An. gambiae9,21,22,26,33,37 och An. stephensi (A.A. personlig kommunikation) att vara tillförlitlig och leda till effektiv omvandling, och är därmed vårt föredragna alternativ. Ett annat alternativ för integrase-leverans är dess in vivo-produktion i självdockande hjälplinjer. Sådana linjer skapades i An. gambiae som uttrycker φC31 integrase under regleringen av de bakteriespecifika promotorn nanos och befanns leda till en förbättrad överlevnad och omvandling effektivitet20. Potentiella träningsbelastningar som införs av in vivo-produktionen av integrasenzymet på hjälplinjen måste dock övervägas.
Liksom med andra transgena tekniker måste särskild omsorg förbehållas uppfödning och korsning av individer som härrör från injicerade embryon för att maximera chanserna att återvinna transformanter. Individer som stabilt har ärvt transgenen kan först återvinnas vid G1-avkomman. Tidiga tecken på potentiell omvandling kan dock utvärderas genom förekomsten av transienta episomala uttryck av fluorescerande markör i anal papiller och/eller nerv sladden av G0 första och andra instar larver när du använder 3xP3 promotorn43. Medan förekomsten av transient fluorescence föreslår framgångsrika plasmid leverans, garanterar det inte ärftliga könsceller omvandling. På samma sätt utesluter bristen på tillfälliga uttryck inte framgångsrik omvandling. Det har dock observerats att övergående positiva individer är mer benägna att ge transgena avkomma jämfört med övergående negativa43,48. I experthänder kan uppfödning och korsning av endast positiva individer vara ett alternativ för att minska myggantalet. Men med tanke på vikten och bräckligheten hos små G0-larver är minsta mängd manipulering fortfarande tillrådligt och uppfödning av alla G0-individer rekommenderas alltid.
Parningsschemat som rapporteras i det här protokollet är utformat för att maximera risken för parning och för att isolera oberoende omvandlingshändelser. Men om insektsutrymme eller personaltillgänglighet är ett problem kan G0 vuxna slås samman efter kön i enstaka burar om tillräckligt många individer av motsatt kön tillhandahålls. En sådan inställning kommer inte att tillåta diskriminering mellan flera omvandlingshändelser som inträffar hos individer från samma bur. Beroende på den experimentella installationen förväntas närvaron av en dubbel (enkel integration) eller en enda (RMCE) markör under screeningprocessen. I enskilda integrationsexperiment är det viktigt att verifiera närvaron av den ursprungliga markören från dockningslinjen, medan det i RMCE är viktigt att verifiera förlusten av den tidigare integrerade markören. Det är faktiskt inte ovanligt i RMCE-konstruktioner att återvinna transformanter där en enda integration i stället för utbyte inträffade på grund av rekombinationen av en enda attP-plats9,33. I sådana individer är både fluorescerande markörer närvarande samt hela givaren plasmid ryggraden belyser vikten av att genomföra en grundlig screening för båda fluorescerande markörer.
Medan förekomsten av förväntade fluorescensmönster indikerar framgångsrik omvandling, måste molekylär karakterisering av insättningsstället genomföras. För att göra detta är utarbetandet av exakta kartor över den förutsedda införing locus, inklusive de flankerande genomiska regionerna i dockningslinjen, avgörande för utformningen av adekvata diagnostiska oligonukleotidprimrar för genförstärkningsanalyser. Enskilda integrationshändelser resulterar i bildandet av attR - och attL-hybridplatser vid korsningen mellan det nyligen integrerade DNA:t och den tidigare insatta kassetten. Dessa platser kan riktas för validering av insättningswebbplats. I RMCE-konstruktioner kan införandet av donatorkassetten ske i två alternativa riktningar med avseende på den genomiska locus, så fyra primers kan användas i alternativa PCR-kombinationer för att upptäcka vilken orientering linjen bär. Eftersom orienteringen av kassett insättning kan påverka transgene uttryck, i jämförande gen uttryck analys är det viktigt att använda linjer som bär samma orientering av insättning.
När man arbetar med lågt antal transformanter kanske det inte är önskvärt att offra hela individer för molekylär analys. Ett alternativ till detta är att genomföra molekylär analys på DNA extraheras från en vuxens ben46 eftersom benförlust inte påverkar en vuxen kvinnlig förmåga att para sig och oviposit49. Det finns dock risk för att skada individen i processen för benborttagning. Framgång har erhållits med hjälp av kasserade pupal fall (L. Grigoraki personlig kommunikation), men det säkraste tillvägagångssättet är att utföra molekylär analys på G2 föräldrar efter att ha erhållit livskraftiga G3 avkomma.
Under de senaste åren har CRISPR/Cas9 revolutionerat sättet att utföra platsspecifik genomredigering26,41,50,51. Till skillnad från platsstyrda RMCE är CRISPR/Cas9-medierade genintegrationer (knock-ins) oberoende av förekomsten av förinsatta rekombinationsplatser med endast en omvandlingshändelse i ett steg som behövs. Crispr/Cas9-systemet förlitar sig dock på närvaron av stora kända genomiska sekvenser som flankerar den önskade insättningsplatsen för framgångsrik homologi riktad reparation samt på effektiv webbplatsigenkänning förmedlad av guide RNAs. Dessa villkor kan inte alltid uppfyllas eller kan vara mödosamma att felsöka och med tanke på tillgången till flera dockningslinjer i An. gambiae och An. stephensi och linjer som härrör från dem, är φC31-systemet fortfarande ett mycket värdefullt verktyg för att utföra direkta fenotypiska jämförelser mellan transgener på samma genomiska platser.

Förmågan att modifiera arvsmassan hos myggvektorer av sjukdomar på ett tillförlitligt och reproducerbart sätt har stärkt in vivo funktionell validering av gener och öppnat dörrarna till realiserbara genetiska vektorkontrollstrategier, till exempel de som riktar sig mot Anopheles myggor som överför malaria1.
Tidig mygggenomredigering förlitade sig enbart på transponerbar element (TE)-medierad omvandling, där piggyBac var den vanligaste transposonen i Anopheles2,3,4. Te-integrationens slumpmässiga karaktär kan dock leda till oönskade modifieringar såsom gen knockouts (insertional mutagenesis) och betydande positionseffekter på transgeneuttryck5,6,7,8. Flera infogningar är också vanliga när du använder piggyBac5,9, vilket gör valideringen och isoleringen av transgena linjer med enstaka infogningar mödosamma. Andra nackdelar inkluderar deras potentiella remobilisering, som observerats i bakterien av Anopheles stephensi när de tillhandahåller en källa till piggyBac transposase10,11,12, och deras begränsade storlek på DNA-last (10-15 kb i längd) med omvandling effektivitet minskar med ökande storlek på givaren plasmid13,14.
Webbplatsstyrda integrationsmetoder infördes för att kringgå dessa frågor. Den vanligaste platsstyrda genommodifieringen hos myggor är den som förmedlas av φC31-systemet (figur 1a). Detta drivs av en viral integras som katalyserar rekombinationen mellan två heterospecific anknytning (att) platser som förekommer naturligt i genomet av bakteriofag φC31 (attP) och i Streptomyces bacterium värd (attB)15. Rekombinationen av de två platserna är enkelriktad och resulterar i bildandet av hybridplatser (attL och attR). Rekombinationen av sådana hybridplatser (som leder till DNA-excision) skulle kräva inte bara närvaron av ett aktivt viralt integras utan också en annan fagerkodad rekombinationsfaktor16,17. En stabil integrationsplats skapas därmed som avlastar frågan om potentiell oönskad remobilisering15. Dessutom gör systemet det möjligt att integrera stora laster (t.ex. integrering av >100 kb-konstruktioner rapporterades i D. melanogaster18), vilket avsevärt ökar bärkapaciteten. Integration sker i en enda fördefinierad genomisk locus som kraftigt förenklar valideringen av insättning och parningssystemet för att erhålla en stabil transgen linje. Slutligen tillåter den platsstyrda karaktären av integrationen normalisering av uttryck eftersom alternativa transgener ligger i samma locus och regleras därför inom samma närliggande genomiska sammanhang. En av de viktigaste tillämpningarna av tekniken är den direkta jämförelsen av fenotyper som ges av olika transgener efter införandet i en identisk locus.
Att uppnå φC31-medierad integration innebär två faser: fas I är skapandet av transgena dockningslinjer som transporterar attP-anläggningar, och fas II är den platsstyrda integrationen av en attB-flankerad last i dockningslinjen19. Skapandet av fas I-dockningslinjer har förlitat sig på te-medierad slumpmässig integration av attP-märkta konstruktioner och därmed involverat en inledande mödosam process (inklusive södra blot och omvända PCR-analyser på en-kvinnliga avkomma) för att isolera och validera transgena linjer som bär en enda integrationshändelse i unika, transkriptionellt aktiva och fitnessneutrala genomiska platser. Ändå har flera dockningslinjer för φC31-medierad enkel integration utvecklats och validerats i An. gambiae19,20,21,22 och i An. stephensi23,24,25 (tabell 1). Var och en av dessa linjer varierar när det gäller dockningsplatsens genomiska läge och den stamspecifika genetiska bakgrunden och från dem kan en stor variation av nya transgena linjer skapas. Den komplexa valideringen av TE-medierade integrationer för tillverkning av dockningslinjer kan nu kringgås med CRISPR/Cas9-tekniken26. Detta förlitar sig dock på a priori kunskap om neutral lokus att vara mål och deras omgivande sekvenser.
φC31-medierad integration har tillämpats i stor utsträckning på insektsgenomredigering från modellorganismen D. melanogaster27, till myggorna Aedes aegypti13,28, Ae. albopictus29, An. gambiae19 och An. stephensi24, liksom andra insekter inklusive Ceratitis capitata30 och Bombyx mori31.
En begränsning av φC31-medierad integration, särskilt med tanke på potentiella fältutsläpp för vektorkontroll, är integrationen i mygggenomet hos hela attB-bärande donatorplasmid, inklusive oönskade sekvenser som genmarkörer för antibiotikaresistens och plasmid stamnätkomponenter av bakteriellt ursprung. För att ta itu med detta genomfördes en ändring av standardsystemet, rekombinerasmedierat kassettutbyte (RMCE), som gör det möjligt att exakt ersätta en tidigare integrerad transgen kassett med ett nytt donator-DNA (figur 1b). Detta uppnås genom att använda två inverterade att platser flankerar donator- och mottagarkassetterna i varje ände, vilket driver två oberoende rekombinationshändelser att äga rum samtidigt som det resulterar i kassettutbyte utan integration av plasmid ryggrad. Denna förbättrade konstruktion kringgår integrationen av oönskade sekvenser och utökar tillämpningen av φC31-system till att till exempel omfatta integrering av omärkta DNA-laster genom screening för förlust av en tidigare integrerad fluorescerande markör32.
RMCE uppnåddes först med D. melanogaster32 och tillämpades senare framgångsrikt på icke-modell insekter inklusive An. gambiae9,26,33, Ae. aegypti34, Plutella xylostella34 och B. mori35. Flera dockningslinjer för RMCE har utvecklats och validerats i An. gambiae5,9,26 (tabell 1). Såvitt vi vet har RMCE ännu inte utforskats i andra Anopheles vektorarter.
Hittills har φC31-systemet använts i stor utsträckning i Anopheles myggor för att introducera och studera en mängd olika molekyler, inklusive antimalaria-effektorer19,24,36, komponenter i GAL4/ UAS-systemet för att överuttrycka och slå ner gener för insekticidresistensstudier9,33, regulatoriska element, reportergener5,21,37 och gendrivelement26 ,38.
Detta protokoll beskriver hur man utför 1) platsstyrd integration av en attB-flankerad last och 2) RMCE av en konstruktion flankerad av inverterade attB-platser i genomet av Anopheles dockningslinjer. Detta uppnås med hjälp av två plasmider: en givaren attB-märkt plasmid som bär transgenen av intresse och en hjälpare plasmid som uttrycker φC31 integrase. De stora malariavektorerna An. gambiae och An. stephensi används som specifika exempel, men dessa protokoll är tillämpliga på andra Anopheles arter.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig01.jpg"> Figur 1. Platsstyrda genomändringar, enkel integrering och rekombinerad kassettutbyte (RMCE) med hjälp av φC31-systemet. φC31 integrase (INT, grå dubbelpil) katalyserar rekombinationen mellan attB-platserna (lila randiga) som finns i en donatorplasmid och attP-platserna (blå randiga) som finns i en mottagningsdockningslinje, vilket resulterar i bildandet av hybridplatser attL och attR. A) Integration uppnås när enstaka attB- och attP-platser kombineras och resulterar i närvaron av två integrerade markörer (blå och röd). B) RMCE inträffar när två attB/P-platser kombineras samtidigt och resulterar i att kassetten byts ut mellan dockningslinjens (blå markör) med den som bärs av donatorplasmiden (röd markör). C) Partiella nukleotidsekvenser av attP (blå) och attB (lila) och hybridplatserna attL/R. Rekombination sker mellan "TT"-kärnsekvenserna markerade i fet svart. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL eppendorf tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well microslides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MARI1216690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree&#160;Plasmid&#160;Maxi&#160;Kit (10)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Absolute, Molecular Biology Grade</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter set CFP for Leica MZ FLIII Excitation 436/20 nm, extinction 480/40 nm</td>
			<td>Leica</td>
			<td>10446363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter set dsRED for Leica MZ FLIII Excitation 545/30 nm, extinction 620/60 nm</td>
			<td>Leica</td>
			<td>10447079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter set YFP customised for Leica MZ FLIII</td>
			<td>Omega Optical</td>
			<td>500QM25, 500QM35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 27</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 700</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium&#160;chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium&#160;Acetate&#160;Solution (3 M),&#160;pH&#160;5.2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Life Technologies)</td>
			<td>R1181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stable brush Size 0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

site-directed &#966;c31-mediated integration and cassette exchange in anopheles vectors of malaria

Funktionell genomisk analys och relaterade strategier för genetisk kontroll av malaria förlitar sig på validerade och reproducerbara metoder för att exakt modifiera genomet av Anopheles myggor. Bland dessa metoder möjliggör φC31-systemet exakt och stabil platsstyrd integrering av transgener, eller ersättning av integrerade transgena kassetter via rekombinerasmedierat kassettutbyte (RMCE). Denna metod bygger på verkan av Streptomyces φC31 bakteriofagintegras för att katalysera rekombination mellan två specifika fästpunkter som betecknas attP (härlett från fag) och attB (härledd från värdbakterien). Systemet använder en eller två attP-platser som tidigare har integrerats i mygggenomet och attB-platserna i donatormallens DNA. Här illustrerar vi hur man stabilt modifierar genomet av attP-bärande Anopheles dockningslinjer med hjälp av två plasmider: en attB-märkt donator som bär integrations- eller utbytesmallen och en hjälpare plasmid som kodar φC31 integrase. Vi rapporterar två representativa resultat av φC31-medierade plats-riktade modifiering: den enda integrationen av en transgenic kassett i An. stephensi och RMCE i An. gambiae myggor. φC31-medierad genommanipulation erbjuder fördelen med reproducerbara transgene uttryck från validerade, fitness neutrala genomiska platser, vilket möjliggör jämförande kvalitativa och kvantitativa analyser av fenotyper. Integrationens platsstyrda karaktär förenklar också avsevärt valideringen av det enskilda insättningsstället och parningssystemet för att erhålla en stabil transgen linje. Dessa och andra egenskaper gör φC31-systemet till en viktig komponent i den genetiska verktygslådan för transgen manipulation av malariamyggor och andra insektsvektorer.

Protokollet som illustreras här gör det möjligt att generera en stabil Anopheles transgen linje i ~ 10 veckor (förutsatt en 21-dagars mygglivscykel).
Efter injektion larval kläckning priser i An. gambiae förväntas vara generellt lägre än An. stephensi, men kläckning priser mellan 10-50% har rapporterats9,20,24,26,33,43,47. Med lämplig injektionsteknik är kläckningshastigheter på ≥20% i allmänhet tillräckliga för att ge transformanter. DNA-upptag av embryona kan bedömas genom screening av unga larver för övergående uttryck av fluorescerande markör. I framgångsrika RMCE experiment i An. gambiae med hjälp av 3xP3 promotorn upp till 50% av de överlevande G0 larverna visade episomal uttryck av markören i anal papillae48.
Generaliserade uppskattningar av omvandlingseffektivitet är svåra att utvärdera bland laboratorier och även bland experiment eftersom omvandling beror på ett komplext samspel mellan variabler inklusive renhet, koncentration, storlek och potentiell toxicitet hos det injicerade DNA, äggkvalitet, hantering före och efter injektion av ägg, mygguppfödning och viktigast av allt operatörens erfarenhet. Omvandlingshastigheter upp till 7% har erhållits för RMCE i An. gambiae (beräknat som antalet oberoende omvandlingshändelser i den totala G0-individerna)9,26,33 och upp till 2,2% omvandlingsgrad för integration i An. stephensi. Vi föreslår att man injicerar minst 500 embryon, vilket bör leda till kläckning av minst 100 G0 larver och till 2-7 G0 vuxna grundare från vilka stabilt omvandlad avkomma kan erhållas. Om screening för övergående uttryck i G0 larver, upp till 40 positiva larver kan förväntas.
Exempel på fenotypisk validering av omvandling via screening av fluorescerande markörer som regleras av 3xP3 promotorn rapporteras i figur 4 ochFigur  5. Figur 4 visar en ny An. stephensi-linje som erhålls genom införandet av en DsRed-märkt kassett i en dockningslinje markerad med CFP (80.9, tabell 1), vilket resulterar i att G1-avkomma uttrycker båda markörerna enligt den röda och blå fluorescens som detekteras i ögonen.
RMCE-konstruktioner förväntas istället leda till att den markör som ursprungligen sattes in i dockningslinjen ersätts med givarplasmidens. Figur 5A ochFigur  B illustrerar detta markörutbyte i en an. gambiae dockningslinje markerad med CFP (A11, tabell 1) där den gemensamma fiskeripolitikens markör efter framgångsrik RMCE går förlorad och YFP-markören förvärvas vilket resulterar i gult (men inte blått) öga och nervsladdfluorescens33. Ibland kan RMCE resultera i en enda integrationshändelse i stället för utbyte av önskad transgen kassett som illustreras i figur 5C, där en larva märkt med både den ursprungliga gemensamma fiskeripolitiken och de nya YFP-markörerna visas. Det rapporteras att upp till 50% av det totala antalet omvandlingshändelser är enskilda integrationer9,33.
Vid screening för förekomst av en fluorescerande markör är det viktigt att skilja dess signal från eventuell bakgrund autofluorescens. Detta är särskilt viktigt när man använder CFP eftersom Anopheles larver visar naturlig blå autofluorescens (figur 6A). Att öka förstoringen och fokusera på vävnader och organ där fluorescens förväntas drivas av promotorn är nödvändigt för att identifiera sanna CFP-positiva individer som illustreras i figur 6B med hjälp av 3xP3-CFP-markören.
Enskilda transformanter utvärderas slutligen molekylärt via PCR för att bekräfta den förväntade införingsplatsen. Figur 7 rapporterar PCR validering i individer från ett utbyte An. gambiae linje visar de två potentiella orienteringarna av insättning i mygggenom33.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig04.jpg"> Figur 4. Validering av φC31 enkel integration i An. stephensi larver (dorsal view). A) Dockningslinjen (80.9, tabell 1) uttrycker den gemensamma fiskeripolitiken i ögonen enligt 3xP3-promotorns reglering. B) Framgångsrik integration resulterar i att den nyförvärvade DsRed uttrycks samt den ursprungliga gemensamma fiskeripolitikens markör i ögonen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig05.jpg"> Figur 5. Validering av φC31 RMCE i An. gambiae larver (ventral vy). A) Dockningslinjen (A10, tabell 1) uttrycker den gemensamma fiskeripolitiken enligt regleringen av 3xP3-promotorn i ögonen e och nervsladden (nc)5. B) Framgångsrik RMCE resulterar i byte av fluorescerande markör från CFP till YFP33. C) En enda integrationshändelse inträffade under RMCE-experimentet där transformant larven uttrycker både CFP- och YFP-markörer. Denna larva bär GAL4/UAS komponenter som orsakar ett brett uttryck mönster av YFP, särskilt stark i bukmusklerna (am). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig05large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig06.jpg"> Figur 6. CFP autofluorescens i An. gambiae larver (dorsal view). A) Sida vid sida bild av en positiv (CFP+) och en negativ (CFP-) L4 larva med hjälp av CFP-filtret. B) Närbild av larvögonen som avslöjar en CFP+ vs CFP- individ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig06large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig07.jpg"> Figur 7. Molekylär validering av orienteringen av kassett insättning i representativa transgena An. gambiae skapad av φC31 RMCE. Den transgena kassetten kan sättas in i en av två alternativa riktningar (A eller B) med avseende på insättningsstället. Varje PCR-reaktion (I - IV) använder en kombination av primers (5-8)33 utformade för att ge ett diagnostiskt förstärkningsfragment för varje orientering som anges i de schematiska plasmidkartorna. T1: Representativ transgen individ som bär orientering av införing A. T2: Representativ transgen individ som bär orientering av införing B. WT: vild typ; DL: dockningslinje; -: reaktionsnegativ kontroll där vatten användes som mall. Denna siffra har ändrats från Adolfi et al. (2019)33. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig07large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Art</td>
			<td>Anstränga</td>
			<td>Namn</td>
			<td>attP/er</td>
			<td>Chromo-some</td>
			<td>Markör för arrangör</td>
			<td>Ursprungsinstitution</td>
			<td>Hänvisning</td>
		</tr>
<tr>
<td>An. stephensi</td>
			<td>Indiana
</td>
			<td>26.10b
</td>
			<td>Singel</td>
			<td>2R</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>Av Kalifornien Irvine</td>
			<td>25</td>
		</tr>
<tr>
<td>An. stephensi</td>
			<td>Indiana
</td>
			<td>44Cb
</td>
			<td>Singel</td>
			<td>X</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>Av Kalifornien Irvine</td>
			<td>23, 24</td>
		</tr>
<tr>
<td>An. stephensi</td>
			<td>Indiana
</td>
			<td>80.9b
</td>
			<td>Singel</td>
			<td>2L</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>Av Kalifornien Irvine</td>
			<td>Denna studie</td>
		</tr>
<tr>
<td>En gambiae</td>
			<td>G3</td>
			<td>113</td>
			<td>Singel</td>
			<td>2R</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>Av Kalifornien Irvine</td>
			<td>Denna studie</td>
		</tr>
<tr>
<td>En gambiae</td>
			<td>KIL</td>
			<td>Ec
</td>
			<td>Singel</td>
			<td>3R</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>Keele Univ.</td>
			<td>19, 43</td>
		</tr>
<tr>
<td>En gambiae</td>
			<td>G3</td>
			<td>X1</td>
			<td>Singel</td>
			<td>2L</td>
			<td>Ingen markör</td>
			<td>Avst.20.12 i Strasbourg</td>
			<td>22</td>
		</tr>
<tr>
<td>En gambiae</td>
			<td>G3</td>
			<td>YAttp</td>
			<td>Singel</td>
			<td>Y</td>
			<td>3xP3-RFP</td>
			<td>Imperialistisk högskola London</td>
			<td>21</td>
		</tr>
<tr>
<td>En gambiae</td>
			<td>G3</td>
			<td>A10b
</td>
			<td>Dubbel</td>
			<td>2R</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>Liverpool skolar Trop. Med.</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>En gambiae</td>
			<td>G3</td>
			<td>A11b
</td>
			<td>Dubbel</td>
			<td>2R</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>Liverpool skolar Trop. Med.</td>
			<td>9</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="8">a. Stam från Johns Hopkins University (gåva av M. Jacobs-Lorena) och i kultur vid Univ. i Kalifornien Irvine i >20 år.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="8">b. Dessa rader är tillgängliga från författarna på rimlig begäran.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="8">c. Denna linje finns tillgänglig i BEI-databasen www.beiresources.org som MRA-1163.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1. Anopheles attP dockningslinjer.

Watch this Scientific Journal Video about Site-Directed Ãâ€ C31-Mediated Integration and Cassette Exchange in Anopheles Vectors of Malaria at JoVE.com

Site-Directed ÃƒÂÃ¢â‚¬Â C31-Mediated Integration and Cassette Exchange in Anopheles Vectors of Malaria

Protokollet beskriver hur man uppnår platsstyrda modifieringar i genomet av Anopheles malariamyggor med hjälp av φC31-systemet . De ändringar som beskrivs omfattar både integration och utbyte av transgena kassetter i arvsmassan hos attP-bärande dockningslinjer.

Platsstyrd φC31-medierad integration och kassettutbyte i Anopheles vektorer av malaria

Functional genomic analysis and related strategies for genetic control of malaria rely on validated and reproducible methods to accurately modify the ...

Detta protokoll stöder karakteriseringen av mygggenernas roll som är involverade i en mängd olika fysiologiska vägar, inklusive till exempel insektsresistens och malariaparasitutveckling. Metoden driver transgene insättning i enda fördefinierade genomiska platser och gör det därför möjligt att direkt jämföra fenotyper som härrör från alternativa transgenes effektivt undvika frågan om positionell effekt. Denna metod kan tillämpas på en mängd olika insektsarter av folkhälso- och jordbruksbetydelse och dess tillämpningar sträcker sig mycket från bakterier till däggdjursceller.Börja med att designa attB donatorplasmider som bär den dominerande fluorescerande markören, attB-rekombinationsplatser och önskad transgene-last. Använd en enda attB-plats för integrering av hela plasmiden som bär den transgena kassetten eller två inverterade attB-platser för kassettbyte. Rena donator- och hjälpplasmider med hjälp av ett endotoxinfritt reningskit.Kombinera den attB-märkta donatorplasmiden som bär den transgene av intresse och hjälparen plasmid som bär integrasen för att få en blandning med en slutlig koncentration på 350 nanogram per mikroliter av donatorplasmiden och 150 nanogram per mikroliter av hjälparens plasmid. Fäll ut DNA genom att tillsätta 0,1 volym tre molarnatriumacetat och 2,5 volymer iskall 100% etanol och virvel. En vit fällning ska vara omedelbart synlig.Tvätta pelleten och återanvänd den i injektionsbuffert för att nå en total slutlig koncentration på 500 nanogram per mikroliter. Förbered sedan alikvoter på 10-15 mikroliter vardera och lagra dem på minus 20 grader Celsius. Blod matar fyra till sju dagar gamla myggor från önskad dockningslinje och deras vilda typ motsvarigheter 72 timmar före mikroinjektion.Utför Anopheles gambiae embryo mikroinjektioner i 25 millimolar natriumklorid genom att rikta in sig på embryots bakre pol i 45 graders vinkel. Utför Anopheles stephensi embryo mikroinjektioner i halokarbonolja genom att rikta in sig på den bakre polen i 30 graders vinkel. Omedelbart efter injektionen överför du äggen till en Petri-maträtt fylld med sterilt destillerat vatten och återgår till insektsförhållanden.Vid kläckning överför du G0 larva till en bricka med saltat destillerat vatten dagligen och bakre till puppar. Sortera G0-puppar efter kön under ett stereoskop. Låt hanarna dyka upp i separata burar i grupper om tre till fem och tillsätt ett tiofaldigt överskott av åldersmatchade vilda typkvinnor.Låt honorna dyka upp i separata burar i grupper om 10 till 15 och lägg till ett lika stort antal åldersmatchade vilda män. Låt vuxna para sig i fyra till fem dagar och ge kvinnor en blodmåltid. Samla äggen och bakre framväxande nästa generations G1: or.Samla in G1- , L3- och L4-larven i en Petri-skål fodrad med våtfilterpapper eller på en mikroskopbild och screena dem med hjälp av ett fluorescerande stereoskop för närvaron av markören som introduceras med den attB-märkta lasten. För enstaka attB-mönster, skärm för närvaron av den nya och befintliga markören. För dubbla attB-mönster för kassettbyte, skärm för närvaron av den nya markören och förlusten av den befintliga.Sortera förvandlade G1-puppar efter kön och korsa dem en masse med motsatt kön åldersmatchade vilda typ individer. Låt vuxna para sig i fyra till fem dagar och ge en blodmåltid. För enstaka integrationsexperiment, samla ägg direkt från masskorset.För kassettutbytesexperiment, samla ägg från enskilda honor och hålla avkomman separat tills molekylär bedömning är klar på grund av den potentiella närvaron av två alternativa kassettorienteringar. Screena G2-avkomman för närvaron av fluorescerande markören och avsätta en delmängd av G2-positiva individer för molekylär analys. Upp resten till vuxen ålder.Utför molekylär validering av insättningsplatserna med PCR enligt beskrivningen i textmanuskriptet. För enkel integration, se till att den förväntade insättnings platsen bär den ursprungliga docknings konstruktionen, plus hela sekvensen av givaren plasmid mellan de två hybrid platser attL och attR. För kassettutbyte, se till att det förväntade insättningsstället är identiskt med dockningslinjen där hybrid inverterade attL-platser ersätter de ursprungliga inverterade attP-platserna och utbytesmallen ersätter kassetten som ursprungligen fanns mellan dem.Protokollet användes för att generera en stabil Anopheles transgen linje i cirka 10 veckor. Fenotypisk validering av omvandling utfördes genom screening för fluorescerande markörer som regleras av 3xP3 promotorn visas här. En ny Anopheles stephensi linje erhölls genom införande av en DS röd märkt kassett i en dockningslinje märkt med CFP vilket resulterade i G1 avkomma uttrycker båda markörer som anges av den röda och blå fluorescensen i ögonen.Kassettutbytesdesigner resulterar i att markören som ursprungligen sattes in i dockningslinjen ersätts med givarplasmidens. Denna markör utbyte visades i en Anopheles gambiae docknings linje där den gemensamma fiskeripolitiken markören förlorades och YFP markör förvärvades resulterar i gula ögat och nerv sladd fluorescence. Ibland kan RMCE resultera i en enda integrationshändelse istället för utbyte av önskad transgen kassett där en larva är markerad med både den ursprungliga gemensamma fiskeripolitiken och de nya YFP-markörerna.Vid screening för förekomst av en fluorescerande markör är det viktigt att skilja dess signal från eventuell bakgrund auto-fluorescens. Att öka förstoringen och fokusera på vävnader och organ där fluorescens förväntas drivas av promotorn är nödvändigt för att identifiera sanna positiva individer inom den gemensamma fiskeripolitiken. Enskilda transformanter bedömdes också molekylärt via PCR för att bekräfta den förväntade insättningspunkten.PCR-validering hos individer från en utbytes Anopheles gambiae-linje visas här. Även lämplig mikroinjektionsteknik, noggrann design och förberedelse av donator- och hjälparplasmider, samt att följa lämpligt mygghållningssystem är nyckeln till att få transgena individer. Denna procedur kan användas för att sätta in element som orsakar genöveruttryck eller ljuddämpning, till exempel GAL4/UAS-systemet, liksom gendrivelement och antipatogenmolekyler för mygggenetisk kontroll.

Research

JoVE Journal

Genetics

Site-Directed &#966;C31-Mediated Integration and Cassette Exchange in Anopheles Vectors of Malaria

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

siRNA Transfektion och EMSA Analyser av nyligen isolerade mänskliga villös cytotrofoblaster

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Parallell Mätning av dygnsrytm klocka genuttryck och hormon i mänskliga primära cellkulturer

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Slumpmässig mutagenes med användning Histon-miniSOG i<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Uppfödning och dubbelsträngade RNA-medierad Gene Knockdown i Hide Beetle,<em&gt; Rävänger</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

Tvåriktad retroviral integrationsplats PCR-metodik och kvantitativ dataanalys arbetsflöde

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions

Retroviral Scanning: Kartläggning av MLV-integrationswebbplatser för att definiera cellspecifika reglerande regioner

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-medierad riktade Integration In Vivo som använder en homologi-medierad slutet att gå-baserad strategi

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

Ett protokoll för produktionen av integras-brist Lentiviral vektorer för CRISPR/Cas9-medierad gen Knockout i delande celler

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 gen redigering till göra villkorlig mutanter av humana malariaparasiten P. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Karaktärisera Histon posttranslationella modifieringen förändringar i jäst neurodegenerativa Proteinopathy modeller

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...