Name: open-source miniature fluorimeter to monitor real-time isothermal nucleic acid amplification reactions in resource-limited settings
Uploaded: 2021-02-03T15:00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Open-Source Miniature Fluorimeter to Monitor Real-Time Isothermal Nucleic Acid Amplification Reactions in Resource-Limited Settings at JoVE.com

特别感谢切尔西·史密斯、梅根·张、埃米莉·纽瑟姆、赛·保罗和克里斯托弗·吴在样品准备方面给予的帮助。作者感谢卡罗琳·诺克逊的手稿修订。这项工作的资金由美国国际开发署通过国际开发署和美国国际开发署根据AID-OAA-A16-00032奖提供，由美国人民提供。

1. 准备步骤：3D 打印和焊接
注：本协议中描述的光学系统专为标准干块加热器设计。
<ol><li>要创建第一个配置，3D 打印 CAD 文件，分别作为补充文件 1、2和3：</li>
	<li>要创建第二个配置，3D 打印作为 补充文件 3、4 和 5提供的 CAD 文件： 注：这些部件设计为带有支架。在此指南中，使用黑色聚碳酸酯长丝，在温度高达 110 °C 后可保持其形式。 一般来说，任何可以加热到所需温度的材料都可以使用，无需显著变形即可进行热反应。为了尽量减少内部反射和环境光线干扰的影响，建议使用黑色或其他深色的材料。</li>
	<li>准备两个光到数字传感器评估模块，以便平行监控两个样本。在传感器测试板上，拆下 R4 电阻器，并将跳线从 PCB 上 R4 区域的右垫焊接到多氯联苯 R1 区域的顶部垫上。这将更改传感器的 I2C 地址，从而允许同时测量两个传感器。 注：使用的传感器由两个多氯联苯组成：一个USB适配器板和一个包含光传感器的传感器测试板：此设备只需要传感器测试板。</li>
	<li>焊接线到两个发光二极管 （LED） 中的每一个。将红色电线（正）连接到 LED 上标有"1"的垫子和 LED 上标有"2"的垫子上的黑色线（阴性）。在 LED 背面涂抹薄薄的热粘合剂层，将 LED 放在末端盖的顶部，然后等待热粘合剂固化。在末端盖的另一边，添加一个散热器。 注意：在 LED 密封在外壳中之前进行测试时，请确保佩戴适当的蓝光阻塞眼睛保护。</li>
	<li>要创建第二个配置，请用剪刀或剃须刀刀片从蓝色激发箔片和四个直径为 1/4 英寸的黄色发射箔片中切出两个直径为 1/4 英寸的圆圈。</li>
	<li>将 M2.5 六角形插入"LCD_Screen_Holder.stl"部分倾斜部分的四个孔中的每一个。</li>
</ol>2. 光学装配
<ol><li>将一个 3/16 英寸长的 4-40 线程插入"Optics_Enclosure_Bottom.stl"部分顶部的孔中。将一个1/4英寸长的4-40线插入到3D打印部分的所有其他孔中，如 图2A所示。</li>
	<li>将传感器测试板插入外壳的顶腔，五个引脚朝向顶部，最接近设备的中轴。用 3/16 英寸长的 4-40 螺丝钉通过传感器测试板上的孔（图 2B）固定。</li>
	<li>将一个 20 mm 焦距镜头放在传感器测试板下方的区域，凸面朝向设备底部，远离测试板（图 2C）。</li>
	<li>要创建第一个配置，将长传滤镜放入放置在前一步的 20 mm 焦距镜头 （图 2D）下方的下一节。要创建第二个配置，请将两个黄色排放滤芯放入镜头下方的部分。</li>
	<li>要创建第一个配置，将二色镜放入包中心附近的对角部分，同时观察制造商指定的滤镜方向（图 2E）。要创建第二个配置，将光束拆分器放入对角部分。光束分离器不需要特定的方向。</li>
	<li>将第二个 20 mm 焦距镜头放入 dichroic 镜（或光束分离器，具体取决于配置）下方部分，凸面侧指向设备顶部（图 2F）。</li>
	<li>要创建第一个配置，请将激发滤镜放在 dichroic 镜右侧的段中，确保箭头指向 dichroic 镜 （图 2G）。要创建第二个配置，请将一个蓝色激发滤芯放入光束分离器右侧的部分。</li>
	<li>将 15 mm 焦距镜头放在激发滤镜的右侧，凸面朝向二色镜 （图 2H）。</li>
	<li>将 LED 放入打印的剩余部分，LED 朝向朝二色镜（或光束拆分器，具体取决于配置）。确保从 LED 引出的两根导线插入凹陷通道，以便打印紧密关闭。</li>
	<li>重复步骤 2.3-2.9 为 3D 打印部分的另一侧 （图 2I）。</li>
	<li>将包的上半部分挤压到包的下半部分的凹槽中，用光学元件关闭打印顶部的空侧。将两个打印部件与 3/8 英寸长的 4-40 螺丝（图 2J）固定在一起。 注：如果两个打印部件没有完全关闭，偏离的激发光可以从光学外壳中逃逸。确保适当的蓝光阻塞眼睛保护佩戴，直到实现适当的密封。重新封装外壳，直到没有多余的光线逸出。</li>
</ol>3. 电子和触摸屏组件
<ol><li>将两个迷你面包板连接在一起，然后将微控制器放在一个面包板上。确保微控制器的微 USB 端口向外移动。</li>
	<li>要连接 LED 调制，将 LED （+） 驱动程序的 CTL 销连接到微控制器的数字引脚和 LED 驱动程序的 LED（-） 引脚连接到微控制器的 GND 销。</li>
	<li>取出面包板背面的塑料盖。将面包板的粘合背向 3D 打印部分按压，将组合面包板连接到"LCD_Screen_Holder.stl"打印部分的背面。</li>
	<li>用一英寸长的 4-40 螺丝固定液晶显示器 （LCD） 屏幕支架，将组装好的面包板固定在第 2 节组装的光学外壳中。</li>
	<li>要连接 LED 电源，将 LED 驱动程序的 LED （+） 引脚连接到第一个 LED 的正线。将第一个 LED 的负线连接到面包板上第二个 LED 的正导线。将第二个 LED 的负线连接到 LED 驱动程序的 LED（-）引脚。 注：第一或第二个 LED 的顺序是任意的。</li>
	<li>要连接 LED 驱动程序电源，将 10 V 电源的正向和负线分别连接到 LED 驱动程序的 VIN+ 和 VIN-引脚。（使用了桶插孔到双针适配器。</li>
	<li>连接传感器测试板电源和数据传输。传感器测试板上仅使用四个引脚：SCK、SDA、VDUT 和 GND。取一个 4 针女性到男性跳线线，并通过 LCD Holder 打印右上角的缝隙将光数字传感器测试板上的引脚连接到迷你面包板。</li>
	<li>在面包板上，确保以下连接到位：微控制器的 3.3 V 引脚和两个测试板的 VDUT 销：微控制器的GND引脚和两个测试板的GND引脚;微控制器的模拟4（A4）引脚和两个测试板的SDA引脚：以及微控制器的模拟 5 （A5） 引脚和两个测试板的 SCK 引脚。 注：由于 I2C 通信用于光传感器，因此两个传感器的 SCK 和 SDA 销都可以路由到微控制器的同一引脚。</li>
	<li>用四颗 M2.5 螺丝将单板计算机固定在 LCD 屏幕支架上。确保单板计算机的 HDMI 和电源适配器端口朝上，单板计算机以 3D 打印部分为中心。</li>
	<li>根据触摸屏说明将触摸屏显示屏连接到单板计算机，然后将单板计算机的 HDMI 端口连接到触摸屏的 HDMI 端口。</li>
</ol>4. 软件安装
<ol><li>安装并使用 Web 编辑器将 补充编码文件 1 中提供的自定义草图"MiniFluorimeter_2Diode.ino"上传到微控制器上。确保使用库管理器安装"封闭立方体 OPT3002"库。</li>
	<li>将变量led_A_pin更改为步骤 3.3 中使用的数字引脚（电子和触摸屏装配部分）中的数字引脚数量。</li>
	<li>通过更改可变曝光时间的价值，在获取荧光测量时调整 LED 打开的毫秒数。通过更改可变led_A_Interval值来调整 LED 暴露之间的毫秒数。</li>
	<li>将变量led_Power更改为零和 1 之间的数字，以调整暴露期间 LED 的亮度。零提供最大亮度，一个给出最少的亮度。</li>
	<li>通过遵循制造商提供的 3.5 英寸显示屏的说明，打开通过触摸屏控制显示屏的能力。 注：如有需要，3.5 英寸屏幕可用作没有触摸屏功能的监视器，键盘和鼠标可连接到单板计算机的 USB 端口，用于控制单板计算机。</li>
	<li>从 补充编码文件 2 下载"MiniFluorimeter_2Diode_GUI.py"文件到单板计算机上所需的位置。</li>
	<li>确保在单板计算机上安装 Python 的工作版本。Python 3.7 用于提供的 Python 模块，但任何稳定的 Python 版本都可以对所提供的脚本进行适当更改。将 Python 程序所需的库安装到单板计算机上。</li>
	<li>将变量measurement_time更改为测量所需的时间长度。程序结束收购，并在所需时间过后关闭。GUI 还允许通过用户界面上的按钮结束收购。</li>
	<li>将可变序列端口更改为连接的微控制器的序列地址。</li>
</ol>5. 记录实时荧光数据
<ol><li>打开商业热块，使其达到所需的温度。</li>
	<li>为单板计算机供电，提供标准的 5 V 电源，提供大多数单板计算机购买。将单板计算机连接到微控制器，使用微型USB到USB电缆。</li>
	<li>使用触摸屏，打开提供的 Python 脚本。将measurement_time和串行端口变量更改为所需的值。将可变输出文件路径更改为程序生成的数据文件的名称。确保文件名以".xlsx"结尾。</li>
	<li>放置两个包含反应的 PCR 管，以便监测到热块中。确保 PCR 管的位置与氟度计的光学通道对齐，一旦它被放置在热块上。</li>
	<li>将氟度计置于热块上，PCR 管位于从氟计的每个光学通道挤出的四个钉子之间。为了进行最佳测量，请确保 3D 打印的氟度计牢固地连接到热块的井中。</li>
	<li>安全地连接荧光计，插入 LED 的电源适配器。</li>
	<li>使用触摸屏启动 Python 程序。LCD 屏幕上会显示图形用户界面 （GUI），并测量实时荧光。</li>
	<li>观察在GUI上显示给用户的两个PCR管的实时荧光测量。</li>
	<li>用户确定的实验时间过后，采集停止。查看保存在用户定义位置的输出数据文件中的测量结果。要提前结束测量，请单击用户界面上标有"停止获取"的按钮。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Daher, R. K., Stewart, G., Boissinot, M., Bergeron, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinase+polymerase+amplification+for+diagnostic+applications.">Recombinase polymerase amplification for diagnostic applications.</a> Clinical Chemistry. 62 (7), 947-958 (2016).</li><li>Yan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+Amplified+Detection+of+DNA+and+RNA.">Isothermal Amplified Detection of DNA and RNA.</a> Molecular BioSystems. 10 (5), 970-1003 (2014).</li><li>Giuffrida, M. 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作者声明没有利益冲突。

这里描述的是一种开源、低成本、模块化、便携式荧光计，用于定量荧光检测等热放大反应。开源项目可通过现成的更换部件进行快速、廉价的维护，并允许用户根据模块化设计灵活地使系统适应其需求。该协议描述了组装机械、光学和电气部件以及验证光学性能的过程。此外，还证明了荧光计在监测两种不同类型的同热放大检测时的灵活性，其温度、体积和荧光要求显著不同，RPA exo 和 RT-LAMP。RPA 在 50 μL 反应中以 39 °C 进行，该反应利用序列特定的 FAM 标记探头进行荧光生成，而 RT-LAMP 在 25μL 反应量中以 65 °C 执行，并使用交错染料报告放大的 DNA 的存在。由于荧光测量是通过带有扁平帽的 PCR 管顶部进行的，因此荧光计能够从两个检测量中检测荧光，并且热量要求仅受选择的商业热块的限制。此外，由于基于染料和探针的荧光信号生成方法，RT-LAMP产生的荧光强度几乎比 RPA 中产生的荧光强度大。但是，选择的光学传感器的动态范围可以检测和量化信号，基线减法算法可以解释这些差异，以产生可靠的荧光读数。
为了促进技术传播和最大限度地降低潜在的维护成本，采用了与不同环境中广泛使用的加热器兼容的模块化设计。在当前协议中，使用了一个普通的干块加热器：同样的光学和电气设计可以很容易地适应其他市售加热器。如果要使用另一个干块加热器，则需要对 3D 外壳设计进行最小的更改。具体来说，必须修改光学外壳 STL 文件的底部钉，以确保与其他商业热块的井正确对齐。虽然示例中显示的外壳印在相对低端的 3D 打印机上（参见 材料表），但应小心确保打印机分辨率和/或打印公差足以容纳光学组件和螺纹插入物。在提供的 STL 文件中，根据制造商指定的尺寸，在径向和轴向光学组件的两侧都添加了 0.01-0.02 英寸的公差。这确保了所有光学元件牢固地安装在打印中，并且外壳完全阻止多余的光线进入或逸出。为了确保适当的按压适合螺纹插入物，从 CAD 文件中制造商提供的直径中减去了 0.01-0.02 英寸的类似公差。
使用第一个氟度测量器配置成功监测了 RPA 反应，而使用任一配置可以监控 RT-LAMP 反应。改进了第一种配置的散射光排斥，以监测 RPA 反应中荧光探头产生的低荧光水平。相比之下，RT-LAMP 使用介相染料进行信号生成，从而产生更高的荧光强度，与使用摄影滤芯的第二个配置的较低动态范围兼容。用户应选择与其测定中的荧光信号生成元素交错染料或荧光探头相匹配的荧光计配置。
该系统的一个限制是，供暖是由一个通过标准墙口供电的市售热块提供的。该系统可以进一步开发，用于缺乏可靠电力供应的地区，包括便携式和可充电电池组，如其他组12所示。另一个限制是系统吞吐量相对较低，允许同时测量一次只有两个样本的荧光。外壳的多个打印可以放置在同一热块上，以增加吞吐量：但是，仅使用的光传感器具有四个独特的 I2C 地址。这限制了可以同时测量到的样本的最大数量为四个。需要具有更多独特 I2C 地址的不同光传感器，以进一步提高吞吐量。

异热放大技术广泛应用于核酸的检测。与传统的PCR方法，需要热循环，同热放大允许核酸放大发生在一个单一的温度，从而使更快的时间，结果和更好的耐受性抑制剂1，2。同热放大的另一个主要好处是仪器复杂性降低。大多数同热放大反应只需要一个热块和一个检测模式-无论是通过荧光监测或端点检测实时检测，例如通过横向流动或凝胶电泳3，4。实时荧光检测通过检测由交错染料产生的荧光来完成，这些染料在双链DNA或淬火荧光探针在特定双链DNA序列存在的情况下激活。
虽然存在市售的台式同热荧光计，但许多氟化物缺乏检测实现的定制性。例如，许多设备需要特定或公司提供的耗材、推荐首选供应商或使用专有软件来获取广告结果。这些系统大多花费超过 5，000 美元，在资源有限设置中广泛使用存在重大障碍。此外，由于环境条件恶劣、备件供应链薄弱以及维护和维修所需的专用工具，低资源环境下的用户在维护高资源环境设备方面面临挑战。为了满足这一需求，这里描述的是一个模块化和低成本的氟度计的设计和组装，该氟计由现成的组件组成，封闭在紧凑的 3D 打印外壳（图 1A-C）中，具有两种可选配置。该设备的第一个配置使用市售的玻璃滤镜和二色镜来阻挡多余的背景光，总组装成本为 830 美元。虽然这些滤镜通常用于荧光成像系统，但更换昂贵的高档光学滤芯之前已被证明允许核酸检测6。氟度计的第二个配置集成了这些廉价的过滤器，并更换了φ1/2"光束分离器的二色镜，将系统的整体成本从 830 美元降低到 450 美元。
装配的代表性图像显示在 图 1 和图 2中的第一个配置中，但第二个配置的类似图像可以在 补充文件 6中找到。为了避免需要专门的光学对齐，光学系统指定了放置每个光学元件的区域，并且可以使用相对低端的 3D 打印机进行，从而广泛使用该设计。两种配置在构造和组装上的唯一区别是用于 3D 打印的文件和放置在外壳中的光学组件。两个系统的 3D 打印外壳的外部尺寸相同。 表1显示了两个系统的成本比较。
如图1A所示，为了保持小的外形，荧光计由Φ1/2"（±12.5毫米）光学元件组成，并配有紧凑的照明和检测，通过PCR管的顶部测量信号。图1中的系统旨在检测峰值激发和发射波长分别为近490纳米和525纳米的染料，包括FITC和密切相关的染料，如SYBR和SYTO-9，它们通常用作实时核酸放大反应7、8的记者。兴奋源、光学滤光片和探测器可以根据需要轻松替代与不同荧光染料兼容的组件。核酸放大反应通常在 PCR 管中执行，氟度计设计用于放置在任何可商用的热块上，该热块可容纳 PCR 管 （图 1D），从而实时监控同热反应。大多数生物医学实验室都提供适当的隔热块，可以低于 500 美元的价格购买。
使用单板计算机为控制成像技术提供低成本的护理点替代方案，此前已有9项证明。基于此工作，在此协议中，单板计算机供电的图形用户界面 （图 1D）用于便于实时数据记录和在护理点显示结果，从而无需笔记本电脑处理或可视化数据。荧光测量通过I2C协议从光传感器转移到微控制器，然后通过串行通信提供给单板计算机。通过在小型面包板上简化布线和焊接，为照明和数据传输提供电气连接，从而消除了对专用印刷电路板 （PCB） 的需求。运行氟度计所需的软件可通过开源软件框架获得，运行设备所需的代码在 补充编码文件中提供。完整的荧光计可以组装在450美元到830美元之间，结果表明，它提供了准确可靠的荧光测量，以监测核酸的实时等热放大。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1/4-inch-long 4-40 threaded insert</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>90742A116</td>
			<td>Used to secure the two sides of the 3D printed optical enclosure together.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10v power supply</td>
			<td>GlobTek, Inc.</td>
			<td>WR9HU1800CCP-F(R6B)</td>
			<td>AC/DC Wall Mount Adapter 10V 18W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mm focal length lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LA 1074</td>
			<td>Two total are used for the fluorimeter. This lens is used to focus the LED illumination.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-inch-long 4-40 screws</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mm focal length lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LA 1540</td>
			<td>Four total are used for the fluorimeter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x WarmStart LAMP Master Mix</td>
			<td>New England Biolabs, Inc</td>
			<td>E1700</td>
			<td>Master mix was used to create the LAMP reactions shown in Figure 3C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5&#8221; Touch Screen</td>
			<td>Uctronics</td>
			<td>BO10601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3/16-inch-long 4-40 screw</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>90128A105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3/16-inch-long 4-40 threaded insert</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>90742A115</td>
			<td>Used to secure the OPT3002 test board onto the 3D printed enclosure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3/8-inch-long 4-40 screws</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>90128A108</td>
			<td>Used to secure the two sides of the 3D printed optical enclosure together.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printer filament</td>
			<td>3D Universe</td>
			<td>UMNFC-PC285-BLACK</td>
			<td>Black or another dark color preferred</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printer used</td>
			<td>Ultimaker</td>
			<td>Ultimaker 2+</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-tube PCR strips</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>#TLS0801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced Mini Dry Block Heater</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>10153-320</td>
			<td>The following heat blocks are acceptable substitutes without the need for redesigning the optical assembly: 949VWMNLUS, 949VWMHLUS, and 949VWMHLEU</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>barrel jack to two-pin adapter</td>
			<td>SparkFun Electronics</td>
			<td>1568-1238-ND</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue Excitation Filter Foil</td>
			<td>LEE</td>
			<td>LE071S</td>
			<td>Selected for use with FITC - other fluorescent dyes may require different filters.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue LED - 460 nm</td>
			<td>Mouser</td>
			<td>LZ1-30DB00-0100</td>
			<td>Selected for use with FITC - other fluorescent dyes may require different parts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic Mirror</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>DMLP505T</td>
			<td>Selected for use with FITC - other fluorescent dyes may require different parts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission Filter</td>
			<td>Edmunds Optics</td>
			<td>OG-515</td>
			<td>Selected for use with FITC - other fluorescent dyes may require different parts. The arrow on the part points away from the illumination source.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excitation Filter</td>
			<td>Omega Filters</td>
			<td>490AESP</td>
			<td>Selected for use with FITC - other fluorescent dyes may require different parts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED Driver</td>
			<td>LEDdynamics</td>
			<td>3021-D-I-700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2.5 Hex Shaped insert</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>91292A009</td>
			<td>Used to secure the Raspberry Pi to the 3D printed LCD Screen Holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcontroller</td>
			<td>Arduino</td>
			<td>Nano</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Breadboard</td>
			<td>Adafruit</td>
			<td>65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular biology-grade mineral oil</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>69794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPT3002EVM - Light-to-Digital Sensor</td>
			<td>Texas Instruments</td>
			<td>OPT3002EVM:</td>
			<td>Light-to-digital sensor used. Consists of two PCBs: a SM-USB_DIG board and the OPT3002 test board; only the OPT3002 test board is needed for this device.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purchased oligonucleotides</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPA kit positive control DNA</td>
			<td>TwistDx Limited</td>
			<td>CONTROL01DNAE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 RNA Control</td>
			<td>Twist Biosciences</td>
			<td>MN908947.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single board computer</td>
			<td>Raspberry Pi</td>
			<td>Raspberry Pi 3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TwistAmp RPA exo kit</td>
			<td>TwistDx Limited</td>
			<td>TAEXO02KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraclear flat caps</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>#TCS0803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yellow Emmission Filter Foil</td>
			<td>LEE</td>
			<td>LE767S</td>
			<td>Selected for use with FITC - other fluorescent dyes may require different parts</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

open-source miniature fluorimeter to monitor real-time isothermal nucleic acid amplification reactions in resource-limited settings

检测和量化核酸的传统方法依赖于聚合酶链反应 （PCR），需要使用昂贵的恒温器，对放大器进行集成荧光检测。同热核酸放大技术消除了热循环的需要：然而，荧光检测产品仍然需要实时，定量的结果。几款带有集成荧光检测的便携式同热加热器现已上市：然而，这些设备的成本仍然是资源有限环境中广泛采用的一大障碍。此处描述的是设计和组装由现成组件构建的模块化低成本氟度计的协议。氟度计采用紧凑的 3D 打印外壳，设计用于放置在可使用 PCR 管的市售热块上。此处描述的氟度计经过优化，可检测荧光乙异氰酸酯 （FITC） 染料，但该系统可与实时核酸放大反应中常用的染料一起进行修改。该系统的临床适用性通过用两种同热放大技术进行实时核酸检测来证明：重组聚合酶放大 （RPA）， 用于检测商业套件中提供的阳性控制 DNA 和反向转录循环介质同热放大 （RT-LAMP），用于检测 SARS-CoV-2 RNA 的临床意义水平。

组装后，可以通过测量 FITC 染料稀释系列的荧光来验证荧光计性能。在 图 3A中，显示了氟度计第一次配置的两个通道上用 1 倍 PBS 对 FITC 染料的浓度进行测量，浓度为 0、20、40、60 和 80 pg/μL。每个样本被测量三次，LED曝光率为1.5 s，间隔为20s。氟度计的两个通道都显示在所需范围内的线性响应。
使用该系统与市售的干热块一起使用 RPA 和 RT-LAMP 两种等热放大技术进行放大，进一步证明了氟度计的临床适用性。
图 3B 演示了在 39 °C 放大 50 μL 实时 RPA 正负控制反应期间测量的荧光基线减去时间过程，这些反应用于标准商业套件中提供的试剂盒阳性控制 DNA，并根据制造商的说明进行准备。RPA反应产生相对较低的荧光水平，使用荧光计的第一个配置进行测量，从而更好地抑制兴奋光。
图3C使用张等人描述的N2、E1和As1e引言集，以及拉贝和Cepko11，在65°C时，演示自定义RT-LAMP检测的时间过程测量。RT-LAMP 反应产生更多的荧光，并使用第二个低成本荧光计配置进行测量。以 1 mM 浓度的 2 倍 TE 缓冲器购买并再分配寡核苷酸。前向内引物 （FIP） 和后内引物 （BIP） 寡头被订购与高性能液相色谱纯化。每套引数（N2， E1 和 As1e） 组合在一起，使 1000 μL 的 25 倍混合如下： 40 μL 的 FIP， 40 μL 的 BIP， 5 μL 的 F3， 5 μL 的 B3， 10 μL 的 LF， 10 μL 的 LB 和 890 μL 的 1x TE 缓冲器.为了组装每个RT-LAMP反应，每套引物的1μL被添加到0.5μL的50倍荧光染料和12.5微L的2倍主混合和反应量被带到20μL与无核糖水根据制造商的指示。SARS-CoV-2 RNA 控制在无核糖水中连续稀释，浓度为每微升 10，100 或 1，000 份，并添加了 5μL，总反应量为 25 μL。所有实验中使用的无靶点控制 （NTC） 是无核糖水。RT-LAMP反应被25μL分子生物学级矿物油覆盖。
RPA 和 RT-LAMP 反应被组装在 0.2 mL 低调的 8 管 PCR 条的两口井中，并盖有超透明的平帽。每个 RPA 和 RT-LAMP 反应都是三元运行的。在所有测试中，微型荧光计成功地量化了与DNA放大相关的荧光水平的时空增加。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62148/62148fig01.jpg"> 图1：光学外壳和组装的微型氟度计在热块之上。 （A） 显示光学元件放置在一个检测通道中的光学外壳图。（B） 组装后微型氟度计第一配置的图。（C） 将光学元件放置在一个检测通道中的光学外壳照片。（D） 组装的微型荧光计的照片放置在市售热块的顶部。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62148/62148fig01large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62148/62148fig02.jpg"> 图2：微型荧光计的组装和电气控制图。A-J） 逐步将光学元件放置在 3D 打印光学外壳中，用于第一个系统配置。（K） 两种配置的微型荧光计的电气图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62148/62148fig02large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62148/62148fig03.jpg"> 图3：用微型荧光计获得的代表性测量值。 （A） 测量的荧光与FITC染料在两个通道中的浓度显示在所需的动态范围内的线性反应。（B） 实时荧光与对市售工具包的正负控制进行等热放大的时间。放大按预期进行正控制。（C） 实时荧光与同热放大时间 50，500 和 5000 份 SARS-CoV-2 RNA 和来自自定义 RT-LAMP 检测的 NTC 样本。放大按预期在检测检测的极限附近发生。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62148/62148fig03large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="2">系统 1</td>
			<td colspan="2">系统 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>项目</td>
			<td>数量</td>
			<td>总价（美元）</td>
			<td>数量</td>
			<td>总价（美元）</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">光学元件</td>
		</tr>
<tr>
<td>镜头</td>
			<td>6</td>
			<td>158.14</td>
			<td>6</td>
			<td>158.14</td>
		</tr>
<tr>
<td>镜子</td>
			<td>2</td>
			<td>244.56</td>
			<td>2</td>
			<td>60</td>
		</tr>
<tr>
<td>光学滤镜</td>
			<td>4</td>
			<td>200</td>
			<td>6</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>小计</td>
			<td>602.7</td>
			<td>小计</td>
			<td>223.14</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">照明和检测</td>
		</tr>
<tr>
<td>LED</td>
			<td>2</td>
			<td>72.62</td>
			<td>2</td>
			<td>72.62</td>
		</tr>
<tr>
<td>LED 驱动程序</td>
			<td>1</td>
			<td>11.49</td>
			<td>1</td>
			<td>11.49</td>
		</tr>
<tr>
<td>光电二极管</td>
			<td>2</td>
			<td>50</td>
			<td>2</td>
			<td>50</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>小计</td>
			<td>134.11</td>
			<td>小计</td>
			<td>134.11</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">电子和显示</td>
		</tr>
<tr>
<td>阿尔杜伊诺纳米</td>
			<td>1</td>
			<td>20.7</td>
			<td>1</td>
			<td>20.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>树莓派</td>
			<td>1</td>
			<td>35</td>
			<td>1</td>
			<td>35</td>
		</tr>
<tr>
<td>液晶屏</td>
			<td>1</td>
			<td>25</td>
			<td>1</td>
			<td>25</td>
		</tr>
<tr>
<td>迷你面包板</td>
			<td>1</td>
			<td>4</td>
			<td>1</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>10V 电源</td>
			<td>1</td>
			<td>8.6</td>
			<td>1</td>
			<td>8.6</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>小计</td>
			<td>93.3</td>
			<td>小计</td>
			<td>93.3</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">总成本（美元）</td>
			<td>830.11</td>
			<td></td>
			<td>450.55</td>
		</tr>
</tbody></table>表1：微型氟度计两种配置的成本比较。 
补充文件1：System1_Optics_Enclosure_Top.stl<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62148/System1_Optics_Enclosure_Top.STL" target="_blank">请点击这里下载此文件。</a>
补充文件2：System1_Optics_Enclosure_Bottom.stl，<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62148/System1_Optics_Enclosure_Bottom.STL" target="_blank">请点击这里下载此文件。</a>
补充文件3：LCD_Screen_Holder.stl<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62148/LCD_Screen_Holder.STL" target="_blank">请点击这里下载此文件。</a>
补充文件4：System2_Optics_Enclosure_Top.stl<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62148/System2_Optics_Enclosure_Top.STL" target="_blank">请点击这里下载此文件。</a>
补充文件5：System2_Optics_Enclosure_Bottom.stl，<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62148/System2_Optics_Enclosure_Bottom.STL" target="_blank">请点击这里下载此文件。</a>
补充文件6：System2_BuildInstructions.pdf<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62148/System2_BuildInstructions.pdf" target="_blank">请点击这里下载此文件。</a> 
补充编码文件1：MiniFluorimeter_2Diode.ino<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62148/MiniFluorimeter_2Diode.ino" target="_blank">请点击这里下载此编码文件。</a>
补充编码文件2：MiniFluorimeter_2Diode_GUI.py<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62148/MiniFluorimeter_2Diode_GUI.zip" target="_blank">请点击这里下载此编码文件。</a>

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Open-Source Miniature Fluorimeter to Monitor Real-Time Isothermal Nucleic Acid Amplification Reactions in Resource-Limited Settings

提供详细的说明，以建立一个开源的模块化氟度计，与许多低成本加热器兼容，以执行实时，定量等热核酸放大。

开源微型氟度计，以监测资源有限设置中的实时异热核酸放大反应

Traditional methods to detect and quantify nucleic acids rely on polymerase chain reaction (PCR) and require the use of expensive thermocyclers with ...

这种方法允许没有电子专业知识的个人制造这种氟度计等仪器，用于同热核酸的放大和检测，这对分子诊断至关重要。该技术的主要优点是，该系统可以完全组装从市售材料和开源软件在低成本。这种氟度计可用于多种等热放大方法。这一点很重要，因为同热放大方法越来越多地用于检测各种传染性和遗传性疾病。要组装光学外壳，请将 3/16 英寸长的 4-40 线程插入光学外壳底部 STL 件顶部的孔中，并将 1/4 英寸长的 4-40 线程插入到该件的所有其他孔中。将中心测试板插入外壳的顶腔，五个引脚朝向顶部，最接近设备的中轴，用 3/16 英寸长的 4-40 螺丝固定测试板。将其中一个 20 毫米焦距透镜放在中心测试板下方的区域，凸面朝向设备底部，远离测试板。要创建第一个配置，将长传滤镜放入 20 毫米焦距镜头下的下一节。要创建第二个配置，请将两个黄色排放滤芯放入镜头下方的部分。要创建第一个配置，将二色镜放入包中心附近的对角线部分，同时观察制造商指定的滤镜方向。要创建第二个配置，将光束拆分器放入对角部分。根据配置，将第二个 20 毫米焦距透镜放入 Dichroic 镜或光束分离器下方的部分，凸面侧指向设备顶部。要创建第一个配置，请将激发滤镜放在 dichroic 镜右侧的区域，确保箭头指向 dichroic 镜。要创建第二个配置，请将一个蓝色激发滤芯放入光束分离器右侧的部分。将 15 毫米焦距镜头放在激发滤镜的右侧，凸面朝向二色镜。并将 LED 放入打印的剩余部分，LED 朝向朝向分光镜或光束分离器，具体取决于配置。确保从 LED 引出的两根电线插入凹槽通道，以便打印紧密关闭。并重复设置为3D打印件的另一侧。然后将包的上半部分挤压到包的下半部分的凹槽中，用光学元件关闭片断的空侧。并将零件与 3/8 英寸长的 4-40 螺丝一起固定。要组装电子产品和触摸屏，将两个迷你面包板连接起来，并将微控制器放入其中一个面包板中，确保微控制器的微 USB 端口朝外。要连接 LED 调制，将 LED+驱动程序的 CTL 销连接到微控制器的数字引脚。并将 LED 驱动程序的 LED 引脚固定在微控制器的 GND 引脚上。取出面包板背面的塑料盖，将面包板的粘合背压到 3D 打印部分，将组合面包板连接到 LCD 屏幕支架 STL 打印件背面的内部。用 1 英寸长的 4-40 螺丝将液晶屏架与组装好的面包板固定在光学外壳内。要连接 LED 电源，将 LED 驱动程序的 LED 正引脚连接到第一个 LED 的正线。并将第一个 LED 的负线连接到面包板上第二个 LED 的正线。将第二个 LED 的负线连接到 LED 驱动程序的 LED 销。要连接 LED 电源，请使用桶插孔到 2 针适配器，将 10 伏电源的正负电线分别连接到 LED 驱动程序的 VIN+和 VIN 销。要连接传感器测试板电源和数据传输，请使用 4 针女性到男性跳线将 SCK、SDA、VDUT 和 GND 销连接到微型面包板，通过 LCD 支架打印右上角的间隙。在面包板上，确认两个测试板的微控制器和 VDUT 引脚的 3.3 伏针、微控制器的 GND 引脚和两个测试板的 GND 引脚、微控制器的模拟 4 针和两个测试板的 SDA 引脚以及微控制器的模拟 5 针，两个测试板的SCK引脚都连接在一起。使用四个 M2.5 螺丝将单板计算机固定在 LCD 屏幕支架上，单板计算机的 HDMI 和电源适配器端口朝上，单板计算机以 3D 打印部分为中心。然后根据触摸屏说明将触摸屏显示屏连接到单板计算机。并将单板计算机的 HDMI 端口连接到触摸屏的 HDMI 端口。要记录实时荧光数据，在热块打开并达到适当的温度后，在单板计算机上通电，并使用微 USB 到 USB 电缆将单板计算机连接到微控制器。打开触摸屏上提供的 Python 脚本并更改测量时间。将可变输出文件路径更改为程序生成的数据文件的名称。并将串行端口变量更改为所需的值。放置两个包含反应的 PCR 管，以便监测到热块中。并将荧光计放在热块上，PCR 管集中在从每个光学通道挤出的四个钉子之间。在确认附加了 3D 打印的氟度计后，插入 LED 的电源适配器并启动 Python 程序。LCD 屏幕上将显示一个图形用户界面，用于测量两个 PCR 管中的实时荧光。在实验结束时，查看保存在用户定义位置的测量和输出数据文件。组装后，可以通过测量 FITC 染料稀释系列的荧光来验证荧光计的性能。在这个具有代表性的分析中，氟度计的两个通道都显示出在所需范围内的线性反应。此处显示了重组酶聚合酶放大阳性的基线减去荧光，以及在荧光计第二个配置上测量的标准商业套件的负控制反应。荧光计第一次配置的SARS-COVID-2 RNA自定义反向转录循环介质等热放大反应的实时荧光测量表明，放大在临床相关RNA拷贝数范围内按预期进行。在全球供应链十分紧张的时候，像这种氟度计这样的开源设备可以帮助我们减少与大流行相关的一些健康不平等。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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