Name: open-source miniature fluorimeter to monitor real-time isothermal nucleic acid amplification reactions in resource-limited settings
Uploaded: 2021-02-03T15:00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Open-Source Miniature Fluorimeter to Monitor Real-Time Isothermal Nucleic Acid Amplification Reactions in Resource-Limited Settings at JoVE.com

Особая благодарность Челси Смит, Меган Чанг, Эмили Ньюшем, Саи Полу и Кристоферу Го за помощь в подготовке образцов. Авторы благодарят Кэролайн Ноксон за доработку рукописи. Финансирование этой работы было предоставлено американским народом USAID через исследовательский грант IAVI CCID 9204 в рамках премии AID-OAA-A16-00032 между IAVI и USAID.

<ol>
	<li>Daher, R. K., Stewart, G., Boissinot, M., Bergeron, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinase+polymerase+amplification+for+diagnostic+applications.">Recombinase polymerase amplification for diagnostic applications.</a> Clinical Chemistry. 62 (7), 947-958 (2016).</li><li>Yan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+Amplified+Detection+of+DNA+and+RNA.">Isothermal Amplified Detection of DNA and RNA.</a> Molecular BioSystems. 10 (5), 970-1003 (2014).</li><li>Giuffrida, M. C., Spoto, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+Isothermal+Amplification+Methods+in+Microfluidic+Devices:+Recent+Advances.">Integration of Isothermal Amplification Methods in Microfluidic Devices: Recent Advances.</a> Biosensors and Bioelectronics. 90, 174-186 (2017).</li><li>Gill, P., Ghaemi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+Acid+Isothermal+Amplification+Technologies-A+Review.">Nucleic Acid Isothermal Amplification Technologies-A Review.</a> Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids. 27 (3), 224-243 (2008).</li><li>Richards-Kortum, R., Oden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Devices+for+Low-Resource+Health+Care.">Devices for Low-Resource Health Care.</a> Science. 342 (6162), 1055-1057 (2013).</li><li>Katzmeier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Low-Cost+Fluorescence+Reader+for+in+vitro+Transcription+and+Nucleic+Acid+Detection+with+Cas13a.">A Low-Cost Fluorescence Reader for in vitro Transcription and Nucleic Acid Detection with Cas13a.</a> PLOS One. 14 (12), e0220091 (2019).</li><li>Safavieh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Loop-Mediated+Isothermal+Amplification-Based+Microchip+and+Microdevice+Technologies+for+Nucleic+Acid+Detection.">Emerging Loop-Mediated Isothermal Amplification-Based Microchip and Microdevice Technologies for Nucleic Acid Detection.</a> ACS Biomaterials Science and Engineering. 2 (3), 278-294 (2016).</li><li>Monis, P. T., Giglio, S., Saint, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+SYTO9+and+SYBR+Green+I+for+Real-Time+Polymerase+Chain+Reaction+and+Investigation+of+the+Effect+of+Dye+concentration+on+Amplifcation+and+DNA+Melting+Curve+Analysis.">Comparison of SYTO9 and SYBR Green I for Real-Time Polymerase Chain Reaction and Investigation of the Effect of Dye concentration on Amplifcation and DNA Melting Curve Analysis.</a> Analytical Biochemistry. 340 (1), 24-34 (2005).</li><li>Parra, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Low-Cost+Point-of-Care+Technologies+for+Cervical+Cancer+Prevention+Based+on+a+Single-Board+Computer.">Development of Low-Cost Point-of-Care Technologies for Cervical Cancer Prevention Based on a Single-Board Computer.</a> IEEE Journal of Translational Engineering in Health and Medicine. 8 (4300210), (2020).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+Colorimetric+Loop-Mediated+Isothermal+Amplification+Speed+and+Sensitivity+with+Guanidine+Chloride.">Enhancing Colorimetric Loop-Mediated Isothermal Amplification Speed and Sensitivity with Guanidine Chloride.</a> Biotechniques. 69 (3), 178-185 (2020).</li><li>Rabe, B. A., Cepko, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+Detection+Using+an+Isothermal+Amplification+Reaction+and+a+Rapid,+Inexpensive+Protocol+for+Sample+Inactivation+and+Purification.">SARS-CoV-2 Detection Using an Isothermal Amplification Reaction and a Rapid, Inexpensive Protocol for Sample Inactivation and Purification.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (39), 24450-24458 (2020).</li><li>Snodgrass, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Portable+Device+for+Nucleic+Acid+Quantification+Powered+by+Sunlight,+a+Flame+or+Electricity.">A Portable Device for Nucleic Acid Quantification Powered by Sunlight, a Flame or Electricity.</a> Nature Biomedical Engineering. 2 (9), 657-665 (2018).</li></ol>

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Здесь описан недорогой модульный флуориметр с открытым исходным кодом для количественного флуоресцентного обнаружения реакций изотермической амплификации. Проекты с открытым исходным кодом облегчают быстрое и недорогое техническое обслуживание с помощью легкодоступных запасных частей и позволяют пользователям гибко адаптировать систему к своим потребностям на основе модульной конструкции. Этот протокол описывает процесс сборки механических, оптических и электрических компонентов и проверки оптических характеристик. Кроме того, была продемонстрирована гибкость флуориметра для мониторинга двух различных типов анализов изотермической амплификации со значительно отличающихся требованиями к температуре, объему и флуоресценции, RPA exo и RT-LAMP. RPA выполняют при 39 °C в реакциях 50 мкл, в которые используют специфический для последовательности FAM-помеченный зонд для генерации флуоресценции, в то время как RT-LAMP выполняется при 65 °C в реакционном объеме 25 мкл и использует интеркалирующий краситель для сообщения о присутствии амплифицированной ДНК. Поскольку измерения флуоресценции производятся через верхнюю часть ПЦР-трубок с плоскими колпачками, флуориметр способен обнаруживать флуоресценцию из обоих объемов анализа, а требования к теплу ограничены только выбранным коммерческим тепловым блоком. Кроме того, интенсивность флуоресценции, производимая в RT-LAMP, почти на порядок больше, чем в RPA, благодаря методам генерации флуоресцентного сигнала на основе красителя и зонда. Однако динамический диапазон выбранного оптического датчика может обнаруживать и количественно оценивать как сигналы, так и алгоритмы вычитания исходных условий учитывают эти различия для получения надежных показаний флуоресценции.
Для облегчения распространения технологий и минимизации потенциальных затрат на техническое обслуживание была использована модульная конструкция, совместимая с нагревателями, которые широко доступны в различных условиях. В действующем протоколе использовался обычный сухой блок нагреватель; такая же оптическая и электрическая конструкция может быть легко адаптирована для других коммерчески доступных нагревателей. Если будет использоваться еще один сухой блочный нагреватель, потребуются минимальные изменения в конструкции 3D-корпуса. В частности, нижние колышки файлов STL оптического корпуса должны быть изменены для обеспечения надлежащего выравнивания с скважинами других коммерческих тепловых блоков. Хотя корпуса, показанные в примерах, были напечатаны на относительно недорогом 3D-принтере (см. Таблицу материалов),следует позаботиться о том, чтобы разрешение принтера и/или допуски печати были адекватными для размещения оптических компонентов и резьбовых вставок. В предоставленных файлах STL допуск 0,01-0,02 дюйма был добавлен по обе стороны оптических компонентов в радиальном и осевом направлениях в зависимости от размеров, указанных производителем. Это гарантирует, что все оптические компоненты надежно помещаются в печать и что корпус полностью блокирует попадание или выход лишнего света. Чтобы обеспечить надлежащую посадку пресса для резьбовых вставок, аналогичный допуск 0,01-0,02 дюйма был вычтен из диаметра, предоставленного производителем в файле CAD.
Реакции RPA успешно контролировались с использованием первой конфигурации флуориметра, в то время как реакции RT-LAMP можно было контролировать с использованием любой конфигурации. Улучшенное отклонение рассеянного света первой конфигурации было необходимо для мониторинга низких уровней флуоресценции, производимой флуорогенной зондой в реакциях RPA. Напротив, RT-LAMP использует интеркалирующий краситель для генерации сигнала, что приводит к более высокой интенсивности флуоресценции, совместимой с более низким динамическим диапазоном второй конфигурации с использованием фотофильтрующей фольги. Пользователи должны выбрать конфигурацию флуориметра, которая соответствует флуоресцентным сигналу, генерирующему элемент-интеркалирующий краситель или флуорогенный зонд- их анализа.
Одним из ограничений этой системы является то, что отопление обеспечивается коммерчески доступным тепловым блоком, питаемым через стандартную настенную розетку. Эта система может быть дополнительно разработана для использования в районах, где отсутствует надежный доступ к электричеству, путем включения портативных и перезаряжаемых аккумуляторных батарей, как показано другими группами12. Другим ограничением является относительно низкая пропускная способность системы, которая позволяет одновременно измерять флуоресценцию только двух образцов одновременно. Несколько отпечатков корпуса могут быть размещены поверх одного и того же теплового блока для увеличения пропускной способности; однако используемый датчик освещенности имеет только четыре уникальных адреса I2C. Это ограничивает максимальное количество образцов, которые могут быть одновременно измерены, до четырех. Для дальнейшего увеличения пропускной способности необходим другой датчик освещенности с большим количеством уникальных адресов I2C.

Технологии изотермической амплификации широко используются для обнаружения нуклеиновых кислот. По сравнению с традиционными подходами ПЦР, которые требуют термоциклирования, изотермическая амплификация позволяет амплификации нуклеиновых кислот происходить при одной температуре, что позволяет ускорить время получения результатов и лучшую переносимость ингибиторов1,2. Еще одним ключевым преимуществом изотермического усиления является снижение сложности приборов. Большинство реакций изотермической амплификации требуют только теплового блока и метода обнаружения - либо обнаружения в режиме реального времени с помощью флуоресцентного мониторинга, либо обнаружения конечных точек, например, боковым потоком или гелевым электрофорезом3,4. Обнаружение флуоресценции в реальном времени осуществляется путем обнаружения флуоресценции, полученной путем интеркалирования красителей, которые активируются в присутствии двухцепочечной ДНК или закаленных флуоресцентных зондов, которые активируются в присутствии специфических двухцепочечных последовательностей ДНК.
В то время как коммерчески доступные настольные изотермические фториметры существуют, многим не хватает настройки для реализации анализа. Например, многие устройства требуют специальных или предоставленных компанией расходных материалов, рекомендуют предпочтительных поставщиков или используют проприетарное программное обеспечение для получения рекламируемых результатов. Большинство из этих систем стоят более 5000 долларов США, что представляет собой значительный барьер для широкого использования в условиях ограниченных ресурсов. Кроме того, пользователи в условиях ограниченных ресурсов сталкиваются с проблемами обслуживания оборудования, предназначенного для высокоресурсных условий из-за суровых условий окружающей среды, слабых цепочек поставок запасных частей и специализированных инструментов, необходимых для технического обслуживания и ремонта5. Для удовлетворения этой потребности здесь описана конструкция и сборка модульного и недорогого флуориметра, изготовленного из готовых компонентов, заключенных в компактный корпус с 3D-печатью(рисунки 1A-C)с двумя дополнительными конфигурациями. Первая конфигурация этого устройства использует коммерчески доступные стеклянные фильтры и дихроичное зеркало для блокировки избыточного фонового света и имеет общую стоимость сборки в размере 830 долларов США. Хотя эти фильтры обычно используются в системах визуализации на основе флуоресценции, ранее было показано, что замена дорогостоящих высококачественных оптических фильтрующих фольг позволяет обнаруживать нуклеиновые кислоты6. Вторая конфигурация флуориметра включает в себя эти недорогие фильтры и заменяет дихроичные зеркала на φ1/2", снижая общую стоимость системы с 830 до 450 долларов США.
Репрезентативные изображения сборки показаны для первой конфигурации на рисунках 1 и 2,но аналогичные изображения для второй конфигурации можно найти в дополнительном файле 6. Чтобы избежать необходимости в специализированном оптическом выравнивании, оптическая система имеет выделенные области для размещения каждого оптического компонента и может быть изготовлена с помощью относительно недорогого 3D-принтера, что позволяет широко использовать конструкцию. Единственными различиями в конструкции и сборке для двух конфигураций являются файлы, используемые для 3D-печати, и оптические компоненты, размещенные в корпусе. Внешние размеры 3D-печатного корпуса для обеих систем одинаковы. Сравнение стоимости этих двух систем приведено в таблице 1.
Как показано на рисунке 1A,для поддержания малого форм-фактора флуориметр состоит из оптики Φ1/2" (~12,5 мм) в сочетании с компактной подсветкой и детектированием, которые размещаются для измерения сигнала через верхнюю часть ПЦР-трубки. Система на фиг.1 предназначена для обнаружения красителей с пиковым возбуждением и длинами волн излучения около 490 нм и 525 нм соответственно, включая FITC и тесно связанные с ним красители, такие как SYBR и SYTO-9, которые обычно используются в качестве репортеров в реакциях амплификации нуклеиновых кислот в реальномвремени 7,8. Источник возбуждения, оптические фильтры и детектор могут быть легко заменены компонентами, совместимыми с различными флуоресцентными красителями по желанию. Реакции амплификации нуклеиновых кислот обычно выполняются в ПЦР-трубках, а флуориметр предназначен для размещения поверх любого коммерчески доступного теплового блока, который содержит трубкиПЦР (рисунок 1D),что позволяет осуществлять мониторинг изотермических реакций в режиме реального времени. Соответствующие тепловые блоки доступны в большинстве биомедицинских лабораторий и могут быть приобретены менее чем за 500 долларов США.
Использование одноплатных компьютеров для обеспечения недорогой альтернативы в месте оказания медицинской помощи для управления технологиями визуализации было ранее продемонстрировано9. Основываясь на этой работе, в этом протоколе используется одноплатный графический пользовательский интерфейс на базе компьютера(рисунок 1D)для облегчения регистрации данных в режиме реального времени и отображения результатов в месте оказания помощи, устраняя необходимость в том, чтобы портативный компьютер обрабатывал или визуализировал данные. Измерения флуоресценции передавались по протоколу I2C от датчиков освещенности к микроконтроллеру, а затем стали доступны для одноплатного компьютера через последовательную связь. Электрические соединения для освещения и передачи данных были обеспечены за счет упрощенной проводки и пайки на миниатюрных макетных платах, что сводило на нет необходимость в специализированных печатных платах (PCB). Программное обеспечение, необходимое для запуска флуориметра, доступно через программные платформы с открытым исходным кодом, а код, необходимый для запуска устройства, предоставляется в дополнительных файлах кодирования. Полный флуориметр может быть собран за сумму от 450 до 830 долларов США, и результаты показывают, что он обеспечивает точные и надежные измерения флуоресценции для мониторинга изотермического усиления нуклеиновых кислот в режиме реального времени.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1/4-inch-long 4-40 threaded insert</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>90742A116</td>
			<td>Used to secure the two sides of the 3D printed optical enclosure together.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10v power supply</td>
			<td>GlobTek, Inc.</td>
			<td>WR9HU1800CCP-F(R6B)</td>
			<td>AC/DC Wall Mount Adapter 10V 18W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mm focal length lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LA 1074</td>
			<td>Two total are used for the fluorimeter. This lens is used to focus the LED illumination.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-inch-long 4-40 screws</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mm focal length lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LA 1540</td>
			<td>Four total are used for the fluorimeter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x WarmStart LAMP Master Mix</td>
			<td>New England Biolabs, Inc</td>
			<td>E1700</td>
			<td>Master mix was used to create the LAMP reactions shown in Figure 3C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5&#8221; Touch Screen</td>
			<td>Uctronics</td>
			<td>BO10601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3/16-inch-long 4-40 screw</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>90128A105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3/16-inch-long 4-40 threaded insert</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>90742A115</td>
			<td>Used to secure the OPT3002 test board onto the 3D printed enclosure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3/8-inch-long 4-40 screws</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>90128A108</td>
			<td>Used to secure the two sides of the 3D printed optical enclosure together.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printer filament</td>
			<td>3D Universe</td>
			<td>UMNFC-PC285-BLACK</td>
			<td>Black or another dark color preferred</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printer used</td>
			<td>Ultimaker</td>
			<td>Ultimaker 2+</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-tube PCR strips</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>#TLS0801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced Mini Dry Block Heater</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>10153-320</td>
			<td>The following heat blocks are acceptable substitutes without the need for redesigning the optical assembly: 949VWMNLUS, 949VWMHLUS, and 949VWMHLEU</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>barrel jack to two-pin adapter</td>
			<td>SparkFun Electronics</td>
			<td>1568-1238-ND</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue Excitation Filter Foil</td>
			<td>LEE</td>
			<td>LE071S</td>
			<td>Selected for use with FITC - other fluorescent dyes may require different filters.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue LED - 460 nm</td>
			<td>Mouser</td>
			<td>LZ1-30DB00-0100</td>
			<td>Selected for use with FITC - other fluorescent dyes may require different parts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic Mirror</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>DMLP505T</td>
			<td>Selected for use with FITC - other fluorescent dyes may require different parts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission Filter</td>
			<td>Edmunds Optics</td>
			<td>OG-515</td>
			<td>Selected for use with FITC - other fluorescent dyes may require different parts. The arrow on the part points away from the illumination source.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excitation Filter</td>
			<td>Omega Filters</td>
			<td>490AESP</td>
			<td>Selected for use with FITC - other fluorescent dyes may require different parts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED Driver</td>
			<td>LEDdynamics</td>
			<td>3021-D-I-700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2.5 Hex Shaped insert</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>91292A009</td>
			<td>Used to secure the Raspberry Pi to the 3D printed LCD Screen Holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcontroller</td>
			<td>Arduino</td>
			<td>Nano</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Breadboard</td>
			<td>Adafruit</td>
			<td>65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular biology-grade mineral oil</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>69794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPT3002EVM - Light-to-Digital Sensor</td>
			<td>Texas Instruments</td>
			<td>OPT3002EVM:</td>
			<td>Light-to-digital sensor used. Consists of two PCBs: a SM-USB_DIG board and the OPT3002 test board; only the OPT3002 test board is needed for this device.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purchased oligonucleotides</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPA kit positive control DNA</td>
			<td>TwistDx Limited</td>
			<td>CONTROL01DNAE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 RNA Control</td>
			<td>Twist Biosciences</td>
			<td>MN908947.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single board computer</td>
			<td>Raspberry Pi</td>
			<td>Raspberry Pi 3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TwistAmp RPA exo kit</td>
			<td>TwistDx Limited</td>
			<td>TAEXO02KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraclear flat caps</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>#TCS0803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yellow Emmission Filter Foil</td>
			<td>LEE</td>
			<td>LE767S</td>
			<td>Selected for use with FITC - other fluorescent dyes may require different parts</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

open-source miniature fluorimeter to monitor real-time isothermal nucleic acid amplification reactions in resource-limited settings

Традиционные методы обнаружения и количественной оценки нуклеиновых кислот основаны на полимеразной цепной реакции (ПЦР) и требуют использования дорогостоящих термоциклеров с интегрированным флуоресцентным обнаружением ампликонов. Технологии амплификации изотермических нуклеиновых кислот устраняют необходимость в тепловом цикле; однако для получения количественных результатов в режиме реального времени по-прежнему требуется обнаружение продуктов на основе флуоресценции. В настоящее время коммерчески доступно несколько портативных изотермических нагревателей со встроенным флуоресцентным детектированием; однако стоимость этих устройств остается значительным препятствием для широкого внедрения в условиях ограниченных ресурсов. Здесь описан протокол для проектирования и сборки модульного, недорогого флуориметра, изготовленного из готовых компонентов. Флуориметр, заключенный в компактный корпус с 3D-печатью, предназначен для размещения на коммерчески доступном тепловом блоке, удерживаемом трубкой ПЦР. Описанный здесь флуориметр был оптимизирован для обнаружения красителя флуоресцеина изотиоцианата (FITC), но система может быть модифицирована для использования с красителями, обычно используемыми в качестве репортеров в реакциях амплификации нуклеиновых кислот в режиме реального времени. Клиническая применимость системы демонстрируется путем выполнения детектирования нуклеиновых кислот в режиме реального времени с помощью двух технологий изотермической амплификации: амплификации полимеразы рекомбиназы (RPA) для обнаружения положительной контрольной ДНК, предоставляемой в коммерческом наборе, и обратной транскрипционной петлево-опосредооцированной изотермической амплификации (RT-LAMP) для обнаружения клинически значимых уровней РНК SARS-CoV-2.

После сборки производительность флуориметра может быть проверена путем измерения флуоресценции из серии разбавления красителя FITC. На фиг.3Апоказаны измерения красителя FITC в концентрациях 0, 20, 40, 60 и 80 пг/мкл, приготовленного в 1x PBS на обоих каналах первой конфигурации флуориметра. Каждый образец измеряли три раза с экспозицией светодиодов 1,5 с интервалом 20 с. Оба канала флуориметра показывают линейный отклик в нужном диапазоне.
Клиническая применимость флуориметра была дополнительно продемонстрирована путем использования системы вместе с коммерчески доступным сухим тепловым блоком для выполнения усиления с помощью двух технологий изотермического усиления: RPA и RT-LAMP.
На рисунке 3В показан вычитаемый исходным уровнем временной ход флуоресценции, измеренный при амплификации при 39 °C 50 мкл положительных и отрицательных реакций контроля RPA в реальном времени для набора положительной контрольной ДНК, поставляемой в стандартном коммерческом комплекте и подготовленной в соответствии с инструкциями производителя. Реакции RPA, которые производят относительно низкий уровень флуоресценции, были измерены с использованием первой конфигурации флуориметра, которая обеспечивает лучшее подавление света возбуждения.
На рисунке 3C показано измерение временного хода пользовательского анализа RT-LAMP при 65 °C с использованием наборов грунтов N2, E1 и As1e, описанных Zhang et al10,а также Rabe и Cepko11. Реакции RT-LAMP производят большее количество флуоресценции и были измерены с использованием второй, более недорогой конфигурации флуориметра. Олигонуклеотиды закупали и повторно суспендировали в буфере 2x TE при концентрации 1 мМ. Олигосы прямой внутренней грунтовки (FIP) и обратной внутренней грунтовки (BIP) были заказаны с высокоэффективной очисткой жидкостной хроматографии. Каждый набор праймеров (N2, E1 и As1e) комбинировали, чтобы получить 1000 мкл 25-кратной смеси следующим образом: 40 мкл FIP, 40 мкл BIP, 5 мкл F3, 5 мкл B3, 10 мкл LF, 10 мкл LB и 890 мкл 1x TE буфера. Для сборки каждой реакции RT-LAMP 1 мкл каждого набора праймеров добавляли к 0,5 мкл 50-кратного флуоресцентного красителя и 12,5 мкл 2-кратной мастер-смеси, а реакционный объем доводили до 20 мкл водой без нуклеазы в соответствии с инструкциями производителя. Контроль РНК SARS-CoV-2 последовательно разбавляли в воде без нуклеазы до концентраций 10, 100 или 1000 копий на мкл, и добавляли 5 мкл для общего объема реакции 25 мкл. Бесцелевая система контроля (NTC), используемая во всех экспериментах, представляла воду без нуклеаз. Реакции RT-LAMP были покрыты 25 мкл минерального масла молекулярной биологии.
Реакции RPA и RT-LAMP были собраны в двух скважинах низкопрофильной 8-трубчатой ПЦР-полосы 0,2 мл и увенчаны ультраклеарными плоскими колпачками. Каждая реакция RPA и RT-LAMP была запущена в трех вариантах. Во всех тестах мини-флуориметр успешно количественно оценивал временное увеличение уровней флуоресценции, связанных с амплификацией ДНК.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62148/62148fig01.jpg"> Рисунок 1:Оптический корпус и собранный миниатюрный флуориметр на вершине теплового блока. (A) Диаграмма оптического корпуса, показывающая оптические компоненты, размещенные в одном канале обнаружения. (B) Схема первой конфигурации миниатюрного флуориметра после сборки. (C)Фотография оптического корпуса с оптическими компонентами, размещенными в одном канале обнаружения. (D) Фотография собранного миниатюрного флуориметра, размещенного поверх коммерчески доступного теплового блока. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62148/62148fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62148/62148fig02.jpg"> Рисунок 2:Схема сборки и электроконтроля миниатюрного флуориметра. A-J) Поэтапное размещение оптических компонентов в 3D-печатном оптическом корпусе для первой конфигурации системы. (K) Электрическая схема миниатюрного флуориметра для обеих конфигураций. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62148/62148fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62148/62148fig03.jpg"> Рисунок 3:Репрезентативные измерения, полученные с помощью миниатюрного флуориметра. (A) Измеренная флуоресценция по сравнению с концентрацией красителя FITC в обоих каналах показывает линейный отклик в желаемом динамическом диапазоне. (B)Флуоресценция в реальном времени в сравнении со временем изотермического усиления положительных и отрицательных элементов управления коммерчески доступного комплекта. Усиление происходит, как и ожидалось для положительного контроля. (C)Флуоресценция в реальном времени в сравнении со временем изотермического усиления 50, 500 и 5000 копий РНК SARS-CoV-2 и образца NTC из пользовательского анализа RT-LAMP. Усиление происходит, как и ожидалось, вблизи предела обнаружения анализа. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62148/62148fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="2">Система 1</td>
			<td colspan="2">Система 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>пункт</td>
			<td>количество</td>
			<td>Общая стоимость (USD)</td>
			<td>количество</td>
			<td>Общая стоимость (USD)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">Оптические компоненты</td>
		</tr>
<tr>
<td>Линзы</td>
			<td>6</td>
			<td>158.14</td>
			<td>6</td>
			<td>158.14</td>
		</tr>
<tr>
<td>Зеркала</td>
			<td>2</td>
			<td>244.56</td>
			<td>2</td>
			<td>60</td>
		</tr>
<tr>
<td>Оптические фильтры</td>
			<td>4</td>
			<td>200</td>
			<td>6</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>промежуточная сумма</td>
			<td>602.7</td>
			<td>промежуточная сумма</td>
			<td>223.14</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">Освещение и обнаружение</td>
		</tr>
<tr>
<td>Светодиоды</td>
			<td>2</td>
			<td>72.62</td>
			<td>2</td>
			<td>72.62</td>
		</tr>
<tr>
<td>Светодиодный драйвер</td>
			<td>1</td>
			<td>11.49</td>
			<td>1</td>
			<td>11.49</td>
		</tr>
<tr>
<td>фотодиод</td>
			<td>2</td>
			<td>50</td>
			<td>2</td>
			<td>50</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>промежуточная сумма</td>
			<td>134.11</td>
			<td>промежуточная сумма</td>
			<td>134.11</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">Электроника и дисплей</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ардуино Нано</td>
			<td>1</td>
			<td>20.7</td>
			<td>1</td>
			<td>20.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>Малина Пи</td>
			<td>1</td>
			<td>35</td>
			<td>1</td>
			<td>35</td>
		</tr>
<tr>
<td>ЖК-экран</td>
			<td>1</td>
			<td>25</td>
			<td>1</td>
			<td>25</td>
		</tr>
<tr>
<td>Мини макет</td>
			<td>1</td>
			<td>4</td>
			<td>1</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>Блок питания 10 В</td>
			<td>1</td>
			<td>8.6</td>
			<td>1</td>
			<td>8.6</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>промежуточная сумма</td>
			<td>93.3</td>
			<td>промежуточная сумма</td>
			<td>93.3</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Общая стоимость (USD)</td>
			<td>830.11</td>
			<td></td>
			<td>450.55</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 1: Сравнение стоимости двух конфигураций миниатюрного флуориметра. 
Дополнительный файл 1: System1_Optics_Enclosure_Top.stl <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62148/System1_Optics_Enclosure_Top.STL" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.</a>
Дополнительный файл 2: System1_Optics_Enclosure_Bottom.stl, и, пожалуйста, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62148/System1_Optics_Enclosure_Bottom.STL" target="_blank">нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.</a>
Дополнительный файл 3: LCD_Screen_Holder.stl <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62148/LCD_Screen_Holder.STL" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.</a>
Дополнительный файл 4: System2_Optics_Enclosure_Top.stl <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62148/System2_Optics_Enclosure_Top.STL" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.</a>
Дополнительный файл 5: System2_Optics_Enclosure_Bottom.stl, и пожалуйста, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62148/System2_Optics_Enclosure_Bottom.STL" target="_blank">нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.</a>
Дополнительный файл 6: System2_BuildInstructions.pdf <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62148/System2_BuildInstructions.pdf" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.</a> 
Дополнительный файл кодирования 1: MiniFluorimeter_2Diode.ino <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62148/MiniFluorimeter_2Diode.ino" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл кодирования.</a>
Дополнительный файл кодирования 2: MiniFluorimeter_2Diode_GUI.py <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62148/MiniFluorimeter_2Diode_GUI.zip" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл кодирования.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Open-Source Miniature Fluorimeter to Monitor Real-Time Isothermal Nucleic Acid Amplification Reactions in Resource-Limited Settings at JoVE.com

Open-Source Miniature Fluorimeter to Monitor Real-Time Isothermal Nucleic Acid Amplification Reactions in Resource-Limited Settings

Приведены подробные инструкции по созданию модульного флуориметра с открытым исходным кодом, совместимого со многими недорогими нагревателями для выполнения количественного усиления изотермических нуклеиновых кислот в режиме реального времени.

Миниатюрный флуориметр с открытым исходным кодом для мониторинга реакций амплификации изотермических нуклеиновых кислот в режиме реального времени в условиях ограниченных ресурсов

Traditional methods to detect and quantify nucleic acids rely on polymerase chain reaction (PCR) and require the use of expensive thermocyclers with ...

Этот метод позволяет людям без опыта в области электроники создавать такие инструменты, как этот флуориметр для амплификации и обнаружения изотермических нуклеиновых кислот, что имеет решающее значение для молекулярной диагностики. Основным преимуществом данной методики является то, что система может быть полностью собрана из коммерчески доступных материалов и программного обеспечения с открытым исходным кодом при низких затратах. Этот флуориметр может использоваться с несколькими изотермическими методами амплификации.Это важно, поскольку методы изотермической амплификации все чаще используются для выявления широкого спектра инфекционных и наследственных заболеваний. Чтобы собрать оптический корпус, поместите 3/16-дюймовую резьбовую вставку длиной 4-40 в отверстие поверх нижней части корпуса оптики STL и поместите резьбовую вставку длиной 1/4 дюйма 4-40 во все другие отверстия детали. Вставьте центральную испытательную плату в верхнюю полость корпуса с пятью контактами, обращенными к верхней и ближайшей к центральной оси устройства, и закрепите испытательную плату винтом длиной 3/16 дюйма 4-40.Поместите один из объективов с фокусным расстоянием 20 миллиметров в секцию под центральной испытательной доской выпуклой стороной, обращенной к нижней части устройства и в стороне от испытательной доски. Чтобы создать первую конфигурацию, поместите фильтр длинных проходов в следующую секцию под объективом с фокусным расстоянием 20 миллиметров. Чтобы создать вторую конфигурацию, поместите две желтые пленки эмиссионного фильтра в секцию под объективом.Чтобы создать первую конфигурацию, поместите дихроичное зеркало в диагональную секцию вблизи центра оболочки, соблюдая ориентацию фильтра, указанную производителем. Чтобы создать вторую конфигурацию, поместите светоотвод в диагональную секцию. Поместите второй объектив с фокусным расстоянием 20 миллиметров в секцию под дихроичным зеркалом или делителя луча в зависимости от конфигурации, причем выпуклая сторона направлена к верхней части устройства.Чтобы создать первую конфигурацию, поместите фильтр возбуждения в секцию справа от дихроичного зеркала, убедившись, что стрелка указывает на дихроичное зеркало. Чтобы создать вторую конфигурацию, поместите одну синюю фольгу фильтра возбуждения в секцию справа от светоотвотрателя. Поместите объектив с 15-миллиметровым фокусным расстоянием справа от фильтра возбуждения выпуклой стороной лицом к дихроичному зеркалу.И поместите светодиод в оставшуюся часть печати, а светодиод будет направлен к дихроичному зеркалу или разветвителю луча, в зависимости от конфигурации. Убедитесь, что два провода, ведущие от светодиода, вставлены в каналы углубления, чтобы печать плотно закрылась. И повторите настройку для другой стороны 3D-печати.Затем поместите экструдированные части верхней половины оболочки в утопленные канавки нижней половины оболочки, чтобы закрыть пустую сторону куска оптическими компонентами. И закрепите детали вместе с помощью винтов длиной 3/8 дюйма 4-40. Чтобы собрать электронику и сенсорный экран, подключите две мини-макетные платы и поместите микроконтроллер в одну из макетных плат, гарантируя, что порт micro-USB микроконтроллера обращен наружу.Чтобы подключить светодиодную модуляцию, подключите CTL-контакт драйвера LED+к цифровому контакту микроконтроллера. И LED-контакт светодиодного драйвера к GND-контакту микроконтроллера. Снимите пластиковые крышки на задней части макетных плат и прижмите клеевую подложку макетных плат к 3D-печатной части, чтобы прикрепить комбинированные макетные платы к внутренней части задней части держателя ЖК-экрана STL, напечатанного на STL.Закрепите держатель ЖК-экрана с помощью собранных макетных плат внутри оптического корпуса с помощью винтов длиной 1 дюйм 4-40. Чтобы подключить светодиодный источник питания, подключите led-положительный контакт светодиодного драйвера к положительному проводу первого светодиода. И подключите отрицательный провод первого светодиода к положительному проводу второго светодиода на макетной плате.Подключите отрицательный провод второго светодиода к LED-контакту светодиодного драйвера. Для подключения светодиодного блока питания используйте бочковой разъем к 2-контактному адаптеру для подключения положительного и отрицательного проводов 10-вольтового блока питания к VIN+ и VIN-контактам светодиодного драйвера соответственно. Чтобы подключить блок питания тестовой платы датчика и передачу данных, используйте 4-контактный провод от гнезда к мужской перемычке для подключения контактов SCK, SDA, VDUT и GND на платах тестирования датчиков light-to-digital к мини-макетной плате через зазор в правом верхнем углу отпечатка держателя ЖК-дисплея.На макетной плате убедитесь, что 3,3-вольтовый контакт микроконтроллера и контакт VDUT обеих тестовых плат, GND-контакт микроконтроллера и GND-контакт обеих тестовых плат, аналоговый 4-контактный микроконтроллер и контакт SDA обеих тестовых плат и аналоговый 5-контактный микроконтроллер , и контакт SCK обеих испытательных плат соединен. Используйте четыре винта M2.5 для крепления одноплатного компьютера к держателю ЖК-экрана, при этом порты HDMI и адаптера питания одноплатного компьютера направлены вверх, а одноплатный компьютер сосредоточен на 3D-печатной детали. Затем подключите сенсорный дисплей к одноматному компьютеру в соответствии с инструкциями сенсорного экрана.И подключите порт HDMI одноплатного компьютера к порту HDMI сенсорного экрана. Для записи данных флуоресценции в режиме реального времени после того, как тепловой блок был включен и достиг соответствующей температуры, включите одноплатный компьютер и используйте кабель micro-USB-USB для подключения одноплатного компьютера к микроконтроллеру. Откройте предоставленный скрипт Python на сенсорном экране и измените время измерения.Измените путь к выходному файлу переменной на имя файла данных, создаваемого программой. И измените переменные последовательного порта на нужные значения. Поместите в тепловой блок две трубки ПЦР, содержащие реакции, которые необходимо контролировать.И поместите флуориметр на тепловой блок с трубками ПЦР, центрированными между четырьмя колышками, выдавливающимися из каждого оптического канала. После подтверждения того, что 3D-печатный флуориметр подключен, подключите адаптер питания для светодиодов и запустите программу Python. На ЖК-экране появится графический пользовательский интерфейс для измерения флуоресценции в режиме реального времени в обеих ПЦР-трубках.В конце эксперимента просмотрите измерения и файлы выходных данных, сохраненные в заданном пользователем расположении. После сборки производительность флуориметра может быть проверена путем измерения флуоресценции из серии разбавления красителя FITC. В этом репрезентативном анализе оба канала флуориметра показали линейный отклик в желаемом диапазоне.Здесь показаны исходные вычитаемые флуоресценции положительной и отрицательной реакции управления армификацией полимеразы рекомбиназы и отрицательные реакции управления стандартного коммерческого комплекта, измеренные на второй конфигурации флуориметра. Измерения флуоресценции в режиме реального времени пользовательской реакции изотермической амплификации с петлевой обратной транскрипцией для РНК SARS-COVID-2 на первой конфигурации флуориметра показывают, что амплификация происходит, как и ожидалось, в клинически значимом диапазоне числа копий РНК. В то время, когда глобальные цепочки поставок очень напряжены, оборудование с открытым исходным кодом, такое как этот флуориметр, может помочь нам уменьшить некоторые неравенства в отношении здоровья, связанные с пандемией.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Simultaneously Capturing Real-time Images in Two Emission Channels Using a Dual Camera Emission Splitting System: Applications to Cell Adhesion

Одновременно Захват изображения в реальном времени в двух выбросов каналов Использование Разделение системы двойной камеры выбросов: Заявки на клеточной адгезии

Multi-color immunofluorescence microscopy to detect specific molecules in the cell membrane can be coupled with parallel plate flow chamber assays to ...

Culturing Mouse Cardiac Valves in the Miniature Tissue Culture System

Культивирование мыши сердечных клапанов в миниатюре культуры тканевой системе

Heart valve disease is a major burden in the Western world and no effective treatment is available. This is mainly due to a lack of knowledge of the ...

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

Недвижимость Мониторинг Время внутриклеточного желчных кислот Dynamics Использование генетически кодируемых FRET основе желчных кислот датчик

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

Протокол для слежения в реальном времени 3D одной частицы

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

На Ситу Микроскопия для определения одноклеточной морфологии в биопроцессах в режиме реального времени

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved ...

Manufacturing of a Nafion-coated, Reduced Graphene Oxide/Polyaniline Chemiresistive Sensor to Monitor pH in Real-time During Microbial Fermentation

Изготовление Nafion покрытием, снижение графена оксид/полианилин Chemiresistive датчик pH монитора в реальном времени во время микробной ферментации

Here, we report the engineering of a solid-state micro pH sensor based on polyaniline-functionalized, electrochemically reduced graphene oxide (ERGO-PA). ...

Real-time Visualization and Analysis of Chondrocyte Injury Due to Mechanical Loading in Fully Intact Murine Cartilage Explants

В реальном времени визуализации и анализа хондроцитов травмы вследствие механической загрузки в полной сохранности мышиных хряща эксплантов

Homeostasis of articular cartilage depends on the viability of resident cells (chondrocytes). Unfortunately, mechanical trauma can induce widespread ...

A Tripeptide-Stabilized Nanoemulsion of Oleic Acid

Трипептид стабилизированный Nanoemulsion олеиновой кислоты

We describe a method to produce a nanoemulsion composed of an oleic acids-Pt(II) core and a lysine-tyrosine-phenylalanine (KYF) coating (KYF-Pt-NE). The ...

Design of an Open-Source, Low-Cost Bioink and Food Melt Extrusion 3D Printer

Дизайн с открытым исходным кодом, низкозатратный биоцинк и пищевых плавки Экструзион 3D принтер

Three-dimensional (3D) printing is an increasingly popular manufacturing technique that allows highly complex objects to be fabricated with no retooling ...

Applications for Open Source Microplate-Compatible Illumination Panels

Приложения для microplate-совместимых панелей для освещения с открытым исходным кодом

Microplates are commonly used in the modern laboratory environment for a wide variety of tasks both in small-scale laboratory benchtop operations as well ...