Name: 3d imaging of pdl collagen fibers during orthodontic tooth movement in mandibular murine model
Uploaded: 2021-04-15T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about 3D Imaging of PDL Collagen Fibers during Orthodontic Tooth Movement in Mandibular Murine Model at JoVE.com

Cette étude a été soutenue par les NIH (NIDCR R00- DE025053, PI:Naveh). Nous tenons à remercier le Harvard Center for Biological Imaging pour son infrastructure et son soutien. Tous les chiffres sont générés avec biorender.com.

Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées conformément aux Lignes directrices des NIH pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et aux lignes directrices du Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’Université Harvard (Protocole no 01840).
1. Mouvement orthodontique des dents
<ol><li>Pour générer un lit de souris, utilisez une plate-forme en plastique plat avec un appui-tête incliné de 45 ° en forme de coin. L’app...

<ol>
	<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthodontic+tooth+movement:+The+biology+and+clinical+implications.">Orthodontic tooth movement: The biology and clinical implications.</a> The Kaohsiung Journal of Medical Sciences. 34 (4), 207-214 (2018).</li><li>Meikle, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tissue,+cellular,+and+molecular+regulation+of+orthodontic+tooth+movement:+100+years+after+Carl+Sandstedt.">The tissue, cellular, and molecular regulation of orthodontic tooth movement: 100 years after Carl Sandstedt.</a> European Journal of Orthodontics. 28, 221-240 (2006).</li><li>Krishnan, V., Davidovitch, Z., molecular, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular,+molecular,+and+tissue-level+reactions+to+orthodontic+force.">Cellular, molecular, and tissue-level reactions to orthodontic force.</a> American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics. 129 (4), 1-32 (2006).</li><li>Shoji-Matsunaga, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteocyte+regulation+of+orthodontic+force-mediated+tooth+movement+via+RANKL+expression.">Osteocyte regulation of orthodontic force-mediated tooth movement via RANKL expression.</a> Scientific Reports. 7 (1), 8753 (2017).</li><li>Oppenheim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+changes,+particularly+of+the+bone,+incident+to+tooth+movement.">Tissue changes, particularly of the bone, incident to tooth movement.</a> European Journal of Orthodontics. 29, 2-15 (2007).</li><li>Unnam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+Orthodontics-An+overview.">Accelerated Orthodontics-An overview.</a> Journal of Archives of Oral Biologyogy and Craniofacial Research. 3 (1), 4 (2018).</li><li>von Bohl, M., Kuijpers-Jagtman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyalinization+during+orthodontic+tooth+movement+:+a+systematic+review+on+tissue+reactions.">Hyalinization during orthodontic tooth movement : a systematic review on tissue reactions.</a> European Journal of Orthodontics. 31 (1), 30-36 (2009).</li><li>Kirschneck, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+assessment+of+mouse+models+for+experimental+orthodontic+tooth+movement.">Comparative assessment of mouse models for experimental orthodontic tooth movement.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1-12 (2020).</li><li>Naveh, G. R. S., Weiner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+orthodontic+tooth+movement+of+a+multirooted+tooth:+a+3D+study+of+a+rat+molar.">Initial orthodontic tooth movement of a multirooted tooth: a 3D study of a rat molar.</a> Orthodontics &amp; Craniofacial Research. 18 (3), 134-142 (2015).</li><li>Nakamura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+observation+of+rat+periodontal+ligament+during+function+and+tooth+movement,+using+microcomputed+tomography.">Time-lapse observation of rat periodontal ligament during function and tooth movement, using microcomputed tomography.</a> European Journal of Orthodontics. 30 (3), 320-326 (2008).</li><li>Kawarizadeh, A., Bourauel, C., Jager, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+and+numerical+determination+of+initial+tooth+mobility+and+material+properties+of+the+periodontal+ligament+in+rat+molar+specimens.">Experimental and numerical determination of initial tooth mobility and material properties of the periodontal ligament in rat molar specimens.</a> European Journal of Orthodontics. 25 (6), 569-578 (2003).</li><li>J&#243;nsd&#243;ttir, S. H., Giesen, E. B. W., Maltha, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanical+behavior+of+the+periodontal+ligament+of+the+beagle+dog+during+the+first+5+hours+of+orthodontic+force+application.">Biomechanical behavior of the periodontal ligament of the beagle dog during the first 5 hours of orthodontic force application.</a> European Journal of Orthodontics. 28, 547 (2006).</li><li>Lindhe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+breakdown+of+peri-implant+and+periodontal+tissues.+A+study+in+the+beagle+dog.">Experimental breakdown of peri-implant and periodontal tissues. A study in the beagle dog.</a> Clinical Oral Implants Research. 3 (1), 9-16 (1992).</li><li>Salamati, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+tooth+mobility+in+young+pigs.">Functional tooth mobility in young pigs.</a> Journal of Biomechanics. 104, 109716 (2020).</li><li>Maria, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unusual+disordered+alveolar+bone+material+in+the+upper+furcation+region+of+minipig+mandibles:+A+3D+hierarchical+structural+study.">An unusual disordered alveolar bone material in the upper furcation region of minipig mandibles: A 3D hierarchical structural study.</a> Journal of Structural Biology. 206 (1), 128-137 (2019).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+miniature+pig:+a+useful+large+animal+model+for+dental+and+orofacial+research.">The miniature pig: a useful large animal model for dental and orofacial research.</a> Oral Diseases. 10, 1-7 (2007).</li><li>Melsen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+reaction+to+orthodontic+tooth+movement--a+new+paradigm.">Tissue reaction to orthodontic tooth movement--a new paradigm.</a> European Journal of Orthodontics. 23 (6), 671-681 (2001).</li><li>Naveh, G. R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+MicroCT+imaging+of+non-mineralized+connective+tissues+at+high+resolution.">Direct MicroCT imaging of non-mineralized connective tissues at high resolution.</a> Connective Tissue Research. 55 (1), 52-60 (2014).</li><li>Naveh, G. R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonuniformity+in+ligaments+is+a+structural+strategy+for+optimizing+functionality.">Nonuniformity in ligaments is a structural strategy for optimizing functionality.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), 9008 (2018).</li><li>Naveh, G. R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tooth+periodontal+ligament:+Direct+3D+microCT+visualization+of+the+collagen+network+and+how+the+network+changes+when+the+tooth+is+loaded.">Tooth periodontal ligament: Direct 3D microCT visualization of the collagen network and how the network changes when the tooth is loaded.</a> Journal of Structural Biology. 181 (2), 108-115 (2013).</li><li>Naveh, G. R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tooth+movements+are+guided+by+specific+contact+areas+between+the+tooth+root+and+the+jaw+bone+:+A+dynamic+3D+microCT+study+of+the+rat+molar.">Tooth movements are guided by specific contact areas between the tooth root and the jaw bone : A dynamic 3D microCT study of the rat molar.</a> Journal of Structural Biology. 17 (2), 477-483 (2012).</li><li>Naveh, G. R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tooth-PDL-bone+complex:+Response+to+compressive+loads+encountered+during+mastication+-A+review.">Tooth-PDL-bone complex: Response to compressive loads encountered during mastication -A review.</a> Archives of Oral Biology. 57 (12), 1575-1584 (2012).</li><li>Ben-Zvi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+the+tooth-periodontal+ligament-bone+complex+to+load:+A+microCT+study+of+the+minipig+molar.">Response of the tooth-periodontal ligament-bone complex to load: A microCT study of the minipig molar.</a> Journal of Structural Biology. 205 (2), 155-162 (2019).</li><li>Klingberg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+Automated+Evaluation+of+Total+Glomerular+Number+and+Capillary+Tuft+Size+in+Nephritic+Kidneys+Using+Lightsheet+Microscopy.">Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452 (2017).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+Tissue+Clearing.">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li><li>Taddei, S. R. d. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+model+of+tooth+movement+in+mice:+A+standardized+protocol+for+studying+bone+remodeling+under+compression+and+tensile+strains.">Experimental model of tooth movement in mice: A standardized protocol for studying bone remodeling under compression and tensile strains.</a> Journal of Biomechanics. 45 (16), 2729-2735 (2012).</li><li>Nakamura, K., Sahara, N., Deguchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+changes+in+the+distribution+and+number+of+macrophage-lineage+cells+in+the+periodontal+membrane+of+the+rat+molar+in+response+to+experimental+tooth+movement.">Temporal changes in the distribution and number of macrophage-lineage cells in the periodontal membrane of the rat molar in response to experimental tooth movement.</a> Archives of Oral Biology. 46 (7), 593-607 (2001).</li><li>Rygh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+vascular+system:+A+main+mediator+of+periodontal+fiber+remodeling+in+orthodontic+tooth+movement.">Activation of the vascular system: A main mediator of periodontal fiber remodeling in orthodontic tooth movement.</a> American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics. 89 (6), 453-468 (1986).</li><li>Nagao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor+in+cartilage+development+and+osteoarthritis.">Vascular endothelial growth factor in cartilage development and osteoarthritis.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13027 (2017).</li><li>Licht, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelium-specific+Cre+recombinase+activity+in+flk-1-Cre+transgenic+mice.">Endothelium-specific Cre recombinase activity in flk-1-Cre transgenic mice.</a> Developmental Dynamics. 229 (2), 312-318 (2004).</li><li>Connizzo, B. K., Naveh, G. R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+AFM-based+nanoscale+rheology+reveals+regional+non-uniformity+in+viscoporoelastic+mechanical+behavior+of+the+murine+periodontal+ligament.">In situ AFM-based nanoscale rheology reveals regional non-uniformity in viscoporoelastic mechanical behavior of the murine periodontal ligament.</a> Journal of Biomechanics. 111, 109996 (2020).</li><li>Connizzo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonuniformity+in+Periodontal+Ligament:+Mechanics+and+Matrix+Composition.">Nonuniformity in Periodontal Ligament: Mechanics and Matrix Composition.</a> Journal of Dental Research. 2, 179-186 (2020).</li></ol>

La génération d’OTM chez la souris est fortement souhaitée en raison de la taille, de la génétique et des avantages de la manipulation. L’utilisation de la mandibule permet une manipulation facile à la fois en termes de dissection tissulaire ainsi que de préparation des échantillons et d’imagerie. Ici nous avons présenté une méthode pour générer OTM avec le mouvement translationnel de la dent à l’intérieur de l’os dans les 7 jours d’OTM. En utilisant ce protocole, la durée globale du mouvement...

Le processus biologique sous-jacent de base dans le mouvement orthodontique des dents (OTM) est le remodelage osseux. Le déclencheur de ce processus de remodelage est attribué à des changements dans la structure du ligament parodontal (PDL) tels que le stress de la matrice extracellulaire (ECM), la nécrose ainsi que la destruction et la formation des vaisseaux sanguins1,2,3. D’autres déclencheurs possibles pour le remodelage alvéolaire d’os sont liés à la détection de force par les ostéocytes dans l’os, ainsi qu’à la déformation mécanique de l’os alvéolaire lui-même; cependant leur rôle dans OTM n’est pas encore entièrement élucidé4,5.
Malgré de nombreuses études visant à révéler les relations structure-fonction du PDL au cours de l’OTM, un mécanisme fonctionnel clair doit encore être défini6,7. La raison principale en est le défi de récupérer les données d’un tissu mou (PDL) situé entre deux tissus durs (cénume et os alvéolaire). Les méthodes acceptées pour recueillir des informations structurelles nécessitent généralement une fixation et un sectionnement qui perturbent et modifient la structure PDL. De plus, la plupart de ces méthodes produisent des données 2D qui, même si elles ne sont pas déformées, ne donnent que des informations partielles et localisées. Puisque le PDL n’est pas uniforme dans sa structure et fonction, une approche qui adresse la structure 3D intacte du complexe entier de dent-PDL-os est justifiée.
Cet article décrira une méthode pour générer un OTM chez la souris et deux méthodes qui permettent la visualisation 3D des fibres de collagène dans le PDL sans aucune section de l’échantillon.
Les modèles murins sont largement utilisés pour les expériences in vivo en médecine, en biologie du développement, en administration de médicaments et en études structurelles. Ils peuvent être génétiquement modifiés pour éliminer ou améliorer des protéines et des fonctions spécifiques; ils fournissent un contrôle du développement rapide, reproductible et prévisible; ils sont également faciles à imager en raison de leur petite taille8. Malgré leurs nombreux avantages, les modèles murins dans la recherche dentaire ne sont pas utilisés fréquemment, en particulier lorsque des manipulations cliniques sont justifiées, principalement en raison des dents de petite taille. Des modèles animaux tels que les rats9,10,11,les chiens12,13,les porcs14,15,16 et les singes17 sont utilisés plus souvent que les souris. Avec le développement récent de techniques d’imagerie haute résolution, les avantages de l’utilisation d’un modèle murin pour déchiffrer les processus alambiqués dans OTM sont nombreux. Ce document présente une méthode pour générer un mouvement mesial de la dent molaire dans la mâchoire inférieure avec les niveaux constants de force qui déclenchent la retouche d’os. La plupart des expériences OTM chez les rongeurs sont faites dans le maxillaire supérieur, puisque la mobilité de la mandibule et la présence de la langue ajoutent un autre niveau de complexité. Cependant, la mandibule présente de nombreux avantages lorsque l’intégrité structurelle 3D est souhaitée. Il peut être facilement disséqué comme un os entier; chez certaines espèces, il peut être séparé en deux hémi-mandibules par la symphyse fibreuse; il est compact, plat et ne contient que les dents sans aucun espace sinusal. En revanche, le maxillaire supérieur fait partie du crâne et est étroitement lié à d’autres organes et structures, donc une section étendue est nécessaire afin de disséquer l’os alvéolaire avec les dents associées.
En utilisant une chambre d’humidité interne couplée à un système de chargement à l’intérieur d’un micro-CT haute résolution qui permet une amélioration de phase, nous avons développé une méthode pour visualiser les tissus fibreux frais en 3D comme décrit précédemment9,18,19,20,21,22,23. Les tissus frais sont scannés immédiatement après le sacrifice de l’animal sans aucune coloration ou fixation, ce qui réduit les artefacts tissulaires ainsi que les altérations des propriétés biomécaniques. Ces données 3D peuvent être utilisées pour la distribution et les analyses de direction des fibres comme décrit ailleurs19.
La deuxième méthode d’imagerie tissulaire entier 3D présentée ici est basée sur la clairance optique de la mandibule qui permet l’imagerie des fibres PDL à travers l’os sans aucune section. Fait intéressant, il permet également la visualisation des fibres de collagène de l’os lui-même, mais cela ne sera pas discuté ici. En général, il existe deux méthodes pour la clairance tissulaire. Le premier est le déblaiement à base aqueuse où l’échantillon est immergé dans une solution aqueuse avec un indice de réfraction supérieur à 1,4 soit par une simple immersion, hyperhydratation ou incorporation d’hydrogel. Cependant, cette méthode est limitée dans le niveau de transparence ainsi que la préservation structurelle du tissu et nécessite donc la fixation du tissu. La seconde méthode qui donne des échantillons très transparents et ne nécessite pas de fixation est la méthode de compensation à base de solvant24,25. Nous avons généré une méthode de compensation modifiée à base de solvant basée sur le 3-phénylprop-2-énoate d’éthyle (cinnamate d’éthyle, ECi) pour les échantillons mandibulaires. Cette méthode présente les avantages d’utiliser un agent de compensation de qualité alimentaire non toxique, un rétrécissement minimal des tissus et la conservation des protéines fluorescentes.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-mL BD Luer-Lok syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X phosphate buffered saline</td>
			<td>VWR Life Sciences</td>
			<td>0780-10L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 proof ethanol</td>
			<td>VWR Life Sciences</td>
			<td>V1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum alloy 5019 wire</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>GF15828813</td>
			<td>0.08 mm diameter wire, length 100th, temper hard. Used as wire ligature around molar.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avizo 9.7</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used to analyze microCT scans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Castroviejo Micro Needle Holders</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12060-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clr Plan-Apochromat 20x/1.0,CorrVIS-IR M27 85mm</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used for second harmonic generation imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cone socket handle, single ended, hand-form</td>
			<td>G.Hartzell and son</td>
			<td>126-CSH3</td>
			<td>Handle of the inspection mirror</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EC Plan-Neofluar 5x/0.16</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>440321-9902</td>
			<td>Used for light-sheet imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elipar DeepCure-S LED curing light</td>
			<td>3M ESPE</td>
			<td>76985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf safe-lock tubes, 1.5mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl cinnamate, &#62;= 98%</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>W243000-1KG-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic Needle, 27G x 1/2&#39;&#39;</td>
			<td>BD</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketathesia 100mg/ml</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>NDC:11695-0702-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIMWIPES delicate task wipers</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>21905-026 (VWR Catalog number)</td>
			<td>Purchased from VWR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightSheet Z.1 dual illumination microscope system</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LightSheet Z.1/LightSheet 7</td>
			<td>Used for lightsheet imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 880 NLO multi-photon microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 880 NLO</td>
			<td>Used for two-photon imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAmicro, plane, 5mm dia, SS-Thread</td>
			<td>Hahnenkratt</td>
			<td>6220</td>
			<td>Front surface inspectrio mirror</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroCT machine, MicroXCT-200</td>
			<td>Xradia</td>
			<td>MICRO XCT-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Colibri</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>17000-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PermaFlo Flowable Composite</td>
			<td>Ultradent</td>
			<td>948</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Procedure platform</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom-made from lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Routine stereo micscope M80</td>
			<td>Leica Micosystems</td>
			<td>M80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sentalloy NiTi open coil spring</td>
			<td>TOMY Inc.</td>
			<td></td>
			<td>A 0.15mm diameter closed NiTi coil with an inner coil diameter of 0.9mm delivers a force of 10g. Similar products can be purchased from Dentsply Sirona.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-304 stainless steel ligature wire, 0.009&#39;&#39; diameter</td>
			<td>Orthodontics</td>
			<td>SBLW109</td>
			<td>0.009&#39;&#39;(.23mm) diameter, Soft temper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Ject E (Xylazine) 100mg/ml</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>NDC:11695-7085-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z100 Restorative, A2 shade</td>
			<td>3M ESPE</td>
			<td>5904A2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3d imaging of pdl collagen fibers during orthodontic tooth movement in mandibular murine model

Le mouvement orthodontique des dents est un processus biologique complexe de remodelage des tissus mous et durs altérés à la suite de forces externes. Afin de comprendre ces processus de remodelage complexes, il est essentiel d’étudier la dent et les tissus parodontals dans leur contexte 3D et donc de minimiser les sectionnements et les artefacts tissulaires. Les modèles murins sont souvent utilisés en biologie du développement et de la structure, ainsi qu’en biomécanique en raison de leur petite taille, de leur taux métabolique élevé, de leur génétique et de leur facilité de manipulation. En principe, cela en fait également d’excellents modèles pour les études dentaires. Cependant, un obstacle majeur est leur petite taille de dent, les molaires en particulier. Ce document vise à fournir un protocole étape par étape pour générer le mouvement orthodontique de dent et deux méthodes pour la formation image 3D du composant fibreux périodontique de ligament d’une molaire mandibulaire de souris. La première méthode présentée est basée sur une installation de micro-CT permettant l’imagerie d’amélioration de phase des tissus frais de collagène. La deuxième méthode est une méthode de nettoyage osseux utilisant du cinnamate d’éthyle qui permet l’imagerie à travers l’os sans sectionnement et préserve la fluorescence endogène. Combinant cette méthode de compensation avec des souris reporters comme Flk1-Cre; TdTomato a fourni une première occasion du genre d’imager la vascularisation 3D dans le PDL et l’os alvéolaire.

Ce document présente une méthode pour produire OTM aussi bien que deux méthodes pour la formation image 3D des fibres de collagène à l’intérieur du PDL sans n’importe quelle sectionnement. À des fins de recherche sur les animaux, lorsque l’alignement des dents n’est pas nécessaire, un mouvement dentaire est considéré comme orthodontique s’il génère un remodelage de l’os alvéolaire à tous les niveaux racinaires. Un niveau de force constant appliqué sur les dents est nécessaire afin de générer...

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3D Imaging of PDL Collagen Fibers during Orthodontic Tooth Movement in Mandibular Murine Model

Nous présentons un protocole pour générer le mouvement orthodontique de dent chez les souris et des méthodes pour la visualisation 3D des fibres de collagène et des vaisseaux sanguins du ligament parodontal sans sectionnement.

Imagerie 3D des fibres de collagène PDL pendant le mouvement orthodontique des dents dans le modèle murin mandibulaire

Orthodontic tooth movement is a complex biological process of altered soft and hard tissue remodeling as a result of external forces. In order to ...

Le mouvement orthodontique des dents est un processus biologique complexe qui implique des forces externes et le remodelage des tissus mous et durs. Afin de comprendre ces processus, il est essentiel d’étudier la dent et les tissus parodontaux dans le contexte 3D. Le modèle murin est un bon candidat pour de telles études en raison de sa taille, de son taux métabolique élevé et de la vaste information génétique dont nous disposons.Cependant, créer un mouvement orthodontique des dents chez les souris n’est pas facile en raison de leur petite taille. De plus, les méthodes d’analyse structurelle impliquent généralement un sectionnement, ce qui perturbe la structure 3D et le contexte du tissu. Pour un tissu non uniforme, tel que le PDL, la préservation de la structure et du contexte 3D est d’une importance critique.Pour aborder ces deux obstacles, nous fournissons un protocole pour générer le mouvement orthodontique mésial de dent de la première molaire mandibulaire chez la souris et décrivons deux méthodes qui permettent la visualisation 3D du ligament parodontal sans sectionnement du tissu. Pour positionner la souris anesthésiée pour l’insertion d’un périphérique orthodontique, branchez l’incisives supérieure sur la boucle du trombone. Immobilisez les incisives inférieures à l’aide de la chaîne d’alimentation Et ouvrez davantage la bouche avec un rétracteur de souris mini-colibri.Appliquez une petite goutte de solution saline sur chaque œil pour prévenir la déshydratation cornéenne. Ce sont les outils utilisés dans l’insertion de périphériques. Couper un morceau de fil d’aluminium à un centimètre de longueur.À l’aide d’un porte-aiguille microchirurgical, faites glisser le fil du côté buccal lingualement dans la zone interproximale au-dessous du point de contact entre les première et deuxième molaires. Tirez le fil du côté linguale vers le côté mésial de la molaire. Tordez les extrémités libres du fil deux à trois fois pour sécuriser.Coupez un morceau de nickel titane ou de ressort hélicoïdal NiTi d’environ sept à neuf fils de longueur. Insérez la bobine entre la première molaire inférieure et l’inciseur, passez une extrémité libre du fil à travers deux fils de la bobine, puis tournez les deux extrémités du fil étroitement pour fixer la bobine à la molaire. Retirez la chaîne d’alimentation à l’aide d’une pince à épiler.Bouclez deux à trois fils de la bobine sur l’inciseur pour ancrer la bobine. Laissez exactement trois fils actifs entre la première molaire et l’inciseur. Faites glisser les menaces vers le bas à la marge gingivale libre d’incisive.Placez une couche de résine composite fluide sur la bordure incisive de la bobine et durcissez-la avec une lumière de durcissement dentaire. Remplacez la chaîne d’alimentation après avoir durci la résine. Coupez l’excès de fil autour de la molaire pour éviter les blessures.En utilisant la même lumière de durcissement, chauffez la bobine NiTi pendant 20 secondes. Cela resserrera la bobine, le placement fini devrait ressembler à ceci. Les tissus mous de l’hémi-mandibule disséquée peuvent être enlevés avec une lingette pelucheux.Avec un échantillon entre deux doigts, frottez l’extérieur en mouvement circulaire jusqu’à ce que la plupart des tissus mous soient enlevés. Le reste peut être coupé à l’aide d’une paire de ciseaux. La mandibule nettoyée est montrée ici à droite.Pour monter l’hémi-mandibule disséquée dans la chambre d’échantillonnage à partir de la micro-tomodensitométrie, façonnez une résine dentaire emballable de la taille d’un grain de riz en une bûche. Ensuite, placez-le dans la fente d’échantillonnage de la scène. Placez l’hémi-mandibule sur le composite.Ajustez la position jusqu’à ce que la première molaire soit centrée sur la rainure médiane et que la surface occlusale soit horizontale. Durcir le composite lorsqu’il est satisfait du positionnement. C’est un exemple de la mandibule en bonne position.Prenez une petite boule de résine dentaire emballable. Son diamètre doit être autour de la largeur de la molaire. Placez la résine sur la surface occlusale de la première molaire.Humidifiez la lingette non peluche avec de l’eau. Placez la lingette humidée à l’intérieur des bassins d’humidité au stade de l’échantillon. Fermez la chambre d’échantillonnage et fixez-la sur le micro CT avec des vis.Prenez maintenant des images 2D tout en abaissant l’enclume verticalement jusqu’à ce que la pointe de l’enclume soit entourée par le composite. Éteignez en toute sécurité la source de rayons X, ouvrez la chambre micro-CT et durcissez le composite à travers la fenêtre en plexiglas claire. Maintenant, l’échantillon est correctement monté et peut être cétré selon les besoins.Pour générer un échantillon d’hémi-mandibule effacé optiquement, préparer les solutions suivantes dans des tubes à centrifuger de 1,5 mil. 4% de paraformaldéhyde, 50% et 70% d’éthanol dans l’eau désionisée. Deux tubes d’éthanol à 100% et de cinnamate d’éthyle.Placez l’hémi-mâchoire inférieure disséquée dans le paraformaldéhyde à 4%. Couvrez le tube de papier d’aluminium et placez-le sur une bascule en douceur pendant six heures à température ambiante. Après six heures, transférer l’échantillon dans de l’éthanol à 50%.Replacez l’échantillon sur la bascule pendant 16 heures à l’abri de la lumière. Répétez l’étape précédente avec un échantillon dans de l’éthanol à 70 % pendant 16 heures, suivi de 100 % d’éthanol deux fois pendant 16 heures à chaque fois. Enfin, déplacer l’échantillon vers le cinnamate d’éthyle pendant au moins 12 heures.Un mouvement orthodontique fiable est généré par le dispositif de bobine NiTi dans la première molaire mandibulaire murine. Chez les souris mâles âgées de neuf semaines, l’espace interproxial moyen est de 40 microns après sept jours. L’amélioration de phase micro CT permet la visualisation du PDL.Après trois jours de mouvement orthodontique mésial, la densité de PDL est réduite. L’interface de PDL d’os est plus rugueuse en raison du développement des cratères dans la surface d’os, qui sont indicatifs de l’activité osteoclastic et de la résorption d’os. La surface rugueuse peut être vue à tous les niveaux des racines.Cela montre que le mouvement est translationnel par opposition à un mouvement de basculement. Au jour sept, l’espace de PDL est plus étroit qu’au jour trois et la frontière de PDL d’os à la surface distale de racine est plus lisse qui sont des signes de l’opposition d’os comme prévu quand le mouvement orthodontique de dent se produit. En raison du long temps d’imagerie micro-TDM et de la rotation de l’étage, le montage sécurisé de l’échantillon est essentiel.Échantillon instable où les résultats dans les balayages flous où une silhouette peut être vu autour de la couronne et les fibres PDL ne sont pas vus. La clairance optique à l’aide de cinnamate d’éthyle fournit une autre méthode pour visualiser le PDL sans sectionnement. Le substrat peut être vu à travers le ramus d’un échantillon suffisamment dégagé montré ici à droite.Cette méthode, préserve la fluorescence endogène et peut être utilisée sans fixation chimique. La microscopie à feuille de lumière peut être utilisée sur des échantillons nettoyés. Avec une souris transgénique, les revêtements des vaisseaux sanguins fluorescents peuvent être observés.Si l’os n’a pas été correctement dégagé, les vaisseaux sanguins dans le PDL ne sont pas visibles comme indiqué dans le panneau F.Ce protocole décrit comment surmonter deux défis majeurs en générant et en analysant le mouvement orthodontique de dent dans les dents molaires mandibulaires murines. Une fois la technique de mouvement orthodontique des dents maîtrisée, elle peut être complétée en 15 minutes. Ce processus est difficile en raison des petites dimensions des dents de souris et de la présence de la langue.Cependant, nous apportons toutes les solutions nécessaires pour surmonter ces défis. L’imagerie micro-TDM nécessite une capacité d’amélioration de phase. Nous avons démontré notre technique utilisant un micro CT de paillasse. Cependant, toute configuration qui peut générer une amélioration de phase fera, par exemple, un synchrotron.Les résultats de la compensation ECi dépendent du processus de déshydratation. Si l’échantillon n’est pas assez transparent, notre suggestion est d’augmenter le temps des étapes de déshydratation. Notre méthode de nettoyage peut également être utilisée sur des échantillons non fixes.Les tissus clairs peuvent être scannés dans le micro CT puisque le processus de clairance n’affecte pas la teneur en minéraux du tissu. Par conséquent, notre méthode fournit une approche corrélative pour la fluorescence et les informations structurelles afin de générer une analyse 3D complète.

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