Name: 3d imaging of pdl collagen fibers during orthodontic tooth movement in mandibular murine model
Uploaded: 2021-04-15T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about 3D Imaging of PDL Collagen Fibers during Orthodontic Tooth Movement in Mandibular Murine Model at JoVE.com

Diese Studie wurde vom NIH (NIDCR R00- DE025053, PI:Naveh) unterstützt. Wir danken dem Harvard Center for Biological Imaging für die Infrastruktur und Unterstützung. Alle Zahlen werden mit biorender.com generiert.

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den NIH-Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren und den Richtlinien des Harvard University Institutional Animal Care and Use Committee (Protokoll Nr. 01840) durchgeführt.
1. Kieferorthopädische Zahnbewegung
<ol><li>Um ein Mausbett zu erzeugen, verwenden Sie eine flache Kunststoffplattform mit einer keilförmigen, um 45 ° abgewinkelten Kopfstütze. Die Kopfstütze kann durch Schneiden einer Kunststoffbox erzeugt werden.<ol...

<ol>
	<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthodontic+tooth+movement:+The+biology+and+clinical+implications.">Orthodontic tooth movement: The biology and clinical implications.</a> The Kaohsiung Journal of Medical Sciences. 34 (4), 207-214 (2018).</li><li>Meikle, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tissue,+cellular,+and+molecular+regulation+of+orthodontic+tooth+movement:+100+years+after+Carl+Sandstedt.">The tissue, cellular, and molecular regulation of orthodontic tooth movement: 100 years after Carl Sandstedt.</a> European Journal of Orthodontics. 28, 221-240 (2006).</li><li>Krishnan, V., Davidovitch, Z., molecular, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular,+molecular,+and+tissue-level+reactions+to+orthodontic+force.">Cellular, molecular, and tissue-level reactions to orthodontic force.</a> American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics. 129 (4), 1-32 (2006).</li><li>Shoji-Matsunaga, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteocyte+regulation+of+orthodontic+force-mediated+tooth+movement+via+RANKL+expression.">Osteocyte regulation of orthodontic force-mediated tooth movement via RANKL expression.</a> Scientific Reports. 7 (1), 8753 (2017).</li><li>Oppenheim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+changes,+particularly+of+the+bone,+incident+to+tooth+movement.">Tissue changes, particularly of the bone, incident to tooth movement.</a> European Journal of Orthodontics. 29, 2-15 (2007).</li><li>Unnam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+Orthodontics-An+overview.">Accelerated Orthodontics-An overview.</a> Journal of Archives of Oral Biologyogy and Craniofacial Research. 3 (1), 4 (2018).</li><li>von Bohl, M., Kuijpers-Jagtman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyalinization+during+orthodontic+tooth+movement+:+a+systematic+review+on+tissue+reactions.">Hyalinization during orthodontic tooth movement : a systematic review on tissue reactions.</a> European Journal of Orthodontics. 31 (1), 30-36 (2009).</li><li>Kirschneck, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+assessment+of+mouse+models+for+experimental+orthodontic+tooth+movement.">Comparative assessment of mouse models for experimental orthodontic tooth movement.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1-12 (2020).</li><li>Naveh, G. R. S., Weiner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+orthodontic+tooth+movement+of+a+multirooted+tooth:+a+3D+study+of+a+rat+molar.">Initial orthodontic tooth movement of a multirooted tooth: a 3D study of a rat molar.</a> Orthodontics &amp; Craniofacial Research. 18 (3), 134-142 (2015).</li><li>Nakamura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+observation+of+rat+periodontal+ligament+during+function+and+tooth+movement,+using+microcomputed+tomography.">Time-lapse observation of rat periodontal ligament during function and tooth movement, using microcomputed tomography.</a> European Journal of Orthodontics. 30 (3), 320-326 (2008).</li><li>Kawarizadeh, A., Bourauel, C., Jager, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+and+numerical+determination+of+initial+tooth+mobility+and+material+properties+of+the+periodontal+ligament+in+rat+molar+specimens.">Experimental and numerical determination of initial tooth mobility and material properties of the periodontal ligament in rat molar specimens.</a> European Journal of Orthodontics. 25 (6), 569-578 (2003).</li><li>J&#243;nsd&#243;ttir, S. H., Giesen, E. B. W., Maltha, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanical+behavior+of+the+periodontal+ligament+of+the+beagle+dog+during+the+first+5+hours+of+orthodontic+force+application.">Biomechanical behavior of the periodontal ligament of the beagle dog during the first 5 hours of orthodontic force application.</a> European Journal of Orthodontics. 28, 547 (2006).</li><li>Lindhe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+breakdown+of+peri-implant+and+periodontal+tissues.+A+study+in+the+beagle+dog.">Experimental breakdown of peri-implant and periodontal tissues. A study in the beagle dog.</a> Clinical Oral Implants Research. 3 (1), 9-16 (1992).</li><li>Salamati, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+tooth+mobility+in+young+pigs.">Functional tooth mobility in young pigs.</a> Journal of Biomechanics. 104, 109716 (2020).</li><li>Maria, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unusual+disordered+alveolar+bone+material+in+the+upper+furcation+region+of+minipig+mandibles:+A+3D+hierarchical+structural+study.">An unusual disordered alveolar bone material in the upper furcation region of minipig mandibles: A 3D hierarchical structural study.</a> Journal of Structural Biology. 206 (1), 128-137 (2019).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+miniature+pig:+a+useful+large+animal+model+for+dental+and+orofacial+research.">The miniature pig: a useful large animal model for dental and orofacial research.</a> Oral Diseases. 10, 1-7 (2007).</li><li>Melsen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+reaction+to+orthodontic+tooth+movement--a+new+paradigm.">Tissue reaction to orthodontic tooth movement--a new paradigm.</a> European Journal of Orthodontics. 23 (6), 671-681 (2001).</li><li>Naveh, G. R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+MicroCT+imaging+of+non-mineralized+connective+tissues+at+high+resolution.">Direct MicroCT imaging of non-mineralized connective tissues at high resolution.</a> Connective Tissue Research. 55 (1), 52-60 (2014).</li><li>Naveh, G. R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonuniformity+in+ligaments+is+a+structural+strategy+for+optimizing+functionality.">Nonuniformity in ligaments is a structural strategy for optimizing functionality.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), 9008 (2018).</li><li>Naveh, G. R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tooth+periodontal+ligament:+Direct+3D+microCT+visualization+of+the+collagen+network+and+how+the+network+changes+when+the+tooth+is+loaded.">Tooth periodontal ligament: Direct 3D microCT visualization of the collagen network and how the network changes when the tooth is loaded.</a> Journal of Structural Biology. 181 (2), 108-115 (2013).</li><li>Naveh, G. R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tooth+movements+are+guided+by+specific+contact+areas+between+the+tooth+root+and+the+jaw+bone+:+A+dynamic+3D+microCT+study+of+the+rat+molar.">Tooth movements are guided by specific contact areas between the tooth root and the jaw bone : A dynamic 3D microCT study of the rat molar.</a> Journal of Structural Biology. 17 (2), 477-483 (2012).</li><li>Naveh, G. R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tooth-PDL-bone+complex:+Response+to+compressive+loads+encountered+during+mastication+-A+review.">Tooth-PDL-bone complex: Response to compressive loads encountered during mastication -A review.</a> Archives of Oral Biology. 57 (12), 1575-1584 (2012).</li><li>Ben-Zvi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+the+tooth-periodontal+ligament-bone+complex+to+load:+A+microCT+study+of+the+minipig+molar.">Response of the tooth-periodontal ligament-bone complex to load: A microCT study of the minipig molar.</a> Journal of Structural Biology. 205 (2), 155-162 (2019).</li><li>Klingberg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+Automated+Evaluation+of+Total+Glomerular+Number+and+Capillary+Tuft+Size+in+Nephritic+Kidneys+Using+Lightsheet+Microscopy.">Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452 (2017).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+Tissue+Clearing.">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li><li>Taddei, S. R. d. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+model+of+tooth+movement+in+mice:+A+standardized+protocol+for+studying+bone+remodeling+under+compression+and+tensile+strains.">Experimental model of tooth movement in mice: A standardized protocol for studying bone remodeling under compression and tensile strains.</a> Journal of Biomechanics. 45 (16), 2729-2735 (2012).</li><li>Nakamura, K., Sahara, N., Deguchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+changes+in+the+distribution+and+number+of+macrophage-lineage+cells+in+the+periodontal+membrane+of+the+rat+molar+in+response+to+experimental+tooth+movement.">Temporal changes in the distribution and number of macrophage-lineage cells in the periodontal membrane of the rat molar in response to experimental tooth movement.</a> Archives of Oral Biology. 46 (7), 593-607 (2001).</li><li>Rygh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+vascular+system:+A+main+mediator+of+periodontal+fiber+remodeling+in+orthodontic+tooth+movement.">Activation of the vascular system: A main mediator of periodontal fiber remodeling in orthodontic tooth movement.</a> American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics. 89 (6), 453-468 (1986).</li><li>Nagao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor+in+cartilage+development+and+osteoarthritis.">Vascular endothelial growth factor in cartilage development and osteoarthritis.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13027 (2017).</li><li>Licht, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelium-specific+Cre+recombinase+activity+in+flk-1-Cre+transgenic+mice.">Endothelium-specific Cre recombinase activity in flk-1-Cre transgenic mice.</a> Developmental Dynamics. 229 (2), 312-318 (2004).</li><li>Connizzo, B. K., Naveh, G. R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+AFM-based+nanoscale+rheology+reveals+regional+non-uniformity+in+viscoporoelastic+mechanical+behavior+of+the+murine+periodontal+ligament.">In situ AFM-based nanoscale rheology reveals regional non-uniformity in viscoporoelastic mechanical behavior of the murine periodontal ligament.</a> Journal of Biomechanics. 111, 109996 (2020).</li><li>Connizzo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonuniformity+in+Periodontal+Ligament:+Mechanics+and+Matrix+Composition.">Nonuniformity in Periodontal Ligament: Mechanics and Matrix Composition.</a> Journal of Dental Research. 2, 179-186 (2020).</li></ol>

Die Erzeugung von OTM bei Mäusen ist aufgrund der Größe, Genetik und Handhabungsvorteile sehr erwünscht. Die Verwendung des Unterkiefers bietet eine einfache Handhabung sowohl in Bezug auf die Gewebedissektion als auch auf die Probenvorbereitung und Bildgebung. Hier haben wir eine Methode vorgestellt, um OTM mit translationaler Bewegung des Zahnes im Knochen innerhalb von 7 Tagen nach OTM zu erzeugen. Mit diesem Protokoll kann die Gesamtdauer der Zahnbewegung verlängert werden, da die aktivierte Spule ein konstantes...

Der grundlegende biologische Prozess in der kieferorthopädischen Zahnbewegung (OTM) ist der Knochenumbau. Der Auslöser für diesen Umbauprozess wird auf Veränderungen in der Struktur des Parodontalbandes (PDL) wie extrazellulären Matrix (ECM) Stress, Nekrose sowie Blutgefäßzerstörung und -bildung zurückgeführt1,2,3. Andere mögliche Auslöser für den Alveolarknochenumbau sind die Krafterfassung durch Osteozyten im Knochen sowie die mechanische Verformung des Alveolarknochens selbst; ihre Rolle im OTM ist jedoch noch nicht vollständig aufgeklärt4,5.
Trotz vieler Studien, die darauf abzielten, Struktur-Funktions-Beziehungen der PDL während der OTM aufzudecken, muss noch ein klarer funktioneller Mechanismus definiert werden6,7. Der Hauptgrund dafür ist die Herausforderung, Daten eines Weichgewebes (PDL) zwischen zwei Hartgeweben (Zement und Alveolarknochen) abzurufen. Die akzeptierten Methoden zum Sammeln von Strukturinformationen erfordern in der Regel Fixierungen und Abschnitte, die die PDL-Struktur stören und modifizieren. Darüber hinaus liefern die meisten dieser Methoden 2D-Daten, die, selbst wenn sie nicht verzerrt sind, nur teilweise und lokalisierte Informationen liefern. Da die PDL in ihrer Struktur und Funktion nicht einheitlich ist, ist ein Ansatz gerechtfertigt, der die intakte 3D-Struktur des gesamten Zahn-PDL-Knochenkomplexes adressiert.
In diesem Artikel werden eine Methode zur Erzeugung eines OTM in Mäusen und zwei Methoden beschrieben, die eine 3D-Visualisierung der Kollagenfasern in der PDL ohne Schnitt der Probe ermöglichen.
Murine Modelle werden häufig für In-vivo-Experimente in der Medizin, Entwicklungsbiologie, Medikamentenabgabe und Strukturstudien verwendet. Sie können genetisch verändert werden, um bestimmte Proteine und Funktionen zu eliminieren oder zu verbessern. sie bieten eine schnelle, wiederholbare und vorhersehbare Entwicklungskontrolle; Sie sind auch aufgrund ihrer geringen Größe 8 leichtabbildbar. Trotz ihrer vielen Vorteile werden Mausmodelle in der Zahnforschung nicht häufig eingesetzt, insbesondere wenn klinische Manipulationen gerechtfertigt sind, meist aufgrund der kleinen Zähne. Tiermodelle wie Ratten9,10,11, Hunde12,13, Schweine14,15,16 und Affen17 werden häufiger als Mäuse verwendet. Mit der jüngsten Entwicklung hochauflösender bildgebungsähnlicher Verfahren sind die Vorteile der Verwendung eines Mausmodells zur Entschlüsselung der verworrenen Prozesse im OTM zahlreich. Dieser Artikel stellt eine Methode vor, um eine mesiale Bewegung des Backenzahns im Unterkiefer mit konstanten Kraftniveaus zu erzeugen, die einen Knochenumbau auslösen. Die meisten OTM-Experimente an Nagetieren werden im Oberkiefer durchgeführt, da die Beweglichkeit des Unterkiefers und das Vorhandensein der Zunge eine weitere Komplexitätsebene hinzufügen. Der Unterkiefer hat jedoch viele Vorteile, wenn strukturelle 3D-Integrität gewünscht wird. Es kann leicht als ganzer Knochen seziert werden; bei einigen Arten kann es durch die faserige Symphyse in zwei Hemi-Unterkiefer getrennt werden; es ist kompakt, flach und enthält nur die Zähne ohne Sinusräume. Im Gegensatz dazu ist der Oberkiefer ein Teil des Schädels und eng mit anderen Organen und Strukturen verwandt, so dass umfangreiche Schnitte erforderlich sind, um den Alveolarknochen mit den zugehörigen Zähnen zu sezieren.
Unter Verwendung einer hauseigenen Feuchtigkeitskammer, die mit einem Beladungssystem in einem hochauflösenden Mikro-CT gekoppelt ist, das eine Phasenverstärkung ermöglicht, haben wir eine Methode entwickelt, um frisches faseriges Gewebe in 3D zuvisualisieren,wie zuvor beschrieben9,18 , 19,20,21,22,23. Frisches Gewebe wird unmittelbar nach dem Opfer des Tieres ohne Färbung oder Fixierung gescannt, was Gewebeartefakte sowie Veränderungen der biomechanischen Eigenschaften reduziert. Diese 3D-Daten können für Verteilungs- und Richtungsanalysen der Fasern wie an anderer Stelle beschrieben verwendet werden19.
Die zweite hier vorgestellte 3D-Ganzgewebsbildgebungsmethode basiert auf der optischen Reinigung des Unterkiefers, die eine Bildgebung der PDL-Fasern durch den Knochen ohne Schnittbildung ermöglicht. Interessanterweise ermöglicht es auch die Visualisierung der Kollagenfasern des Knochens selbst, dies wird hier jedoch nicht diskutiert. Im Allgemeinen gibt es zwei Methoden zur Gewebereinigung. Die erste ist die wässrige Reinigung, bei der die Probe in eine wässrige Lösung mit einem Brechungsindex von mehr als 1,4 getaucht wird, entweder durch einfaches Eintauchen, Hyperhydratation oder Hydrogeleinbettung. Diese Methode ist jedoch sowohl in der Transparenz als auch in der strukturellen Erhaltung des Gewebes begrenzt und erfordert daher eine Fixierung des Gewebes. Das zweite Verfahren, das hochtransparente Proben liefert und keine Fixierung erfordert, ist das lösungsmittelbasierte Clearingverfahren24,25. Für die Unterkieferproben haben wir ein modifiziertes lösemittelbasiertes Clearingverfahren auf Basis von Ethyl-3-phenylprop-2-enoat (Ethylzimt, ECi) erstellt. Diese Methode hat die Vorteile der Verwendung von ungiftigem Clearingmittel in Lebensmittelqualität, minimaler Gewebeschrumpfung und Konservierung von fluoreszierenden Proteinen.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>1-mL BD Luer-Lok syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X phosphate buffered saline</td>
			<td>VWR Life Sciences</td>
			<td>0780-10L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 proof ethanol</td>
			<td>VWR Life Sciences</td>
			<td>V1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum alloy 5019 wire</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>GF15828813</td>
			<td>0.08 mm diameter wire, length 100th, temper hard. Used as wire ligature around molar.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avizo 9.7</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used to analyze microCT scans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Castroviejo Micro Needle Holders</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12060-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clr Plan-Apochromat 20x/1.0,CorrVIS-IR M27 85mm</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used for second harmonic generation imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cone socket handle, single ended, hand-form</td>
			<td>G.Hartzell and son</td>
			<td>126-CSH3</td>
			<td>Handle of the inspection mirror</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EC Plan-Neofluar 5x/0.16</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>440321-9902</td>
			<td>Used for light-sheet imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elipar DeepCure-S LED curing light</td>
			<td>3M ESPE</td>
			<td>76985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf safe-lock tubes, 1.5mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl cinnamate, &#62;= 98%</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>W243000-1KG-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic Needle, 27G x 1/2&#39;&#39;</td>
			<td>BD</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketathesia 100mg/ml</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>NDC:11695-0702-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIMWIPES delicate task wipers</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>21905-026 (VWR Catalog number)</td>
			<td>Purchased from VWR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightSheet Z.1 dual illumination microscope system</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LightSheet Z.1/LightSheet 7</td>
			<td>Used for lightsheet imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 880 NLO multi-photon microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 880 NLO</td>
			<td>Used for two-photon imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAmicro, plane, 5mm dia, SS-Thread</td>
			<td>Hahnenkratt</td>
			<td>6220</td>
			<td>Front surface inspectrio mirror</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroCT machine, MicroXCT-200</td>
			<td>Xradia</td>
			<td>MICRO XCT-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Colibri</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>17000-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PermaFlo Flowable Composite</td>
			<td>Ultradent</td>
			<td>948</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Procedure platform</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom-made from lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Routine stereo micscope M80</td>
			<td>Leica Micosystems</td>
			<td>M80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sentalloy NiTi open coil spring</td>
			<td>TOMY Inc.</td>
			<td></td>
			<td>A 0.15mm diameter closed NiTi coil with an inner coil diameter of 0.9mm delivers a force of 10g. Similar products can be purchased from Dentsply Sirona.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-304 stainless steel ligature wire, 0.009&#39;&#39; diameter</td>
			<td>Orthodontics</td>
			<td>SBLW109</td>
			<td>0.009&#39;&#39;(.23mm) diameter, Soft temper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Ject E (Xylazine) 100mg/ml</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>NDC:11695-7085-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z100 Restorative, A2 shade</td>
			<td>3M ESPE</td>
			<td>5904A2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3d imaging of pdl collagen fibers during orthodontic tooth movement in mandibular murine model

Kieferorthopädische Zahnbewegung ist ein komplexer biologischer Prozess des veränderten Weich- und Hartgewebeumbaus als Folge äußerer Kräfte. Um diese komplexen Umbauprozesse zu verstehen, ist es wichtig, das Zahn- und Parodontalgewebe in ihrem 3D-Kontext zu untersuchen und somit Schnitte und Gewebeartefakte zu minimieren. Mausmodelle werden aufgrund ihrer geringen Größe, hohen Stoffwechselrate, Genetik und einfachen Handhabung häufig in der Entwicklungs- und Strukturbiologie sowie in der Biomechanik eingesetzt. Prinzipiell sind sie damit auch hervorragende Modelle für zahnärztliche Studien. Ein großes Hindernis ist jedoch ihre geringe Zahngröße, insbesondere die Backenzähne. Dieses Papier zielt darauf ab, ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Erzeugung kieferorthopädischer Zahnbewegungen und zwei Methoden zur 3D-Bildgebung der parodontalen Bandfaserkomponente eines Maus-Unterkiefermolaren bereitzustellen. Die erste vorgestellte Methode basiert auf einem Mikro-CT-Setup, das die Phasenverstärkungsbildgebung von frischem Kollagengewebe ermöglicht. Die zweite Methode ist eine Knochenreinigungsmethode mit Ethylzimt, die eine Bildgebung durch den Knochen ohne Schnitt ermöglicht und die endogene Fluoreszenz bewahrt. Kombination dieser Clearing-Methode mit Reportermäusen wie Flk1-Cre; TdTomato bot eine erste Gelegenheit seiner Art, das 3D-Gefäßsystem in der PDL und im Alveolarknochen abbilden zu können.

Dieser Artikel stellt eine Methode zur Herstellung von OTM sowie zwei Methoden zur 3D-Bildgebung von Kollagenfasern innerhalb der PDL ohne Schnitte vor. Für Tierversuchszwecke gilt eine Zahnbewegung, wenn eine Ausrichtung der Zähne nicht notwendig ist, als kieferorthopädisch, wenn sie einen Umbau des Alveolarknochens auf allen Wurzelebenen erzeugt. Um ein zuverlässiges OTM zu erzeugen, ist ein konstantes Kraftniveau auf die Zähne erforderlich. Hier wird eine aktivierte Formgedächtnis-NiTi-Spule verwendet, um eine k...

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3D Imaging of PDL Collagen Fibers during Orthodontic Tooth Movement in Mandibular Murine Model

Wir präsentieren ein Protokoll zur Erzeugung kieferorthopädischer Zahnbewegungen bei Mäusen und Methoden zur 3D-Visualisierung der Kollagenfasern und Blutgefäße von Parodontalbändern ohne Schnitt.

3D-Bildgebung von PDL-Kollagenfasern während kieferorthopädischer Zahnbewegungen im Unterkiefermine modell

Orthodontic tooth movement is a complex biological process of altered soft and hard tissue remodeling as a result of external forces. In order to ...

Kieferorthopädische Zahnbewegung ist ein komplexer biologischer Prozess, der äußere Kräfte und den Umbau von Weich- und Hartgewebe beinhaltet. Um diese Prozesse zu verstehen, ist es wichtig, den Zahn und das Parodontalgewebe im 3D-Kontext zu untersuchen. Das Murinmodell ist aufgrund seiner Größe, der hohen Stoffwechselrate und der riesigen genetischen Information, die wir haben, ein guter Kandidat für solche Studien.Die Herstellung kieferorthopädischer Zahnbewegungen bei Mäusen ist jedoch aufgrund ihrer geringen Größe nicht einfach. Darüber hinaus beinhalten Strukturanalysemethoden in der Regel Schnitte, die die 3D-Struktur und den Kontext des Gewebes stören. Für ein ungleichmäßiges Gewebe wie die PDL ist die Erhaltung der 3D-Struktur und des Kontexts von entscheidender Bedeutung.Um diese beiden Hindernisse zu beseitigen, stellen wir ein Protokoll zur Verfügung, um die mesiale kieferorthopädische Zahnbewegung des ersten Unterkiefermolaren bei Mäusen zu erzeugen und zwei Methoden zu beschreiben, die eine 3D-Visualisierung des Parodontalbandes ermöglichen, ohne das Gewebe zu durchtrappen. Um die betäubte Maus für das Einsetzen des kieferorthopädischen Geräts zu positionieren, haken Sie den oberen Schneidezahn an die Büroklammerschlaufe an. Immobilisieren Sie die unteren Schneidezähne mit der Stromkette Und öffnen Sie den Mund weiter mit Mini-Colibri-Mausretraktor.Tragen Sie einen kleinen Tropfen Kochsalzlösung auf jedes Auge auf, um eine Hornhautaustrocknung zu verhindern. Dies sind die Werkzeuge, die beim Einsetzen von Geräten verwendet werden. Schneiden Sie ein Stück Aluminiumdraht auf einen Zentimeter Länge.Schieben Sie den Draht mit einem mikrochirurgischen Nadelhalter von der Wangenseite lingual in den interproximalen Bereich unterhalb des Kontaktpunkts zwischen dem ersten und zweiten Backenzähn. Ziehen Sie den Draht von der lingualen Seite zur mesialen Seite des Backenzahns. Drehen Sie die freien Enden des Drahtes zwei- bis dreimal, um sie zu sichern.Schneiden Sie ein Stück Nickeltitan oder NiTi-Schraubenfeder in einer Länge von sieben bis neun Gewinden. Setzen Sie die Spule zwischen dem unteren ersten Backenzahn und dem Schneidezahn ein, führen Sie ein freies Ende des Drahtes durch zwei Gewinde der Spule und drehen Sie dann beide Enden des Drahtes fest, um die Spule am Backenzahn zu befestigen. Entfernen Sie die Stromkette mit einer Pinzette.Schlingen Sie zwei bis drei Gewinde der Spule über den Schneidekreis, um die Spule zu verankern. Lassen Sie genau drei aktive Fäden zwischen dem ersten Backenzahn und dem Schneidezahn. Schieben Sie die Bedrohungen bis zum schneidebogenfreien Zahnfleischrand.Legen Sie eine Schicht aus fließfähigem Kompositharz auf den Schneiderand der Spule und härten Sie sie mit Zahnhärtelicht aus. Ersetzen Sie die Stromkette nach dem Aushärten des Harzes. Trimmen Sie überschüssigen Draht um den Backenzahn, um Verletzungen zu vermeiden.Erhitzen Sie die NiTi-Spule mit demselben Aushärtungslicht für 20 Sekunden. Dadurch wird die Spule festgezogen, die fertige Platzierung sollte so aussehen. Weichgewebe am sezierten Hemi-Unterkiefer kann mit einem fusselfreien Tuch entfernt werden.Reiben Sie mit einer Probe zwischen zwei Fingern die Außenseite in kreisenden Bewegungen, bis der größte Teil des Weichgewebes entfernt ist. Der Rest kann mit einer Schere abgeschnitten werden. Gereinigter Unterkiefer ist hier rechts dargestellt.Um den sezierten Hemi-Unterkiefer aus dem Mikro-CT-Scan in der Probenkammer zu montieren, formen Sie ein reiskorngroßes packbares Dentalharz zu einem Stamm. Legen Sie es dann in den Sample-Slot der Bühne. Legen Sie den Hemi-Unterkiefer auf den Verbund.Stellen Sie die Position ein, bis der erste Backenzahn an der Mittellinienrille zentriert ist und die Okklusionsfläche horizontal ist. Härten Sie den Verbundwerkstoff aus, wenn Er mit der Positionierung zufrieden ist. Dies ist ein Beispiel für den Unterkiefer in der richtigen Position.Nehmen Sie eine kleine Kugel packbares Zahnharz. Sein Durchmesser sollte etwa die Breite des Backenzahns liegen. Legen Sie das Harz auf die Okklusionsoberfläche des ersten Backenzahns.Fusselfreies Wischen mit Wasser befeuchten. Legen Sie das gedämpfte Tuch in die Feuchtigkeitspools in der Probenstufe. Schließen Sie die Probenkammer und befestigen Sie sie mit Schrauben am Mikro-CT.Nehmen Sie nun 2D-Bilder auf, während Sie den Amboss vertikal absenken, bis die Spitze des Ambosses vom Komposit umgeben ist. Schalten Sie die Röntgenquelle sicher aus, öffnen Sie die Mikro-CT-Kammer und härten Sie das Komposit durch das klare Plexiglasfenster aus. Jetzt ist die Probe ordnungsgemäß montiert und kann bei Bedarf abgebildet werden.Um optisch gereinigte Hemi-Unterkiefer-Probe zu erzeugen, bereiten Sie die folgenden Lösungen in 1,5 mil Zentrifugenröhrchen vor. 4% Paraformaldehyd, 50% und 70% Ethanol in entionisiertem Wasser. Zwei Röhrchen aus 100% Ethanol und Ethylzimt.Sezierte Hemi-Unterkiefer in 4% Paraformaldehyd geben. Decken Sie das Rohr mit Aluminiumfolie ab und legen Sie es sechs Stunden lang bei Raumtemperatur auf eine Wippe. Nach sechs Stunden die Probe in 50% Ethanol überführen.Legen Sie die Probe für 16 Stunden wieder auf die Wippe, die von Licht bedeckt ist. Wiederholen Sie den vorherigen Schritt mit einer Probe in 70% Ethanol für 16 Stunden, gefolgt von 100% Ethanol zweimal für jeweils 16 Stunden. Schließlich die Probe für mindestens 12 Stunden auf Ethylzimt bringen.Zuverlässige kieferorthopädische Bewegung wird durch das NiTi-Spulengerät im murinen Unterkiefer-ersten Backenzahn erzeugt. Bei neun Wochen alten männlichen Mäusen beträgt der durchschnittliche interproximale Raum nach sieben Tagen 40 Mikrometer. Phasenverstärkungs-Mikro-CT ermöglicht die Visualisierung der PDL.Nach drei Tagen kieferorthopädischer Bewegung ist die PDL-Dichte reduziert. Die Knochen-PDL-Grenzfläche ist aufgrund der Entwicklung von Kratern in der Knochenoberfläche, die auf osteoklastische Aktivität und Knochenresorption hinweisen, rauer. Raue Oberfläche ist auf allen Ebenen der Wurzeln zu sehen.Dies zeigt, dass die Bewegung translational ist und nicht eine Kippbewegung. Am siebten Tag ist der PDL-Raum schmaler als am dritten Tag und der Knochen-PDL-Rand an der distalen Wurzeloberfläche ist glatter, was Anzeichen einer Knochenresposition sind, wie erwartet, wenn kieferorthopädische Zahnbewegungen auftreten. Aufgrund der langen Mikro-CT-Bildgebungszeit und der Rotation der Stufe ist eine sichere Montage der Probe unerlässlich.Instabile Probe, bei der verschwommene Scans entstehen, bei denen eine Silhouette um die Krone herum zu sehen ist und die PDL-Fasern nicht zu sehen sind. Die optische Reinigung mit Ethylzimt bietet eine weitere Methode, um die PDL ohne Schnitte anzuzeigen. Das Substrat ist durch den Ramus einer ausreichend gereinigten Probe zu sehen, die hier rechts gezeigt wird.Diese Methode bewahrt die endogene Fluoreszenz und kann ohne chemische Fixierung verwendet werden. Die Lightsheet-Mikroskopie kann an gereinigten Proben verwendet werden. Bei einer transgenen Maus können die fluoreszierenden Blutgefäßauskleidungen beobachtet werden.Wenn der Knochen nicht richtig gereinigt wurde, sind Blutgefäße in der PDL nicht sichtbar, wie in Panel F gezeigt.Dieses Protokoll beschreibt, wie zwei große Herausforderungen bei der Erzeugung und Analyse kieferorthopädischer Zahnbewegungen in murinen Unterkiefermolarenzähnen überwunden werden können. Sobald die kieferorthopädische Zahnbewegungstechnik beherrscht ist, kann sie in 15 Minuten abgeschlossen werden. Dieser Prozess ist aufgrund der geringen Abmessungen der Mauszähne und der Anwesenheit der Zunge eine Herausforderung.Wir bieten jedoch alle notwendigen Lösungen, um diese Herausforderungen zu meistern. Die Mikro-CT-Bildgebung erfordert eine Phasenverstärkungsfähigkeit. Wir demonstrierten unsere Technik mit einem Mikro-CT auf dem Tisch. Jedes Setup, das eine Phasenverstärkung erzeugen kann, führt jedoch beispielsweise ein Synchrotron durch.Die ECi-Clearing-Ergebnisse hängen vom Dehydratisierungsprozess ab. Wenn die Probe nicht transparent genug ist, ist unser Vorschlag, die Zeit der Dehydratisierungsschritte zu erhöhen. Unsere Clearing-Methode kann auch bei nicht fixierten Proben angewendet werden.Die klaren Gewebe können im Mikro-CT gescannt werden, da der Clearing-Prozess den Mineralstoffgehalt des Gewebes nicht beeinflusst. Daher bietet unsere Methode einen korrelativen Ansatz für Fluoreszenz- und Strukturinformationen, um eine vollständige 3D-Analyse zu erstellen.

Research

JoVE Journal

Medicine

Intracranial Implantation with Subsequent 3D In Vivo Bioluminescent Imaging of Murine Gliomas

Intracranial Implantation with Subsequent 3D In Vivo Bioluminescent Imaging of Murine Gliomas

Intrakranielle Implantation mit anschließender 3D In Vivo Bioluminescent Imaging von Murine Gliome

The mouse glioma 261 (GL261) is recognized as an in vivo model system that recapitulates many of the features of human glioblastoma multiforme (GBM). The ...

Forschung

Medizin

Three-dimensional Imaging of Nociceptive Intraepidermal Nerve Fibers in Human Skin Biopsies

Dreidimensionale Bildgebung Nozizeptive Intraepidermale Nervenfasern im menschlichen Hautproben

A punch biopsy of the skin is commonly used to quantify intraepidermal nerve fiber densities (IENFD) for the diagnosis of peripheral polyneuropathy 1,2. ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

Quantitative Visualisierung von Leukozyten-Infiltrat in einem Murin-Modell der Fulminant-Myokarditis durch Licht-Blatt-Mikroskopie

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

3D Ultrasound Imaging: Fast and Cost-effective Morphometry of Musculoskeletal Tissue

3D Ultraschall-Bildgebung: schnelle und kostengünstige Morphometrie des Muskel-Skelett-Gewebe

The developmental goal of 3D ultrasound imaging (3DUS) is to engineer a modality to perform 3D morphological ultrasound analysis of human muscles. 3DUS ...

Determining and Controlling External Power Output During Regular Handrim Wheelchair Propulsion

Bestimmung und Steuerung der externen Leistung während des regulären Handrim-Rollstuhlantriebs

The use of a manual wheelchair is critical to 1% of the world&#39;s population. Human powered wheeled mobility research has considerably matured, which ...

Delayed Intramyocardial Delivery of Stem Cells after Ischemia Reperfusion Injury in a Murine Model

Verzögerte intramyokardiale Lieferung von Stammzellen nach Ischämie-Reperfusionsverletzung in einem Murine-Modell

There is significant interest in the use of stem cells (SCs) for the recovery of cardiac function in individuals with myocardial injuries. Most commonly, ...

Multiphoton Intravital Imaging for Monitoring Leukocyte Recruitment during Arteriogenesis in a Murine Hindlimb Model

Multiphotonen-Intravital-Bildgebung zur Überwachung der Leukozytenrekrutierung während der Arteriogenese in einem murinen Hintergliedmaßenmodell

Arteriogenesis strongly depends on leukocyte and platelet recruitment to the perivascular space of growing collateral vessels. The standard approach for ...

3D Imaging of the Liver Extracellular Matrix in a Mouse Model of Non-Alcoholic Steatohepatitis

3D-Bildgebung der extrazellulären Matrix der Leber in einem Mausmodell der nicht-alkoholischen Steatohepatitis

Non-alcoholic steatohepatitis (NASH) is the most common chronic liver disease in the United States, affecting more than 70 million Americans. NASH can ...

Analyzing Alveolar Bone Remodeling to Explore Skeletal Mechanical Biology

Using Inducible Osteoblastic Lineage-Specific Stat3 Knockout Mice to Study Alveolar Bone Remodeling During Orthodontic Tooth Movement

Comparing Alveolar and Long Bone Remodeling to Explore OTM Model Potential (Video) | JoVE

Verwendung von induzierbaren osteoblastischen Abstammungs-spezifischen Stat3-Knockout-Mäusen zur Untersuchung des Alveolarknochenumbaus während kieferorthopädischer Zahnbewegung

The alveolar bone, with a high turnover rate, is the most actively-remodeling bone in the body. Orthodontic tooth movement (OTM) is a common artificial ...

A Murine Maxillary Orthodontic Model Guide to Bone Remodeling Analysis

The Establishment of a Murine Maxillary Orthodontic Model

Author Spotlight: Insights into an Efficient Murine Maxillary Orthodontic Model Protocol

Due to the lack of reproducible protocols for establishing a murine maxillary orthodontic model, we present a reliable and reproducible protocol to ...