Name: 3d imaging of pdl collagen fibers during orthodontic tooth movement in mandibular murine model
Uploaded: 2021-04-15T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about 3D Imaging of PDL Collagen Fibers during Orthodontic Tooth Movement in Mandibular Murine Model at JoVE.com

Questo studio è stato supportato dal NIH (NIDCR R00- DE025053, PI:Naveh). Vorremmo ringraziare l'Harvard Center for Biological Imaging per le infrastrutture e il supporto. Tutte le cifre sono generate con biorender.com.

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le Linee guida del NIH per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e le linee guida del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Harvard (protocollo n. 01840).
1. Movimento ortodontico dei denti
<ol><li>Per generare un letto per topi, utilizzare una piattaforma di plastica piatta con un poggiacapo angolato a forma di cuneo a 45°. Il poggiacapo può essere generato tagliando un...

<ol>
	<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthodontic+tooth+movement:+The+biology+and+clinical+implications.">Orthodontic tooth movement: The biology and clinical implications.</a> The Kaohsiung Journal of Medical Sciences. 34 (4), 207-214 (2018).</li><li>Meikle, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tissue,+cellular,+and+molecular+regulation+of+orthodontic+tooth+movement:+100+years+after+Carl+Sandstedt.">The tissue, cellular, and molecular regulation of orthodontic tooth movement: 100 years after Carl Sandstedt.</a> European Journal of Orthodontics. 28, 221-240 (2006).</li><li>Krishnan, V., Davidovitch, Z., molecular, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular,+molecular,+and+tissue-level+reactions+to+orthodontic+force.">Cellular, molecular, and tissue-level reactions to orthodontic force.</a> American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics. 129 (4), 1-32 (2006).</li><li>Shoji-Matsunaga, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteocyte+regulation+of+orthodontic+force-mediated+tooth+movement+via+RANKL+expression.">Osteocyte regulation of orthodontic force-mediated tooth movement via RANKL expression.</a> Scientific Reports. 7 (1), 8753 (2017).</li><li>Oppenheim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+changes,+particularly+of+the+bone,+incident+to+tooth+movement.">Tissue changes, particularly of the bone, incident to tooth movement.</a> European Journal of Orthodontics. 29, 2-15 (2007).</li><li>Unnam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+Orthodontics-An+overview.">Accelerated Orthodontics-An overview.</a> Journal of Archives of Oral Biologyogy and Craniofacial Research. 3 (1), 4 (2018).</li><li>von Bohl, M., Kuijpers-Jagtman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyalinization+during+orthodontic+tooth+movement+:+a+systematic+review+on+tissue+reactions.">Hyalinization during orthodontic tooth movement : a systematic review on tissue reactions.</a> European Journal of Orthodontics. 31 (1), 30-36 (2009).</li><li>Kirschneck, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+assessment+of+mouse+models+for+experimental+orthodontic+tooth+movement.">Comparative assessment of mouse models for experimental orthodontic tooth movement.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1-12 (2020).</li><li>Naveh, G. R. S., Weiner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+orthodontic+tooth+movement+of+a+multirooted+tooth:+a+3D+study+of+a+rat+molar.">Initial orthodontic tooth movement of a multirooted tooth: a 3D study of a rat molar.</a> Orthodontics &amp; Craniofacial Research. 18 (3), 134-142 (2015).</li><li>Nakamura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+observation+of+rat+periodontal+ligament+during+function+and+tooth+movement,+using+microcomputed+tomography.">Time-lapse observation of rat periodontal ligament during function and tooth movement, using microcomputed tomography.</a> European Journal of Orthodontics. 30 (3), 320-326 (2008).</li><li>Kawarizadeh, A., Bourauel, C., Jager, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+and+numerical+determination+of+initial+tooth+mobility+and+material+properties+of+the+periodontal+ligament+in+rat+molar+specimens.">Experimental and numerical determination of initial tooth mobility and material properties of the periodontal ligament in rat molar specimens.</a> European Journal of Orthodontics. 25 (6), 569-578 (2003).</li><li>J&#243;nsd&#243;ttir, S. H., Giesen, E. B. W., Maltha, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanical+behavior+of+the+periodontal+ligament+of+the+beagle+dog+during+the+first+5+hours+of+orthodontic+force+application.">Biomechanical behavior of the periodontal ligament of the beagle dog during the first 5 hours of orthodontic force application.</a> European Journal of Orthodontics. 28, 547 (2006).</li><li>Lindhe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+breakdown+of+peri-implant+and+periodontal+tissues.+A+study+in+the+beagle+dog.">Experimental breakdown of peri-implant and periodontal tissues. A study in the beagle dog.</a> Clinical Oral Implants Research. 3 (1), 9-16 (1992).</li><li>Salamati, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+tooth+mobility+in+young+pigs.">Functional tooth mobility in young pigs.</a> Journal of Biomechanics. 104, 109716 (2020).</li><li>Maria, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unusual+disordered+alveolar+bone+material+in+the+upper+furcation+region+of+minipig+mandibles:+A+3D+hierarchical+structural+study.">An unusual disordered alveolar bone material in the upper furcation region of minipig mandibles: A 3D hierarchical structural study.</a> Journal of Structural Biology. 206 (1), 128-137 (2019).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+miniature+pig:+a+useful+large+animal+model+for+dental+and+orofacial+research.">The miniature pig: a useful large animal model for dental and orofacial research.</a> Oral Diseases. 10, 1-7 (2007).</li><li>Melsen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+reaction+to+orthodontic+tooth+movement--a+new+paradigm.">Tissue reaction to orthodontic tooth movement--a new paradigm.</a> European Journal of Orthodontics. 23 (6), 671-681 (2001).</li><li>Naveh, G. R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+MicroCT+imaging+of+non-mineralized+connective+tissues+at+high+resolution.">Direct MicroCT imaging of non-mineralized connective tissues at high resolution.</a> Connective Tissue Research. 55 (1), 52-60 (2014).</li><li>Naveh, G. R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonuniformity+in+ligaments+is+a+structural+strategy+for+optimizing+functionality.">Nonuniformity in ligaments is a structural strategy for optimizing functionality.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), 9008 (2018).</li><li>Naveh, G. R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tooth+periodontal+ligament:+Direct+3D+microCT+visualization+of+the+collagen+network+and+how+the+network+changes+when+the+tooth+is+loaded.">Tooth periodontal ligament: Direct 3D microCT visualization of the collagen network and how the network changes when the tooth is loaded.</a> Journal of Structural Biology. 181 (2), 108-115 (2013).</li><li>Naveh, G. R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tooth+movements+are+guided+by+specific+contact+areas+between+the+tooth+root+and+the+jaw+bone+:+A+dynamic+3D+microCT+study+of+the+rat+molar.">Tooth movements are guided by specific contact areas between the tooth root and the jaw bone : A dynamic 3D microCT study of the rat molar.</a> Journal of Structural Biology. 17 (2), 477-483 (2012).</li><li>Naveh, G. R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tooth-PDL-bone+complex:+Response+to+compressive+loads+encountered+during+mastication+-A+review.">Tooth-PDL-bone complex: Response to compressive loads encountered during mastication -A review.</a> Archives of Oral Biology. 57 (12), 1575-1584 (2012).</li><li>Ben-Zvi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+the+tooth-periodontal+ligament-bone+complex+to+load:+A+microCT+study+of+the+minipig+molar.">Response of the tooth-periodontal ligament-bone complex to load: A microCT study of the minipig molar.</a> Journal of Structural Biology. 205 (2), 155-162 (2019).</li><li>Klingberg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+Automated+Evaluation+of+Total+Glomerular+Number+and+Capillary+Tuft+Size+in+Nephritic+Kidneys+Using+Lightsheet+Microscopy.">Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452 (2017).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+Tissue+Clearing.">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li><li>Taddei, S. R. d. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+model+of+tooth+movement+in+mice:+A+standardized+protocol+for+studying+bone+remodeling+under+compression+and+tensile+strains.">Experimental model of tooth movement in mice: A standardized protocol for studying bone remodeling under compression and tensile strains.</a> Journal of Biomechanics. 45 (16), 2729-2735 (2012).</li><li>Nakamura, K., Sahara, N., Deguchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+changes+in+the+distribution+and+number+of+macrophage-lineage+cells+in+the+periodontal+membrane+of+the+rat+molar+in+response+to+experimental+tooth+movement.">Temporal changes in the distribution and number of macrophage-lineage cells in the periodontal membrane of the rat molar in response to experimental tooth movement.</a> Archives of Oral Biology. 46 (7), 593-607 (2001).</li><li>Rygh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+vascular+system:+A+main+mediator+of+periodontal+fiber+remodeling+in+orthodontic+tooth+movement.">Activation of the vascular system: A main mediator of periodontal fiber remodeling in orthodontic tooth movement.</a> American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics. 89 (6), 453-468 (1986).</li><li>Nagao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor+in+cartilage+development+and+osteoarthritis.">Vascular endothelial growth factor in cartilage development and osteoarthritis.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13027 (2017).</li><li>Licht, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelium-specific+Cre+recombinase+activity+in+flk-1-Cre+transgenic+mice.">Endothelium-specific Cre recombinase activity in flk-1-Cre transgenic mice.</a> Developmental Dynamics. 229 (2), 312-318 (2004).</li><li>Connizzo, B. K., Naveh, G. R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+AFM-based+nanoscale+rheology+reveals+regional+non-uniformity+in+viscoporoelastic+mechanical+behavior+of+the+murine+periodontal+ligament.">In situ AFM-based nanoscale rheology reveals regional non-uniformity in viscoporoelastic mechanical behavior of the murine periodontal ligament.</a> Journal of Biomechanics. 111, 109996 (2020).</li><li>Connizzo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonuniformity+in+Periodontal+Ligament:+Mechanics+and+Matrix+Composition.">Nonuniformity in Periodontal Ligament: Mechanics and Matrix Composition.</a> Journal of Dental Research. 2, 179-186 (2020).</li></ol>

La generazione di OTM nei topi è altamente desiderata a causa delle dimensioni, della genetica e dei vantaggi di gestione. L'uso della mattiere fornisce una facile manipolazione sia in termini di dissezione tissutale che di preparazione e imaging del campione. Qui abbiamo presentato un metodo per generare OTM con movimento trascizionale del dente all'interno dell'osso entro 7 giorni da OTM. Utilizzando questo protocollo, la durata complessiva del movimento del dente può essere estesa, poiché la bobina attivata fornisc...

Il processo biologico di base nel movimento ortodontico dei denti (OTM) è il rimodellamento osseo. Il trigger per questo processo di rimodellamento è attribuito a cambiamenti nella struttura del legamento parodontale (PDL) come lo stress della matrice extracellulare (ECM), la necrosi, la distruzione e la formazione dei vasisanguigni 1,2,3. Altri possibili fattori scatenanti per il rimodellamento osseo alveolare sono correlati al rilevamento della forza da parte degli osteociti nell'osso, così come alla deformazione meccanica dell'osso alveolare stesso; tuttavia il loro ruolo in OTM non è ancora del tutto chiarito4,5.
Nonostante molti studi volti a rivelare le relazioni struttura-funzione del PDL durante l'OTM, un chiaro meccanismo funzionale deve ancora esseredefinito 6,7. La ragione principale di ciò è la sfida nel recupero dei dati di un tessuto molle (PDL) situato tra due tessuti duri (cemento e osso alveolare). I metodi accettati per raccogliere informazioni strutturali di solito richiedono fissazione e sezionamento che interrompono e modificano la struttura PDL. Inoltre, la maggior parte di questi metodi fornisce dati 2D che, anche se non distorti, forniscono solo informazioni parziali e localizzate. Poiché il PDL non è uniforme nella sua struttura e funzione, è giustificato un approccio che affronta la struttura 3D intatta dell'intero complesso dentale-PDL-osso.
Questo documento descriverà un metodo per generare un OTM nei topi e due metodi che consentono la visualizzazione 3D delle fibre di collagene nel PDL senza alcuna sezione del campione.
I modelli murini sono ampiamente utilizzati per esperimenti in vivo in medicina, biologia dello sviluppo, somministrazione di farmaci e studi strutturali. Possono essere geneticamente modificati per eliminare o migliorare proteine e funzioni specifiche; forniscono un controllo dello sviluppo rapido, ripetibile e prevedibile; sono anche facili da immaginare grazie alle loro piccole dimensioni8. Nonostante i loro numerosi vantaggi, i modelli di topo nella ricerca dentale non vengono utilizzati frequentemente, specialmente quando le manipolazioni cliniche sono giustificate, principalmente a causa dei denti di piccole dimensioni. Modelli animali come ratti9,10,11,cani12,13,maiali14,15,16 e scimmie 17 sono usati più spesso dei topi. Con il recente sviluppo di tecniche di imaging ad alta risoluzione, i vantaggi dell'utilizzo di un modello di mouse per decifrare i processi contorti in OTM sono numerosi. Questo articolo presenta un metodo per generare un movimento mesiale del dente molare nella madibola con livelli di forza costanti che innescano il rimodellamento osseo. La maggior parte degli esperimenti OTM sui roditori sono fatti nella mascella, poiché la mobilità della mattiglia e la presenza della lingua aggiungono un altro livello di complessità. Tuttavia, la madibola ha molti vantaggi quando si desidera l'integrità strutturale 3D. Può essere facilmente sezionato come un osso intero; in alcune specie può essere separato in due emi-madibole attraverso la sifisi fibrosa; è compatto, piatto e contiene solo i denti senza spazi seno. Al contrario, la mascella è una parte del cranio e strettamente correlata ad altri organi e strutture, quindi è necessaria una sezione estesa per sezionare l'osso alveolare con i denti associati.
Utilizzando una camera di umidità interna accoppiata a un sistema di carico all'interno di una micro-TAC ad alta risoluzione che consente il miglioramento della fase, abbiamo sviluppato un metodo per visualizzare tessuti fibrosi freschi in 3D comeprecedentemente descritto 9,18,19,20,21,22,23. I tessuti freschi vengono scansionati immediatamente dopo che l'animale è stato sacrificato senza alcuna colorazione o fissazione, il che riduce i manufatti tissutali e le alterazioni delle proprietà biomeccaniche. Questi dati 3D possono essere utilizzati per analisi di distribuzione e direzione delle fibre come descritto altrove19.
Il secondo metodo di imaging 3D di tessuti interi qui presentato si basa sulla pulizia ottica della madibola che consente l'imaging delle fibre PDL attraverso l'osso senza alcuna sezione. È interessante notare che consente anche la visualizzazione delle fibre di collagene dell'osso stesso, tuttavia questo non sarà discusso qui. In generale, ci sono due metodi per la pulizia dei tessuti. Il primo è la radura a base acquosa in cui il campione è immerso in una soluzione acquosa con un indice di rifrazione maggiore di 1,4 attraverso una semplice immersione, iperidratazione o immersione di idrogel. Tuttavia, questo metodo è limitato nel livello di trasparenza e nella conservazione strutturale del tessuto e quindi richiede la fissazione del tessuto. Il secondo metodo che produce campioni altamente trasparenti e non richiede fissazione è il metodo di compensazione a base disolventi 24,25. Abbiamo generato un metodo di compensazione modificato a base di solventi basato sull'etil-3-fenilprop-2-enoato (etil cinnamato, ECi) per i campioni mandibolari. Questo metodo ha i vantaggi di utilizzare agenti di compensazione non tossici per uso alimentare, restringimento minimo dei tessuti e conservazione delle proteine fluorescenti.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-mL BD Luer-Lok syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X phosphate buffered saline</td>
			<td>VWR Life Sciences</td>
			<td>0780-10L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 proof ethanol</td>
			<td>VWR Life Sciences</td>
			<td>V1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum alloy 5019 wire</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>GF15828813</td>
			<td>0.08 mm diameter wire, length 100th, temper hard. Used as wire ligature around molar.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avizo 9.7</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used to analyze microCT scans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Castroviejo Micro Needle Holders</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12060-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clr Plan-Apochromat 20x/1.0,CorrVIS-IR M27 85mm</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used for second harmonic generation imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cone socket handle, single ended, hand-form</td>
			<td>G.Hartzell and son</td>
			<td>126-CSH3</td>
			<td>Handle of the inspection mirror</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EC Plan-Neofluar 5x/0.16</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>440321-9902</td>
			<td>Used for light-sheet imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elipar DeepCure-S LED curing light</td>
			<td>3M ESPE</td>
			<td>76985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf safe-lock tubes, 1.5mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl cinnamate, &#62;= 98%</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>W243000-1KG-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic Needle, 27G x 1/2&#39;&#39;</td>
			<td>BD</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketathesia 100mg/ml</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>NDC:11695-0702-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIMWIPES delicate task wipers</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>21905-026 (VWR Catalog number)</td>
			<td>Purchased from VWR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightSheet Z.1 dual illumination microscope system</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LightSheet Z.1/LightSheet 7</td>
			<td>Used for lightsheet imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 880 NLO multi-photon microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 880 NLO</td>
			<td>Used for two-photon imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAmicro, plane, 5mm dia, SS-Thread</td>
			<td>Hahnenkratt</td>
			<td>6220</td>
			<td>Front surface inspectrio mirror</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroCT machine, MicroXCT-200</td>
			<td>Xradia</td>
			<td>MICRO XCT-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Colibri</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>17000-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PermaFlo Flowable Composite</td>
			<td>Ultradent</td>
			<td>948</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Procedure platform</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom-made from lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Routine stereo micscope M80</td>
			<td>Leica Micosystems</td>
			<td>M80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sentalloy NiTi open coil spring</td>
			<td>TOMY Inc.</td>
			<td></td>
			<td>A 0.15mm diameter closed NiTi coil with an inner coil diameter of 0.9mm delivers a force of 10g. Similar products can be purchased from Dentsply Sirona.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-304 stainless steel ligature wire, 0.009&#39;&#39; diameter</td>
			<td>Orthodontics</td>
			<td>SBLW109</td>
			<td>0.009&#39;&#39;(.23mm) diameter, Soft temper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Ject E (Xylazine) 100mg/ml</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>NDC:11695-7085-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z100 Restorative, A2 shade</td>
			<td>3M ESPE</td>
			<td>5904A2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3d imaging of pdl collagen fibers during orthodontic tooth movement in mandibular murine model

Il movimento ortodontico dei denti è un complesso processo biologico di rimodellamento alterato dei tessuti molli e duri come risultato di forze esterne. Per comprendere questi complessi processi di rimodellamento, è fondamentale studiare i tessuti dentali e parodontali all'interno del loro contesto 3D e quindi ridurre al minimo qualsiasi sezionamento e artefatti tissutali. I modelli di topo sono spesso utilizzati nella biologia dello sviluppo e strutturale, così come nella biomeccanica a causa delle loro piccole dimensioni, alto tasso metabolico, genetica e facilità di manipolazione. In linea di principio questo li rende anche modelli eccellenti per studi relativi all'odontoiatria. Tuttavia, un grosso impedimento è la loro piccola dimensione del dente, i molari in particolare. Questo documento ha lo scopo di fornire un protocollo passo dopo passo per generare il movimento ortodontico dei denti e due metodi per l'imaging 3D del componente fibroso legamento parodontale di un molare mandibolare del topo. Il primo metodo presentato si basa su una configurazione micro-CT che consente l'imaging di miglioramento della fase dei tessuti di collagene fresco. Il secondo metodo è un metodo di compensazione ossea che utilizza cinnamato etilico che consente l'imaging attraverso l'osso senza sessare e preserva la fluorescenza endogena. Combinando questo metodo di compensazione con topi reporter come Flk1-Cre; TdTomato ha fornito una prima opportunità nel suo genere di immagine della vascuola 3D nel PDL e nell'osso alveolare.

Questo articolo presenta un metodo per produrre OTM e due metodi per l'imaging 3D di fibre di collagene all'interno del PDL senza alcuna sezione. Ai fini della ricerca animale, quando l'allineamento dei denti non è necessario, un movimento del dente è considerato ortodontico se genera rimodellamento dell'osso alveolare a tutti i livelli delle radici. È necessario un livello di forza costante applicato sui denti per generare un OTM affidabile. Qui, una bobina NiTi a memoria di forma attivata viene utilizzata per genera...

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3D Imaging of PDL Collagen Fibers during Orthodontic Tooth Movement in Mandibular Murine Model

Presentiamo un protocollo per generare movimento ortodontico dei denti nei topi e metodi per la visualizzazione 3D delle fibre di collagene e dei vasi sanguigni del legamento parodontale senza sezioni.

Imaging 3D delle fibre di collagene PDL durante il movimento ortodontico dei denti nel modello murino mandibolare

Orthodontic tooth movement is a complex biological process of altered soft and hard tissue remodeling as a result of external forces. In order to ...

Il movimento ortodontico dei denti è un complesso processo biologico che coinvolge forze esterne e rimodellamento di tessuti molli e duri. Per comprendere questi processi, è fondamentale studiare il dente e i tessuti parodontali all'interno del contesto 3D. Il modello murino è un buon candidato per tali studi a causa delle sue dimensioni, dell'alto tasso metabolico e delle vaste informazioni genetiche che abbiamo.Tuttavia, creare movimento ortodontico dei denti nei topi non è facile a causa delle loro piccole dimensioni. Inoltre, i metodi di analisi strutturale di solito coinvolgono il sezionamento, che interrompe la struttura 3D e il contesto del tessuto. Per un tessuto non uniforme, come il PDL, preservare la struttura e il contesto 3D è di importanza critica.Per affrontare questi due ostacoli, forniamo un protocollo per generare il movimento ortodontico mesiale dei denti del primo molare mandibolare nei topi e descriviamo due metodi che consentono la visualizzazione 3D del legamento parodontale senza separare il tessuto. Per posizionare il mouse anestetizzato per l'inserimento del dispositivo ortodontico, agganciare l'incisivo superiore al loop di graffetta. Immobilizzare gli incisivi inferiori utilizzando la catena di alimentazione E aprire ulteriormente la bocca con il retrattile del mouse mini-colibri.Applicare una piccola goccia di soluzione salina su ogni occhio per prevenire la disidratazione corneale. Questi sono gli strumenti utilizzati nell'inserimento del dispositivo. Tagliare un pezzo di filo di alluminio a un centimetro di lunghezza.Utilizzando il supporto dell'ago microchirurgico, far scorrere il filo dal lato buccale lingualmente nell'area interprossimale sotto il punto di contatto tra il primo e il secondo molare. Tirare il filo dal lato linguale verso il lato mesiale del molare. Ruotare le estremità libere del filo da due a tre volte per fissare.Tagliare un pezzo di nichel titanio o niti bobina molla circa sette-nove fili di lunghezza. Inserire la bobina tra il primo molare inferiore e l'incisivo, passare un'estremità libera del filo attraverso due fili della bobina, quindi ruotare entrambe le estremità del filo saldamente per fissare la bobina al molare. Rimuovere la catena di alimentazione utilizzando un paio di pinzette.Avvolgere da due a tre fili della bobina sopra l'incisivo per ancorare la bobina. Lasciare esattamente tre fili attivi tra il primo molare e l'incisivo. Far scorrere le minacce fino al margine gengivale libero incisore.Posizionare uno strato di resina composita scorrevole sul bordo incisale della bobina e curarlo con luce di polimerizzazione dentale. Sostituire la catena di alimentazione dopo aver polimerizzato la resina. Tagliare il filo in eccesso intorno al molare per evitare lesioni.Utilizzando la stessa luce di polimerizzazione, riscaldare la bobina NiTi per 20 secondi. Questo restringerà la bobina, il posizionamento finito dovrebbe essere simile a questo. I tessuti molli sull'emi-madibola sezionata possono essere rimossi con una salvietta priva di pelucchi.Con un campione tra due dita, strofinare l'esterno in movimento circolare fino a quando la maggior parte del tessuto molle viene rimossa. Il resto può essere tagliato usando un paio di forbici. La mattiere pulita è mostrata qui sulla destra.Per montare l'emi-mandibola sezionata nella camera campione dalla micro TAC, modellare una resina dentale comprimibile di grani di riso in un tronco. Quindi posizionarlo nello slot campione del palco. Posizionare l'emi-madibola sul composito.Regolate la posizione fino a quando il primo molare non è centrato sulla scanalatura della linea mediana e la superficie occlusione è orizzontale. Curare il composito se soddisfatto del posizionamento. Questo è un esempio della mattiere in posizione corretta.Prendi una piccola palla di resina dentale impacchettabile. Il suo diametro dovrebbe essere intorno alla larghezza del molare. Posizionare la resina sulla superficie occlusale del primo molare.Pulire senza pelucchi con acqua. Posizionare la salvietta smorzata all'interno delle piscine di umidità nella fase del campione. Chiudere la camera campione e apporre sulla microTC con viti.Ora scatta immagini 2D mentre abbassa l'incudine verticalmente fino a quando la punta dell'incudine non è circondata dal composito. Spegnere in modo sicuro la sorgente di raggi X, aprire la camera micro CT e curare il composito attraverso la finestra in plexiglass trasparente. Ora il campione è montato correttamente e può essere immaginato in base alle esigenze.Per generare un campione emi-madibola otticamente eliminato, preparare le seguenti soluzioni in tubi di centrifuga da 1,5 mil. 4% di paraformaldeide, 50% e 70% di etanolo in acqua deionizzata. Due tubi di etanolo al 100% ed etil cinnamato.Posizionare l'emi-madibola sezionata in paraformaldeide al 4%. Coprire il tubo con un foglio di alluminio e posizionarlo su un rocker su un ambiente delicato per sei ore a temperatura ambiente. Dopo sei ore, trasferire il campione in 50% di etanolo.Riposizionare il campione sul rocker per 16 ore coperto di luce. Ripetere il passaggio precedente con un campione in 70%etanolo per 16 ore seguito dal 100%etanolo due volte per 16 ore ogni volta. Infine spostare il campione in etile cinnamato per un minimo di 12 ore.Il movimento ortodontico affidabile è generato dal dispositivo a bobina NiTi nel primo molare mandibolare murino. Nei topi maschi di nove settimane, lo spazio interprossimale medio è di 40 micron dopo sette giorni. Il micro CT di miglioramento della fase consente la visualizzazione del PDL.Dopo tre giorni di movimento ortodontico mesiale, la densità PDL viene ridotta. L'interfaccia PDL ossea è più ruvida a causa dello sviluppo di crateri nella superficie ossea, che sono indicativi dell'attività osteoclastica e del riassorbimento osseo. La superficie ruvida può essere vista a tutti i livelli delle radici.Ciò dimostra che il movimento è traslazionale rispetto a un movimento di ribaltamento. Al settimo giorno, lo spazio PDL è più stretto rispetto al terzo giorno e il bordo del PDL osseo sulla superficie della radice distale è più liscio, che sono segni di opposizione ossea come previsto quando si verifica il movimento ortodontico dei denti. A causa del lungo tempo di imaging micro CT e della rotazione dello stadio, è essenziale un montaggio sicuro del campione.Campione instabile in cui si trae una scansione sfocata in cui una silhouette può essere vista intorno alla corona e le fibre PDL non sono viste. La compensazione ottica con cinnamato etilico fornisce un altro metodo per visualizzare il PDL senza sessatura. Il substrato può essere visto attraverso il ramus di un campione adeguatamente cancellato mostrato qui a destra.Questo metodo, preserva la fluorescenza endogena e può essere utilizzato senza fissazione chimica. La microscopia a fogli leggeri può essere utilizzata su campioni cancellati. Con un topo transgenico, si possono osservare i rivestimenti fluorescenti dei vasi sanguigni.Se l'osso non è stato correttamente eliminato, i vasi sanguigni nel PDL non sono visibili come mostrato nel pannello F.Questo protocollo ha descritto come superare due sfide principali nella generazione e nell'analisi del movimento ortodontico dei denti nei denti molare mandibolari murini. Una volta padroneggiata la tecnica di movimento ortodontico dei denti, può essere completata in 15 minuti. Questo processo è impegnativo a causa delle piccole dimensioni dei denti del mouse e della presenza della lingua.Tuttavia, forniamo tutte le soluzioni necessarie per superare queste sfide. L'imaging micro CT richiede una capacità di miglioramento della fase. Abbiamo dimostrato la nostra tecnica utilizzando una micro CT da banco. Tuttavia, qualsiasi configurazione in grado di generare un miglioramento della fase farà, ad esempio, un sincrotrone.I risultati della cancellazione dell'ICE dipendono dal processo di disidratazione. Se il campione non è abbastanza trasparente, il nostro suggerimento è quello di aumentare il tempo dei passaggi di disidratazione. Il nostro metodo di compensazione può essere utilizzato anche su campioni non con prefisso.I tessuti chiari possono essere scansionati nella microTC poiché il processo di compensazione non influisce sul contenuto minerale del tessuto. Pertanto il nostro metodo fornisce un approccio correlativo per la fluorescenza e le informazioni strutturali per generare un'analisi 3D completa.

Research

JoVE Journal

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