Name: 3d imaging of pdl collagen fibers during orthodontic tooth movement in mandibular murine model
Uploaded: 2021-04-15T13:30:00
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この研究は、NIH(NIDCR R00- DE025053、PI:Naveh)によってサポートされました。ハーバード大学生物イメージングセンターのインフラとサポートに感謝します。すべての数値は biorender.com で生成されます。

すべての動物実験は、NIHの実験動物のケアと使用に関するガイドラインとハーバード大学の施設動物のケアと使用委員会(議定書no.01840)のガイドラインに従って行われました。
1. 歯列歯運動
<ol><li>マウスベッドを生成するには、くさび状の45°斜めヘッドレストを備えた平らなプラスチックプラットフォームを使用してください。ヘッドレストはプラスチック製の箱を切?...

<ol>
	<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthodontic+tooth+movement:+The+biology+and+clinical+implications.">Orthodontic tooth movement: The biology and clinical implications.</a> The Kaohsiung Journal of Medical Sciences. 34 (4), 207-214 (2018).</li><li>Meikle, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tissue,+cellular,+and+molecular+regulation+of+orthodontic+tooth+movement:+100+years+after+Carl+Sandstedt.">The tissue, cellular, and molecular regulation of orthodontic tooth movement: 100 years after Carl Sandstedt.</a> European Journal of Orthodontics. 28, 221-240 (2006).</li><li>Krishnan, V., Davidovitch, Z., molecular, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular,+molecular,+and+tissue-level+reactions+to+orthodontic+force.">Cellular, molecular, and tissue-level reactions to orthodontic force.</a> American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics. 129 (4), 1-32 (2006).</li><li>Shoji-Matsunaga, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteocyte+regulation+of+orthodontic+force-mediated+tooth+movement+via+RANKL+expression.">Osteocyte regulation of orthodontic force-mediated tooth movement via RANKL expression.</a> Scientific Reports. 7 (1), 8753 (2017).</li><li>Oppenheim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+changes,+particularly+of+the+bone,+incident+to+tooth+movement.">Tissue changes, particularly of the bone, incident to tooth movement.</a> European Journal of Orthodontics. 29, 2-15 (2007).</li><li>Unnam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+Orthodontics-An+overview.">Accelerated Orthodontics-An overview.</a> Journal of Archives of Oral Biologyogy and Craniofacial Research. 3 (1), 4 (2018).</li><li>von Bohl, M., Kuijpers-Jagtman, A. 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S., Weiner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+orthodontic+tooth+movement+of+a+multirooted+tooth:+a+3D+study+of+a+rat+molar.">Initial orthodontic tooth movement of a multirooted tooth: a 3D study of a rat molar.</a> Orthodontics &amp; Craniofacial Research. 18 (3), 134-142 (2015).</li><li>Nakamura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+observation+of+rat+periodontal+ligament+during+function+and+tooth+movement,+using+microcomputed+tomography.">Time-lapse observation of rat periodontal ligament during function and tooth movement, using microcomputed tomography.</a> European Journal of Orthodontics. 30 (3), 320-326 (2008).</li><li>Kawarizadeh, A., Bourauel, C., Jager, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+and+numerical+determination+of+initial+tooth+mobility+and+material+properties+of+the+periodontal+ligament+in+rat+molar+specimens.">Experimental and numerical determination of initial tooth mobility and material properties of the periodontal ligament in rat molar specimens.</a> European Journal of Orthodontics. 25 (6), 569-578 (2003).</li><li>J&#243;nsd&#243;ttir, S. H., Giesen, E. B. W., Maltha, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanical+behavior+of+the+periodontal+ligament+of+the+beagle+dog+during+the+first+5+hours+of+orthodontic+force+application.">Biomechanical behavior of the periodontal ligament of the beagle dog during the first 5 hours of orthodontic force application.</a> European Journal of Orthodontics. 28, 547 (2006).</li><li>Lindhe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+breakdown+of+peri-implant+and+periodontal+tissues.+A+study+in+the+beagle+dog.">Experimental breakdown of peri-implant and periodontal tissues. A study in the beagle dog.</a> Clinical Oral Implants Research. 3 (1), 9-16 (1992).</li><li>Salamati, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+tooth+mobility+in+young+pigs.">Functional tooth mobility in young pigs.</a> Journal of Biomechanics. 104, 109716 (2020).</li><li>Maria, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unusual+disordered+alveolar+bone+material+in+the+upper+furcation+region+of+minipig+mandibles:+A+3D+hierarchical+structural+study.">An unusual disordered alveolar bone material in the upper furcation region of minipig mandibles: A 3D hierarchical structural study.</a> Journal of Structural Biology. 206 (1), 128-137 (2019).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+miniature+pig:+a+useful+large+animal+model+for+dental+and+orofacial+research.">The miniature pig: a useful large animal model for dental and orofacial research.</a> Oral Diseases. 10, 1-7 (2007).</li><li>Melsen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+reaction+to+orthodontic+tooth+movement--a+new+paradigm.">Tissue reaction to orthodontic tooth movement--a new paradigm.</a> European Journal of Orthodontics. 23 (6), 671-681 (2001).</li><li>Naveh, G. R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+MicroCT+imaging+of+non-mineralized+connective+tissues+at+high+resolution.">Direct MicroCT imaging of non-mineralized connective tissues at high resolution.</a> Connective Tissue Research. 55 (1), 52-60 (2014).</li><li>Naveh, G. R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonuniformity+in+ligaments+is+a+structural+strategy+for+optimizing+functionality.">Nonuniformity in ligaments is a structural strategy for optimizing functionality.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), 9008 (2018).</li><li>Naveh, G. R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tooth+periodontal+ligament:+Direct+3D+microCT+visualization+of+the+collagen+network+and+how+the+network+changes+when+the+tooth+is+loaded.">Tooth periodontal ligament: Direct 3D microCT visualization of the collagen network and how the network changes when the tooth is loaded.</a> Journal of Structural Biology. 181 (2), 108-115 (2013).</li><li>Naveh, G. R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tooth+movements+are+guided+by+specific+contact+areas+between+the+tooth+root+and+the+jaw+bone+:+A+dynamic+3D+microCT+study+of+the+rat+molar.">Tooth movements are guided by specific contact areas between the tooth root and the jaw bone : A dynamic 3D microCT study of the rat molar.</a> Journal of Structural Biology. 17 (2), 477-483 (2012).</li><li>Naveh, G. R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tooth-PDL-bone+complex:+Response+to+compressive+loads+encountered+during+mastication+-A+review.">Tooth-PDL-bone complex: Response to compressive loads encountered during mastication -A review.</a> Archives of Oral Biology. 57 (12), 1575-1584 (2012).</li><li>Ben-Zvi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+the+tooth-periodontal+ligament-bone+complex+to+load:+A+microCT+study+of+the+minipig+molar.">Response of the tooth-periodontal ligament-bone complex to load: A microCT study of the minipig molar.</a> Journal of Structural Biology. 205 (2), 155-162 (2019).</li><li>Klingberg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+Automated+Evaluation+of+Total+Glomerular+Number+and+Capillary+Tuft+Size+in+Nephritic+Kidneys+Using+Lightsheet+Microscopy.">Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452 (2017).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+Tissue+Clearing.">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li><li>Taddei, S. R. d. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+model+of+tooth+movement+in+mice:+A+standardized+protocol+for+studying+bone+remodeling+under+compression+and+tensile+strains.">Experimental model of tooth movement in mice: A standardized protocol for studying bone remodeling under compression and tensile strains.</a> Journal of Biomechanics. 45 (16), 2729-2735 (2012).</li><li>Nakamura, K., Sahara, N., Deguchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+changes+in+the+distribution+and+number+of+macrophage-lineage+cells+in+the+periodontal+membrane+of+the+rat+molar+in+response+to+experimental+tooth+movement.">Temporal changes in the distribution and number of macrophage-lineage cells in the periodontal membrane of the rat molar in response to experimental tooth movement.</a> Archives of Oral Biology. 46 (7), 593-607 (2001).</li><li>Rygh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+vascular+system:+A+main+mediator+of+periodontal+fiber+remodeling+in+orthodontic+tooth+movement.">Activation of the vascular system: A main mediator of periodontal fiber remodeling in orthodontic tooth movement.</a> American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics. 89 (6), 453-468 (1986).</li><li>Nagao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor+in+cartilage+development+and+osteoarthritis.">Vascular endothelial growth factor in cartilage development and osteoarthritis.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13027 (2017).</li><li>Licht, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelium-specific+Cre+recombinase+activity+in+flk-1-Cre+transgenic+mice.">Endothelium-specific Cre recombinase activity in flk-1-Cre transgenic mice.</a> Developmental Dynamics. 229 (2), 312-318 (2004).</li><li>Connizzo, B. K., Naveh, G. R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+AFM-based+nanoscale+rheology+reveals+regional+non-uniformity+in+viscoporoelastic+mechanical+behavior+of+the+murine+periodontal+ligament.">In situ AFM-based nanoscale rheology reveals regional non-uniformity in viscoporoelastic mechanical behavior of the murine periodontal ligament.</a> Journal of Biomechanics. 111, 109996 (2020).</li><li>Connizzo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonuniformity+in+Periodontal+Ligament:+Mechanics+and+Matrix+Composition.">Nonuniformity in Periodontal Ligament: Mechanics and Matrix Composition.</a> Journal of Dental Research. 2, 179-186 (2020).</li></ol>

マウスでOTMを生成することは、サイズ、遺伝学および取り扱いの利点のために非常に望ましい。下顎薬を使用すると、組織解剖の点で簡単に処理できるだけでなく、サンプル調製物およびイメージングを提供します。ここでは、OTMの7日以内に骨の中の歯の移動運動を伴うOTMを生成する方法を提示した。このプロトコルを使用すると、活性化コイルが約1mmまでの動きのための一定の力レベルを...

歯歯運動(OTM)の基本的な基礎となる生物学的プロセスは骨のリモデリングである。このリモデリングプロセスのトリガは、細胞外マトリックス(ECM)ストレス、壊死、血管破壊および形成1、2、3などの歯周靭帯(PDL)の構造の変化に起因する。歯槽骨リモデリングの他の可能なトリガーは、骨の骨細胞による力の感知に関連しています, だけでなく、歯槽骨自体の機械的変形;しかし、OTMにおける彼らの役割はまだ完全に解明されていません4,5.
OTM中のPDLの構造機能関係を明らかにすることを目的とした多くの研究にもかかわらず、明確な機能機構はまだ6,7に定義されていない。この主な理由は、2つの硬い組織(セメントと歯槽骨)の間にある軟部組織(PDL)のデータを取得する際の課題です。通常、構造情報を収集するメソッドは、PDL 構造を中断および変更する固定と断面化を必要とします。さらに、これらのメソッドのほとんどは、歪んでいなくても部分的な情報とローカライズされた情報のみを提供する2Dデータを生成します。PDLは構造と機能において均一ではないため、歯-PDL-骨複合体全体の無傷の3D構造に対処するアプローチが保証されています。
本論文では、マウスでOTMを生成する方法と、サンプルを切り離さずにPDL内のコラーゲン線維を3D可視化する2つの方法について説明する。
マウスモデルは、医学、発生生物学、薬物送達および構造研究におけるインビボ実験に広く使用されています。彼らは、特定のタンパク質と機能を排除または強化するために遺伝子組み換えすることができます。高速で再現可能で予測可能な開発制御を提供します。彼らはまた、その小さなサイズ8に画像を容易に.多くの利点にもかかわらず、歯科研究におけるマウスモデルは、特に臨床操作が保証されている場合、主に小さな歯のために頻繁に使用されません。ラット9、10、11、イヌ12、13、豚14、15、16およびサル17などの動物モデルは、マウスよりも頻繁に使用される。近年の高解像度イメージング技術の開発により、マウスモデルを利用してOTMの複雑なプロセスを解読する利点は数多くあります。本論文では、骨のリモデリングを引き起こす一定の力レベルを有する下顎骨の臼歯のメシャル運動を生成する方法を提示する。げっ歯類のOTM実験のほとんどは、下顎骨の移動性と舌の存在が別の複雑性レベルを追加するので、上顎で行われます。しかし、3D構造の完全性が望まれる場合には、下顎が多くの利点を有する。骨全体として簡単に解剖することができます。いくつかの種では、線維性の交付を介して2つの半下顎骨に分離することができます。それは密集し、平らであり、すべての内大なスペースのない歯だけを含んでいる。対照的に、上顎は頭蓋骨の一部であり、他の器官および構造と密接に関連しており、したがって、関連する歯茎骨を関連する歯槽骨を解剖するために広範な断面化が必要である。
位相増強を可能にする高分解能マイクロCT内のローディングシステムに結合した室内湿度室を用いて、先に述べたとおりに新鮮な繊維組織を3Dで可視化する方法を開発しました。新鮮な組織は、動物が染色や固定なしで犠牲にされた直後にスキャンされ、組織のアーティファクトや生体機械特性の変化を減らします。これらの3Dデータは、他の場所で説明されているように繊維の分布と方向分析に利用することができる。
ここで紹介する第2の3D組織全体のイメージング方法は、切断することなく骨を通してPDL繊維のイメージングを可能にする下顎骨の光学的なクリアリングに基づいています。興味深いことに、骨自体のコラーゲン線維の視覚化も可能にしますが、ここでは議論されません。一般に、組織をクリアする方法は2つあります。1つ目は、単純な浸漬、過水性またはヒドロゲル埋め込みのいずれかを介して、1.4を超える屈折率を有する水溶液にサンプルが浸漬される水性の洗浄である水性ベースのクリアリングです。しかし、この方法は、組織の構造保存と同様に透明性のレベルに制限され、したがって、組織の固定を必要とします。高透明サンプルを生成し、固定を必要としない第2の方法は、溶媒ベースの清算方法24,25である。下顎試料に対するエチル-3フェニルプロップ-2-エノエート(エチルシンナメート、ECi)に基づく修飾溶媒ベースのクリアリング法を生成した。この方法は、非毒性食品グレードのクリアリング剤、最小限の組織収縮、および蛍光タンパク質の保存を使用する利点を有する。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-mL BD Luer-Lok syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X phosphate buffered saline</td>
			<td>VWR Life Sciences</td>
			<td>0780-10L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 proof ethanol</td>
			<td>VWR Life Sciences</td>
			<td>V1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum alloy 5019 wire</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>GF15828813</td>
			<td>0.08 mm diameter wire, length 100th, temper hard. Used as wire ligature around molar.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avizo 9.7</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used to analyze microCT scans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Castroviejo Micro Needle Holders</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12060-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clr Plan-Apochromat 20x/1.0,CorrVIS-IR M27 85mm</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used for second harmonic generation imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cone socket handle, single ended, hand-form</td>
			<td>G.Hartzell and son</td>
			<td>126-CSH3</td>
			<td>Handle of the inspection mirror</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EC Plan-Neofluar 5x/0.16</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>440321-9902</td>
			<td>Used for light-sheet imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elipar DeepCure-S LED curing light</td>
			<td>3M ESPE</td>
			<td>76985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf safe-lock tubes, 1.5mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl cinnamate, &#62;= 98%</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>W243000-1KG-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic Needle, 27G x 1/2&#39;&#39;</td>
			<td>BD</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketathesia 100mg/ml</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>NDC:11695-0702-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIMWIPES delicate task wipers</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>21905-026 (VWR Catalog number)</td>
			<td>Purchased from VWR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightSheet Z.1 dual illumination microscope system</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LightSheet Z.1/LightSheet 7</td>
			<td>Used for lightsheet imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 880 NLO multi-photon microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 880 NLO</td>
			<td>Used for two-photon imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAmicro, plane, 5mm dia, SS-Thread</td>
			<td>Hahnenkratt</td>
			<td>6220</td>
			<td>Front surface inspectrio mirror</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroCT machine, MicroXCT-200</td>
			<td>Xradia</td>
			<td>MICRO XCT-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Colibri</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>17000-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PermaFlo Flowable Composite</td>
			<td>Ultradent</td>
			<td>948</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Procedure platform</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom-made from lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Routine stereo micscope M80</td>
			<td>Leica Micosystems</td>
			<td>M80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sentalloy NiTi open coil spring</td>
			<td>TOMY Inc.</td>
			<td></td>
			<td>A 0.15mm diameter closed NiTi coil with an inner coil diameter of 0.9mm delivers a force of 10g. Similar products can be purchased from Dentsply Sirona.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-304 stainless steel ligature wire, 0.009&#39;&#39; diameter</td>
			<td>Orthodontics</td>
			<td>SBLW109</td>
			<td>0.009&#39;&#39;(.23mm) diameter, Soft temper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Ject E (Xylazine) 100mg/ml</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>NDC:11695-7085-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z100 Restorative, A2 shade</td>
			<td>3M ESPE</td>
			<td>5904A2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3d imaging of pdl collagen fibers during orthodontic tooth movement in mandibular murine model

歯歯の運動は、外部力の結果として変化した軟部および硬い組織の複雑な生物学的プロセスである。これらの複雑なリモデリングプロセスを理解するためには、歯と歯周組織を3Dコンテキスト内で研究し、断面や組織のアーティファクトを最小限に抑えることが重要です。マウスモデルは、小さなサイズ、高い代謝率、遺伝学、取り扱いの容易さから、発生生物学や構造生物学、バイオメカニクスにも利用されることが多い。原則として、歯科関連研究のための優れたモデルにもなります。しかし、大きな障害は、その小さな歯の大きさ、特に臼歯です。本論文は、マウス下顎臼歯の歯周靭帯線維成分の歯周歯周運動を生成するためのステップ・プロトコルと、3Dイメージングのための2つの方法を提供することを目的としている。最初に提示される方法は、新鮮なコラーゲン組織の位相増強イメージングを可能にするマイクロCTセットアップに基づいています。第2の方法は、切片をかけずに骨を通してイメージングを可能にし、内因性蛍光を保存するエチルシンナメートを用いた骨のクリアリング法である。 Flk1-Creのようなレポーターマウスとこのクリアリング方法を組み合わせる 。TdTomatoは、PDLと歯槽骨の3D血管構造を画像化するその種の機会の最初の機会を提供しました。

本論文では、OTMを作製する方法と、断面を全くつけずにPDL内部のコラーゲン繊維を3Dイメージングする方法を2つ紹介する。動物研究のために、歯の整列が必要でない場合、歯の動きは、すべての根のレベルで歯槽骨の改造を生成する場合、矯正と見なされます。信頼性の高いOTMを生成するためには、歯に適用される一定の力レベルが必要です。ここで、活性化された形状記憶NiTiコイルは、7?...

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3D Imaging of PDL Collagen Fibers during Orthodontic Tooth Movement in Mandibular Murine Model

マウスにおける歯の動きを発生させるプロトコルと、歯周靭帯のコラーゲン線維や血管の3D可視化法を、切り離さずに提示する。

下顎マウスモデルにおける歯歯運動中のPDLコラーゲン線維の3Dイメージング

Orthodontic tooth movement is a complex biological process of altered soft and hard tissue remodeling as a result of external forces. In order to ...

歯矯正歯の動きは、軟部組織と硬組織の両方の外部力と改造を伴う複雑な生物学的プロセスです。これらのプロセスを理解するためには、歯と歯周組織を3Dコンテキスト内で研究することが重要です。マウスモデルは、その大きさ、高い代謝率と私たちが持っている広大な遺伝情報のために、このような研究のための良い候補です。しかし、マウスの歯歯の動きを作ることは、その小さなサイズのために容易ではありません。さらに、構造解析法は通常、組織の3D構造およびコンテキストを破壊する断面化を伴う。PDLのような不均一な組織では、3D構造とコンテキストを維持することが非常に重要です。これら2つの障害に対処するために、マウスの第1下顎臼歯のメシアル歯の運動を生成するプロトコルを提供し、組織を切り離さずに歯周靭帯を3D可視化できる2つの方法を説明する。矯正装置挿入用に麻酔マウスを配置するには、上部切り込み部をクリップループにフックします。パワーチェーンを使用して下切歯を固定し、さらにミニコリブリマウスレトラクタで口を開きます。角膜脱水を防ぐために、各目に生理液を少し落とします。これらは、デバイスの挿入に使用されるツールです。アルミ線を1センチの長さに切ります。マイクロサージカルニーホルダーを使用して、第1モルと第2のモル間の接触点の下の近位領域で頬側からワイヤーをリング状にスライドさせます。リングアル側から大臼歯のメス側に向かってワイヤーを引っ張ります。ワイヤーのフリーエンドを2~3回ねじって固定します。ニッケルチタンまたはNiTiコイルスプリングを7~9本の糸で切ります。下部の最初の大臼歯と切歯の間にコイルを挿入し、コイルの2つのスレッドを通してワイヤーの1つの自由な端を渡し、次にコイルをモルに固定するためにワイヤーの両端をしっかりとねじります。ピンセットを使用して電源チェーンを取り外します。切り傷器の上にコイルの2〜3本の糸をループさせて、コイルを固定します。最初の大臼歯と切歯の間にちょうど3つのアクティブな糸を残します。脅威を切り込み自由な歯肉マージンまで滑り落とします。流動性複合樹脂の層をコイルの切口境界に置き、歯科硬化光で硬化させます。樹脂を硬化した後、電源チェーンを交換してください。怪我を避けるために、大臼歯の周りに余分なワイヤーをトリミングします。同じ硬化光を使用して、NiTiコイルを20秒間加熱します。これはコイルを引き締め、完成した配置はこのように見えるはずです。解剖されたヘミ下顎の軟部組織は、糸くずのない拭き取りで除去することができる。2本の指の間にサンプルを使用して、軟部組織のほとんどが取り除かれるまで、円形の動きで外側をこすります。残りはさみを使用して切断することができます。右側に清掃済み下顎が表示されます。マイクロCTスキャンからサンプルチャンバに解剖されたヘミ下顎を取り付けるために、米粒サイズのパック可能な歯科用樹脂を丸太に形作る。次に、ステージのサンプルスロットに配置します。ヘミ下顎を複合材料の上に置きます。最初のモルが正中の溝を中心にして、咬合面が水平になるまで、位置を調整します。位置決めに満足したら、複合材料を硬化させます。これは、適切な位置にある下顎の例です。パック可能な歯科用樹脂の小さなボールを取ります。その直径は、大臼歯の幅の周りでなければなりません。樹脂を第1の臼歯の咬合面に置きます。湿らせたりフリーの水で拭く。湿らせたワイプをサンプルステージの湿度プール内に置きます。サンプルチャンバを閉じ、ネジでマイクロCTに貼り付ける。アンビルの先端がコンポジットに囲まれるまで、アンビルを垂直に下げながら2D画像を撮影します。X線源を安全にオフにし、マイクロCTチャンバーを開き、透明なプレキシガラスウィンドウからコンポジットを治します。これでサンプルが適切にマウントされ、必要に応じてイメージ化できるようになりました。光学的にクリアされた半下顎のサンプルを生成するために、1.5ミル遠心分離管に次の溶液を準備する。4%パラホルムアルデヒド、50%および70%エタノールを脱イオン水で。100%エタノールとエチルシンナメートの2つのチューブ。4%パラホルムアルデヒドに解剖されたヘミ下顎を入れる。チューブをアルミホイルで覆い、室温で6時間穏やかな設定でロッカーに置きます。6時間後、試料を50%エタノールに移す。サンプルをロッカーに戻し、光から16時間覆います。前のステップを16時間、70%エタノールでサンプルで繰り返し、その後100%エタノールを16時間2回繰り返します。最後に、サンプルを少なくとも12時間、シンナメートエチルに移動します。信頼性の高い矯正運動は、マウスの下顎第一の臼歯でNiTiコイル装置によって生成されます。生後9週間の雄マウスでは、平均近位間空間は7日後に40ミクロンである。位相増強マイクロCTにより、PDLの可視化が可能です。3日間のメシアル矯正運動の後、PDL密度が低下する。骨PDL界面は、破骨形成活性と骨吸収を示す骨表面のクレーターの発達により粗い。粗い表面は根のすべてのレベルで見ることができます。これは、移動が転倒運動とは対照的に翻訳的であることを示しています。7日目のPDL空間は3日目よりも狭く、遠位根表面の骨PDL境界は、歯歯運動が起こると予想通り骨の反対の兆候である滑らかである。マイクロCTイメージング時間が長く、ステージの回転が長いため、サンプルの安全な取り付けが不可欠です。不安定なサンプルで、クラウンの周囲にシルエットが見え、PDL繊維が見えないぼやけたスキャンが行われます。エチルシンナメートを用いた光クリアは、断面化せずにPDLを表示する別の方法を提供する。基板は、右にここに示す十分にクリアされたサンプルのラムスを通して見ることができます。この方法は、内因性蛍光を保存し、化学固定なしで使用することができる。ライトシート顕微鏡は、クリアされたサンプルに使用することができます。トランスジェニックマウスを使用すると、蛍光血管内層が観察されます。骨が適切にクリアされなかった場合、PDLの血管はパネルFに示すように見えません。歯の運動技術を習得したら、15分で完了できます。このプロセスは、マウスの歯の小さな寸法と舌の存在のために挑戦的です。しかし、これらの課題を克服するために必要な解決策をすべて提供しています。マイクロCTイメージングには位相増強機能が必要です。ベンチトップマイクロCTを用いた技術を実演しました。ただし、位相拡張を生成できる設定は、たとえばシンクロトロンなどで行われます。ECiクリアの結果は脱水プロセスによって異なります。サンプルが十分に透明でない場合、我々の提案は、脱水ステップの時間を増やします。当社のクリアリング方法は、固定されていないサンプルにも使用できます。クリアプロセスは組織のミネラル含有量に影響を与えないので、透明な組織をマイクロCTでスキャンすることができます。そこで我々の方法は、完全な3D解析を生成するための蛍光および構造情報のための相関的アプローチを提供する。

Research

JoVE Journal

Medicine

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