Name: 3d imaging of pdl collagen fibers during orthodontic tooth movement in mandibular murine model
Uploaded: 2021-04-15T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about 3D Imaging of PDL Collagen Fibers during Orthodontic Tooth Movement in Mandibular Murine Model at JoVE.com

Este estudo foi apoiado pelo NIH (NIDCR R00- DE025053, PI:Naveh). Gostaríamos de agradecer ao Centro de Imagens Biológicas de Harvard por infraestrutura e apoio. Todos os números são gerados com biorender.com.

Todos os experimentos em animais foram realizados em conformidade com as Diretrizes do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Harvard (Protocolo nº 01840).
1. Movimento ortodôntico de dente
<ol><li>Para gerar uma cama de rato, use uma plataforma de plástico plana com uma cunha em forma de encravado, encostou em 45° de enceinte. O encores de cabeça pode ser gerado cortando uma caixa de plá...

<ol>
	<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthodontic+tooth+movement:+The+biology+and+clinical+implications.">Orthodontic tooth movement: The biology and clinical implications.</a> The Kaohsiung Journal of Medical Sciences. 34 (4), 207-214 (2018).</li><li>Meikle, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tissue,+cellular,+and+molecular+regulation+of+orthodontic+tooth+movement:+100+years+after+Carl+Sandstedt.">The tissue, cellular, and molecular regulation of orthodontic tooth movement: 100 years after Carl Sandstedt.</a> European Journal of Orthodontics. 28, 221-240 (2006).</li><li>Krishnan, V., Davidovitch, Z., molecular, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular,+molecular,+and+tissue-level+reactions+to+orthodontic+force.">Cellular, molecular, and tissue-level reactions to orthodontic force.</a> American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics. 129 (4), 1-32 (2006).</li><li>Shoji-Matsunaga, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteocyte+regulation+of+orthodontic+force-mediated+tooth+movement+via+RANKL+expression.">Osteocyte regulation of orthodontic force-mediated tooth movement via RANKL expression.</a> Scientific Reports. 7 (1), 8753 (2017).</li><li>Oppenheim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+changes,+particularly+of+the+bone,+incident+to+tooth+movement.">Tissue changes, particularly of the bone, incident to tooth movement.</a> European Journal of Orthodontics. 29, 2-15 (2007).</li><li>Unnam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+Orthodontics-An+overview.">Accelerated Orthodontics-An overview.</a> Journal of Archives of Oral Biologyogy and Craniofacial Research. 3 (1), 4 (2018).</li><li>von Bohl, M., Kuijpers-Jagtman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyalinization+during+orthodontic+tooth+movement+:+a+systematic+review+on+tissue+reactions.">Hyalinization during orthodontic tooth movement : a systematic review on tissue reactions.</a> European Journal of Orthodontics. 31 (1), 30-36 (2009).</li><li>Kirschneck, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+assessment+of+mouse+models+for+experimental+orthodontic+tooth+movement.">Comparative assessment of mouse models for experimental orthodontic tooth movement.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1-12 (2020).</li><li>Naveh, G. R. S., Weiner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+orthodontic+tooth+movement+of+a+multirooted+tooth:+a+3D+study+of+a+rat+molar.">Initial orthodontic tooth movement of a multirooted tooth: a 3D study of a rat molar.</a> Orthodontics &amp; Craniofacial Research. 18 (3), 134-142 (2015).</li><li>Nakamura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+observation+of+rat+periodontal+ligament+during+function+and+tooth+movement,+using+microcomputed+tomography.">Time-lapse observation of rat periodontal ligament during function and tooth movement, using microcomputed tomography.</a> European Journal of Orthodontics. 30 (3), 320-326 (2008).</li><li>Kawarizadeh, A., Bourauel, C., Jager, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+and+numerical+determination+of+initial+tooth+mobility+and+material+properties+of+the+periodontal+ligament+in+rat+molar+specimens.">Experimental and numerical determination of initial tooth mobility and material properties of the periodontal ligament in rat molar specimens.</a> European Journal of Orthodontics. 25 (6), 569-578 (2003).</li><li>J&#243;nsd&#243;ttir, S. H., Giesen, E. B. W., Maltha, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanical+behavior+of+the+periodontal+ligament+of+the+beagle+dog+during+the+first+5+hours+of+orthodontic+force+application.">Biomechanical behavior of the periodontal ligament of the beagle dog during the first 5 hours of orthodontic force application.</a> European Journal of Orthodontics. 28, 547 (2006).</li><li>Lindhe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+breakdown+of+peri-implant+and+periodontal+tissues.+A+study+in+the+beagle+dog.">Experimental breakdown of peri-implant and periodontal tissues. A study in the beagle dog.</a> Clinical Oral Implants Research. 3 (1), 9-16 (1992).</li><li>Salamati, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+tooth+mobility+in+young+pigs.">Functional tooth mobility in young pigs.</a> Journal of Biomechanics. 104, 109716 (2020).</li><li>Maria, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unusual+disordered+alveolar+bone+material+in+the+upper+furcation+region+of+minipig+mandibles:+A+3D+hierarchical+structural+study.">An unusual disordered alveolar bone material in the upper furcation region of minipig mandibles: A 3D hierarchical structural study.</a> Journal of Structural Biology. 206 (1), 128-137 (2019).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+miniature+pig:+a+useful+large+animal+model+for+dental+and+orofacial+research.">The miniature pig: a useful large animal model for dental and orofacial research.</a> Oral Diseases. 10, 1-7 (2007).</li><li>Melsen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+reaction+to+orthodontic+tooth+movement--a+new+paradigm.">Tissue reaction to orthodontic tooth movement--a new paradigm.</a> European Journal of Orthodontics. 23 (6), 671-681 (2001).</li><li>Naveh, G. R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+MicroCT+imaging+of+non-mineralized+connective+tissues+at+high+resolution.">Direct MicroCT imaging of non-mineralized connective tissues at high resolution.</a> Connective Tissue Research. 55 (1), 52-60 (2014).</li><li>Naveh, G. R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonuniformity+in+ligaments+is+a+structural+strategy+for+optimizing+functionality.">Nonuniformity in ligaments is a structural strategy for optimizing functionality.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), 9008 (2018).</li><li>Naveh, G. R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tooth+periodontal+ligament:+Direct+3D+microCT+visualization+of+the+collagen+network+and+how+the+network+changes+when+the+tooth+is+loaded.">Tooth periodontal ligament: Direct 3D microCT visualization of the collagen network and how the network changes when the tooth is loaded.</a> Journal of Structural Biology. 181 (2), 108-115 (2013).</li><li>Naveh, G. R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tooth+movements+are+guided+by+specific+contact+areas+between+the+tooth+root+and+the+jaw+bone+:+A+dynamic+3D+microCT+study+of+the+rat+molar.">Tooth movements are guided by specific contact areas between the tooth root and the jaw bone : A dynamic 3D microCT study of the rat molar.</a> Journal of Structural Biology. 17 (2), 477-483 (2012).</li><li>Naveh, G. R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tooth-PDL-bone+complex:+Response+to+compressive+loads+encountered+during+mastication+-A+review.">Tooth-PDL-bone complex: Response to compressive loads encountered during mastication -A review.</a> Archives of Oral Biology. 57 (12), 1575-1584 (2012).</li><li>Ben-Zvi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+the+tooth-periodontal+ligament-bone+complex+to+load:+A+microCT+study+of+the+minipig+molar.">Response of the tooth-periodontal ligament-bone complex to load: A microCT study of the minipig molar.</a> Journal of Structural Biology. 205 (2), 155-162 (2019).</li><li>Klingberg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+Automated+Evaluation+of+Total+Glomerular+Number+and+Capillary+Tuft+Size+in+Nephritic+Kidneys+Using+Lightsheet+Microscopy.">Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452 (2017).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+Tissue+Clearing.">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li><li>Taddei, S. R. d. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+model+of+tooth+movement+in+mice:+A+standardized+protocol+for+studying+bone+remodeling+under+compression+and+tensile+strains.">Experimental model of tooth movement in mice: A standardized protocol for studying bone remodeling under compression and tensile strains.</a> Journal of Biomechanics. 45 (16), 2729-2735 (2012).</li><li>Nakamura, K., Sahara, N., Deguchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+changes+in+the+distribution+and+number+of+macrophage-lineage+cells+in+the+periodontal+membrane+of+the+rat+molar+in+response+to+experimental+tooth+movement.">Temporal changes in the distribution and number of macrophage-lineage cells in the periodontal membrane of the rat molar in response to experimental tooth movement.</a> Archives of Oral Biology. 46 (7), 593-607 (2001).</li><li>Rygh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+vascular+system:+A+main+mediator+of+periodontal+fiber+remodeling+in+orthodontic+tooth+movement.">Activation of the vascular system: A main mediator of periodontal fiber remodeling in orthodontic tooth movement.</a> American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics. 89 (6), 453-468 (1986).</li><li>Nagao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor+in+cartilage+development+and+osteoarthritis.">Vascular endothelial growth factor in cartilage development and osteoarthritis.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13027 (2017).</li><li>Licht, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelium-specific+Cre+recombinase+activity+in+flk-1-Cre+transgenic+mice.">Endothelium-specific Cre recombinase activity in flk-1-Cre transgenic mice.</a> Developmental Dynamics. 229 (2), 312-318 (2004).</li><li>Connizzo, B. K., Naveh, G. R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+AFM-based+nanoscale+rheology+reveals+regional+non-uniformity+in+viscoporoelastic+mechanical+behavior+of+the+murine+periodontal+ligament.">In situ AFM-based nanoscale rheology reveals regional non-uniformity in viscoporoelastic mechanical behavior of the murine periodontal ligament.</a> Journal of Biomechanics. 111, 109996 (2020).</li><li>Connizzo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonuniformity+in+Periodontal+Ligament:+Mechanics+and+Matrix+Composition.">Nonuniformity in Periodontal Ligament: Mechanics and Matrix Composition.</a> Journal of Dental Research. 2, 179-186 (2020).</li></ol>

Gerar OTM em camundongos é altamente desejado devido ao tamanho, genética e vantagens de manuseio. O uso da mandíbula proporciona um manuseio fácil tanto em termos de dissecção tecidual quanto de preparação de amostras e imagens. Aqui apresentamos um método para gerar OTM com movimento translacional do dente dentro do osso dentro de 7 dias de OTM. Utilizando este protocolo, a duração geral do movimento dos dentes pode ser estendida, uma vez que a bobina ativada fornece um nível de força constante para o movi...

O processo biológico básico subjacente no movimento dentário ortodôntico (OTM) é a remodelagem óssea. O gatilho para este processo de remodelação é atribuído a alterações na estrutura do ligamento periodontal (PDL) como estresse da matriz extracelular (ECM), necrose, bem como destruição e formação de vasos sanguíneos1,2,3. Outros possíveis gatilhos para a remodelação óssea alveolar estão relacionados à detecção de força por osteocitos no osso, bem como a deformação mecânica do próprio osso alveolar; no entanto, seu papel na OTM ainda não é totalmente elucidado4,5.
Apesar de muitos estudos que visam revelar relações estrutura-função do PDL durante o OTM, um mecanismo funcional claro ainda está para ser definido6,7. A principal razão para isso é o desafio na recuperação de dados de um tecido mole (PDL) localizado entre dois tecidos duros (cementum e osso alveolar). Os métodos aceitos para coletar informações estruturais geralmente exigem fixação e seção que interrompem e modificam a estrutura PDL. Além disso, a maioria desses métodos produz dados 2D que, mesmo que não distorcidos, dão apenas informações parciais e localizadas. Uma vez que o PDL não é uniforme em sua estrutura e função, uma abordagem que aborda a estrutura 3D intacta de todo o complexo de osso dentário-PDL é justificada.
Este artigo descreverá um método para gerar um OTM em camundongos e dois métodos que permitem a visualização 3D das fibras de colágeno no PDL sem qualquer seção da amostra.
Os modelos murinos são amplamente utilizados para experimentos in vivo em medicina, biologia do desenvolvimento, entrega de medicamentos e estudos estruturais. Eles podem ser geneticamente modificados para eliminar ou melhorar proteínas e funções específicas; eles fornecem controle de desenvolvimento rápido, repetível e previsível; eles também são fáceis de imagem devido ao seu pequeno tamanho8. Apesar de suas muitas vantagens, os modelos de camundongos em pesquisas odontológicas não são utilizados com frequência, especialmente quando as manipulações clínicas são justificadas, principalmente devido aos dentes de pequeno porte. Modelos animais como ratos9,10,11, cães12,13, porcos14,15,16 e macacos17 são usados com mais frequência do que ratos. Com o recente desenvolvimento de técnicas de imagem de alta resolução, as vantagens de utilizar um modelo de mouse para decifrar os processos complicados em OTM são inúmeras. Este artigo apresenta um método para gerar um movimento mesial do dente molar na mandíbula com níveis constantes de força que desencadeiam a remodelação óssea. A maioria dos experimentos de OTM em roedores são feitos na maxila, uma vez que a mobilidade da mandíbula e a presença da língua adicionam outro nível de complexidade. No entanto, a mandíbula tem muitas vantagens quando a integridade estrutural 3D é desejada. Pode ser facilmente dissecado como um osso inteiro; em algumas espécies pode ser separado em duas mandíbulas hemi através da sífilis fibrosa; é compacto, plano e contém apenas os dentes sem espaços sinusos. Em contraste, a maxila é uma parte do crânio e intimamente relacionada a outros órgãos e estruturas, assim é necessária uma seção extensiva para dissecar o osso alveolar com os dentes associados.
Utilizando uma câmara de umidade interna acoplada a um sistema de carregamento dentro de uma micro-TC de alta resolução que permite o aprimoramento de fase, desenvolvemos um método para visualizar tecidos fibrosos frescos em 3D como descrito anteriormente9,18,19,20,21,22,23. Tecidos frescos são escaneados imediatamente após o animal ser sacrificado sem qualquer coloração ou fixação, o que reduz artefatos teciduais, bem como alterações de propriedades biomecânicas. Esses dados 3D podem ser utilizados para análises de distribuição e direção das fibras descritas em outros lugares19.
O segundo método de imagem tecidual 3D apresentado aqui é baseado na limpeza óptica da mandíbula que permite a imagem das fibras PDL através do osso sem qualquer secção. Curiosamente, também permite a visualização das fibras de colágeno do próprio osso, porém isso não será discutido aqui. Em geral, existem dois métodos para limpeza tecidual. A primeira é a limpeza baseada em aquoso, onde a amostra está imersa em uma solução aquosa com um índice refrativo superior a 1,4, seja através de uma simples imersão, hiperhidratação ou incorporação de hidrogel. No entanto, esse método é limitado ao nível de transparência, bem como à preservação estrutural do tecido e, portanto, requer fixação do tecido. O segundo método que produz amostras altamente transparentes e não requer fixação é o método de compensação baseado em solventes24,25. Geramos um método de compensação modificado à base de solventes baseado em etil-3-fenilprop-2-enoato (etil cinnamate, ECi) para as amostras mandibulares. Este método tem as vantagens de usar um agente de compensação de grau alimentar não tóxico, encolhimento mínimo de tecidos e preservação de proteínas fluorescentes.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-mL BD Luer-Lok syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X phosphate buffered saline</td>
			<td>VWR Life Sciences</td>
			<td>0780-10L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 proof ethanol</td>
			<td>VWR Life Sciences</td>
			<td>V1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum alloy 5019 wire</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>GF15828813</td>
			<td>0.08 mm diameter wire, length 100th, temper hard. Used as wire ligature around molar.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avizo 9.7</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used to analyze microCT scans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Castroviejo Micro Needle Holders</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12060-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clr Plan-Apochromat 20x/1.0,CorrVIS-IR M27 85mm</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used for second harmonic generation imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cone socket handle, single ended, hand-form</td>
			<td>G.Hartzell and son</td>
			<td>126-CSH3</td>
			<td>Handle of the inspection mirror</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EC Plan-Neofluar 5x/0.16</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>440321-9902</td>
			<td>Used for light-sheet imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elipar DeepCure-S LED curing light</td>
			<td>3M ESPE</td>
			<td>76985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf safe-lock tubes, 1.5mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl cinnamate, &#62;= 98%</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>W243000-1KG-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic Needle, 27G x 1/2&#39;&#39;</td>
			<td>BD</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketathesia 100mg/ml</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>NDC:11695-0702-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIMWIPES delicate task wipers</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>21905-026 (VWR Catalog number)</td>
			<td>Purchased from VWR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightSheet Z.1 dual illumination microscope system</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LightSheet Z.1/LightSheet 7</td>
			<td>Used for lightsheet imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 880 NLO multi-photon microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 880 NLO</td>
			<td>Used for two-photon imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAmicro, plane, 5mm dia, SS-Thread</td>
			<td>Hahnenkratt</td>
			<td>6220</td>
			<td>Front surface inspectrio mirror</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroCT machine, MicroXCT-200</td>
			<td>Xradia</td>
			<td>MICRO XCT-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Colibri</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>17000-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PermaFlo Flowable Composite</td>
			<td>Ultradent</td>
			<td>948</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Procedure platform</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom-made from lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Routine stereo micscope M80</td>
			<td>Leica Micosystems</td>
			<td>M80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sentalloy NiTi open coil spring</td>
			<td>TOMY Inc.</td>
			<td></td>
			<td>A 0.15mm diameter closed NiTi coil with an inner coil diameter of 0.9mm delivers a force of 10g. Similar products can be purchased from Dentsply Sirona.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-304 stainless steel ligature wire, 0.009&#39;&#39; diameter</td>
			<td>Orthodontics</td>
			<td>SBLW109</td>
			<td>0.009&#39;&#39;(.23mm) diameter, Soft temper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Ject E (Xylazine) 100mg/ml</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>NDC:11695-7085-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z100 Restorative, A2 shade</td>
			<td>3M ESPE</td>
			<td>5904A2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3d imaging of pdl collagen fibers during orthodontic tooth movement in mandibular murine model

O movimento dontário ortodôntico é um processo biológico complexo de remodelação de tecidos moles e duros alterados como resultado de forças externas. Para compreender esses complexos processos de remodelação, é fundamental estudar os tecidos dentários e periodontais dentro de seu contexto 3D e, portanto, minimizar quaisquer secções e artefatos tecuais. Modelos de camundongos são frequentemente utilizados em biologia desenvolvimentante e estrutural, bem como em biomecânica devido ao seu pequeno tamanho, alta taxa metabólica, genética e facilidade de manuseio. Em princípio, isso também os torna excelentes modelos para estudos odontológicos. No entanto, um grande impedimento é o tamanho do dente pequeno, os molares em particular. Este artigo visa fornecer um protocolo passo a passo para a geração de movimento dentário ortodôntico e dois métodos para imagem 3D do componente fibroso do ligamento periodontal de um molar mandibular de camundongos. O primeiro método apresentado baseia-se em uma configuração de micro-TC que permite a melhor imagem de aprimoramento de fase de tecidos de colágeno frescos. O segundo método é um método de limpeza óssea usando cinnamate etílico que permite a imagem através do osso sem secção e preserva fluorescência endógena. Combinando este método de compensação com ratos repórteres como Flk1-Cre; TdTomato proporcionou uma primeira oportunidade de imagem da vasculatura 3D no PDL e osso alveolar.

Este artigo apresenta um método para produzir OTM, bem como dois métodos para imagem 3D de fibras de colágeno dentro do PDL sem qualquer secção. Para fins de pesquisa animal, quando o alinhamento dos dentes não é necessário, um movimento dentário é considerado ortodôntico se gera remodelação do osso alveolar em todos os níveis radiculares. O nível de força constante aplicado nos dentes é necessário para gerar um OTM confiável. Aqui, uma bobina NiTi de memória de forma ativada é usada para gerar uma f...

Watch this Scientific Journal Video about 3D Imaging of PDL Collagen Fibers during Orthodontic Tooth Movement in Mandibular Murine Model at JoVE.com

3D Imaging of PDL Collagen Fibers during Orthodontic Tooth Movement in Mandibular Murine Model

Apresentamos um protocolo para geração de movimento dentário ortodôntico em camundongos e métodos para visualização 3D das fibras de colágeno e vasos sanguíneos do ligamento periodontal sem secção.

Imagem 3D de fibras de colágeno PDL durante movimento dentário ortodôntico no modelo de murina mandibular

Orthodontic tooth movement is a complex biological process of altered soft and hard tissue remodeling as a result of external forces. In order to ...

O movimento ortodôntico do dente é um processo biológico complexo que envolve forças externas e remodelação de tecidos moles e duros. Para entender esses processos, é fundamental estudar o dente e os tecidos periodontais dentro do contexto 3D. O modelo murine é um bom candidato para tais estudos devido ao seu tamanho, alta taxa metabólica e as vastas informações genéticas que temos.No entanto, criar movimento dentário ortodôntico em camundongos não é fácil devido ao seu pequeno tamanho. Além disso, os métodos de análise estrutural geralmente envolvem secção, o que interrompe a estrutura 3D e o contexto do tecido. Para um tecido não uniforme, como o PDL, preservar a estrutura e o contexto 3D é de importância crítica.Para enfrentar esses dois obstáculos, fornecemos um protocolo para gerar movimento dentário ortodôntico mesial do primeiro molar mandibular em camundongos e descrever dois métodos que permitem a visualização 3D do ligamento periodontal sem seccionar o tecido. Para posicionar o mouse anestesiado para inserção do dispositivo ortodôntico, conecte o incisivo superior ao laço do clipe de papel. Imobilize os incisivos inferiores usando a corrente de alimentação e abra ainda mais a boca com o retrátil do rato mini-colibri.Aplique uma pequena gota de soro fisiológico em cada olho para evitar a desidratação da córnea. Estas são as ferramentas utilizadas na inserção do dispositivo. Corte um pedaço de fio de alumínio para um centímetro de comprimento.Utilizando suporte de agulha microcirúrgica, deslize o fio do lado bucal lingually na área interproxmal abaixo do ponto de contato entre o primeiro e o segundo molares. Puxe o fio do lado lingual em direção ao lado mesial do molar. Torça as extremidades livres do fio duas a três vezes para proteger.Corte um pedaço de titânio de níquel ou mola de bobina NiTi em torno de sete a nove fios de comprimento. Insira a bobina entre o molar inferior e o incisivo, passe uma extremidade livre do fio através de dois fios da bobina e, em seguida, gire as duas extremidades do fio firmemente para fixar a bobina no molar. Remova a corrente de alimentação usando um par de pinças.Enrole de dois a três fios da bobina sobre o incisivo para ancorar a bobina. Deixe exatamente três roscas ativas entre o primeiro molar e o incisivo. Deslize as ameaças até a margem gengival livre incisivo.Coloque uma camada de resina composta esvoaçante na borda incisal da bobina e cure-a com luz de cura dental. Substitua a corrente de alimentação após a cura da resina. Corte o excesso de fio ao redor do molar para evitar ferimentos.Usando a mesma luz de cura, aqueça a bobina NiTi por 20 segundos. Isso vai apertar a bobina, a colocação final deve ser assim. Tecido mole na hemi-mandíbula dissecada pode ser removido com uma limpeza sem fiapos.Com uma amostra entre dois dedos, esfregue o exterior em movimento circular até que a maior parte do tecido mole seja removida. O resto pode ser cortado usando uma tesoura. A mandíbula limpa é mostrada aqui à direita.Para montar a hemi-mandíbula dissecada na câmara de amostra da micro tomografia computadorizada, modele uma resina dentária embalada do tamanho de um grão de arroz em um tronco. Em seguida, coloque-o no slot amostral do palco. Coloque a hemi-mandible sobre o composto.Ajuste a posição até que o primeiro molar esteja centrado na ranhura média e a superfície oclusal esteja horizontal. Cure o composto quando estiver satisfeito com o posicionamento. Este é um exemplo da mandíbula em posição adequada.Pegue uma pequena bola de resina dentária embalada. Seu diâmetro deve ser em torno da largura do molar. Coloque a resina na superfície oclusal do primeiro molar.Umedeça o lenço sem fiapos com água. Coloque a limpeza umedecida dentro das piscinas de umidade no estágio amostral. Feche a câmara de amostra e afixe-a na micro CT com parafusos.Agora tire imagens 2D enquanto baixa a bigorna verticalmente até que a ponta da bigorna esteja cercada pelo composto. Desligue com segurança a fonte de raios-X, abra a câmara micro CT e cure o composto através da janela plexiglass clara. Agora a amostra está montada corretamente e pode ser imageda conforme necessário.Para gerar amostra de hemi-mandíbula limpa opticamente, prepare as seguintes soluções em tubos de centrífugas de 1,5 mil. 4% paraformaldeído, 50% e 70% etanol em água deionizada. Dois tubos de 100% etanol e cinnamate etílico.Coloque hemi-mandible dissecada em 4%paraformaldeído. Cubra o tubo com papel alumínio e coloque em um roqueiro em um ajuste suave por seis horas em temperatura ambiente. Depois de seis horas, transfira a amostra para 50% de etanol.Coloque a amostra de volta no roqueiro por 16 horas coberta de luz. Repita a etapa anterior com uma amostra de 70% de etanol durante 16 horas, seguida de 100% de etanol duas vezes por 16 horas cada vez. Por fim, mova a amostra para o cinnamate etílico por um mínimo de 12 horas.O movimento ortodôntico confiável é gerado pelo dispositivo de bobina NiTi no primeiro molar mandibular murine. Em nove semanas de camundongos machos, o espaço interproxmal médio é de 40 mícrons após sete dias. O microC de melhoria de fase permite a visualização do PDL.Após três dias de movimento ortodôntico mesial, a densidade de PDL é reduzida. A interface pdl óssea é mais áspera devido ao desenvolvimento de crateras na superfície óssea, que são indicativas de atividade osteoclástica e resorção óssea. Superfície áspera pode ser vista em todos os níveis das raízes.Isso mostra que o movimento é translacional em oposição a um movimento de tombamento. No sétimo dia, o espaço PDL é mais estreito do que no terceiro dia e a borda do PDL ósseo na superfície da raiz distal é mais suave, que são sinais de oposição óssea como esperado quando ocorre movimento dentário ortodôntico. Devido ao longo tempo de imagem microC e à rotação do estágio, a montagem segura da amostra é essencial.Amostra instável onde resulta em varreduras embaçadas onde uma silhueta pode ser vista ao redor da coroa e as fibras PDL não são vistas. A limpeza óptica usando o cinnamate etílico fornece outro método para visualizar o PDL sem secção. O substrato pode ser visto através do ramus de uma amostra adequadamente limpa mostrada aqui à direita.Este método preserva fluorescência endógena e pode ser usado sem fixação química. A microscopia de folha de luz pode ser usada em amostras limpas. Com um rato transgênico, os revestimentos fluorescentes dos vasos sanguíneos podem ser observados.Se o osso não foi devidamente limpo, os vasos sanguíneos no PDL não são visíveis como mostrado no painel F.Este protocolo descreveu como superar dois grandes desafios na geração e análise do movimento dontário ortodôntico nos dentes molares mandibulares murinas. Uma vez que a técnica de movimento do dente ortodôntico seja dominada, ela pode ser completada em 15 minutos. Este processo é desafiador devido às pequenas dimensões dos dentes do rato e à presença da língua.No entanto, fornecemos todas as soluções necessárias para superar esses desafios. A imagem microCÁptica requer um recurso de melhoria de fase. Demonstramos nossa técnica usando uma micro tomografia. No entanto, qualquer configuração que possa gerar melhoria de fase fará, por exemplo, um síncrotron.Os resultados de compensação do ECi dependem do processo de desidratação. Se a amostra não for transparente o suficiente, nossa sugestão é aumentar o tempo das etapas de desidratação. Nosso método de compensação também pode ser usado em amostras não fixadas.Os tecidos claros podem ser escaneados na micro TC, uma vez que o processo de compensação não afeta o conteúdo mineral do tecido. Portanto, nosso método fornece uma abordagem correlativa para fluorescência e informações estruturais para gerar uma análise 3D completa.

Research

JoVE Journal

Medicine

Intracranial Implantation with Subsequent 3D In Vivo Bioluminescent Imaging of Murine Gliomas

Intracranial Implantation with Subsequent 3D In Vivo Bioluminescent Imaging of Murine Gliomas

Implantação intracraniana com 3D subseqüentes In Vivo Bioluminescent imagem de Gliomas murino

The mouse glioma 261 (GL261) is recognized as an in vivo model system that recapitulates many of the features of human glioblastoma multiforme (GBM). The ...

Medicina

Three-dimensional Imaging of Nociceptive Intraepidermal Nerve Fibers in Human Skin Biopsies

Imagem tridimensional de nociceptivos Fibras Nervosas intraepidérmicos em biópsias de pele humana

A punch biopsy of the skin is commonly used to quantify intraepidermal nerve fiber densities (IENFD) for the diagnosis of peripheral polyneuropathy 1,2. ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

Visualização Quantitativa de Infiltrado de Leucócitos em um Modelo Murino de Miocardite Fulminante por Microscopia de Folha de Luz

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

3D Ultrasound Imaging: Fast and Cost-effective Morphometry of Musculoskeletal Tissue

Imagens de ultra-som 3D: rápida e econômica de morfometria do tecido músculo-esquelético

The developmental goal of 3D ultrasound imaging (3DUS) is to engineer a modality to perform 3D morphological ultrasound analysis of human muscles. 3DUS ...

Determining and Controlling External Power Output During Regular Handrim Wheelchair Propulsion

Determinando e controlando a saída de energia externa durante propulsão regular de cadeira de rodas Handrim

The use of a manual wheelchair is critical to 1% of the world&#39;s population. Human powered wheeled mobility research has considerably matured, which ...

Delayed Intramyocardial Delivery of Stem Cells after Ischemia Reperfusion Injury in a Murine Model

Entrega intramiocárdica atrasada de células-tronco após lesão de reperfusão de Isquemia em um modelo murino

There is significant interest in the use of stem cells (SCs) for the recovery of cardiac function in individuals with myocardial injuries. Most commonly, ...

Multiphoton Intravital Imaging for Monitoring Leukocyte Recruitment during Arteriogenesis in a Murine Hindlimb Model

Imagem Intravital Multifóton para Monitoramento do Recrutamento de Leucócitos durante a Arteriogênese em Modelo de Membro Posterior Murino

Arteriogenesis strongly depends on leukocyte and platelet recruitment to the perivascular space of growing collateral vessels. The standard approach for ...

3D Imaging of the Liver Extracellular Matrix in a Mouse Model of Non-Alcoholic Steatohepatitis

Imagem 3D da Matriz Extracelular Hepática em Modelo de Esteatohepatite Não Alcoólica em Camundongos

Non-alcoholic steatohepatitis (NASH) is the most common chronic liver disease in the United States, affecting more than 70 million Americans. NASH can ...

Analyzing Alveolar Bone Remodeling to Explore Skeletal Mechanical Biology

Using Inducible Osteoblastic Lineage-Specific Stat3 Knockout Mice to Study Alveolar Bone Remodeling During Orthodontic Tooth Movement

Comparing Alveolar and Long Bone Remodeling to Explore OTM Model Potential (Video) | JoVE

Uso de camundongos knockout Stat3 específicos para linhagem osteoblástica induzível para estudar a remodelação óssea alveolar durante a movimentação ortodôntica

The alveolar bone, with a high turnover rate, is the most actively-remodeling bone in the body. Orthodontic tooth movement (OTM) is a common artificial ...

A Murine Maxillary Orthodontic Model Guide to Bone Remodeling Analysis

The Establishment of a Murine Maxillary Orthodontic Model

Author Spotlight: Insights into an Efficient Murine Maxillary Orthodontic Model Protocol

Due to the lack of reproducible protocols for establishing a murine maxillary orthodontic model, we present a reliable and reproducible protocol to ...