Name: platform incubator with movable xy stage: a new platform for implementing in-cell fast photochemical oxidation of proteins
Uploaded: 2021-05-17T13:30:00
Duration: 5 min 50 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Platform Incubator with Movable XY Stage: A New Platform for Implementing In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins at JoVE.com

وقد دعم هذا العمل بمنحة من المعهد الوطني للصحة R01 GM128983-01.

<ol>
	<li>Johnson, D. T., Di Stefano, L. H., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+photochemical+oxidation+of+proteins+(FPOP):+A+powerful+mass+spectrometry+based+structural+proteomics+tool.">Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP): A powerful mass spectrometry based structural proteomics tool.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (32), 11969-11979 (2019).</li><li>Liu, X. R., Zhang, M. M., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Spectrometry-Based+Protein+Footprinting+for+Higher-Order+Structure+Analysis:+Fundamentals+and+Applications.">Mass Spectrometry-Based Protein Footprinting for Higher-Order Structure Analysis: Fundamentals and Applications.</a> Chemical Reviews. 120 (10), 4355-4454 (2019).</li><li>Li, J., Chen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+fast+photochemical+oxidation+of+proteins+coupled+with+mass+spectrometry+in+protein+therapeutics+discovery+and+development.">The use of fast photochemical oxidation of proteins coupled with mass spectrometry in protein therapeutics discovery and development.</a> Drug Discovery Today. 24 (3), 829-883 (2019).</li><li>Zhao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Covalent+Labeling+with+an+&#945;,&#946;-Unsaturated+Carbonyl+Scaffold+for+Studying+Protein+Structure+and+Interactions+by+Mass+Spectrometry.">Covalent Labeling with an &#945;,&#946;-Unsaturated Carbonyl Scaffold for Studying Protein Structure and Interactions by Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 92 (9), 6637-6644 (2020).</li><li>Hambly, D. M., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Flash+Photolysis+of+Hydrogen+Peroxide+to+Oxidize+Protein+Solvent-Accessible+Residues+on+the+Microsecond+Timescale.">Laser Flash Photolysis of Hydrogen Peroxide to Oxidize Protein Solvent-Accessible Residues on the Microsecond Timescale.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 16 (12), 2057-2063 (2005).</li><li>Li, K. S., Shi, L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Spectrometry-Based+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+(FPOP)+for+Higher+Order+Structure+Characterization.">Mass Spectrometry-Based Fast Photochemical Oxidation of Proteins (FPOP) for Higher Order Structure Characterization.</a> Accounts of Chemical Research. 51 (3), 736-744 (2018).</li><li>Chea, E. E., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modifications+generated+by+fast+photochemical+oxidation+of+proteins+reflect+the+native+conformations+of+proteins.">Modifications generated by fast photochemical oxidation of proteins reflect the native conformations of proteins.</a> Protein Science. 27 (6), 1047-1056 (2018).</li><li>Hambly, D., Gross, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+flash+photochemical+oxidation+to+locate+heme+binding+and+conformational+changes+in+myoglobin.">Laser flash photochemical oxidation to locate heme binding and conformational changes in myoglobin.</a> International Journal of Mass Spectrometry. 259 (1), 124-129 (2007).</li><li>Yan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+photochemical+oxidation+of+proteins+(FPOP)+maps+the+epitope+of+EGFR+binding+to+adnectin.">Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) maps the epitope of EGFR binding to adnectin.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 25 (12), 2084-2092 (2014).</li><li>Zhang, Y., Wecksler, A. T., Molina, P., Deperalta, G., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+Binding+Interface+of+VEGF+and+a+Monoclonal+Antibody+Fab-1+Fragment+with+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+(FPOP)+and+Mass+Spectrometry.">Mapping the Binding Interface of VEGF and a Monoclonal Antibody Fab-1 Fragment with Fast Photochemical Oxidation of Proteins (FPOP) and Mass Spectrometry.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 28 (5), 850-858 (2017).</li><li>Espino, J. A., Mali, V. S., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Cell+Footprinting+Coupled+with+Mass+Spectrometry+for+the+Structural+Analysis+of+Proteins+in+Live+Cells.">In Cell Footprinting Coupled with Mass Spectrometry for the Structural Analysis of Proteins in Live Cells.</a> Analytical Chemistry. 87 (15), 7971-7978 (2015).</li><li>Rinas, A., Mali, V. S., Espino, J. A., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Microflow+System+for+In-Cell+Footprinting+Coupled+with+Mass+Spectrometry.">Development of a Microflow System for In-Cell Footprinting Coupled with Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 88 (20), 10052-10058 (2016).</li><li>Johnson, D. T., Punshon-Smith, B., Espino, J. A., Gershenson, A., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementing+In-Cell+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+in+a+Platform+Incubator+with+a+Movable+XY+Stage.">Implementing In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins in a Platform Incubator with a Movable XY Stage.</a> Analytical Chemistry. 92 (2), 1691-1696 (2019).</li><li>Bangel-Ruland, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator-mRNA+delivery:+a+novel+alternative+for+cystic+fibrosis+gene+therapy.">Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator-mRNA delivery: a novel alternative for cystic fibrosis gene therapy.</a> The Journal of Gene Medicine. 15 (11-12), 414-426 (2013).</li><li>Gau, B. C., Chen, H., Zhang, Y., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sulfate+Radical+Anion+as+a+New+Reagent+for+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins.">Sulfate Radical Anion as a New Reagent for Fast Photochemical Oxidation of Proteins.</a> Analytical Chemistry. 82 (18), 7821-7827 (2010).</li><li>Xu, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroxyl+Radical-Mediated+Modification+of+Proteins+as+Probes+for+StructuralProteomics.">Hydroxyl Radical-Mediated Modification of Proteins as Probes for StructuralProteomics.</a> Chemical Reviews. American Chemical Society. 107 (8), 3514-3543 (2007).</li><li>Espino, J. A., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+Biological+Interactions+with+In+Vivo+Protein+Footprinting.">Illuminating Biological Interactions with In Vivo Protein Footprinting.</a> Analytical Chemistry. 9 (10), 6577-6584 (2019).</li><li>Gau, B. C., Sharp, J. S., Rempel, D. L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Photochemical+Oxidation+of+Protein+Footprints+Faster+than+Protein+Unfolding.">Fast Photochemical Oxidation of Protein Footprints Faster than Protein Unfolding.</a> Analytical Chemistry. 81 (16), 6563-6571 (2009).</li><li>Kaur, U., Johnson, D. T., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+the+Applicability+of+In-Cell+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+across+Multiple+Eukaryotic+Cell+Lines.">Validation of the Applicability of In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins across Multiple Eukaryotic Cell Lines.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (7), 1372-1379 (2020).</li></ol>

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود مصلحة مالية متنافسة. يرتبط البحث المقدم هنا بطلب البراءة المشار إليه أدناه: رقم طلب براءة الاختراع غير المؤقت في الولايات المتحدة: 17/042,565 العنوان: "الجهاز وطريقة تحديد طي البروتين" رقم جدول UMB: LJ-2018-104 UMass Ref: UMA 18-059.

البروتينات أداء الكثير من العمل في الخلايا الحية. ونظرا لهذه الأهمية، هناك حاجة إلى بيانات مفصلة عن وظيفة البروتين وهيكل النظام الأعلى (HOS) في البيئة الخلوية لتعميق فهم التعقيدات في المجمعات الكبيرة والتفاعلات الأنزيمية في الخلايا بدلا من الأنظمة المنقى. للقيام بذلك، تم اعتماد طريقة طباعة القدم البروتين الراديكالي هيدروكسيل (HRFP) بعنوان الأكسدة الضوئية السريعة في الخلية من البروتينات (IC-FPOP). وقد أجريت معظم الدراسات FPOP في المختبر في أنظمة البروتين النقي نسبيا، والذي يتناقض بشكل ملحوظ مع البيئة الجزيئية المزدحمة التي تؤثر على التفاعلات ملزمة وديناميات البروتين تشكيلية. ونتيجة لذلك، هناك هوة بين النتائج المستخلصة من التجارب المختبرية 18 وتلك التي يمكن الحصول عليها في بيئة خلوية فعلية. ولسد الفجوة بين الظروف المثالية لتجربة FPOP في المختبر والطبيعة المعقدة للخلية، تم تطوير لوحة آلية جديدة من ستة آبار في منصة الخلية-FPOP. هذه التكنولوجيا الجديدة FPOP قادرة على تحديد وتميز هذه الأنواع الجزيئية وتتبع تفاعلاتها الجزيئية الديناميكية في كل من الحالات الصحية والمرضية. وتسمى هذه المنصة الجديدة حاضنة المنصة مع المرحلة XY المنقولة (PIXY).
وقد استخدمت بنجاح FPOP لتوصيف المعلومات الهيكلية داخل البروتيوم. ومع ذلك ، فإن كل تقنية بيولوجية لها بعض القيود التي تتطلب المزيد من التحسين. مطلوبة الكواشف محددة أثناء تحلل ضوئي ليزر وإرواء بكفاءة الجذور الهيدروكسيل غير المنقحة. فصل الببتيدات المهضومة يمكن أن تتطلب كميات كبيرة من الوقت لتحقيق أقصى قدر من المعلومات الهيكلية. هذه الثروة من المعلومات يمكن أن تتطلب أيضا كميات واسعة النطاق أثناء تحليل بيانات ما بعدمرض التصلبالعصبي المتعدد 1 . حاضنة المنصة، بما في ذلك الآلات الطرفية اللازمة لثقافة الخلايا وIC-FPOP في منصة الليزر، تأتي مع تكلفة كبيرة قد لا تكون مجدية لبعض المختبرات. ومع استمرار إحراز تقدم، ينبغي أن تقدم البرمجيات القوية وأدوات التحليل هذه التقنية؛ بعضها معروض في هذه الدراسة. وقد أجريت الدراسات الحالية في هذه الحاضنة منصة على خلايا HEK293T وفي C. elegans. وقد ثبت أن طريقة IC-FPOP متوافقة مع مجموعة واسعة من خطوط الخلية بما في ذلك مبيض الهامستر الصيني (CHO) ، Vero ، MCF-7 ، وخلايا MCF10-A19. وبما أن طريقة IC-FPOP العامة قابلة للترجمة إلى هذا النظام الأساسي الثابت، يجب أن تكون خطوط الخلايا هذه قابلة للدراسة باستخدام PIXY أيضا.
يستخدم IC-FPOP H2O2 لتعديل السلاسل الجانبية للمذيبات التي يمكن الوصول إليها من الأحماض الأمينية ، ثم تمييز المزيد من التفاعلات البروتينية والهيكل والآثار الأيضية داخل الخلايا القابلة للحياة وهو أمر مهم في توفير السياق البيولوجي. من الضروري قبل تجربة IC-FPOP التأكد من أن الخلايا قابلة للحياة بعد إضافة H2O2. أثبتت دراسات قابلية الخلية للحياة أن الخلايا كانت قابلة للحياة في وجود تركيزات H2O2 تصل إلى 200 mM 13. من المهم أيضا التأكد من أن H2O2 يتم غرسه بتركيز نهائي قدره 200 مليون متر في الخلايا مباشرة بعد إزالة الوسائط. الفشل في إزالة الوسائط ثقافة الخلية تماما سوف يسبب تركيزات متفاوتة من H2O2. بالمقارنة مع الظروف القياسية، أدت زيادة وقت الحضانة إلى 10 ثوان إلى جانب زيادة تركيز H2O2 إلى ارتفاع عدد البروتينات المعدلة بواسطة IC-FPOP في حاضنة المنصة. من الضروري أن المضخات العتمة رئيس قبل استخدامها لضمان مضخات تعمل بشكل صحيح ويتم تشتيت السائل. قد يؤدي الفشل في القيام بذلك إلى فقاعات الهواء في الأنابيب ، وحجم غير كاف من H2O2 لتزج الخلايا ، و / أو حجم غير كاف من محلول التبريد.
وثمة مسألة أخرى قد تنشأ وهي التأخيرات غير المرغوب فيها في النظام. مثال على ذلك هو عملية التحقق من الأوامر الواردة لأنظمة المضخة مما يضيف تأخيرات كبيرة على ترتيب 1000 مللي ثانية أو أكثر باستخدام برنامج التكامل. يمكن إصلاح هذه المشكلة عن طريق تقليل الاتصال مع المضخات أثناء التجربة واستخدام أوامر محددة مسبقا في وقت مبكر قدر الإمكان.
في المستقبل، والهدف من PIXY هو إنتاج نظام مؤتمتة ومتكاملة بالكامل. بالإضافة إلى المضخات العتمة ، سيتم تشغيل نبض الليزر آليا. كما سيتم استخدام نظام تحديد المواقع الجديد للحركة السريعة لحاضنة المنصة لتعزيز السرعة والدقة. وسيستمر برمجة جميع مكونات النظام باستخدام برنامج التكامل لزيادة الإنتاجية.

تقنيات البصمة البروتين يمكن أن تكشف عن معلومات عميقة عن تنظيم البروتينات. هذه التقنيات الأساسية القائمة على البيولوجيا الهيكلية MS هي عنصر من عناصر مجموعة أدوات قياس الطيف الكتلي. هذه الأساليب التحقيق البروتين أعلى بنية النظام (HOS) والتآزر عن طريق وضع العلامات التساهمية1،2،3،4. أكسدة البروتينات الضوئية السريعة (FPOP) توظف الجذور الهيدروكسيل لتعديل السلاسل الجانبية للمذيبات التي يمكن الوصول إليها من الأحماض الأمينية5،6 (الجدول 1). تستخدم هذه الطريقة ليزر اكسيمر في 248 نانومتر للتحلل الضوئي لبيروكسيد الهيدروجين (H2O2) لتوليد الجذور الهيدروكسيل. نظريا، 19 من الأحماض الأمينية 20 يمكن تعديلها بشكل مؤاكس مع غلي يجري الاستثناء الوحيد. ومع ذلك ، نظرا لمعدلات التفاعل متفاوتة من الأحماض الأمينية مع الجذور الهيدروكسيل ، تم رصد تعديل مجموعة فرعية فقط من هذه تجريبيا. ومع ذلك ، فإن الطريقة لديها القدرة على التحليل على طول تسلسل البروتين5. يقوم FPOP بتعديل البروتينات على مقياس الوقت ميكروثانية، مما يجعله مفيدا في دراسة التفاعلات الضعيفة مع معدلات إيقاف سريع. تغييرات إمكانية الوصول المذيبات على الربط ليغاند أو تغيير في تشكيل البروتين، وبالتالي، فإن قوة الأسلوب يكمن في مقارنة نمط وضع العلامات من البروتين في ولايات متعددة (أي، ليجاند خالية بالمقارنة مع ليغاند ملزمة). ونتيجة لذلك، وقد FPOP ناجحة في تحديد البروتين البروتين والبروتين ليغاند مواقع التفاعل والمناطق من تغيير تشكيلي7،8،9،10. تم توسيع طريقة FPOP من دراسة أنظمة البروتين النقي إلى التحليل داخل الخلية. يمكن FPOP داخل الخلية (IC-FPOP) تعديل التأكسدي أكثر من ألف البروتينات في الخلايا لتوفير المعلومات الهيكلية عبر البروتيوم11،12. تستخدم منصة IC-FPOP التقليدية نظام تدفق لتدفق الخلايا ملف واحد بعد شعاع الليزر. وقد أتاح تطوير هذا النظام للخلايا الفردية التعرض على قدم المساواة للإشعاع بالليزر. وأدى ذلك إلى ارتفاع 13 أضعاف في عدد البروتينات المسماة التأكسدي12. ومع ذلك، فإن أحد القيود المفروضة على نظام التدفق هو طول تجربة عينة واحدة تتكون من فاصل إشعاعي مدته 10 دقائق يتم خلاله التعديل ودورة غسيل إضافية مدتها 10 دقائق. القيود الزمنية لIC-FPOP يجعلها غير مناسبة لدراسة وسيطة طي البروتين قصيرة الأجل أو التغيرات الموجودة بين شبكات التفاعل في سلاسل الإشارات الكيميائية الحيوية. وقد ألهم هذا القيد الزمني تصميم منصة جديدة من نوع IC-FPOP مجهزة بكمية إنتاجية أعلى.
لقياس دقيق للبروتين أعلى ترتيب هيكل في بيئة الخلية الأصلية، والتصميم الجديد يسمح لثقافة الخلية أن يتحقق مباشرة في منصة الليزر، والتي تمكن IC-FPOP أن تكون الإنتاجية العالية. يسمح هذا الإعداد أيضا الاضطرابات المصغرة للبيئة الخلوية، على النقيض من IC-FPOP باستخدام تدفق حيث يجب إزالة الخلايا الملتصقة من الركيزة. تسمح المنصة الجديدة ل IC-FPOP بالحدوث في نظام حضانة معقم باستخدامثاني أكسيد الكربون وغرفة المرحلة العليا التي يتم التحكم في درجة حرارتها مع استخدام البصريات المتطابقة المكونة لتوجيه شعاع الليزر ، ونظام تحديد المواقع لحركة XY ، والمضخات العاكسة للتبادل الكيميائي. المنصة الجديدة لإجراء IC-FPOP بعنوان حاضنة المنصة مع المرحلة XY المنقولة (PIXY)(الشكل 1). في PIXY ، يتم تنفيذ IC-FPOP على الخلايا البشرية التي تزرع في لوحات من ست آبار داخل غرفة حاضنة المنصة. لهذا التكوين، وينعكس شعاع الليزر إلى أسفل على لوحة باستخدام المرايا متوافقة مع شعاع كمرحلة تحديد المواقع التي تحمل الحاضنة يتم نقلها، في الطائرة XY، لذلك يتم محاذاة شعاع الليزر استراتيجيا لتشعيع بئر واحد فقط في وقت واحد. تظهر دراسات التحقق من الصحة أنه يمكن إجراء IC-FPOP بشكل أسرع في PIXY مما هو عليه في نظام التدفق ويؤدي إلى زيادة تعديلات الأحماض الأمينية لكل بروتين. تطوير هذه المنصة الجديدة IC-FPOP سوف شرح على المعرفة التي يمكن الحصول عليها من التجارب الخلوية13.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ismatec Reglo ICC Peristaltic Pumps</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>122270050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Kinematic Mirror Mount for &#216;2&#34; Optics</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X trypsin&#8722;EDTA</td>
			<td>Corning</td>
			<td>AB00490-00005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50.0mm 248nm 45&#176;, Excimer Laser Line Mirror</td>
			<td>Edmond Optics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone, HPLC Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18 Trap Column, 100&#197;, 5 &#181;m, 180 &#181;m x 20 mm, 2G, V/M, 1/pkg</td>
			<td>Waters</td>
			<td>23275</td>
			<td>other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACQUITY UPLC M-Class System</td>
			<td>Waters</td>
			<td>A53225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Afinia H480 3D Printer</td>
			<td>(Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>air pump</td>
			<td>OKOlabs</td>
			<td>D12345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Foil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Stock #63-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua 5 &#181;m C18 125 &#197; packing material</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carbon dioxide unit</td>
			<td>OKOlabs</td>
			<td>MadMotor&#174;-UHV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>connectors (Y PP 1/16&#8221; and 1/16x1/8&#8221;)</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>116891000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate Task Wipers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>022625501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreiotol (DTT)</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO, Anhydrous</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LS118-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>SK-78001-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EX350 excimer laser</td>
			<td>GAM Laser</td>
			<td>PI89900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>SK-12023-78</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid, LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A929-4</td>
			<td>4 L quantity is not necessary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T cells</td>
			<td>Paul Shapiro Lab (University of Maryland Baltimore)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>humidifier</td>
			<td>OKOlabs</td>
			<td>Nano-LPMW stage</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HV3-2 VALVE</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>LS120-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide (IAA)</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LABVIEW Professional 2018</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>86728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MadMotor Positioning system and controllers</td>
			<td>Mad City Labs</td>
			<td>W6-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-213-100</td>
			<td>any brand is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>H301-T Unit-BL-PLUS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8242;-Dimethylthiourea (DMTU)</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanopositioinging stage</td>
			<td>Mad City Labs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-tert-Butyl-&#945;-phenylnitrone (PBN)</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OKO Touch Monitoring System</td>
			<td>OKOlabs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>7Z02936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE50-C pyroelectric energy meter</td>
			<td>Ophir Optronics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Trypsin Protease, MS Grade</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Universal Nuclease for Cell Lysis</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pressure gauge</td>
			<td>OKOlabs</td>
			<td>OKO-AIR-PUMP-BL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE filter</td>
			<td>OKOlabs</td>
			<td>CO2-UNIT-BL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Six 33 mm PLA filament rings</td>
			<td>(Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile incubator</td>
			<td>OKOlabs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>temperature unit</td>
			<td>OKOlabs</td>
			<td>OKO-TOUCH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A117-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TiNKERcad</td>
			<td>(Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H325-100</td>
			<td>any 30% hydrogen peroxide is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tubing (Tygon 3.18 and 1.59 ID)</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>177350250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A454SK-4</td>
			<td>4 L quantity is not necessary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>88702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>90058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>KM200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>186007496</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

platform incubator with movable xy stage: a new platform for implementing in-cell fast photochemical oxidation of proteins

الأكسدة الضوئية السريعة للبروتينات (FPOP) إلى جانب قياس الطيف الكتلي (MS) أصبحت أداة لا تقدر بثمن في علم البروتيات الهيكلي لاستجواب تفاعلات البروتين والهيكل وديناميكيات تكوين البروتين كدالة على إمكانية الوصول إلى المذيبات. في السنوات الأخيرة ، تم توسيع نطاق FPOP ، وهي تقنية طباعة القدم البروتين الراديكالي الهيدروكسيل (HRPF) ، إلى وضع العلامات على البروتين في ثقافات الخلايا الحية ، مما يوفر الوسائل لدراسة تفاعلات البروتين في البيئة الخلوية المعقدة. يمكن أن توفر تعديلات البروتين داخل الخلية نظرة ثاقبة للتغيرات الهيكلية المستحثة في الليغند أو التغييرات التشكيلية المصاحبة لتشكيل مجمع البروتين ، كل ذلك في السياق الخلوي. وقد تم إنجاز بصمة البروتين باستخدام نظام التدفق العرفي والليزر 248 نانومتر KrF excimer لتسفر عن الجذور الهيدروكسيل عن طريق التحليل الضوئي لبيروكسيد الهيدروجين، مما يتطلب 20 دقيقة من التحليل لعينة خلية واحدة. ولتيسير تجارب FPOP التي تم حلها زمنيا، كان استخدام منصة IC-FPOP جديدة قائمة على 6 آبار رائدا. في النظام الحالي ، يقوم نبض ليزر واحد بتشعيع بئر واحد كامل ، مما يؤدي إلى اقتطاع الإطار الزمني التجريبي FPOP مما يؤدي إلى 20 ثانية من وقت التحليل ، وهو انخفاض 60 ضعفا. هذا الوقت تحليل انخفاض كبير يجعل من الممكن للبحث في الآليات الخلوية مثل السلاسل الإشارات الكيميائية الحيوية، طي البروتين، والتجارب التفاضلية (أي، خالية من المخدرات مقابل المخدرات ملزمة) بطريقة تعتمد على الوقت. هذا الجهاز الجديد، بعنوان حاضنة منصة مع المرحلة XY المنقولة (PIXY)، يسمح للمستخدم لأداء ثقافة الخلية وIC-FPOP مباشرة على مقاعد البدلاء البصرية باستخدام حاضنة منصة مع درجة الحرارة، CO2 والتحكم في الرطوبة. كما تتضمن المنصة مرحلة تحديد المواقع، والمضخات العتمة، والبصريات المرآة لتوجيه شعاع الليزر. تم تحسين ظروف IC-FPOP مثل تكوين البصريات ومعدلات التدفق والأمراض العابرة وتركيز H2O2 في PIXY ومراجعتها من قبل الأقران. أتمتة جميع مكونات النظام سوف تقلل من التلاعب البشري وزيادة الإنتاجية.

للتأكد من أن ظروف حاضنة المنصة كافية لثقافة الخلايا في منصة الليزر ، تم تحويل GCaMP2 بشكل عابر إلى HEK293T وتم تقييم كفاءة العدوى لكلا اللوحين عن طريق التصوير الفلوري(الشكل 4A). GCaMP2 هو بروتين فلوري استشعار الكالسيوم يستخدم كمؤشر الكالسيوم المشفرة وراثيا داخل الخلايا. وهو مزيج من البروتين الفلوري الأخضر (GFP) والبروتين الملزم للكالسيوم، كالمودولين. تم إجراء فحص لوسيفيراز على خلايا HEK 293 المصابة بplasmid prl-TK من أجل تحديد كفاءة العدوى(الشكل 4B). وتظهر هذه النتائج أن حاضنة المنصة تجاوزت أداء الحاضنة القياسية، مع زيادة قدرها 1.13 مرة في كفاءة العدوى، مما يوفر معيارا كميا لبيئة زراعة الخلايا المثلى.
تمت مقارنة تعديلات FPOP في خلايا HEK293T المسماة في نظام التدفق بتلك المسماة في حاضنة المنصة وأظهرت أن حاضنة المنصة تتفوق على نظام التدفق سواء في عدد البروتينات المعدلة(الشكل 5)أو إجمالي تغطية FPOP في تلك البروتينات. وكان عدد البروتينات المعدلة FPOP المكتسبة في حاضنة المنصة حوالي 1051، 2.2 أضعاف تلك المكتسبة في تجربة نموذجية. وتم الجمع بين تعديلات بين نسختين بيولوجيتين متماثلتين لكل تجربة. علاوة على ذلك، يوفر PIXY سرعة نقل أعلى.
ولإثبات ميزة تغطية التعديل الأعلى عبر البروتين، تم تحديد موضع تعديلات IC-FPOP على مستوى الببتيد وتم تحديد مدى التعديل كميا لتمييز الاختلافات في النتائج بين أنظمة أكتين، وهو بروتين حمض أميني 375. في نظام التدفق، تم الكشف عن اثنين من الببتيدات المعدلة، وتوفير معلومات هيكلية محدودة(الشكل 6A). ومع ذلك ، تم الكشف عن خمسة الببتيدات المعدلة التي تمتد على تسلسل actin في حاضنة المنصة. أطياف كتلة جنبا إلى جنب تشير إلى أن بقايا Pro322 تم تعديلها على حد سواء والكشف عنها في كل تجربة (الشكل 6B). تحتوي الببتيدات الخمس المعدلة في عينات حاضنة المنصة على اثني عشر بقايا معدلة ، في حين تم تعديل أربعة بقايا فقط مع نظام التدفق(الشكل 6C). توفر الزيادة في تغطية الأكسدة المزيد من المعلومات الهيكلية عبر البروتين.
Espino وآخرون أظهرت قدرة FPOP أن يؤديها في الجسم الحي (IV-FPOP) داخل C. elegans, نموذج دودة لأمراض الإنسان الدول17. بينما يتم أيضا تنفيذ IV-FPOP عبر نظام تدفق، تم اختبار نظام PIXY للتوافق مع الديدان. وتم احتضان ما يقرب من 10,000 دودة في كل بئر في حاضنة المنصة عند 20 درجة مئوية، وكشف تحليل LC−MS/MS أن 792 بروتينا تم تعديلها بواسطة IV-FPOP في حاضنة المنصة مقارنة ب 545 بروتينا تم تعديلها بنظام التدفق(الشكل 7). هذه النتائج تثبت أنه بالإضافة إلى زراعة الخلايا 2D، هذه المنهجية الجديدة متوافقة أيضا مع دراسة النظم البيولوجية الأخرى مثل C. elegans.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62153/62153fig01.jpg"> الشكل 1. تخطيطي لنظام PIXY. مكونات النظام: (أ) حاضنة المرحلة العليا، (ب) نظام تحديد المواقع ، (ج) مضخات التثاقين، و (د) خطوط التغلغل. تتم إزالة وسائط ثقافة الخلية من كل بئر عبر المضخات قبل H2O2 ويتم غرس حلول التبريد في النقاط الزمنية المحسوبة. عرض مسار الليزر للإشعاع باللون الأبيض. أعيد طبعها بإذن من جونسون، د. ت. ، بونشون سميث، ب. ، إسبينو، ج. أ. ، غيرشينسون، أ. ، جونز، L.M، تنفيذ الأكسدة الكيميائية الضوئية السريعة في الخلية من البروتينات في حاضنة منصة مع مرحلة XY المنقولة. الكيمياء التحليلية، 92(2)، 1691-1696 2019. حقوق الطبع والنشر 2020 الجمعية الكيميائية الأمريكية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62153/62153fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62153/62153fig02.jpg"> الشكل 2. نظام PIXY مجمع بالكامل. (أ) نظام مراقبة اللمس،(ب)وحدة ثاني أكسيد الكربون، (ج) وحدة درجة الحرارة، (D) مضخة الهواء، (E) مرطب، (F) المرايا البصرية، (G) حاضنة منصة، (H) مرحلة تحديد المواقع، (I) 248nm KrF ليزر إكسيمر، و (J) مضخات التجلي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62153/62153fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62153/62153fig03.jpg"> الشكل 3. أتمتة مضخات التثابير. (أ) مثال الأمر النصي في LABVIEW. تتضمن خيارات الأمر الحجم ومعدل التدفق والوقفات واتجاه التدفق. ويجري حاليا التشغيل الآلي للسرعة والمسافة في المرحلة والموقع. (ب) قارئ البرامج النصية في LABVIEW. هنا، يتم تحميل البرامج النصية الأمر ثم تشغيل تسلسل ويتم الضغط على START لبدء مضخات. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62153/62153fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62153/62153fig04.jpg"> الشكل 4. كفاءة نقل خلية HEK. (أ)متوسط كثافة الفلورسنت مقارنة GCaMP2 transfection بين الحاضنة القياسية (التحكم) وحاضنة المرحلة العليا (PIXY). تمثل النقاط والمربعات كل نقطة في بئر تم فيها اتخاذ إجراء. (ب)كفاءة العدوى كمية ومعتمدة مع ناقل مختلف البلازميد، pRL-TK. قيمة P< 0.005. أعيد طبعها بإذن من جونسون، د. ت. ، بونشون سميث، ب. ، إسبينو، ج. أ. ، غيرشينسون، أ. ، جونز، L.M، تنفيذ الأكسدة الكيميائية الضوئية السريعة في الخلية من البروتينات في حاضنة منصة مع مرحلة XY المنقولة. الكيمياء التحليلية، 92(2)، 1691-1696 2019. حقوق الطبع والنشر 2020 الجمعية الكيميائية الأمريكية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62153/62153fig04large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62153/62153fig05.jpg"> الشكل 5. مقارنة بين البروتينات المعدلة في نظام تدفق الخلية الواحدة وPIXY. رسم تخطيطي Venn للبروتينات المعدلة باستخدام في نظام التدفق (الأرجواني) وفي PIXY (أخضر). أعيد طبعها بإذن من جونسون، د. ت. ، بونشون سميث، ب. ، إسبينو، ج. أ. ، غيرشينسون، أ. ، جونز، L.M، تنفيذ الأكسدة الكيميائية الضوئية السريعة في الخلية من البروتينات في حاضنة منصة مع مرحلة XY المنقولة. الكيمياء التحليلية، 92(2)، 1691-1696 2019. حقوق الطبع والنشر 2020 الجمعية الكيميائية الأمريكية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62153/62153fig05large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62153/62153fig06.jpg"> الشكل 6. توطين تعديلات IC-FPOP. مقارنة بين التعديلات IC-FPOP بين الأنظمة. (أ) شريط الرسم البياني للببتيدات المعدلة بشكل مؤاكس داخل أكتين من نظام التدفق (الأرجواني) مقابل حاضنة منصة (الأخضر). (ب) أطياف التصلب المتعدد الترادفي من أكتين (الببتيد 316-326) مع برولين معدلة في كلا النظامين والببتيد actin غير المعدلة (C) FPOP المخلفات المعدلة من أكتين (PDB: 6ZXJ، سلسلة A 11 المخلفات المعدلة في حاضنة منصة (الأخضر)، 3 بقايا معدلة في نظام التدفق (الأرجواني)، 1 بقايا معدلة متداخلة (الأصفر). أعيد طبعها بإذن من جونسون، د. ت. ، بونشون سميث، ب. ، إسبينو، ج. أ. ، غيرشينسون، أ. ، جونز، L.M، تنفيذ الأكسدة الكيميائية الضوئية السريعة في الخلية من البروتينات في حاضنة منصة مع مرحلة XY المنقولة. الكيمياء التحليلية، 92(2)، 1691-1696 2019. حقوق الطبع والنشر 2020 الجمعية الكيميائية الأمريكية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62153/62153fig06large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62153/62153fig07.jpg"> الشكل 7. مقارنة البروتينات المعدلة FPOP في C. elegans حسب التدفق مقابل PIXY. هناك زيادة 1.5 أضعاف في البروتينات المعدلة بشكل مؤأكسد باستخدام PIXY بالمقارنة مع نظام التدفق. أعيد طبعها بإذن من جونسون، د. ت. ، بونشون سميث، ب. ، إسبينو، ج. أ. ، غيرشينسون، أ. ، جونز، L.M، تنفيذ الأكسدة الكيميائية الضوئية السريعة في الخلية من البروتينات في حاضنة منصة مع مرحلة XY المنقولة. الكيمياء التحليلية، 92(2)، 1691-1696 2019. حقوق الطبع والنشر 2020 الجمعية الكيميائية الأمريكية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62153/62153fig07large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
الجدول 1 - الجداول توزيع تعديل سير العمل والتحولات الجماعية (Da). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62153/Table%201.docx" target="_blank"></a>

Watch this Scientific Journal Video about Platform Incubator with Movable XY Stage: A New Platform for Implementing In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins at JoVE.com

Platform Incubator with Movable XY Stage: A New Platform for Implementing In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

يتم استخدام منصة ثابتة جديدة لتوصيف بنية البروتين ومواقع التفاعل في بيئة الخلايا الأصلية باستخدام تقنية بصمة البروتين تسمى الأكسدة الكيميائية الضوئية السريعة داخل الخلية للبروتينات (IC-FPOP).

حاضنة منصة مع المرحلة XY المنقولة: منصة جديدة لتنفيذ الأكسدة الضوئية السريعة في الخلية من البروتينات

Fast Photochemical Oxidation of proteins (FPOP) coupled with mass spectrometry (MS) has become an invaluable tool in structural proteomics to interrogate ...

توفر هذه الطريقة حلولا للأسئلة البيولوجية الصعبة اليوم. من تجربة FPOP في الخلية ، يمكننا دراسة التفاعلات بين البروتين والليغاند ، ومواقع التفاعل بين البروتين والبروتين ، ومناطق التغيير التوافقي. ميزة هذه التكنولوجيا هي استخدام منصة IC-FPOP الآلية المستندة إلى ستة آبار والتي تجعل من الممكن زراعة الخلايا وإجراء دراسات FPOP داخل الخلية مباشرة في الليزر.ويمكن استخدام هذه الطريقة في الصناعات الصيدلانية والتكنولوجيا الحيوية، فضلا عن معاهد البحوث الأكاديمية والسريرية الكبرى، وخاصة من قبل المحققين البيولوجيين في الجامعات التي تدرس ديناميات البروتين. للبدء، فك حاضنة المنصة من مرحلة تحديد المواقع وفصل خطوط درجة الحرارة والغاز ومرطب. رش الحاضنة مع 70٪ الإيثانول ووضعه في غطاء محرك السيارة ثقافة الخلية.قم بإزالة اللوحة ذات الست آبار من حاضنة المنصة، وتأمين الغطاء الأصلي للوح، وتأكيد التقاء الخلايا باستخدام المجهر، ثم ضع لوحة الستة آبار مع خلايا التقاء مرة أخرى في حاضنة المنصة داخل غطاء محرك السيارة لثقافة الخلية. أدخل ثلاثة أنابيب تايغون مسبقة القطع في كل بئر عبر المنافذ المضمنة عن طريق مسح الأنابيب إلى جدران البئر وتأمينها بحلقات مطبوعة ثلاثية الأبعاد مخصصة. إعداد برنامج تكامل البرنامج النصي لسحب المضخة.استخدام مضخة واحدة التجذم لإزالة وسائط الخلية تماما من جميع الآبار الستة. المذيبات الرئيسية في كل قناة من المضخات التجاوية الثلاث الأخرى ، ثم غرس بيروكسيد الهيدروجين وحاجز Quench في أنابيب بالتناوب الخاصة بهم حتى تصل الكواشف إلى منافذ الحاضنة. تأكد من أن شعاع الليزر قد تم زاوية بشكل صحيح ويصل إلى الحاضنة دون عائق.تحقق من طاقة الليزر باستخدام مستشعر خارجي. إعداد البرنامج النصي تكامل ضخ مضخة بعد تأكيد محاذاة الحزمة. غرس 200 ملليمولار بيروكسيد الهيدروجين في 35 ملليلتر في الدقيقة الواحدة في البئر الأول.اضغط على زر البدء على برنامج الليزر عند علامة الخمس ثوان لتشغيل النبض عند علامة ال 11 ثانية على جهاز ضبط الوقت. غرس محلول 125 ملليمولار Quench بمعدل 35 ملليلتر في الدقيقة في البئر الأول مباشرة بعد نبض الليزر. يدويا نقل مرحلة تحديد المواقع لمحاذاة البئر المقبل مع شعاع الليزر وتكرار العملية لجميع الآبار.في غطاء محرك السيارة ثقافة الخلية، استخدم مكشطة الخلية لنقل الخلايا من كل بئر إلى أنابيب مخروطية 15 ملليلتر الفردية. خلايا الطرد المركزي في 1، 200 مرة G لمدة خمس دقائق. تجاهل supernatant وإعادة إنفاق الخلايا في 100 ميكرولتر من العازلة تحلل RIPA.نقل الخلايا إلى أنابيب البولي بروبلين 1.2 ملليلتر الفردية. فلاش تجميد جميع العينات في النيتروجين السائل ووضعها في الفريزر ناقص 80 درجة حتى الاستخدام. لترجمة تعديلات FPOP، قم بتحليل تحلل الخلية المهضومة باستخدام تحليل قياس الطيف الكتلي الترادفي الكروماتوغرافي السائل، ثم احسب مدى التعديل.وللتأكد من أن ظروف حاضنة المنصة كافية لزراعة الخلايا في منصة الليزر، تم تحويل GCaMP2 بشكل عابر إلى HEK293T وتم تقييم كفاءة العدوى لكلا اللوحين عن طريق التصوير الفلوري. وقد أجريت عملية فحص لوسيفيراز لكمية كفاءة العدوى. تمت مقارنة تعديلات FPOP في خلايا HEK293T المسماة في نظام التدفق بتلك المسماة في حاضنة المنصة.وتفوقت حاضنة المنصة على نظام التدفق سواء في عدد البروتينات المعدلة أو في إجمالي تغطية FPOP في تلك البروتينات. وفي نظام التدفق، تم الكشف عن ببتيدات معدلة، مما يوفر معلومات هيكلية محدودة. ومع ذلك ، تم الكشف عن خمسة الببتيدات المعدلة التي تمتد على تسلسل actin في حاضنة المنصة.جنبا إلى جنب أطياف MS من أكتين مع برولين المعدلة في كل من النظم والببتيد actin غير المعدلة تظهر هنا. وتحتوي المخلفات المعدلة ل FPOP في عينات حاضنة المنصة على 12 بقايا معدلة، وثلاثة مخلفات معدلة في نظام التدفق، وبقايا معدلة متداخلة واحدة. وكشف تحليل LC-MS MS أن 792 بروتينا تم تعديلها في الجسم الحي FPOP في حاضنة المنصة مقارنة بالبروتينات ال 545 المعدلة مع نظام التدفق.من الضروري إبقاء الخلايا تحت ظروف معقمة. أحضر دائما حاضنة المنصة إلى غطاء محرك السيارة العقيم لثقافة الخلايا لإدخال جميع اللوحات والأنابيب والحلقات الضرورية ذات الست آبار. وهذا يضمن سلامة التجربة.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Fabricating a UV-Vis and Raman Spectroscopy Immunoassay Platform

افتعال أشعة فوق البنفسجية فيس ورامان الطيفي المناعية منصة

Immunoassays are used to detect proteins based on the presence of associated antibodies. Because of their extensive use in research and clinical settings, ...

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

البروتين فيلم الأشعة تحت الحمراء كهربية أبداه Hydrogenase [NiFe] للدراسة لأكسدة2 ح

Understanding the chemistry of redox proteins demands methods that provide precise control over redox centers within the protein. The technique of protein ...

Multiplexed Isothermal Amplification Based Diagnostic Platform to Detect Zika, Chikungunya, and Dengue 1

متعدد التضخيم متحاور على أساس منهاج التشخيصية للكشف عن زكى وداء شيكونغونيا وحمى الضنك 1

Zika, dengue, and chikungunya viruses are transmitted by mosquitoes, causing diseases with similar patient symptoms. However, they have different ...

A Rat Methyl-Seq Platform to Identify Epigenetic Changes Associated with Stress Exposure

منصة Seq الميثيل الفئران لتحديد تغييرات جينية المرتبطة بالتعرض للإجهاد

As genomes of a wider variety of animals become available, there is an increasing need for tools that can capture dynamic epigenetic changes in these ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

استخدام البروتينات الانصهار المؤتلف في منصة فحص حوزتي فلورسنت وما ريناتوريشن في جل

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

قياس التفاعلات بين مجسات الفلورسنت والليغسين في أقسام النبات بواسطة sFLIM استنادا إلى الفلورية الاصليه

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...

Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

توصيف البروتينات الخلوية مع الأكسدة الضوئية السريعة في الخلية من البروتينات

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting method used to characterize protein structure and interactions. ...

A Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS) Platform for Investigating Peptide Biosynthetic Enzymes

A Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry HDX-MS Platform for Investigating Peptide Biosynthetic Enzymes

منصة قياس الطيف الكتلي لتبادل الهيدروجين والديوتريوم (HDX-MS) للتحقيق في إنزيمات الببتيد التركيب الحيوي

Hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) is a powerful method for the biophysical characterization of enzyme conformational changes and ...

Spectrophotometric Screening for Potential Inhibitors of Cytosolic Glutathione S-Transferases

فحص الطيفي لمثبطات محتملة من الجلوتاثيون السيتوسولي S-Transferases

Glutathione S-transferases (GSTs) are metabolic enzymes responsible for the elimination of endogenous or exogenous electrophilic compounds by glutathione ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support