Name: platform incubator with movable xy stage: a new platform for implementing in-cell fast photochemical oxidation of proteins
Uploaded: 2021-05-17T13:30:00
Duration: 5 min 50 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Platform Incubator with Movable XY Stage: A New Platform for Implementing In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענק של NIH R01 GM128983-01.

<ol>
	<li>Johnson, D. T., Di Stefano, L. H., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+photochemical+oxidation+of+proteins+(FPOP):+A+powerful+mass+spectrometry+based+structural+proteomics+tool.">Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP): A powerful mass spectrometry based structural proteomics tool.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (32), 11969-11979 (2019).</li><li>Liu, X. R., Zhang, M. M., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Spectrometry-Based+Protein+Footprinting+for+Higher-Order+Structure+Analysis:+Fundamentals+and+Applications.">Mass Spectrometry-Based Protein Footprinting for Higher-Order Structure Analysis: Fundamentals and Applications.</a> Chemical Reviews. 120 (10), 4355-4454 (2019).</li><li>Li, J., Chen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+fast+photochemical+oxidation+of+proteins+coupled+with+mass+spectrometry+in+protein+therapeutics+discovery+and+development.">The use of fast photochemical oxidation of proteins coupled with mass spectrometry in protein therapeutics discovery and development.</a> Drug Discovery Today. 24 (3), 829-883 (2019).</li><li>Zhao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Covalent+Labeling+with+an+&#945;,&#946;-Unsaturated+Carbonyl+Scaffold+for+Studying+Protein+Structure+and+Interactions+by+Mass+Spectrometry.">Covalent Labeling with an &#945;,&#946;-Unsaturated Carbonyl Scaffold for Studying Protein Structure and Interactions by Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 92 (9), 6637-6644 (2020).</li><li>Hambly, D. M., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Flash+Photolysis+of+Hydrogen+Peroxide+to+Oxidize+Protein+Solvent-Accessible+Residues+on+the+Microsecond+Timescale.">Laser Flash Photolysis of Hydrogen Peroxide to Oxidize Protein Solvent-Accessible Residues on the Microsecond Timescale.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 16 (12), 2057-2063 (2005).</li><li>Li, K. S., Shi, L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Spectrometry-Based+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+(FPOP)+for+Higher+Order+Structure+Characterization.">Mass Spectrometry-Based Fast Photochemical Oxidation of Proteins (FPOP) for Higher Order Structure Characterization.</a> Accounts of Chemical Research. 51 (3), 736-744 (2018).</li><li>Chea, E. E., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modifications+generated+by+fast+photochemical+oxidation+of+proteins+reflect+the+native+conformations+of+proteins.">Modifications generated by fast photochemical oxidation of proteins reflect the native conformations of proteins.</a> Protein Science. 27 (6), 1047-1056 (2018).</li><li>Hambly, D., Gross, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+flash+photochemical+oxidation+to+locate+heme+binding+and+conformational+changes+in+myoglobin.">Laser flash photochemical oxidation to locate heme binding and conformational changes in myoglobin.</a> International Journal of Mass Spectrometry. 259 (1), 124-129 (2007).</li><li>Yan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+photochemical+oxidation+of+proteins+(FPOP)+maps+the+epitope+of+EGFR+binding+to+adnectin.">Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) maps the epitope of EGFR binding to adnectin.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 25 (12), 2084-2092 (2014).</li><li>Zhang, Y., Wecksler, A. T., Molina, P., Deperalta, G., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+Binding+Interface+of+VEGF+and+a+Monoclonal+Antibody+Fab-1+Fragment+with+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+(FPOP)+and+Mass+Spectrometry.">Mapping the Binding Interface of VEGF and a Monoclonal Antibody Fab-1 Fragment with Fast Photochemical Oxidation of Proteins (FPOP) and Mass Spectrometry.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 28 (5), 850-858 (2017).</li><li>Espino, J. A., Mali, V. S., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Cell+Footprinting+Coupled+with+Mass+Spectrometry+for+the+Structural+Analysis+of+Proteins+in+Live+Cells.">In Cell Footprinting Coupled with Mass Spectrometry for the Structural Analysis of Proteins in Live Cells.</a> Analytical Chemistry. 87 (15), 7971-7978 (2015).</li><li>Rinas, A., Mali, V. S., Espino, J. A., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Microflow+System+for+In-Cell+Footprinting+Coupled+with+Mass+Spectrometry.">Development of a Microflow System for In-Cell Footprinting Coupled with Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 88 (20), 10052-10058 (2016).</li><li>Johnson, D. T., Punshon-Smith, B., Espino, J. A., Gershenson, A., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementing+In-Cell+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+in+a+Platform+Incubator+with+a+Movable+XY+Stage.">Implementing In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins in a Platform Incubator with a Movable XY Stage.</a> Analytical Chemistry. 92 (2), 1691-1696 (2019).</li><li>Bangel-Ruland, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator-mRNA+delivery:+a+novel+alternative+for+cystic+fibrosis+gene+therapy.">Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator-mRNA delivery: a novel alternative for cystic fibrosis gene therapy.</a> The Journal of Gene Medicine. 15 (11-12), 414-426 (2013).</li><li>Gau, B. C., Chen, H., Zhang, Y., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sulfate+Radical+Anion+as+a+New+Reagent+for+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins.">Sulfate Radical Anion as a New Reagent for Fast Photochemical Oxidation of Proteins.</a> Analytical Chemistry. 82 (18), 7821-7827 (2010).</li><li>Xu, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroxyl+Radical-Mediated+Modification+of+Proteins+as+Probes+for+StructuralProteomics.">Hydroxyl Radical-Mediated Modification of Proteins as Probes for StructuralProteomics.</a> Chemical Reviews. American Chemical Society. 107 (8), 3514-3543 (2007).</li><li>Espino, J. A., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+Biological+Interactions+with+In+Vivo+Protein+Footprinting.">Illuminating Biological Interactions with In Vivo Protein Footprinting.</a> Analytical Chemistry. 9 (10), 6577-6584 (2019).</li><li>Gau, B. C., Sharp, J. S., Rempel, D. L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Photochemical+Oxidation+of+Protein+Footprints+Faster+than+Protein+Unfolding.">Fast Photochemical Oxidation of Protein Footprints Faster than Protein Unfolding.</a> Analytical Chemistry. 81 (16), 6563-6571 (2009).</li><li>Kaur, U., Johnson, D. T., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+the+Applicability+of+In-Cell+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+across+Multiple+Eukaryotic+Cell+Lines.">Validation of the Applicability of In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins across Multiple Eukaryotic Cell Lines.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (7), 1372-1379 (2020).</li></ol>

המחברים מצהירים שאין אינטרס כספי מתחרה. המחקר המוצג בזאת קשור לבקשת הפטנט המוזכרת להלן: מספר בקשה לפטנט בארה"ב: 17/042,565 כותרת: "מכשיר ושיטה לקביעת קיפול חלבונים" מספר לוח הזמנים של UMB: LJ-2018-104 UMass Ref: UMA 18-059.

חלבונים מבצעים חלק גדול מהעבודה בתאים חיים. בהתחשב בחשיבות זו, יש צורך בנתונים מפורטים על תפקוד החלבון ומבנה מסדר גבוה יותר (HOS) בסביבה התאית כדי להעמיק את ההבנה של המורכבות במתחמים גדולים יותר ותגובות אנזימטיות בתאים לעומת מערכות מטוהרות. כדי לעשות זאת, שיטה להדפסת רגל חלבון רדיקלית הידרוקסיל (HRFP) אומצה בשם בתא חמצון פוטוכימי מהיר של חלבונים (IC-FPOP). רוב מחקרי FPOP נעשו במבחנה במערכות חלבון טהורות יחסית, המנוגדות במידה ניכרת לסביבה המולקולרית הצפופה המשפיעה על אינטראקציות מחייבות ודינמיקה קונפורמציה של חלבונים. כתוצאה מכך, יש תהום בין הממצאים מניסויי במבחנה 18 לבין אלה שיושגו בסביבה תאית בפועל. כדי לגשר על הפער בין התנאים האידיאליים של ניסוי FPOP במבחנה לבין האופי המורכב של התא, פותחה פלטפורמת FPOP אוטומטית חדשה בת שש בארות בפלטפורמת cell-FPOP. טכנולוגיית FPOP חדשנית זו מסוגלת לזהות ולאפיין מינים מולקולריים אלה ולאתר את האינטראקציות המולקולריות הדינמיות שלהם במצבים בריאים וחולים כאחד. פלטפורמה חדשה זו נקראת חממת פלטפורמה עם שלב Movable XY (PIXY).
FPOP שימש בהצלחה כדי לאפיין את המידע המבני בתוך הפרוטום. עם זאת, לכל טכניקה ביולוגית יש מגבלות מסוימות הדורשות שיפור נוסף. ריאגנטים ספציפיים נדרשים במהלך פוטוליזה בלייזר כדי להרוות ביעילות רדיקלים הידרוקסיל unreacted. הפרדת פפטידים מתעכלים יכולה לדרוש כמויות גדולות של זמן כדי למקסם את המידע המבני. שפע זה של מידע יכול גם לדרוש כמותיות נרחבת במהלך ניתוח נתונים שלאחר MS1. חממת הפלטפורמה, כולל המכונות ההיקפיות הדרושות לתרבות התאים ו- IC-FPOP בפלטפורמת הלייזר, מגיעה עם עלות גדולה שעשויה שלא להיות אפשרית עבור מעבדות מסוימות. ככל שההתקדמות ממשיכה להתבצע, כלי תוכנה וניתוח חזקים צריכים לקדם את הטכניקה עוד יותר; חלקם מוצגים במחקר זה. מחקרים עדכניים באינקובטור פלטפורמה זה בוצעו על תאי HEK293T וב- C. elegans. שיטת IC-FPOP הוכח להיות תואם עם מגוון רחב של קווי תאים כולל השחלה אוגר סינית (CHO), Vero, MCF-7, ו MCF10-A תאים19. מכיוון ששיטת IC-FPOP הכללית ניתנת לתרגום לפלטפורמה סטטית זו, קווי תאים אלה צריכים להיות נוחים למחקר גם באמצעות PIXY.
IC-FPOP מנצל H2O 2 כדי לשנות חמצונישרשראות צד נגיש ממס של חומצות אמינו, ולאחר מכן להבחין עוד יותר אינטראקציות חלבון, מבנה, והשפעות מטבוליות בתוך תאים קיימא אשר משמעותי במתן הקשר ביולוגי. זה חיוני לפני ניסוי IC-FPOP כדי לאשר כי התאים הם קיימא לאחר H2O2 תוספת. מחקרי הכדאיות של התא הראו כי התאים היו קיימא בנוכחות ריכוזי H2O2 עד 200 מ"מ 13. חשוב גם לוודא H2O2 הוא חדורים בריכוז הסופי של 200 mM ישירות על תאים לאחר הסרת מדיה. כישלון להסיר לחלוטין את המדיה תרבות התא יגרום ריכוזים שונים של H2O2. בהשוואה לתנאים סטנדרטיים, הגדלת זמן הדגירה ל -10 שניות יחד עם הגדלת ריכוז H2O2 הוביל למספר גבוה יותר של חלבונים ששונו על ידי IC-FPOP באינקובטור הפלטפורמה. זה הכרחי כדי משאבות פרייסטליות הממשלה לפני השימוש כדי להבטיח משאבות פועלות כראוי נוזלים מפוזרים. כישלון לעשות זאת עלול לגרום בועות אוויר בצינורות, נפח מספיק של H2O2 כדי לטבול תאים, ו / או נפח מספיק של פתרון להרוות.
בעיה נוספת שעלולה להתעורר היא עיכובים לא רצויים במערכת. דוגמה לכך היא תהליך אימות הפקודות שהתקבלו עבור מערכות המשאבה אשר מוסיף עיכובים משמעותיים בסדר גודל של 1000 אלפיות שניה או יותר באמצעות תוכנת האינטגרציה. ניתן לתקן בעיה זו על ידי מזעור התקשורת עם המשאבות במהלך הניסוי ושימוש בפקודות מוגדרות מראש מראש ככל האפשר.
בעתיד, המטרה של PIXY היא לייצר מערכת אוטומטית ומשולבת לחלוטין. בנוסף למשאבות peristaltic, הפעלת פולס הלייזר יהיה אוטומטי. מערכת מיצוב חדשה תנוצל גם לתנועה מהירה של חממת הפלטפורמה כדי לשפר את המהירות והדיוק. כל רכיבי המערכת ימשיכו להיות מתוכנתים באמצעות תוכנת האינטגרציה כדי להגדיל עוד יותר את התפוקה.

טכניקות טביעת רגל של חלבונים יכולות לחשוף מידע מעמיק על ארגון החלבונים. טכניקות חיוניות אלה המבוססות על ביולוגיה מבנית MS הן מרכיב בארגז הכלים של ספקטרומטריית המסה. שיטות אלה בדיקה חלבון מבנה מסדר גבוה יותר (HOS) וסינרגיה באמצעות תיוג covalent1,2,3,4. חמצון פוטוכימי מהיר של חלבונים (FPOP) מעסיק רדיקלים הידרוקסיל כדי לשנות באופן חמצוני שרשראות צד נגיש ממס של חומצות אמינו5,6 (טבלה 1). השיטה משתמשת לייזר excimer ב 248 ננומטר עבור פוטוליזה של מי חמצן (H2O2) כדי ליצור רדיקלים הידרוקסיל. תיאורטית, 19 מתוך 20 חומצות האמינו ניתן לשנות באופן חמצוני עם גלי להיות היוצא מן הכלל הבודד. עם זאת, בשל שיעורי תגובתיות משתנים של חומצות אמינו עם רדיקלים hydroxyl, שינוי של רק תת קבוצה של אלה נצפתה באופן ניסיוני. עדיין, השיטה יש פוטנציאל לניתוח לאורך רצף חלבון5. FPOP משנה חלבונים בציר הזמן של מיקרו-שניות, מה שהופך אותו לשימושי בחקר אינטראקציות חלשות עם קצבי ניתוק מהירים. נגישות ממס משתנה על קשירה ליגנד או שינוי קונפורמציה חלבון, ולכן, כוחה של השיטה טמון בהשוואה של דפוס תיוג של חלבון במצבים מרובים (כלומר, ללא ליגנד בהשוואה ליגנד מאוגד). כתוצאה מכך, FPOP הצליחה לזהות אתרי אינטראקציה של חלבון-חלבון וחלבון-ליגנד ואזורים של שינוי קונפורמי7,8,9,10. שיטת FPOP הורחבה ממחקר של מערכות חלבון מטוהרות לניתוח תאים. FPOP בתא (IC-FPOP) יכול לשנות באופן חמצוני מעל אלף חלבונים בתאים כדי לספק מידע מבני על פני פרוטאום11,12. פלטפורמת IC-FPOP הקונבנציונלית משתמשת במערכת זרימה כדי לזרום תאים קובץ יחיד מעבר לקרן הלייזר. הפיתוח של מערכת זו אפשר לתאים בודדים יש חשיפה שווה הקרנת לייזר. זה הוביל לעלייה של פי 13 במספר החלבונים המסומנים בצורה חמצונית12. עם זאת, מגבלה של מערכת הזרימה היא אורך של ניסוי מדגם יחיד המורכב מרווח הקרנה של 10 דקות שבמהלכו מתרחש שינוי ומחזור שטיפה נוסף של 10 דקות. אילוצי הזמן של IC-FPOP הופכים אותו לבלתי מתאים לחקר ביניים מתקפלים של חלבונים קצרי מועד או לשינויים הקיימים בין רשתות אינטראקציה במפלים של איתות ביוכימי. מגבלה זמנית זו נתנה השראה לעיצוב פלטפורמת IC-FPOP חדשה המצוידת בתפוקה גבוהה יותר.
כדי למדוד במדויק מבנה חלבון בסדר גבוה יותר בסביבת התאים המקורית, העיצוב החדש מאפשר תרבית תאים להתבצע ישירות בפלטפורמת הלייזר, המאפשרת IC-FPOP להיות תפוקה גבוהה. התקנה זו מאפשרת גם הפרעה ממוזערת לסביבה הסלולרית, בניגוד ל- IC-FPOP באמצעות זרימה שבה יש להסיר תאים חסידים מהמצע. הפלטפורמה החדשה מאפשרת ל- IC-FPOP להתרחש במערכת דגירה סטרילית באמצעות CO2 ותא עליון שלב מבוקר טמפרטורה תוך שימוש באופטיקה מראה מוגדרת להנחיית קרן לייזר, מערכת מיקום עבור תנועת XY ומשאבות פריסטליות להחלפה כימית. הפלטפורמה החדשה לניהול IC-FPOP נקראת חממת פלטפורמה עם שלב XY נייד (PIXY) (איור 1). ב- PIXY, IC-FPOP מתבצע על תאים אנושיים הגדלים בלוחות שש בארות בתוך תא החממה של הפלטפורמה. עבור תצורה זו, קרן הלייזר משתקפת כלפי מטה אל הצלחת באמצעות מראות תואמות קרן כשלב מיקום המחזיק את החממה מועברת, במישור ה- XY, כך שקרן הלייזר מיושרת אסטרטגית להקרין רק באר אחת בכל פעם. מחקרי אימות מראים כי IC-FPOP יכול להתבצע מהר יותר ב- PIXY מאשר במערכת הזרימה ומוביל לשינויים מוגברים בחומצות אמינו לחלבון. הפיתוח של פלטפורמת IC-FPOP חדשה זו תסביר את הידע שניתן להשיג מניסויים סלולריים13.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ismatec Reglo ICC Peristaltic Pumps</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>122270050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Kinematic Mirror Mount for &#216;2&#34; Optics</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X trypsin&#8722;EDTA</td>
			<td>Corning</td>
			<td>AB00490-00005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50.0mm 248nm 45&#176;, Excimer Laser Line Mirror</td>
			<td>Edmond Optics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone, HPLC Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18 Trap Column, 100&#197;, 5 &#181;m, 180 &#181;m x 20 mm, 2G, V/M, 1/pkg</td>
			<td>Waters</td>
			<td>23275</td>
			<td>other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACQUITY UPLC M-Class System</td>
			<td>Waters</td>
			<td>A53225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Afinia H480 3D Printer</td>
			<td>(Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>air pump</td>
			<td>OKOlabs</td>
			<td>D12345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Foil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Stock #63-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua 5 &#181;m C18 125 &#197; packing material</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carbon dioxide unit</td>
			<td>OKOlabs</td>
			<td>MadMotor&#174;-UHV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>connectors (Y PP 1/16&#8221; and 1/16x1/8&#8221;)</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>116891000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate Task Wipers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>022625501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreiotol (DTT)</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO, Anhydrous</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LS118-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>SK-78001-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EX350 excimer laser</td>
			<td>GAM Laser</td>
			<td>PI89900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>SK-12023-78</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid, LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A929-4</td>
			<td>4 L quantity is not necessary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T cells</td>
			<td>Paul Shapiro Lab (University of Maryland Baltimore)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>humidifier</td>
			<td>OKOlabs</td>
			<td>Nano-LPMW stage</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HV3-2 VALVE</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>LS120-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide (IAA)</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LABVIEW Professional 2018</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>86728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MadMotor Positioning system and controllers</td>
			<td>Mad City Labs</td>
			<td>W6-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-213-100</td>
			<td>any brand is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>H301-T Unit-BL-PLUS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8242;-Dimethylthiourea (DMTU)</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanopositioinging stage</td>
			<td>Mad City Labs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-tert-Butyl-&#945;-phenylnitrone (PBN)</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OKO Touch Monitoring System</td>
			<td>OKOlabs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>7Z02936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE50-C pyroelectric energy meter</td>
			<td>Ophir Optronics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Trypsin Protease, MS Grade</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Universal Nuclease for Cell Lysis</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pressure gauge</td>
			<td>OKOlabs</td>
			<td>OKO-AIR-PUMP-BL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE filter</td>
			<td>OKOlabs</td>
			<td>CO2-UNIT-BL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Six 33 mm PLA filament rings</td>
			<td>(Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile incubator</td>
			<td>OKOlabs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>temperature unit</td>
			<td>OKOlabs</td>
			<td>OKO-TOUCH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A117-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TiNKERcad</td>
			<td>(Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H325-100</td>
			<td>any 30% hydrogen peroxide is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tubing (Tygon 3.18 and 1.59 ID)</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>177350250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A454SK-4</td>
			<td>4 L quantity is not necessary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>88702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>90058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>KM200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>186007496</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

platform incubator with movable xy stage: a new platform for implementing in-cell fast photochemical oxidation of proteins

חמצון פוטוכימי מהיר של חלבונים (FPOP) בשילוב עם ספקטרומטריית מסה (MS) הפך לכלי רב ערך בפרוטאומיקה מבנית כדי לחקור אינטראקציות חלבון, מבנה ודינמיקה קונפורמטיבית של חלבונים כפונקציה של נגישות ממס. בשנים האחרונות הורחב היקף ה-FPOP, טכניקה להדפסת רגלי חלבון רדיקלית הידרוקסיל (HRPF), לתיוג חלבונים בתרביות תאים חיים, המספקים את האמצעים לחקר אינטראקציות חלבון בסביבה התאית המפותלת. שינויים בחלבון בתא יכולים לספק תובנות לגבי שינויים מבניים הנגרמים על ידי ליגנד או שינויים קונפורמיים הנלווים להיווצרות קומפלקס חלבונים, הכל בהקשר התאי. טביעת רגל של חלבונים הושגה באמצעות מערכת מבוססת זרימה מקובלת לייזר 248 ננומטר KrF excimer להניב רדיקלים הידרוקסיל באמצעות פוטוליזה של מי חמצן, הדורש 20 דקות של ניתוח עבור מדגם תא אחד. כדי להקל על ניסויי FPOP שנפתרו בזמן, השימוש בפלטפורמת IC-FPOP חדשה המבוססת על 6 בארות היה חלוץ. במערכת הנוכחית, פולס לייזר יחיד מקרין באר שלמה אחת, אשר חותכת את מסגרת הזמן הניסיונית FPOP וכתוצאה מכך 20 שניות של זמן ניתוח, ירידה של פי 60. זמן ניתוח מופחת מאוד זה מאפשר לחקור מנגנונים תאיים כגון מפלים איתות ביוכימי, קיפול חלבונים, וניסויים דיפרנציאליים (כלומר, ללא סמים לעומת סמים מאוגדים) באופן תלוי זמן. מכשור חדש זה, שכותרתו חממת פלטפורמה עם שלב Movable XY (PIXY), מאפשר למשתמש לבצע תרבות תאים ו- IC-FPOP ישירות על הספסל האופטי באמצעות חממת פלטפורמה עם טמפרטורה, CO2 ובקרת לחות. הפלטפורמה כוללת גם שלב מיצוב, משאבות פריסטליות ואופטיקה מראה להנחיית קרן לייזר. תנאי IC-FPOP כגון תצורת אופטיקה, קצב זרימה, טרנזיט ארעי וריכוז H2O2 ב- PIXY עברו אופטימיזציה וסקרו עמיתים. אוטומציה של כל מרכיבי המערכת תפחית את המניפולציה האנושית ותגדיל את התפוקה.

כדי לאשר שתנאי החממה של הפלטפורמה מספיקים לתרבות התאים בפלטפורמת הלייזר, GCaMP2 הוחלף באופן ארעי לתוך HEK293T ויעילות ההעתקה לשני הלוחות הוערכה באמצעות הדמיית פלואורסצנטיות(איור 4A). GCaMP2 הוא חלבון פלואורסצנטי חישת סידן המשמש כחיווי סידן תאי מקודד גנטית. זהו היתוך של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) וחלבון מחייב סידן, calmodulin. בדיקת לוציפראז בוצעה בתאי HEK 293 עם פלסמיד פרל-TK על מנת לכמת יעילות של פליטת רוחב(איור 4B). תוצאות אלו מראות כי חממת הפלטפורמה חרגה מביצועי החממה הסטנדרטית, עם עלייה של פי 1.13 ביעילות ההעתקה, ומספקת אמת מידה כמותית לסביבת תרבות התאים האופטימלית.
שינויים ב-FPOP בתאי HEK293T המסומנים במערכת הזרימה הושוו לאלה שסומנו בחממת הפלטפורמה והראו כי חממת הפלטפורמה עולה על מערכת הזרימה הן במספר החלבונים ששונו (איור 5)והן בכיסוי FPOP הכולל בחלבונים אלה. מספר החלבונים ששונו על ידי FPOP שנרכשו בחממת הפלטפורמה היה כ-1051, פי 2.2 יותר מאלה שנרכשו בניסוי טיפוסי. שינויים שולבו בין שני משכפלים ביולוגיים עבור כל ניסוי. יתר על כן, PIXY מספק תפוקה גבוהה יותר.
כדי להדגים את היתרון של כיסוי שינוי גבוה יותר על פני חלבון, שינויים IC-FPOP היו מקומיים ברמת פפטיד ואת היקף השינוי היה לכמת להבחין הבדלים בתוצאות בין המערכות עבור actin, חלבון חומצת אמינו 375. במערכת הזרימה זוהו שני פפטידים ששונו, המספקים מידע מבני מוגבל (איור 6A). עם זאת, חמישה פפטידים מותאמים המשתרעים על רצף האקטין זוהו באינקובטור הפלטפורמה. ספקטרום מסה טנדם מצביע על כך שהשאריות Pro322 שונו וזוהו בכל ניסוי (איור 6B). חמשת הפפטידים ששונו בדגימות החממה הכילו 12 שאריות ששונו, בעוד שרק ארבע שאריות שונו באמצעות מערכת הזרימה (איור 6C). הגידול בכיסוי החמצון מספק מידע מבני רב יותר על פני החלבון.
אספינו ואח 'הדגימו את היכולת של FPOP להתבצע vivo (IV-FPOP) בתוך C. elegans, מודל תולעת למחלות אנושיות מדינות17. בעוד IV-FPOP מבוצע גם באמצעות מערכת זרימה, מערכת PIXY נבדקה לתאימות עם התולעים. כ-10,000 תולעים דגירו בכל באר באינקובטור הפלטפורמה ב-20 °C (LC-MS/MS) ניתוח גילה כי 792 חלבונים שונו על ידי IV-FPOP בחממת הפלטפורמה בהשוואה ל-545 החלבונים ששונו עם מערכת הזרימה (איור 7). תוצאות אלה מראות כי בנוסף לתרבות התאים הדו-מימדית, מתודולוגיה חדשה זו תואמת גם את המחקר של מערכות ביולוגיות אחרות כגון C. elegans.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62153/62153fig01.jpg"> איור 1. סכמטי של מערכת PIXY. רכיבי מערכת: (A) חממה שלב העליון, (B) מערכת מיקום , (C) משאבות peristaltic, ו - (D) קווי זלוף. מדיה תרבות התא מוסר מכל באר באמצעות משאבות לפני H2O2 ופתרונות להרוות הם חדורים בנקודות זמן מחושבות. שביל לייזר להקרנה לראווה בלבן. הודפס מחדש באישור ג'ונסון, ד.ט., פונשון-סמית', ב', אספינו, ג'יי.איי, גרשנסון, א', ג'ונס, ל.M,, הטמעת חמצון פוטוכימי מהיר בתא של חלבונים באינקובטור פלטפורמה עם שלב XY מטלטלין. כימיה אנליטית, 92(2), 1691-1696 2019. זכויות יוצרים 2020 האגודה האמריקנית לכימיה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62153/62153fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62153/62153fig02.jpg"> איור 2. מערכת PIXY מורכבת במלואה. (A) מערכת ניטור מגע, (B) יחידת פחמן דו חמצני, (C) יחידת טמפרטורה, (D) משאבת אוויר, (E) מפזר אדים, (F)מראות אופטיות, (G) חממת פלטפורמה, (H) שלב מיקום, (I) 248nm לייזר exrF excimer, ו - (J) משאבות פריסטאליות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62153/62153fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62153/62153fig03.jpg"> איור 3. אוטומציה של משאבות פריסטליות. (A) קובץ Script לדוגמה של פקודות ב- LABVIEW. אפשרויות הפקודה כוללות נפח, קצב זרימה, השהיות, כיוון זרימה. המהירות, מרחק הבמה והמיקום נמצאים כעת באוטומציה. (B) קורא תסריטים ב- LABVIEW. כאן, קבצי Script של פקודות מועלים לאחר מכן הפעל רצף ו- START לחוצים ליזום משאבות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62153/62153fig03large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62153/62153fig04.jpg"> איור 4. יעילות טרנס-פליטה של תא HEK. (A)עוצמת פלואורסצנט ממוצעת של השוואת החלקה GCaMP2 בין חממה סטנדרטית (Control) לבין חממה הבמה העליונה (PIXY). נקודות וריבועים מייצגים כל נקודה בבאר שבה ננקט מדד. (B)יעילות Transfection כמותי ומאומת עם פלסמיד וקטור שונה, pRL-TK. ערך P< 0.005. הודפס מחדש באישור ג'ונסון, ד.ט., פונשון-סמית', ב', אספינו, ג'יי.איי, גרשנסון, א', ג'ונס, ל.M,, הטמעת חמצון פוטוכימי מהיר בתא של חלבונים באינקובטור פלטפורמה עם שלב XY מטלטלין. כימיה אנליטית, 92(2), 1691-1696 2019. זכויות יוצרים 2020 האגודה האמריקנית לכימיה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62153/62153fig04large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62153/62153fig05.jpg"> איור 5. השוואה של חלבונים ששונו במערכת זרימת התא הבודד ו- PIXY. דיאגרמת Venn של חלבונים ששונו באמצעות במערכת הזרימה (סגול) וב- PIXY (ירוק). הודפס מחדש באישור ג'ונסון, ד.ט., פונשון-סמית', ב', אספינו, ג'יי.איי, גרשנסון, א', ג'ונס, ל.M,, הטמעת חמצון פוטוכימי מהיר בתא של חלבונים באינקובטור פלטפורמה עם שלב XY מטלטלין. כימיה אנליטית, 92(2), 1691-1696 2019. זכויות יוצרים 2020 האגודה האמריקנית לכימיה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62153/62153fig05large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62153/62153fig06.jpg"> איור 6. לוקליזציה של שינויי IC-FPOP. השוואה בין שינויים IC-FPOP בין מערכות. (A)גרף עמודות של פפטידים שעברו שינוי חמצוני בתוך אקטין ממערכת הזרימה (סגול) לעומת חממת פלטפורמה (ירוק). (B)טנדם MS ספקטרום של אקטין (פפטיד 316-326) עם פרולין שונה בשתי המערכות ואקטין פפטיד (C) FPOP שונה שאריות של אקטין (PDB: 6ZXJ, שרשרת A 11 שאריות שונה בחממת פלטפורמה (ירוק), 3 שאריות שונה במערכת הזרימה (סגול), 1 שאריות שונה חופפות (צהוב). הודפס מחדש באישור ג'ונסון, ד.ט., פונשון-סמית', ב', אספינו, ג'יי.איי, גרשנסון, א', ג'ונס, ל.M,, הטמעת חמצון פוטוכימי מהיר בתא של חלבונים באינקובטור פלטפורמה עם שלב XY מטלטלין. כימיה אנליטית, 92(2), 1691-1696 2019. זכויות יוצרים 2020 האגודה האמריקנית לכימיה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62153/62153fig06large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62153/62153fig07.jpg"> איור 7. השוואה של חלבונים ששונו על ידי FPOP ב- C. elegans לפי זרימה לעומת PIXY. יש עלייה של פי 1.5 בחלבונים שעברו שינוי חמצוני באמצעות PIXY בהשוואה למערכת הזרימה. הודפס מחדש באישור ג'ונסון, ד.ט., פונשון-סמית', ב', אספינו, ג'יי.איי, גרשנסון, א', ג'ונס, ל.M,, הטמעת חמצון פוטוכימי מהיר בתא של חלבונים באינקובטור פלטפורמה עם שלב XY מטלטלין. כימיה אנליטית, 92(2), 1691-1696 2019. זכויות יוצרים 2020 האגודה האמריקנית לכימיה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62153/62153fig07large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
שולחן 1. הפצת שינויים בזרימת עבודה ומשמרות בנפח גדול (Da). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62153/Table%201.docx" target="_blank"></a>

Watch this Scientific Journal Video about Platform Incubator with Movable XY Stage: A New Platform for Implementing In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins at JoVE.com

Platform Incubator with Movable XY Stage: A New Platform for Implementing In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

פלטפורמה סטטית חדשה משמשת לאפיון מבנה החלבון ואתרי האינטראקציה בסביבת התאים המקומית תוך שימוש בטכניקת טביעת רגל של חלבון הנקראת חמצון פוטוכימי מהיר בתא של חלבונים (IC-FPOP).

חממת פלטפורמה עם שלב Movable XY: פלטפורמה חדשה ליישום חמצון פוטוכימי מהיר בתא של חלבונים

Fast Photochemical Oxidation of proteins (FPOP) coupled with mass spectrometry (MS) has become an invaluable tool in structural proteomics to interrogate ...

שיטה זו מספקת פתרונות לשאלות הביולוגיות התובעניות של ימינו. מניסוי FPOP בתא, אנו יכולים לחקור אינטראקציות חלבון-ליגנד, אתרי אינטראקציה בין חלבונים לחלבון ואזורים של שינוי קונפורמי. היתרון של טכנולוגיה זו הוא השימוש בפלטפורמת IC-FPOP אוטומטית מבוססת שש בארות המאפשרת לגדל תאים ולבצע מחקרי FPOP בתאים ממש בלייזר.שיטה זו יכולה לשמש בתעשיות התרופות והביוטכנולוגיה, כמו גם במכוני מחקר אקדמיים וקליניים גדולים, במיוחד על ידי חוקרים ביולוגיים באוניברסיטאות החוקרות דינמיקה של חלבונים. כדי להתחיל, פתח את חממת האסדה משלב המיקום ונתק את קווי הטמפרטורה, הגז ומכשיר האדים. מרססים את האינקובטור ב-70% אתנול ומניחים אותו במכסה המנוע של תרבות התאים.הסר את צלחת שש באר מן החממה פלטפורמה, לאבטח את המכסה המקורי של הצלחת, ולאשר מפגש התא באמצעות מיקרוסקופ, ולאחר מכן למקם את צלחת שש באר עם תאים confluent בחזרה באינקובטור פלטפורמה בתוך מכסה המנוע תרבות התא. הכנס שלושה צינורות Tygon לחתוך מראש בכל באר דרך היציאות מוטבע על ידי שטיפת הצינורות אל קירות הבאר ולאבטח אותם עם טבעות מודפסות 3D מותאם אישית. הכן סקריפט תוכנת אינטגרציה לנסיגת משאבה.השתמש במשאבה פריסטלית אחת כדי להסיר לחלוטין את מדיית התא מכל שש הבארות. ממיסים ראשוניים בכל ערוץ של שלוש המשאבות הפריאסטליות האחרות, ואז להחדיר מי חמצן ומאגר Quench בצינורות לסירוגין שלהם בהתאמה עד ריאגנטים להגיע ליציאות האינקובטור. ודא שקרן הלייזר זוויתית כראוי ומגיעה לאינקובטור ללא מעצורים.בדוק אנרגיית לייזר באמצעות חיישן חיצוני. הכינו את סקריפט תוכנת האינטגרציה לעירוי משאבה לאחר אישור יישור הקרן. להחדיר 200 מי חמצן מילימולארי ב 35 מיליליטר לדקה לתוך הבאר הראשונה.לחץ על לחצן 'התחל' בתוכנת הלייזר בסימן חמש השניות כדי להפעיל את הדופק בסימן 11 השניות על שעון העצר. להחדיר 125 מילימולאר Quench פתרון ב 35 מיליליטר לדקה לתוך הבאר הראשונה מיד לאחר פולס לייזר. הזז ידנית את שלב המיקום כדי ליישר את הבאר הבאה עם קרן הלייזר ולחזור על התהליך עבור כל הבארות.במכסה המנוע של תרבות התא, השתמש במגרד תאים כדי להעביר את התאים מכל באר לצינורות חרוטים בודדים של 15 מיליליטר. תאי צנטריפוגה ב 1, 200 פעמים G במשך חמש דקות. השלך את supernatant ו resuspend התאים ב 100 microliters של מאגר תמוגה RIPA.להעביר תאים בודדים 1.2 מיליליטר פוליפרופילן צינורות. פלאש להקפיא את כל הדגימות חנקן נוזלי ומניחים אותם במקפיא מינוס 80 מעלות עד השימוש. כדי להתאים שינויים FPOP, לנתח את lysate התא מתעכל באמצעות ניתוח ספקטרומטריית מסה טנדם כרומטוגרפיה נוזלית, ולאחר מכן לחשב את היקף השינוי.כדי לאשר שתנאי החממה של הפלטפורמה מספיקים לתרבות התאים בפלטפורמת הלייזר, GCaMP2 הוחלף באופן ארעי לתוך HEK293T ויעילות transfection עבור שני הלוחות הוערכה באמצעות הדמיה פלואורסצנטית. בוצעה בדיקת לוציפראז לכמות יעילות ההעתקה. שינויים FPOP בתאי HEK293T שכותרתו במערכת הזרימה הושוו לאלה המסומנים בחממה פלטפורמה.חממת הפלטפורמה עלתה על מערכת הזרימה הן במספר החלבונים ששונו והן בכיסוי FPOP הכולל בחלבונים אלה. במערכת הזרימה זוהו שני פפטידים ששונו, המספקים מידע מבני מוגבל. עם זאת, חמישה פפטידים מותאמים המשתרעים על רצף האקטין זוהו באינקובטור הפלטפורמה.ספקטרום טנדם MS של actin עם פרולין שונה בשתי המערכות ופפטיד actin ללא שינוי מוצגים כאן. שאריות FPOP ששונו בדגימות החממה של הפלטפורמה הכילו 12 שאריות ששונו, שלוש שאריות ששונו במערכת הזרימה ושאריות שונה חופפות. ניתוח LC-MS MS גילה כי 792 חלבונים שונו על ידי in vivo FPOP בחממת הפלטפורמה בהשוואה ל-545 החלבונים ששונו עם מערכת הזרימה.זה הכרחי כדי לשמור על תאים בתנאים סטריליים. תמיד להביא את החממה פלטפורמה לתוך מכסה המנוע תרבות התא סטרילי להכניס את כל צלחות שש באר הדרושים, צינורות, וטבעות. זה מבטיח את שלמות הניסוי.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Fabricating a UV-Vis and Raman Spectroscopy Immunoassay Platform

בודה UV-Vis ראמאן ספקטרוסקופיה פלטפורמת Immunoassay

Immunoassays are used to detect proteins based on the presence of associated antibodies. Because of their extensive use in research and clinical settings, ...

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

חלבון הסרט אינפרא-אדום אלקטרוכימיה שהפגינו למחקר של H2 חמצון Hydrogenase [ניפה]

Understanding the chemistry of redox proteins demands methods that provide precise control over redox centers within the protein. The technique of protein ...

Multiplexed Isothermal Amplification Based Diagnostic Platform to Detect Zika, Chikungunya, and Dengue 1

הגברה איזותרמי מרובבת מבוסס פלטפורמת אבחון לאיתור Zika Chikungunya, קדחת דנגה 1

Zika, dengue, and chikungunya viruses are transmitted by mosquitoes, causing diseases with similar patient symptoms. However, they have different ...

A Rat Methyl-Seq Platform to Identify Epigenetic Changes Associated with Stress Exposure

פלטפורמה מתיל-Seq חולדה כדי לזהות שינויים Epigenetic הקשורים בחשיפה מתח

As genomes of a wider variety of animals become available, there is an increasing need for tools that can capture dynamic epigenetic changes in these ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

השימוש פיוז'ן רקומביננטי חלבונים פלטפורמה Assay פרוטאז פלורסנט, Renaturation שלהם בג'ל

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

מדידת אינטראקציות בין הפלורסנט לליגנין בסעיפים צמחיים על ידי sFLIM בהתבסס על מבוסס על קרינה פלואורסצנטית מקורית

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...

Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

אפיון חלבונים סלולריים עם החמצון בתוך תא מהיר לפוטוכימיקלים של חלבונים

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting method used to characterize protein structure and interactions. ...

A Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS) Platform for Investigating Peptide Biosynthetic Enzymes

A Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry HDX-MS Platform for Investigating Peptide Biosynthetic Enzymes

פלטפורמת ספקטרומטריית מסה של חילופי מימן-דיטריום (HDX-MS) לבדיקת אנזימים ביוסינתטיים פפטיד

Hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) is a powerful method for the biophysical characterization of enzyme conformational changes and ...

Spectrophotometric Screening for Potential Inhibitors of Cytosolic Glutathione S-Transferases

הקרנה ספקטרופוטומטרית עבור מעכבים פוטנציאליים של גלוטתיון ציטוסולי S-Transferases

Glutathione S-transferases (GSTs) are metabolic enzymes responsible for the elimination of endogenous or exogenous electrophilic compounds by glutathione ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support