Name: platform incubator with movable xy stage: a new platform for implementing in-cell fast photochemical oxidation of proteins
Uploaded: 2021-05-17T13:30:00
Duration: 5 min 50 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Platform Incubator with Movable XY Stage: A New Platform for Implementing In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins at JoVE.com

この作業は、NIH R01 GM128983-01からの助成金によって支えられた。

<ol>
	<li>Johnson, D. T., Di Stefano, L. H., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+photochemical+oxidation+of+proteins+(FPOP):+A+powerful+mass+spectrometry+based+structural+proteomics+tool.">Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP): A powerful mass spectrometry based structural proteomics tool.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (32), 11969-11979 (2019).</li><li>Liu, X. R., Zhang, M. M., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Spectrometry-Based+Protein+Footprinting+for+Higher-Order+Structure+Analysis:+Fundamentals+and+Applications.">Mass Spectrometry-Based Protein Footprinting for Higher-Order Structure Analysis: Fundamentals and Applications.</a> Chemical Reviews. 120 (10), 4355-4454 (2019).</li><li>Li, J., Chen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+fast+photochemical+oxidation+of+proteins+coupled+with+mass+spectrometry+in+protein+therapeutics+discovery+and+development.">The use of fast photochemical oxidation of proteins coupled with mass spectrometry in protein therapeutics discovery and development.</a> Drug Discovery Today. 24 (3), 829-883 (2019).</li><li>Zhao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Covalent+Labeling+with+an+&#945;,&#946;-Unsaturated+Carbonyl+Scaffold+for+Studying+Protein+Structure+and+Interactions+by+Mass+Spectrometry.">Covalent Labeling with an &#945;,&#946;-Unsaturated Carbonyl Scaffold for Studying Protein Structure and Interactions by Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 92 (9), 6637-6644 (2020).</li><li>Hambly, D. M., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Flash+Photolysis+of+Hydrogen+Peroxide+to+Oxidize+Protein+Solvent-Accessible+Residues+on+the+Microsecond+Timescale.">Laser Flash Photolysis of Hydrogen Peroxide to Oxidize Protein Solvent-Accessible Residues on the Microsecond Timescale.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 16 (12), 2057-2063 (2005).</li><li>Li, K. S., Shi, L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Spectrometry-Based+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+(FPOP)+for+Higher+Order+Structure+Characterization.">Mass Spectrometry-Based Fast Photochemical Oxidation of Proteins (FPOP) for Higher Order Structure Characterization.</a> Accounts of Chemical Research. 51 (3), 736-744 (2018).</li><li>Chea, E. E., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modifications+generated+by+fast+photochemical+oxidation+of+proteins+reflect+the+native+conformations+of+proteins.">Modifications generated by fast photochemical oxidation of proteins reflect the native conformations of proteins.</a> Protein Science. 27 (6), 1047-1056 (2018).</li><li>Hambly, D., Gross, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+flash+photochemical+oxidation+to+locate+heme+binding+and+conformational+changes+in+myoglobin.">Laser flash photochemical oxidation to locate heme binding and conformational changes in myoglobin.</a> International Journal of Mass Spectrometry. 259 (1), 124-129 (2007).</li><li>Yan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+photochemical+oxidation+of+proteins+(FPOP)+maps+the+epitope+of+EGFR+binding+to+adnectin.">Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) maps the epitope of EGFR binding to adnectin.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 25 (12), 2084-2092 (2014).</li><li>Zhang, Y., Wecksler, A. T., Molina, P., Deperalta, G., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+Binding+Interface+of+VEGF+and+a+Monoclonal+Antibody+Fab-1+Fragment+with+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+(FPOP)+and+Mass+Spectrometry.">Mapping the Binding Interface of VEGF and a Monoclonal Antibody Fab-1 Fragment with Fast Photochemical Oxidation of Proteins (FPOP) and Mass Spectrometry.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 28 (5), 850-858 (2017).</li><li>Espino, J. A., Mali, V. S., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Cell+Footprinting+Coupled+with+Mass+Spectrometry+for+the+Structural+Analysis+of+Proteins+in+Live+Cells.">In Cell Footprinting Coupled with Mass Spectrometry for the Structural Analysis of Proteins in Live Cells.</a> Analytical Chemistry. 87 (15), 7971-7978 (2015).</li><li>Rinas, A., Mali, V. S., Espino, J. A., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Microflow+System+for+In-Cell+Footprinting+Coupled+with+Mass+Spectrometry.">Development of a Microflow System for In-Cell Footprinting Coupled with Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 88 (20), 10052-10058 (2016).</li><li>Johnson, D. T., Punshon-Smith, B., Espino, J. A., Gershenson, A., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementing+In-Cell+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+in+a+Platform+Incubator+with+a+Movable+XY+Stage.">Implementing In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins in a Platform Incubator with a Movable XY Stage.</a> Analytical Chemistry. 92 (2), 1691-1696 (2019).</li><li>Bangel-Ruland, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator-mRNA+delivery:+a+novel+alternative+for+cystic+fibrosis+gene+therapy.">Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator-mRNA delivery: a novel alternative for cystic fibrosis gene therapy.</a> The Journal of Gene Medicine. 15 (11-12), 414-426 (2013).</li><li>Gau, B. C., Chen, H., Zhang, Y., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sulfate+Radical+Anion+as+a+New+Reagent+for+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins.">Sulfate Radical Anion as a New Reagent for Fast Photochemical Oxidation of Proteins.</a> Analytical Chemistry. 82 (18), 7821-7827 (2010).</li><li>Xu, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroxyl+Radical-Mediated+Modification+of+Proteins+as+Probes+for+StructuralProteomics.">Hydroxyl Radical-Mediated Modification of Proteins as Probes for StructuralProteomics.</a> Chemical Reviews. American Chemical Society. 107 (8), 3514-3543 (2007).</li><li>Espino, J. A., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+Biological+Interactions+with+In+Vivo+Protein+Footprinting.">Illuminating Biological Interactions with In Vivo Protein Footprinting.</a> Analytical Chemistry. 9 (10), 6577-6584 (2019).</li><li>Gau, B. C., Sharp, J. S., Rempel, D. L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Photochemical+Oxidation+of+Protein+Footprints+Faster+than+Protein+Unfolding.">Fast Photochemical Oxidation of Protein Footprints Faster than Protein Unfolding.</a> Analytical Chemistry. 81 (16), 6563-6571 (2009).</li><li>Kaur, U., Johnson, D. T., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+the+Applicability+of+In-Cell+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+across+Multiple+Eukaryotic+Cell+Lines.">Validation of the Applicability of In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins across Multiple Eukaryotic Cell Lines.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (7), 1372-1379 (2020).</li></ol>

著者らは、競合する金銭的利益を宣言しない。 本明細書に示される研究は、以下の参照される特許出願に関連しています: 米国非仮特許出願件数:17/042,565 タイトル:「タンパク質フォールディングを決定するためのデバイスと方法」 UMB ドケット番号: LJ-2018-104 UMass Ref: UMA 18-059.

タンパク質は生きている細胞で仕事の多くを行います。この重要性を考えると、細胞環境におけるタンパク質機能および高次構造(HOS)に関する詳細なデータは、精製システムとは対照的に、細胞内のより大きな複合体および酵素反応における複雑さの理解を深めるために必要である。これを行うために、ヒドロキシルラジカルプロテインフットプリンティング(HRFP)法を採用し、タンパク質の高速光化学酸化(IC-FPOP)と題した。ほとんどのFPOP研究は、結合相互作用およびタンパク質立体構造ダイナミクスに影響を与える混雑した分子環境とは対照的な比較的純粋なタンパク質系 でインビトロで 行われてきた。その結果、 インビトロ 実験18 からの知見と実際の細胞環境で得られるものとの間に、シスムがある。 インビトロ FPOP実験の理想化された条件と細胞の複雑な性質との間のギャップを埋めるために、セルFPOPプラットフォームで新しい自動化された6ウェルプレートベースのギャップが開発されました。この新しいFPOP技術は、これらの分子種を同定し、特徴付け、健康な状態と病気の両方の状態でそれらの動的分子相互作用をトレースすることができる。この新しいプラットフォームは、移動可能 XY ステージ(PIXY)を備えたプラットフォームインキュベーターと呼ばれています。
FPOPは、プロテオーム内の構造情報の特徴付けに成功しました。しかし、すべての生物学的手法には、さらなる改善が必要な特定の制限があります。レーザー光分解時に、かつ、未反応のヒドロキシルラジカルを効率的に焼入れさせるために、特定の試薬が必要です。消化されたペプチドの分離は、構造情報を最大化するために多くの時間を必要とします。この豊富な情報は、MS後のデータ分析1の間に、大量の定量化を必要とすることもできます。レーザープラットフォームでの細胞培養やIC-FPOPに必要な周辺機械を含むプラットフォームインキュベーターには、一部のラボでは実現不可能な大きなコストが付属しています。進歩が続く中、堅牢なソフトウェアおよび分析ツールは、この技術をさらに進める必要があります。その一部は、この研究で紹介されています。このプラットフォームインキュベーターの現在の研究は、HEK293T細胞および C.エレガンスで行われている。このIC-FPOP法は、中国のハムスター卵巣(CHO)、ベロ、MCF-7、およびMCF10-A細胞19を含む多種多様な細胞株との相性が示されている。一般的なIC-FPOP法はこの静的プラットフォームに翻訳可能であるため、これらの細胞株はPIXYを用いた研究にも適しているはずです。
IC-FPOPは、H2O2を利用して、アミノ酸のアクセス可能な側鎖の溶媒を酸化的に修飾し、生物学的文脈を提供する上で有意である生存細胞内のタンパク質相互作用、構造、代謝効果をさらに識別する。H2O2添加後に細胞が生存可能であることを確認することは、IC-FPOP実験の前に不可欠である。細胞生存率試験は、細胞が200 mM 13までのH2O2濃度の存在下で生存可能であることを実証した。また、培地を取り除いた後、H2O2を細胞に直接200 mMの最終濃度で注入することも重要です。細胞培養培地を完全に除去しないと、H2O2の濃度が変化する。標準的な条件と比較して、H2O2濃度を増加させるとともにインキュベーション時間を10秒に増加させることで、プラットフォームインキュベーター内のIC-FPOPによってより多くのタンパク質が修飾された。ポンプが正常に動作し、液体が分散されていることを確認するために使用する前に蠕動ポンプをプライムすることが不可欠です。これを怠ると、チューブ内の気泡、細胞を浸漬するH2O2のボリュームが不十分、および/またはクエンチ溶液の量が不足する可能性があります。
発生する可能性のある別の問題は、システムの不要な遅延です。この例は、統合ソフトウェアを使用して 1000 ミリ秒以上の大きな遅延を追加するポンプ システムの受信コマンドを検証するプロセスです。この問題は、実験中にポンプとの通信を最小限に抑え、事前に設定されたコマンドをできるだけ早く使用することで解決できます。
今後、PIXY の目標は、完全に自動化された統合システムを生産することです。蠕動ポンプに加えて、レーザーパルスのトリガーは自動化される。また、プラットフォームインキュベーターの迅速な移動に新しい測位システムを利用して、速度と精度を向上させます。システムのすべてのコンポーネントは、スループットをさらに向上させるために統合ソフトウェアを使用してプログラムされ続けます。

タンパク質のフットプリント技術は、タンパク質の組織に関する深遠な情報を明らかにすることができます。これらの必須の構造生物学MSベースの技術は、質量分析ツールの構成要素である。これらの方法は、タンパク質高次構造(HOS)と共有標識1、2、3、4を介して相乗効果をプローブする。タンパク質の高速光化学酸化(FPOP)は、アミノ酸の可溶性側鎖の溶媒を酸化的に修飾するヒドロキシルラジカルを採用している5,6(表1)。この方法は、過酸化水素(H2O2)の光分解のために248nmでエキシマレーザーを利用してヒドロキシルラジカルを生成する。理論的には、20個のアミノ酸のうち19個は、Glyが唯一の例外である酸化的に変えることができる。しかしながら、ヒドロキシルラジカルを用いたアミノ酸の反応速度が変化するため、これらのサブセットのみの改変が実験的に観察されている。それでも、この方法はタンパク質配列5の長さにわたって分析する可能性を秘めている。FPOPはマイクロ秒のタイムスケールでタンパク質を変更し、高速オフレートで弱い相互作用を研究するのに役立ちます。リガンド結合またはタンパク質の立体構造の変化に伴う溶媒のアクセシビリティ変化は、したがって、この方法の力は、タンパク質の標識パターンを複数の状態(すなわち、リガンド結合と比較して自由なリガンド)の比較にある。その結果、FPOPは、タンパク質とタンパク質-リガンド相互作用部位および立体構造変化の領域7、8、9、10の同定に成功している。FPOP法は、精製タンパク質システムの研究から細胞内分析まで拡張されています。細胞内FPOP(IC-FPOP)は、1000以上のタンパク質を酸化的に改変して、プロテオーム11、12の構造情報を提供することができる。従来のIC-FPOPプラットフォームは、レーザービームを越えて単一ファイルを流れるフローシステムを利用しています。このシステムの開発により、個々の細胞はレーザー照射に等しく曝露することができました。これにより、酸化標識タンパク質12の数が13倍に増加した。しかし、流れシステムの制限は、改変が行われる10分間の照射間隔と追加の10分の洗浄サイクルからなる単一のサンプル実験の長さである。IC-FPOPの時間的制約は、生化学的シグナル伝達カスケードにおける相互作用ネットワーク間に存在する短命タンパク質折りたたみ中間体または変化を研究するのに適さない。この時間的な制限は、より高いスループットを備えた新しいIC-FPOPプラットフォームの設計に影響を与えました。
天然細胞環境におけるタンパク質の高次構造を正確に測定するために、新しい設計により、細胞培養をレーザープラットフォームで直接行うことができるため、IC-FPOPは高スループットになります。この設定はまた、接着細胞を基質から除去しなければならない流れを用いたIC-FPOPとは対照的に、細胞環境への最小の摂動を可能にする。新しいプラットホームはレーザービーム指導のための構成されたミラー光学、XY運動のための位置付けシステム、および化学交換のための蠕動ポンプを利用している間、CO2 および温度制御された段階の最室を使用して無菌のインキュベーションシステムでIC-FPOPを起こすことを可能にする。IC-FPOP を実施するための新しいプラットフォームは、可動 XY ステージ (PIXY) を持つプラットフォームインキュベーター (図 1)と題されています。PIXYでは、IC-FPOPは、プラットフォームインキュベーターチャンバー内の6ウェルプレートで成長したヒト細胞に対して行われます。この構成では、XY平面内でインキュベーターを保持する位置決め段階としてビーム適合ミラーを使用して、レーザービームをプレートに下方に反射するので、レーザービームは一度に1つの井戸のみを照射するように戦略的に整列します。検証研究は、IC-FPOPがフローシステムよりもPIXYで速く行われ、タンパク質あたりのアミノ酸修飾の増加につながることを示しています。この新しいIC-FPOPプラットフォームの開発は、細胞実験13から得ることができる知識を説明します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ismatec Reglo ICC Peristaltic Pumps</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>122270050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Kinematic Mirror Mount for &#216;2&#34; Optics</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X trypsin&#8722;EDTA</td>
			<td>Corning</td>
			<td>AB00490-00005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50.0mm 248nm 45&#176;, Excimer Laser Line Mirror</td>
			<td>Edmond Optics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone, HPLC Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18 Trap Column, 100&#197;, 5 &#181;m, 180 &#181;m x 20 mm, 2G, V/M, 1/pkg</td>
			<td>Waters</td>
			<td>23275</td>
			<td>other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACQUITY UPLC M-Class System</td>
			<td>Waters</td>
			<td>A53225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Afinia H480 3D Printer</td>
			<td>(Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>air pump</td>
			<td>OKOlabs</td>
			<td>D12345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Foil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Stock #63-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua 5 &#181;m C18 125 &#197; packing material</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carbon dioxide unit</td>
			<td>OKOlabs</td>
			<td>MadMotor&#174;-UHV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>connectors (Y PP 1/16&#8221; and 1/16x1/8&#8221;)</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>116891000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate Task Wipers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>022625501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreiotol (DTT)</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO, Anhydrous</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LS118-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>SK-78001-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EX350 excimer laser</td>
			<td>GAM Laser</td>
			<td>PI89900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>SK-12023-78</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid, LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A929-4</td>
			<td>4 L quantity is not necessary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T cells</td>
			<td>Paul Shapiro Lab (University of Maryland Baltimore)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>humidifier</td>
			<td>OKOlabs</td>
			<td>Nano-LPMW stage</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HV3-2 VALVE</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>LS120-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide (IAA)</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LABVIEW Professional 2018</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>86728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MadMotor Positioning system and controllers</td>
			<td>Mad City Labs</td>
			<td>W6-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-213-100</td>
			<td>any brand is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>H301-T Unit-BL-PLUS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8242;-Dimethylthiourea (DMTU)</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanopositioinging stage</td>
			<td>Mad City Labs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-tert-Butyl-&#945;-phenylnitrone (PBN)</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OKO Touch Monitoring System</td>
			<td>OKOlabs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>7Z02936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE50-C pyroelectric energy meter</td>
			<td>Ophir Optronics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Trypsin Protease, MS Grade</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Universal Nuclease for Cell Lysis</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pressure gauge</td>
			<td>OKOlabs</td>
			<td>OKO-AIR-PUMP-BL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE filter</td>
			<td>OKOlabs</td>
			<td>CO2-UNIT-BL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Six 33 mm PLA filament rings</td>
			<td>(Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile incubator</td>
			<td>OKOlabs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>temperature unit</td>
			<td>OKOlabs</td>
			<td>OKO-TOUCH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A117-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TiNKERcad</td>
			<td>(Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H325-100</td>
			<td>any 30% hydrogen peroxide is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tubing (Tygon 3.18 and 1.59 ID)</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>177350250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A454SK-4</td>
			<td>4 L quantity is not necessary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>88702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>90058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>KM200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>186007496</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

platform incubator with movable xy stage: a new platform for implementing in-cell fast photochemical oxidation of proteins

タンパク質の高速光化学酸化(FPOP)と質量分析(MS)を組み合わせることで、タンパク質相互作用、構造、タンパク質の立体構造ダイナミクスを溶媒のアクセシビリティの関数として問い合わせる構造プロテオミクスにおいて非常に貴重なツールとなっています。近年、FPOPの範囲は、ヒドロキシルラジカルプロテインフットプリンティング(HRPF)技術であり、生細胞培養におけるタンパク質標識に拡大され、複雑な細胞環境におけるタンパク質相互作用を研究する手段を提供している。細胞内タンパク質修飾は、細胞内の全てのタンパク質複合体形成に伴うリガンド誘導構造変化または構造変化に関する洞察を提供することができる。タンパク質のフットプリントは、通常のフローベースのシステムと248 nmのKrFエキシマーレーザーを採用して過酸化水素の光分解を介してヒドロキシルラジカルを得るために達成されており、1つの細胞サンプルに対して20分間の分析が必要です。時間分解FPOP実験を容易にするために、新しい6ウェルプレートベースのIC-FPOPプラットフォームの使用が開拓されました。現在のシステムでは、単一のレーザーパルスがウェル全体を1回照射し、FPOP実験時間枠を切り捨て、20秒の分析時間を生じ、60倍の減少を示します。この解析時間が大幅に短縮され、生化学的シグナル伝達カスケード、タンパク質フォールディング、および差動実験(薬物を含まない、薬物に結合した)などの細胞機構を時間依存的に研究することが可能です。この新しい計器は、可動XYステージ(PIXY)を備えたプラットフォームインキュベーターと題され、温度、CO2 および湿度制御を備えたプラットフォームインキュベーターを使用して光学ベンチで直接細胞培養およびIC-FPOPを実行することを可能にします。プラットフォームには、レーザービームガイダンス用の位置決め段階、蠕動ポンプ、ミラー光学装置も含まれています。PIXY における光学構成、流量、過渡性トランスフェクション、および H2O2 濃度などの IC-FPOP 条件が最適化され、査読されています。システムのすべてのコンポーネントを自動化すると、人間の操作が減少し、スループットが向上します。

プラットフォームインキュベーター条件がレーザープラットフォームでの細胞培養に十分であることを確認するために、GCaMP2はHEK293Tに一過性トランスフェクションし、両方のプレートのトランスフェクション効率を蛍光イメージングを介して評価した(図4A)。GCaMP2は、遺伝的にコード化された細胞内カルシウム指標として使用されるカルシウムセンシング蛍光タンパク質である。緑色蛍光タンパク質(GFP)とカルシウム結合タンパク質、カルモジュリンの融合です。トランスフェクション効率を定量化するためにプラスミドprl-TKをトランスフェクトしたHEK 293細胞に対してルシファーゼアッセイを行った(図4B)。これらの結果は、プラットフォームインキュベーターが標準的なインキュベーターの性能を超え、トランスフェクション効率が1.13倍向上し、最適な細胞培養環境の定量的ベンチマークを提供したことを示している。
フローシステムで標識されたHEK293T細胞におけるFPOP修飾を、プラットフォームインキュベーターで標識されたものと比較し、プラットフォームインキュベーターが、改変されたタンパク質の数およびそれらのタンパク質におけるFPOP総被覆率の両方においてフローシステムを上回ることを示した。プラットフォームインキュベーターで獲得したFPOP改変タンパク質の数は、一般的な実験で得られたタンパク質よりも約1051、2.2倍多かった。各実験について2つの生物学的複製の間で改変を組み合わせた。さらに、PIXY は高いスループットを提供します。
タンパク質全体でより高い修飾カバレッジの利点を実証するために、IC-FPOP修飾はペプチドレベルに局在し、修飾の程度を定量化してアクチンの系間の結果の違いを区別した、375アミノ酸タンパク質である。フローシステムでは、2つの修飾ペプチドが検出され、限られた構造情報を提供した(図6A)。しかし、アクチン配列にまたがる5個の改変ペプチドがプラットフォームインキュベーターで検出された。タンデム質量スペクトルは、各実験で残留物Pro322が改変され、検出されたことを示す(図6B)。プラットフォームインキュベーターサンプルで改変された5つのペプチドには12個の改変残基が含まれ、フローシステムで改変された残基は4個のみであった(図6C)。酸化カバレッジの増加は、タンパク質全体のより多くの構造情報を提供します。
Espinoら. 生体 内で 行われるFPOPの能力を実証した (IV-FPOP) C. エレガンス, ヒト疾患状態のワームモデル17.IV-FPOPはフローシステムを介して実行されますが、PIXYシステムはワームとの互換性についてテストされました。LC-MS/MS分析では、プラットフォームインキュベーターの各井戸に約10,000個のワームがインキュベートされ、792個のタンパク質がフローシステムで改変された545個のタンパク質と比較して、プラットフォームインキュベーター内のIV-FPOPによって改変されたことが明らかになった(図7)。これらの結果は、2D細胞培養に加えて、この新しい方法論が C.エレガンスのような他の生物学的システムの研究とまた互換性があることを示している。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62153/62153fig01.jpg"> 図 1.PIXYシステムの概略図。システムコンポーネント: (A) ステージトップインキュベーター, (B) ポジショニングシステム , (C) 蠕動ポンプ, (D) 灌流ライン.細胞培養培地は、H2O2の前にポンプを介して各ウェルから除去され、クエンチ溶液は計算されたタイムポイントで注入される。白色で示される照射のためのレーザー経路。ジョンソン、D.T.、パンションスミス、B.、エスピーノ、J.A.、ゲルシェンソン、A.、ジョーンズ、L.M.、可動XYステージを有するプラットフォームインキュベーターでタンパク質の細胞内高速光化学酸化を実施する。分析化学, 92(2), 1691-1696 2019.著作権 2020 アメリカ化学会.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62153/62153fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62153/62153fig02.jpg"> 図 2.完全に組み立てられたPIXYシステム。(A)タッチ監視システム、( B)炭酸ガスユニット、(C)温度単位、(D)空気ポンプ、(E)加湿器、(F)光学ミラー、(G)プラットフォームインキュベーター、(H)ポジショニングステージ、(I)248nm KrF励起剤レーザー、及び(J)の蠕動ポンプ。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62153/62153fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62153/62153fig03.jpg"> 図 3.蠕動ポンプの自動化。 (A) LABVIEWのコマンドスクリプトの例。コマンドオプションには、ボリューム、流量、一時停止、流れ方向があります。スピード、ステージの距離、位置は現在自動化されています。(B) LABVIEWのスクリプトリーダー。ここでは、コマンド スクリプトがアップロードされ、その後、Run Sequence と START が押されてポンプが開始されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62153/62153fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62153/62153fig04.jpg"> 図 4.HEK細胞トランスフェクション効率。(A)標準インキュベーター(コントロール)とステージトップインキュベーター(PIXY)の間のGCaMP2トランスフェクション比較の平均蛍光強度。ドットと四角形は、メジャーが取られた井戸の各点を表します。(B)異なるベクタープラスミド pRL-TK で定量し、検証されたトランスフェクション効率。p値<0.005。ジョンソン、D.T.、パンションスミス、B.、エスピーノ、J.A.、ゲルシェンソン、A.、ジョーンズ、L.M.、可動XYステージを有するプラットフォームインキュベーターでタンパク質の細胞内高速光化学酸化を実施する。分析化学, 92(2), 1691-1696 2019.著作権 2020 アメリカ化学会.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62153/62153fig04large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62153/62153fig05.jpg"> 図 5.単細胞流動系とPIXYで改変したタンパク質の比較 フローシステム(紫)とPIXY(緑色)で修飾されたタンパク質のベン図。ジョンソン、D.T.、パンションスミス、B.、エスピーノ、J.A.、ゲルシェンソン、A.、ジョーンズ、L.M.、可動XYステージを有するプラットフォームインキュベーターでタンパク質の細胞内高速光化学酸化を実施する。分析化学, 92(2), 1691-1696 2019.著作権 2020 アメリカ化学会. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62153/62153fig05large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62153/62153fig06.jpg"> 図 6.IC-FPOP の変更のローカライズ。システム間のIC-FPOPの変更の比較。(A)フローシステム(紫色)とプラットフォームインキュベーター(緑色)からのアクチン内の酸化的に改変されたペプチドの棒グラフ。(B)アクチンのタンデムMSスペクトル(ペプチド316-326)とアクチンの両方の系で改変プロリン(C)FPOP改変残基のアクチン(PDB:6ZXJ、チェーンA11)はプラットフォームインキュベーター内の改変残基(緑色)、フロー系中3個の改変残基(黄)を重ね合わせ、1個の変性残基(黄黄色)。ジョンソン、D.T.、パンションスミス、B.、エスピーノ、J.A.、ゲルシェンソン、A.、ジョーンズ、L.M.、可動XYステージを有するプラットフォームインキュベーターでタンパク質の細胞内高速光化学酸化を実施する。分析化学, 92(2), 1691-1696 2019.著作権 2020 アメリカ化学会.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62153/62153fig06large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62153/62153fig07.jpg"> 図 7. フローによるC.エレガンス におけるFPOP修飾タンパク質の比較とPIXYの比較 流れシステムと比較すると、PIXYを用いた酸化修飾タンパク質の1.5倍の増加があります。ジョンソン、D.T.、パンションスミス、B.、エスピーノ、J.A.、ゲルシェンソン、A.、ジョーンズ、L.M.、可動XYステージを有するプラットフォームインキュベーターでタンパク質の細胞内高速光化学酸化を実施する。分析化学, 92(2), 1691-1696 2019.著作権 2020 アメリカ化学会. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62153/62153fig07large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
表 1.ワークフロー変更分布と質量シフト (Da). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62153/Table%201.docx" target="_blank">ここをクリックしてこの表をダウンロードしてください。</a>

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Platform Incubator with Movable XY Stage: A New Platform for Implementing In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

新しい静的プラットフォームは、タンパク質の細胞内高速光化学酸化(IC-FPOP)と呼ばれるタンパク質フットプリント技術を利用して、ネイティブ細胞環境におけるタンパク質構造および相互作用部位を特徴付けるために使用されます。

可動XYステージを用いてプラットフォームインキュベーター:タンパク質の細胞内高速光化学酸化を実装するための新しいプラットフォーム

Fast Photochemical Oxidation of proteins (FPOP) coupled with mass spectrometry (MS) has become an invaluable tool in structural proteomics to interrogate ...

この方法は、今日の厳しい生物学的な質問のためのソリューションを提供します。細胞内FPOP実験から、タンパクリガンド相互作用、タンパク質相互作用部位、および立体構造変化の領域を研究することができます。この技術の利点は、細胞を成長させ、レーザーで細胞内FPOP研究を行うことを可能にする自動化された6ウェルプレートベースのIC-FPOPプラットフォームの使用です。この方法は、製薬およびバイオテクノロジー産業、特にタンパク質ダイナミクスを研究する大学の生物学的研究者によって、主要な学術および臨床研究機関で使用することができます。まず、プラットフォームインキュベーターを位置決め段階から外し、温度、ガス、加湿器ラインを取り外します。70%エタノールでインキュベーターをスプレーし、細胞培養フードに入れます。プラットフォームインキュベーターから6ウェルプレートを取り出し、プレートの元の蓋を固定し、顕微鏡を使用して細胞の合流を確認し、コンフルエント細胞を持つ6ウェルプレートを細胞培養フード内のプラットフォームインキュベーターに戻します。ウェルの壁にチューブをフラッシュすることにより、埋め込みポートを介して各ウェルに3つのプリカットタイゴンチューブを挿入し、カスタム3Dプリントリングでそれらを確保します。ポンプ撤退のための統合ソフトウェアスクリプトを準備します。1つの蠕動ポンプを使用して、6つのウェルすべてから細胞培地を完全に除去します。他の3つの蠕動ポンプの各チャネルに溶媒を主に、次に、試薬がインキュベーターポートに到達するまで、それぞれの交番チューブに過酸化水素とクエンチバッファーを注入する。レーザービームが正しく傾いており、インキュベーターに無制限に到達していることを確認します。外部センサーを使用してレーザーエネルギーをチェックします。ビームの位置合わせを確認した後、ポンプ注入用の統合ソフトウェアスクリプトを準備します。1分あたり35ミリリットルで200ミリモル過酸化水素を最初の井戸に注入する。5秒のマークでレーザーソフトウェアのスタートボタンを押して、タイマーの11秒のマークでパルスをトリガーします。レーザーパルスの直後に1分あたり35ミリリットルで125ミリモルクエンチ溶液を注入します。手動でレーザービームと次の井戸を整列し、すべての井戸のためのプロセスを繰り返すために位置決め段階を移動します。細胞培養フードでは、細胞スクレーパーを使用して、各ウェルから個々の15ミリリットルの円錐管に細胞を移す。遠心分離細胞は1,200倍Gで5分間行う。上清を捨て、100マイクロリットルのRIPAライシスバッファーで細胞を再懸濁します。細胞を個々の1.2ミリリットルのポリプロピレンチューブに移す。フラッシュは液体窒素ですべてのサンプルを凍結し、使用するまでマイナス80度の冷凍庫に入れます。FPOP修飾を局所化するには、液体クロマトグラフィータンデム質量分析を用いて消化細胞溶解物を分析し、次に修飾の程度を計算する。プラットフォームインキュベーター条件がレーザープラットフォームでの細胞培養に十分であることを確認するために、GCaMP2はHEK293Tに一過性トランスフェクションされ、両方のプレートのトランスフェクション効率を蛍光イメージングで評価した。トランスフェクション効率を定量化するためにルシファーゼアッセイを行った。フローシステムで標識されたHEK293T細胞におけるFPOP改変を、プラットフォームインキュベーターで標識したものと比較した。プラットフォームインキュベーターは、改変されたタンパク質の数とそれらのタンパク質の合計FPOPカバレッジの両方でフローシステムを上回りました。フローシステムでは、2つの修飾ペプチドが検出され、限られた構造情報を提供した。しかし、アクチン配列にまたがる5個の改変ペプチドがプラットフォームインキュベーターで検出された。タンデムMSスペクトルのアクチンと、両方の系におけるプロリンと非修飾アクチンペプチドの両方を用いて示す。プラットフォームインキュベーターサンプル中のFPOP改変残基には、12個の改変残基、フローシステム内の3つの改変残基、および1つの重複する改変残基が含まれていた。LC-MS MS分析の結果、792のタンパク質が、フローシステムで改変された545タンパク質と比較して、プラットフォームインキュベーターでin vivo FPOPによって改変されたことが明らかになった。細胞を無菌状態に保つことが不可欠です。常に滅菌細胞培養フードにプラットフォームインキュベーターを持って来て、必要なすべての6ウェルプレート、チューブ、リングを挿入します。これにより、実験の完全性が保証されます。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Fabricating a UV-Vis and Raman Spectroscopy Immunoassay Platform

紫外可視およびラマン分光法イムノアッセイプラットフォームを製作

Immunoassays are used to detect proteins based on the presence of associated antibodies. Because of their extensive use in research and clinical settings, ...

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

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タンパク質フィルム赤外線電気化学 [NiFe] ヒドロゲナーゼによって H2酸化反応に関する研究の実証

Understanding the chemistry of redox proteins demands methods that provide precise control over redox centers within the protein. The technique of protein ...

Multiplexed Isothermal Amplification Based Diagnostic Platform to Detect Zika, Chikungunya, and Dengue 1

多重等温増幅ベース ジカ、チクングニア ウイルスおよびデング熱 1 を検出する診断プラットフォーム

Zika, dengue, and chikungunya viruses are transmitted by mosquitoes, causing diseases with similar patient symptoms. However, they have different ...

A Rat Methyl-Seq Platform to Identify Epigenetic Changes Associated with Stress Exposure

ストレス曝露に伴うエピジェネティックな変化を識別するためにラット メチル Seq プラットフォーム

As genomes of a wider variety of animals become available, there is an increasing need for tools that can capture dynamic epigenetic changes in these ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

蛍光プロテアーゼ アッセイプラット フォームとそのゲルの下で遺伝子組換えの融合蛋白質の使用

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Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

ネイティブ自己蛍光に基づくsFLIMによる植物切片における蛍光プローブとリグニン間の相互作用の測定

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...

Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

細胞内高速光化学タンパク質による細胞タンパク質の特性分析

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A Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS) Platform for Investigating Peptide Biosynthetic Enzymes

A Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry HDX-MS Platform for Investigating Peptide Biosynthetic Enzymes

ペプチド生合成酵素を調べた水素重水素交換質量分析(HDX-MS)プラットフォーム

Hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) is a powerful method for the biophysical characterization of enzyme conformational changes and ...

Spectrophotometric Screening for Potential Inhibitors of Cytosolic Glutathione S-Transferases

細胞細胞性グルタチオンSトランスレセファーゼの潜在的阻害剤に対する分光測定法

Glutathione S-transferases (GSTs) are metabolic enzymes responsible for the elimination of endogenous or exogenous electrophilic compounds by glutathione ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support