Name: platform incubator with movable xy stage: a new platform for implementing in-cell fast photochemical oxidation of proteins
Uploaded: 2021-05-17T13:30:00
Duration: 5 min 50 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Platform Incubator with Movable XY Stage: A New Platform for Implementing In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por una subvención del NIH R01 GM128983-01.

<ol>
	<li>Johnson, D. T., Di Stefano, L. H., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+photochemical+oxidation+of+proteins+(FPOP):+A+powerful+mass+spectrometry+based+structural+proteomics+tool.">Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP): A powerful mass spectrometry based structural proteomics tool.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (32), 11969-11979 (2019).</li><li>Liu, X. R., Zhang, M. M., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Spectrometry-Based+Protein+Footprinting+for+Higher-Order+Structure+Analysis:+Fundamentals+and+Applications.">Mass Spectrometry-Based Protein Footprinting for Higher-Order Structure Analysis: Fundamentals and Applications.</a> Chemical Reviews. 120 (10), 4355-4454 (2019).</li><li>Li, J., Chen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+fast+photochemical+oxidation+of+proteins+coupled+with+mass+spectrometry+in+protein+therapeutics+discovery+and+development.">The use of fast photochemical oxidation of proteins coupled with mass spectrometry in protein therapeutics discovery and development.</a> Drug Discovery Today. 24 (3), 829-883 (2019).</li><li>Zhao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Covalent+Labeling+with+an+&#945;,&#946;-Unsaturated+Carbonyl+Scaffold+for+Studying+Protein+Structure+and+Interactions+by+Mass+Spectrometry.">Covalent Labeling with an &#945;,&#946;-Unsaturated Carbonyl Scaffold for Studying Protein Structure and Interactions by Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 92 (9), 6637-6644 (2020).</li><li>Hambly, D. M., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Flash+Photolysis+of+Hydrogen+Peroxide+to+Oxidize+Protein+Solvent-Accessible+Residues+on+the+Microsecond+Timescale.">Laser Flash Photolysis of Hydrogen Peroxide to Oxidize Protein Solvent-Accessible Residues on the Microsecond Timescale.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 16 (12), 2057-2063 (2005).</li><li>Li, K. S., Shi, L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Spectrometry-Based+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+(FPOP)+for+Higher+Order+Structure+Characterization.">Mass Spectrometry-Based Fast Photochemical Oxidation of Proteins (FPOP) for Higher Order Structure Characterization.</a> Accounts of Chemical Research. 51 (3), 736-744 (2018).</li><li>Chea, E. E., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modifications+generated+by+fast+photochemical+oxidation+of+proteins+reflect+the+native+conformations+of+proteins.">Modifications generated by fast photochemical oxidation of proteins reflect the native conformations of proteins.</a> Protein Science. 27 (6), 1047-1056 (2018).</li><li>Hambly, D., Gross, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+flash+photochemical+oxidation+to+locate+heme+binding+and+conformational+changes+in+myoglobin.">Laser flash photochemical oxidation to locate heme binding and conformational changes in myoglobin.</a> International Journal of Mass Spectrometry. 259 (1), 124-129 (2007).</li><li>Yan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+photochemical+oxidation+of+proteins+(FPOP)+maps+the+epitope+of+EGFR+binding+to+adnectin.">Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) maps the epitope of EGFR binding to adnectin.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 25 (12), 2084-2092 (2014).</li><li>Zhang, Y., Wecksler, A. T., Molina, P., Deperalta, G., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+Binding+Interface+of+VEGF+and+a+Monoclonal+Antibody+Fab-1+Fragment+with+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+(FPOP)+and+Mass+Spectrometry.">Mapping the Binding Interface of VEGF and a Monoclonal Antibody Fab-1 Fragment with Fast Photochemical Oxidation of Proteins (FPOP) and Mass Spectrometry.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 28 (5), 850-858 (2017).</li><li>Espino, J. A., Mali, V. S., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Cell+Footprinting+Coupled+with+Mass+Spectrometry+for+the+Structural+Analysis+of+Proteins+in+Live+Cells.">In Cell Footprinting Coupled with Mass Spectrometry for the Structural Analysis of Proteins in Live Cells.</a> Analytical Chemistry. 87 (15), 7971-7978 (2015).</li><li>Rinas, A., Mali, V. S., Espino, J. A., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Microflow+System+for+In-Cell+Footprinting+Coupled+with+Mass+Spectrometry.">Development of a Microflow System for In-Cell Footprinting Coupled with Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 88 (20), 10052-10058 (2016).</li><li>Johnson, D. T., Punshon-Smith, B., Espino, J. A., Gershenson, A., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementing+In-Cell+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+in+a+Platform+Incubator+with+a+Movable+XY+Stage.">Implementing In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins in a Platform Incubator with a Movable XY Stage.</a> Analytical Chemistry. 92 (2), 1691-1696 (2019).</li><li>Bangel-Ruland, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator-mRNA+delivery:+a+novel+alternative+for+cystic+fibrosis+gene+therapy.">Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator-mRNA delivery: a novel alternative for cystic fibrosis gene therapy.</a> The Journal of Gene Medicine. 15 (11-12), 414-426 (2013).</li><li>Gau, B. C., Chen, H., Zhang, Y., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sulfate+Radical+Anion+as+a+New+Reagent+for+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins.">Sulfate Radical Anion as a New Reagent for Fast Photochemical Oxidation of Proteins.</a> Analytical Chemistry. 82 (18), 7821-7827 (2010).</li><li>Xu, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroxyl+Radical-Mediated+Modification+of+Proteins+as+Probes+for+StructuralProteomics.">Hydroxyl Radical-Mediated Modification of Proteins as Probes for StructuralProteomics.</a> Chemical Reviews. American Chemical Society. 107 (8), 3514-3543 (2007).</li><li>Espino, J. A., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+Biological+Interactions+with+In+Vivo+Protein+Footprinting.">Illuminating Biological Interactions with In Vivo Protein Footprinting.</a> Analytical Chemistry. 9 (10), 6577-6584 (2019).</li><li>Gau, B. C., Sharp, J. S., Rempel, D. L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Photochemical+Oxidation+of+Protein+Footprints+Faster+than+Protein+Unfolding.">Fast Photochemical Oxidation of Protein Footprints Faster than Protein Unfolding.</a> Analytical Chemistry. 81 (16), 6563-6571 (2009).</li><li>Kaur, U., Johnson, D. T., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+the+Applicability+of+In-Cell+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+across+Multiple+Eukaryotic+Cell+Lines.">Validation of the Applicability of In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins across Multiple Eukaryotic Cell Lines.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (7), 1372-1379 (2020).</li></ol>

Los autores no declaran ningún interés financiero competidor. La investigación presentada en este documento está asociada a la solicitud de patente a la que se hace referencia a continuación: Número de solicitud de patente no provisional de ee.UU.: 17/042.565 Título: "Dispositivo y método para determinar el plegado de proteínas" Número de expediente UMB: LJ-2018-104 UMass Ref: UMA 18-059.

Las proteínas realizan gran parte del trabajo en células vivas. Dada esta importancia, se necesitan datos detallados sobre la función proteica y la estructura de orden superior (HOS) en el entorno celular para profundizar la comprensión de los entresijos en complejos más grandes y reacciones enzimáticas en las células en lugar de sistemas purificados. Para ello, se adoptó un método de impresión de pies de proteína de radical hidroxilo (HRFP) titulado Oxidación fotoquímica rápida en células de proteínas (IC-FPOP). La mayoría de los estudios de FPOP se han realizado in vitro en sistemas proteicos relativamente puros, lo que contrasta notablemente con el ambiente molecular lleno de gente que afecta a las interacciones de unión y la dinámica de conformación de proteínas. Como resultado, hay un abismo entre los hallazgos de los experimentos in vitro 18 y los que se obtendrían en un entorno celular real. Para cerrar la brecha entre las condiciones idealizadas de un experimento FPOP in vitro y la naturaleza compleja de la célula, se ha desarrollado una nueva plataforma automatizada de seis pozos basada en placas en células-FPOP. Esta novedosa tecnología FPOP es capaz de identificar y caracterizar estas especies moleculares y rastrear sus interacciones moleculares dinámicas tanto en estados sanos como enfermos. Esta nueva plataforma se llama Incubadora de Plataforma con etapa XY Móvil (PIXY).
FPOP se ha utilizado con éxito para caracterizar la información estructural dentro del proteoma. Sin embargo, cada técnica biológica tiene ciertas limitaciones que requieren una mejora adicional. Se requieren reactivos específicos durante la fotolisis láser y para saciar eficientemente los radicales hidroxilos no reactivos. La separación de péptidos digeridos puede requerir grandes cantidades de tiempo para maximizar la información estructural. Esta gran cantidad de información también puede requerir una cuantificación extensa durante el análisis de datos posteriores a la EM1. La incubadora de plataformas, incluida la maquinaria periférica necesaria para el cultivo celular y IC-FPOP en la plataforma láser, tiene un gran costo que puede no ser factible para algunos laboratorios. A medida que se sigan avanzando, el software robusto y las herramientas de análisis deben seguir avanzando en la técnica; algunos de los cuales se muestran en este estudio. Los estudios actuales en esta incubadora de plataforma se han realizado en células HEK293T y en C. elegans. Se ha demostrado que el método IC-FPOP es compatible con una amplia variedad de líneas celulares, incluyendo ovario de hámster chino (CHO), vero, MCF-7 y células MCF10-A19. Puesto que el método general IC-FPOP es traducible a esta plataforma estática, estas líneas celulares deben ser amenables para el estudio usando PIXY también.
IC-FPOP utiliza H2O2 para modificar oxidativamente cadenas laterales accesibles de disolvente de aminoácidos, para luego discernir aún más las interacciones proteicas, estructura, y efectos metabólicos dentro de las células viables que es significativo en proporcionar contexto biológico. Es esencial antes de un experimento IC-FPOP para confirmar que las células son viables después de la adición H2O2. Los estudios de viabilidad celular demostraron que las células eran viables en presencia de concentraciones H2O2 de hasta 200 mM 13. También es importante asegurarse de que H2O2 está infundido a una concentración final de 200 mM directamente en las células después de que se elimina el medio. Si no se eliminan completamente los medios de cultivo celular, se realizarán concentraciones variables de H2O2. En comparación con las condiciones estándar, aumentar el tiempo de incubación a 10 segundos junto con el aumento de la concentración H2O2 condujo a un mayor número de proteínas modificadas por IC-FPOP en la incubadora de plataformas. Es imperativo preparar bombas peristálticas antes de su uso para garantizar que las bombas funcionen correctamente y que el líquido se disperse. Si no lo hace, puede provocar burbujas de aire en el tubo, un volumen insuficiente de H2O2 para sumergir las células y/o un volumen insuficiente de solución de enfriamiento.
Otro problema que puede surgir son los retrasos no deseados en el sistema. Un ejemplo de esto es el proceso de verificar los comandos recibidos para los sistemas de bomba que agrega retrasos significativos en el orden de 1000 o más milisegundos utilizando el software de integración. Este problema se puede solucionar minimizando la comunicación con las bombas durante el experimento y utilizando comandos preestables con anticipación tanto como sea posible.
En el futuro, el objetivo de PIXY es producir un sistema totalmente automatizado e integrado. Además de las bombas peristálticas, se automatizará la activación del pulso láser. También se utilizará un nuevo sistema de posicionamiento para el rápido movimiento de la incubadora de plataformas para mejorar la velocidad y la precisión. Todos los componentes del sistema seguirán estadándose utilizando el software de integración para aumentar aún más el rendimiento.

Las técnicas de huella proteica pueden revelar información profunda sobre la organización de proteínas. Estas técnicas esenciales basadas en EM de biología estructural son un componente de la caja de herramientas de espectrometría de masas. Estos métodos sondean la estructura de orden superior de proteínas (HOS) y la sinergia a través del etiquetado covalente1,2,3,4. La oxidación fotoquímica rápida de las proteínas (FPOP) emplea radicales hidroxilos para modificar oxidativamente las cadenas laterales accesibles al disolvente de los aminoácidos5,6 (Tabla 1). El método utiliza un láser de excitación a 248 nm para la fotolisis de peróxido de hidrógeno (H2O2)para generar radicales hidroxilos. Teóricamente, 19 de los 20 aminoácidos pueden ser modificados oxidativamente con Gly siendo la única excepción. Sin embargo, debido a las diferentes tasas de reactividad de los aminoácidos con radicales hidroxilos, modificación de sólo un subconjunto de estos se ha observado experimentalmente. Aún así, el método tiene el potencial de análisis a lo largo de la longitud de una secuencia deproteínas 5. FPOP modifica las proteínas en la escala de tiempo del microsegundo, por lo que es útil para estudiar interacciones débiles con velocidades de apagado rápido. La accesibilidad al disolvente cambia en la unión de ligando o un cambio en la conformación de proteínas, por lo tanto, el poder del método radica en la comparación del patrón de etiquetado de una proteína en múltiples estados (es decir, libre de ligando en comparación con el ligando). Como resultado, FPOP ha tenido éxito en la identificación de sitios de interacción proteína-proteína y ligando proteínas y regiones de cambio conformacional7,8,9,10. El método FPOP se ha extendido desde el estudio de sistemas de proteínas purificadas hasta el análisis en células. FPOP en células (IC-FPOP) puede modificar oxidativamente más de mil proteínas en las células para proporcionar información estructural a través del proteoma11,12. La plataforma IC-FPOP convencional utiliza un sistema de flujo para fluir las celdas un solo archivo más allá del rayo láser. El desarrollo de este sistema permitió que las células individuales tuvieran la misma exposición a la irradiación láser. Esto condujo a un aumento de 13 veces en el número de proteínas etiquetadas oxidativamente12. Sin embargo, una limitación del sistema de flujo es la longitud de un único experimento de muestra que consiste en un intervalo de irradiación de 10 minutos durante el cual se produce una modificación y un ciclo de lavado adicional de 10 minutos. Las limitaciones de tiempo de IC-FPOP hacen que no sea adecuado para estudiar intermedios plegables de proteínas de corta duración o cambios que existen entre las redes de interacción en cascadas de señalización bioquímica. Esta limitación temporal inspiró el diseño de una nueva plataforma IC-FPOP equipada con mayor rendimiento.
Para medir con precisión la estructura de orden superior de proteínas en el entorno celular nativo, el nuevo diseño permite que el cultivo celular se realice directamente en la plataforma láser, lo que permite que IC-FPOP tenga un alto rendimiento. Esta configuración también permite minimizar las perturbaciones al entorno celular, a diferencia de IC-FPOP utilizando el flujo donde las células adherentes deben ser eliminadas del sustrato. La nueva plataforma permite que IC-FPOP se produzca en un sistema de incubación estéril utilizando una cámara superior de etapa controlada por temperatura y CO2 mientras utiliza óptica de espejo configurada para la guía de haz láser, un sistema de posicionamiento para movimiento XY y bombas peristálticas para intercambio químico. La nueva plataforma para la realización de IC-FPOP se titula Incubadora de Plataformas con Etapa XY Móvil (PIXY) (Figura 1). En PIXY, IC-FPOP se lleva a cabo en células humanas cultivadas en placas de seis pozos dentro de la cámara de incubadora de plataforma. Para esta configuración, el rayo láser se refleja hacia abajo en la placa utilizando espejos compatibles con vigas como una etapa de posicionamiento que sostiene la incubadora se mueve, en el plano XY, por lo que el rayo láser está estratégicamente alineado para irradiar sólo un pozo a la vez. Los estudios de validación demuestran que IC-FPOP se puede realizar más rápido en PIXY que en el sistema de flujo y conduce a mayores modificaciones de aminoácidos por proteína. El desarrollo de esta nueva plataforma IC-FPOP expondrá el conocimiento que se puede obtener de los experimentos celulares13.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ismatec Reglo ICC Peristaltic Pumps</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>122270050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Kinematic Mirror Mount for &#216;2&#34; Optics</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X trypsin&#8722;EDTA</td>
			<td>Corning</td>
			<td>AB00490-00005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50.0mm 248nm 45&#176;, Excimer Laser Line Mirror</td>
			<td>Edmond Optics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone, HPLC Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18 Trap Column, 100&#197;, 5 &#181;m, 180 &#181;m x 20 mm, 2G, V/M, 1/pkg</td>
			<td>Waters</td>
			<td>23275</td>
			<td>other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACQUITY UPLC M-Class System</td>
			<td>Waters</td>
			<td>A53225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Afinia H480 3D Printer</td>
			<td>(Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>air pump</td>
			<td>OKOlabs</td>
			<td>D12345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Foil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Stock #63-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua 5 &#181;m C18 125 &#197; packing material</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carbon dioxide unit</td>
			<td>OKOlabs</td>
			<td>MadMotor&#174;-UHV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>connectors (Y PP 1/16&#8221; and 1/16x1/8&#8221;)</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>116891000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate Task Wipers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>022625501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreiotol (DTT)</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO, Anhydrous</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LS118-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>SK-78001-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EX350 excimer laser</td>
			<td>GAM Laser</td>
			<td>PI89900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>SK-12023-78</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid, LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A929-4</td>
			<td>4 L quantity is not necessary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T cells</td>
			<td>Paul Shapiro Lab (University of Maryland Baltimore)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>humidifier</td>
			<td>OKOlabs</td>
			<td>Nano-LPMW stage</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HV3-2 VALVE</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>LS120-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide (IAA)</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LABVIEW Professional 2018</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>86728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MadMotor Positioning system and controllers</td>
			<td>Mad City Labs</td>
			<td>W6-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-213-100</td>
			<td>any brand is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>H301-T Unit-BL-PLUS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8242;-Dimethylthiourea (DMTU)</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanopositioinging stage</td>
			<td>Mad City Labs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-tert-Butyl-&#945;-phenylnitrone (PBN)</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OKO Touch Monitoring System</td>
			<td>OKOlabs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>7Z02936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE50-C pyroelectric energy meter</td>
			<td>Ophir Optronics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Trypsin Protease, MS Grade</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Universal Nuclease for Cell Lysis</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pressure gauge</td>
			<td>OKOlabs</td>
			<td>OKO-AIR-PUMP-BL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE filter</td>
			<td>OKOlabs</td>
			<td>CO2-UNIT-BL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Six 33 mm PLA filament rings</td>
			<td>(Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile incubator</td>
			<td>OKOlabs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>temperature unit</td>
			<td>OKOlabs</td>
			<td>OKO-TOUCH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A117-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TiNKERcad</td>
			<td>(Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H325-100</td>
			<td>any 30% hydrogen peroxide is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tubing (Tygon 3.18 and 1.59 ID)</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>177350250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A454SK-4</td>
			<td>4 L quantity is not necessary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>88702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>90058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>KM200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>186007496</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

platform incubator with movable xy stage: a new platform for implementing in-cell fast photochemical oxidation of proteins

La oxidación fotoquímica rápida de proteínas (FPOP) junto con la espectrometría de masas (EM) se ha convertido en una herramienta invaluable en la proteómica estructural para interrogar interacciones proteicas, estructura y dinámicas de conformación de proteínas en función de la accesibilidad a los disolventes. En los últimos años, el alcance de FPOP, una técnica de impresión de pies de proteína de radical hidroxilo (HRPF), se ha ampliado al etiquetado de proteínas en cultivos celulares vivos, proporcionando los medios para estudiar las interacciones proteicas en el entorno celular enrevesado. Las modificaciones de proteínas en las células pueden proporcionar información sobre los cambios estructurales inducidos por ligando o los cambios de conformación que acompañan la formación compleja de proteínas, todo dentro del contexto celular. Se ha logrado la huella proteica empleando un sistema basado en flujo habitual y un láser de excitador KrF de 248 nm para producir radicales hidroxilos mediante fotolisis de peróxido de hidrógeno, requiriendo 20 minutos de análisis para una muestra celular. Para facilitar experimentos FPOP resueltos en el tiempo, se fue pionero en el uso de una nueva plataforma IC-FPOP basada en placas de 6 pozos. En el sistema actual, un solo pulso láser irradia un pozo entero, lo que trunca el marco de tiempo experimental FPOP, lo que resulta en 20 segundos de tiempo de análisis, una disminución de 60 veces. Este tiempo de análisis muy reducido permite investigar mecanismos celulares como cascadas de señalización bioquímica, plegado de proteínas y experimentos diferenciales (es decir, libres de drogas frente a fármacos) de una manera dependiente del tiempo. Esta nueva instrumentación, titulada Incubadora de plataforma con etapa XY móvil (PIXY), permite al usuario realizar cultivo celular e IC-FPOP directamente en el banco óptico utilizando una incubadora de plataforma con temperatura, CO2 y control de humedad. La plataforma también incluye una etapa de posicionamiento, bombas peristálticas y óptica de espejo para la orientación del rayo láser. Las condiciones IC-FPOP tales como la configuración óptica, los caudales, las transcciones transitorias, y la concentración H2O2 en PIXY se han optimizado y revisado por pares. La automatización de todos los componentes del sistema reducirá la manipulación humana y aumentará el rendimiento.

Para confirmar que las condiciones de la incubadora de plataformas son suficientes para el cultivo celular en la plataforma láser, GCaMP2 se transfectó transitoriamente a HEK293T y la eficiencia de transfección para ambas placas se evaluó a través de imágenes de fluorescencia(Figura 4A). GCaMP2 es una proteína fluorescente de detección de calcio utilizada como un indicador de calcio intracelular codificado genéticamente. Es una fusión de proteína fluorescente verde (GFP) y la proteína que une calcio, la calmodulina. Se realizó un ensayo luciferasa en células HEK 293 transfectadas con prl-TK plásmido con el fin de cuantificar la eficiencia de la transfección (Figura 4B). Estos resultados muestran que la incubadora de plataformas superó el rendimiento de la incubadora estándar, con un aumento de 1,13 veces en la eficiencia de transfección, proporcionando un punto de referencia cuantitativo para un entorno óptimo de cultivo celular.
Las modificaciones de FPOP en las células HEK293T etiquetadas en el sistema de flujo se compararon con las etiquetadas en la incubadora de plataformas y mostraron que la incubadora de plataformas supera al sistema de flujo tanto en el número de proteínas modificadas(Figura 5)como en la cobertura total de FPOP en esas proteínas. El número de proteínas modificadas FPOP adquiridas en la incubadora de plataformas fue aproximadamente 1051, 2,2 veces más que las adquiridas en un experimento típico. Las modificaciones se combinaron entre dos réplicas biológicas para cada experimento. Además, PIXY proporciona un mayor rendimiento.
Para demostrar la ventaja de una mayor cobertura de modificación a través de una proteína, las modificaciones ic-fpop se localizaron en el nivel de péptido y el grado de modificación se cuantificó para distinguir las diferencias en los resultados entre los sistemas de actina, una proteína de 375 aminoácidos. En el sistema de flujo, se detectaron dos péptidos modificados, proporcionando información estructural limitada (Figura 6A). Sin embargo, se detectaron cinco péptidos modificados que abarcaban la secuencia actin en la incubadora de plataforma. Los espectros de masa tándem indican que los residuos Pro322 fueron modificados y detectados en cada experimento (Figura 6B). Los cinco péptidos modificados en las muestras de incubadora de plataforma contenían doce residuos modificados, mientras que sólo cuatro residuos fueron modificados con el sistema de flujo(Figura 6C). El aumento en la cobertura de oxidación proporciona más información estructural a través de la proteína.
Espino et al. demostraron la capacidad de FPOP para ser realizado in vivo (IV-FPOP) dentro de C. elegans,un modelo de gusano para los estados de enfermedad humana17. Mientras que iv-FPOP también se realiza a través de un sistema de flujo, el sistema PIXY fue probado para la compatibilidad con los gusanos. Aproximadamente 10.000 gusanos fueron incubados en cada pozo de la incubadora de plataformas a 20 °C. El análisis LC-MS/MS reveló que 792 proteínas fueron modificadas por IV-FPOP en la incubadora de plataformas en comparación con las 545 proteínas modificadas con el sistema de flujo (Figura 7). Estos resultados demuestran que además del cultivo celular 2D, esta nueva metodología también es compatible con el estudio de otros sistemas biológicos como C. elegans.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62153/62153fig01.jpg"> Figura 1. Esquema del sistema PIXY. Componentes del sistema: (A) incubadora de etapa superior, (B) sistema de posicionamiento , (C) bombas peristálticas, y (D) líneas de perfusión. Los medios de cultivo celular se eliminan de cada pozo a través de bombas antes de H2O2 y las soluciones de enfriamiento se infunden en puntos de tiempo calculados. Trayectoria láser para irradiación exhibida en blanco. Reimpreso con permiso de Johnson, D. T., Punshon-Smith, B., Espino, J. A., Gershenson, A., Jones, L.M., Implementando oxidación fotoquímica rápida en células de proteínas en una incubadora de plataforma con una etapa XY móvil. Química Analítica, 92(2), 1691-1696 2019. Derechos de autor 2020 Sociedad Química Americana. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62153/62153fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62153/62153fig02.jpg"> Figura 2. Sistema PIXY totalmente ensamblado. (A) Sistema de monitoreo táctil, (B) unidad de dióxido de carbono, (C) unidad de temperatura, (D) bomba de aire, (E) humidificador, (F) espejos ópticos, (G) incubadora de plataforma, (H) etapa de posicionamiento, (I) láser de excitador KrF de 248nm, y (J) bombas peristálticas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62153/62153fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62153/62153fig03.jpg"> Figura 3. Automatización de bombas peristálticas. (A) Ejemplo de script de comandos en LABVIEW. Las opciones de comando incluyen volumen, caudal, pausas, dirección de flujo. La velocidad, la distancia de etapa y la ubicación se están automatizando actualmente. (B) Lector de scripts en LABVIEW. Aquí, los scripts de comandos se cargan y luego se presiona Ejecutar secuencia y START para iniciar las bombas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62153/62153fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62153/62153fig04.jpg"> Figura 4. Eficiencia de transfección de células HEK. (A) Intensidad fluorescente media de la comparación de transfección GCaMP2 entre incubadora estándar (Control) y incubadora de etapa superior (PIXY). Puntos y cuadrados representan cada punto en un pozo donde se tomó una medida. B) Eficiencia de transfección cuantificada y validada con un plásmido vectorial diferente, pRL-TK. Valor P< 0,005. Reimpreso con permiso de Johnson, D. T., Punshon-Smith, B., Espino, J. A., Gershenson, A., Jones, L.M., Implementando oxidación fotoquímica rápida en células de proteínas en una incubadora de plataforma con una etapa XY móvil. Química Analítica, 92(2), 1691-1696 2019. Derechos de autor 2020 Sociedad Química Americana. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62153/62153fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62153/62153fig05.jpg"> Figura 5. Comparación de proteínas modificadas en el sistema de flujo celular único y PIXY. Diagrama de venina de proteínas modificadas utilizando en el sistema de flujo (púrpura) y en PIXY (verde). Reimpreso con permiso de Johnson, D. T., Punshon-Smith, B., Espino, J. A., Gershenson, A., Jones, L.M., Implementando oxidación fotoquímica rápida en células de proteínas en una incubadora de plataforma con una etapa XY móvil. Química Analítica, 92(2), 1691-1696 2019. Derechos de autor 2020 Sociedad Química Americana. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62153/62153fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62153/62153fig06.jpg"> Figura 6. Localización de modificaciones IC-FPOP. Comparación de modificaciones IC-FPOP entre sistemas. (A) Gráfico de barras de péptidos modificados oxidativamente dentro de actin desde el sistema de flujo (púrpura) vs incubadora de plataforma (verde). (B) Espectros de EM tándem de actina (péptido 316-326) con prolínea modificada en ambos sistemas y péptido actin no modificado (C) Residuos modificados FPOP de actina (PDB: 6ZXJ, cadena A 11 residuos modificados en incubadora de plataforma (verde), 3 residuos modificados en el sistema de flujo (púrpura), 1 residuos modificados superpuestos (amarillo). Reimpreso con permiso de Johnson, D. T., Punshon-Smith, B., Espino, J. A., Gershenson, A., Jones, L.M., Implementando oxidación fotoquímica rápida en células de proteínas en una incubadora de plataforma con una etapa XY móvil. Química Analítica, 92(2), 1691-1696 2019. Derechos de autor 2020 Sociedad Química Americana. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62153/62153fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62153/62153fig07.jpg"> Figura 7. Comparación de proteínas modificadas FPOP en C. elegans por flujo vs PIXY. Hay un aumento de 1,5 veces en las proteínas modificadas oxidativamente usando PIXY en comparación con el sistema de flujo. Reimpreso con permiso de Johnson, D. T., Punshon-Smith, B., Espino, J. A., Gershenson, A., Jones, L.M., Implementando oxidación fotoquímica rápida en células de proteínas en una incubadora de plataforma con una etapa XY móvil. Química Analítica, 92(2), 1691-1696 2019. Derechos de autor 2020 Sociedad Química Americana. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62153/62153fig07large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Tabla 1. Distribución de modificación de flujo de trabajo y desplazamientos masivos (Da). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62153/Table%201.docx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>

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Platform Incubator with Movable XY Stage: A New Platform for Implementing In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

Una nueva plataforma estática se utiliza para caracterizar la estructura proteica y los sitios de interacción en el entorno celular nativo utilizando una técnica de huella proteica llamada oxidación fotoquímica rápida en células de proteínas (IC-FPOP).

Incubadora de plataformas con etapa XY móvil: una nueva plataforma para implementar la oxidación fotoquímica rápida en células de proteínas

Fast Photochemical Oxidation of proteins (FPOP) coupled with mass spectrometry (MS) has become an invaluable tool in structural proteomics to interrogate ...

Este método proporciona soluciones para las exigentes cuestiones biológicas actuales. A partir de un experimento FPOP en células, podemos estudiar interacciones proteína-ligando, sitios de interacción proteína-proteína y regiones de cambio de conformación. La ventaja de esta tecnología es el uso de una plataforma automatizada ic-fpop basada en placas de seis pozos que permite cultivar células y realizar estudios FPOP en la célula directamente en el láser.Este método se puede utilizar en industrias farmacéuticas y biotecnológicas, así como en importantes institutos de investigación académica y clínica, especialmente por investigadores biológicos en universidades que estudian dinámicas proteicas. Para empezar, desenrosque la incubadora de plataforma de la etapa de posicionamiento y desconecte las líneas de temperatura, gas y humidificador. Rocíe la incubadora con un 70% de etanol y colóquela en la campana del cultivo celular.Retire la placa de seis pozos de la incubadora de plataforma, asegure la tapa original de la placa y confirme la confluencia celular usando un microscopio, luego coloque la placa de seis pozos con células confluentes en la incubadora de plataforma dentro de la campana de cultivo celular. Inserte tres tubos Tygon precortados en cada pozo a través de los puertos incrustados tirando los tubos a las paredes del pozo y asegurándolos con anillos impresos 3D personalizados. Prepare un script de software de integración para la retirada de la bomba.Utilice una bomba peristáltica para eliminar completamente los medios celulares de los seis pozos. Los disolventes primos en cada canal de las otras tres bombas peristálticas, luego infunden peróxido de hidrógeno y amortiguador de enfriamiento en sus respectivos tubos alternos hasta que los reactivos lleguen a los puertos de incubadora. Confirme que el rayo láser se ha inclinado correctamente y llega a la incubadora desinhibido.Compruebe la energía láser utilizando un sensor externo. Prepare el script de software de integración para la perfusión de la bomba después de confirmar la alineación del haz. Infunda 200 mililitros de peróxido de hidrógeno a 35 mililitros por minuto en el primer pozo.Pulse el botón de inicio del software láser en la marca de cinco segundos para activar el pulso a la marca de 11 segundos en el temporizador. Infunda 125 mililitros solución de enfriamiento a 35 mililitros por minuto en el primer pozo inmediatamente después del pulso láser. Mueva manualmente la etapa de posicionamiento para alinear el siguiente pozo con el rayo láser y repita el proceso de todos los pozos.En una campana de cultivo celular, utilice un raspador de células para transferir las células de cada pozo a tubos cónicos individuales de 15 mililitros. Células centrífugas a 1.200 veces G durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y vuelva a abrir las células en 100 microlitros del búfer de lisis RIPA.Transfiera las células a tubos individuales de polipropileno de 1,2 mililitros. Flash congelar todas las muestras en nitrógeno líquido y colocarlas en un congelador de menos 80 grados hasta su uso. Para localizar las modificaciones de FPOP, analice el lisato de celda digerido mediante el análisis de espectrometría de masa tándem cromatografía líquida y, a continuación, calcule el grado de modificación.Para confirmar que las condiciones de la incubadora de plataformas son suficientes para el cultivo celular en la plataforma láser, GCaMP2 se transfectó transitoriamente a HEK293T y la eficiencia de transfección para ambas placas se evaluó a través de imágenes de fluorescencia. Se realizó un ensayo luciferasa para cuantificar la eficiencia de la transfección. Las modificaciones FPOP en las celdas HEK293T etiquetadas en el sistema de flujo se compararon con las etiquetadas en la incubadora de plataforma.La incubadora de plataformas superó al sistema de flujo tanto en el número de proteínas modificadas como en la cobertura total de FPOP en esas proteínas. En el sistema de flujo, se detectaron dos péptidos modificados, proporcionando información estructural limitada. Sin embargo, se detectaron cinco péptidos modificados que abarcaban la secuencia actin en la incubadora de plataforma.Aquí se muestran espectros de EM tándem de actina con prolina modificada en ambos sistemas y péptido de actina no modificado. Los residuos modificados FPOP en las muestras de incubadora de plataforma contenían 12 residuos modificados, tres residuos modificados en el sistema de flujo y uno sobrepuesto de residuos modificados. El análisis de LC-MS MS reveló que 792 proteínas fueron modificadas por FPOP in vivo en la incubadora de plataformas en comparación con las 545 proteínas modificadas con el sistema de flujo.Es imperativo mantener las células en condiciones estériles. Lleve siempre la incubadora de plataforma a la campana de cultivo celular estéril para insertar todas las placas, tubos y anillos de seis pozos necesarios. Esto garantiza la integridad del experimento.

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