Name: generation of murine primary colon epithelial monolayers from intestinal crypts
Uploaded: 2021-02-06T14:30:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Murine Primary Colon Epithelial Monolayers from Intestinal Crypts at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af en Crohns og Colitis Foundation Career Development Award (544599, til MQ) og NIH-stipendierne (DK055679, DK089763, DK059888, til AN). Vi vil gerne takke Michigan Medicine Translational Tissue Modeling Laboratory for deres fortsatte hjælp og adgang til deres reagenser og protokoller.

Alle procedurer, der er beskrevet nedenfor, er blevet godkendt og udført i overensstemmelse med retningslinjerne fra University of Michigan Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Forberedelse af reagenser til kryptisolation og -kultur (forberedes i vævskulturhætte)
<ol><li>50 mM ethylendiaminthaneddikesyre (EDTA): Der tilsættes 50 mL 0,5 M lager til 450 mL fosfatbufferet saltvand uden calcium (Ca2+) og magnesium (Mg2+) til fremstilling af 500 mL. I denne protokol vil PBS henvise til PBS uden calcium og magnesium, medmindre andet er angivet.</li>
	<li>Rystebuffer: Der opløses 7,4 g saccharose (43,3 mM) og 5 g sorbitol (54,9 mM) i PBS til fremstilling af 500 mL.</li>
	<li>L-WRN (L-Wnt-3A, R-spondin og Noggin) medier: Supplement Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium / Ham's F-12 (DMEM/ F12) (780 mL) med 20% FFA (200 mL), 1x kommercielt tilgængelige glutamin supplement (10 mL), 100 U / mL penicillin og, 100 g/mL streptomycin (10 ml), og filteret steriliseres med 0,22 μm filter.<ol>
<li>Få L-WRN celler gennem ATCC, vokse i T175 kolber, og vælg ved hjælp af Geneticin og Hygromycin. Medier ændres og indsamles i 12 dage. BEMÆRK: Hvert parti medier testes for Wnt-aktivitet ved hjælp af en TOPflash Wnt Reporter-analyse. I dette tilfælde Michigan Medicine Translational Tissue Modeling Laboratory protokoller (https://www.umichttml.org/protocols) blev fulgt. ToPflash HEK 293 cellelinjen dyrkes til sammenløb i en T75 kolbe, trypsinized og belagt på en 96-brønds plade. Den følgende dag tilsættes forskellige fortyndinger af det indsamlede medie til celler og inkuberes i en 5% CO 2-inkubator ved 37 °C natten over. Næste dag lyser cellerne, og Firefly Luciferase assay udføres i henhold til producentens anvisninger. Analysen normaliseres ved hjælp af rekombinant Wnt-3A. Medierne er opdelt i 25 mL aliquots i 50 mL koniske rør og opbevares ved -80 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Basismedier: For 500 mL suppleres Advanced DMEM/F12 (448 mL) med 2x kommercielt tilgængeligt glutamintilskud (10 mL), 20 mM HEPES (10 mL), 100 U/mL penicillin og 100 g/mL streptomycin (10 mL), 2 mM N-acetyl-L-cystein (2 ml), N2-tillæg (10 ml) og B27-tillæg (20 ml), filtersteriliseres med 0,22 μm filter. Medierne opdeles i 25 mL aliquots i 50 mL konisk rør og opbevares ved -80 °C.</li>
	<li>LWRN komplet medie: Kombiner 25 mL LWRN medier med 25 ml basismedier og supplere med 200 ng/mL Epidermal vækstfaktor (EGF) (20μL) og 2x antibiotisk-antimykotisk opløsning (1 mL). Det komplette medie opbevares ved 4 °C.</li>
	<li>Kollagen og Laminin: 5 mg pulver opløses i 5 ml filtersteriliseret 100 mM eddikesyre (tilsættes 60 μL eddikesyrebestand til 9,94 ml vand af molekylær kvalitet) for at producere en bestandskoncentration på 1 mg/mL. Rotere ved 4 °C i 4 timer og fremstille 100 μL aliquots i 0,2 mL rør. Frys ved -20 °C. Laminin købes i en lagerkoncentration på 100 μg/mL.</li>
	<li>Komplette medier uden vækstfaktorer (CMGF-): Supplement Avanceret DMEM/F12 (500 ml) med 1x kommercielt tilgængelig glutamintilskud (5 ml), 10 mM HEPES (5 ml), 100 U/mL penicillin og 100 g/mL streptomycin (5 ml).</li>
	<li>Differentiering medier: Til 9,2 mL CMGF-medier, Der tilsættes 200 μL B27-tillæg, 100 μL N2-tillæg, 20 μL N-acetyl-L-cystein, 500 μL Noggin media12 (fremstillet af Noggin-producerende celler) og 2 μL EGF for at fremstille 10 ml differentieringsmedier.</li>
</ol>2. Fremstilling af plader, kammerrutsjebaner og cellekulturmembranindsatser
<ol><li>Belægning 48-brønds plade og kammer dias til plating 2D monolayer: Brug belægningsopløsningen, som udgør laminin (1:40 fortynding, se Materialetabel) og kollagen (1:30 fortynding) i kold Dulbecco's Fosfat buffered saltvand, med Ca2 + og Mg2 + (DPBS). Der tilsættes 200 μL belægningsopløsning til hver brønd, og pladen/kammerdiaset forøges i en 5% CO2-inkubator ved 37 °C i mindst 2 timer.</li>
	<li>Belægning 0,4 μm cellekultur membran skær: Lav 1:30 fortynding af kollagen i molekylær kvalitet vand og tilsæt 200 μL til hvert skær. Pladen med membranindsatsen opbevares på is ved 4 °C i 30 min. Efter 30 minutters inkubation opbevares pladen i en 5% CO 2-inkubator ved 37 °C i 1,5-2 timer. Polyester- og polycarbonatmembranindsatser giver sammenlignelige resultater. BEMÆRK: Enhver vævskulturplade kan sås (op og nedskalering kan udføres) ved hjælp af denne protokol ved at justere kollagen/ lamininvolumen for at opnå fuld dækning af platingoverfladen.</li>
</ol>3. Kryptisolation
BEMÆRK: Før dissektionen påbegyndes, skal kollagen og/eller lamininbelagte plade-/membranindsatser/kammerdias koges og efterlades i en 5% CO2-inkubator ved 37 °C. Forbered en ren arbejdsbænk og sterile kirurgiske instrumenter, der passer til kirurgi, og et biologisk sikkerhedsskab til dyrkning af 2D-monolag. Bekræft alt andet standardudstyr til 2D-monolagskulering, såsom befugtet CO 2-inkubator, bordpladecentrifuger (holdes ved 4 °C), mikroskop og pipetter (herunder serologiske pipetter) er klar. 
<ol><li>Brug C57Bl/6 mus, 8-12 uger gamle. Eutanasi mus ved hjælp af en godkendt metode til aktiv dødshjælp.</li>
	<li>Spray muskroppene med 70% ethanol (EtOH) opløsning for at rense dissektionsområdet og fjerne overskydende EtOH ved hjælp af papirvæv. BEMÆRK: Sørg for, at kryptisolationsreagenserne (f.eks. Disse reagenser kan tilberedes en dag før og er gode at bruge i mindst 3 måneder, når de opbevares ved 4 °C. Sørg også for, at LWRN-komplette medier opbevares i et perle-/vandbad, der holdes ved 37 °C, indtil de tages i brug.</li>
	<li>Brug ren dissektion saks og pincet, dissekere ud tyktarmen fra endetarmen til cecum. Hold enden af tyktarmen ved hjælp af pincet og skyl forsigtigt afføringen af ved hjælp af iskold PBS i en 10 mL sprøjte, forsynet med et 20 G fodringsrør (Figur 1A). Sørg for ikke at sprænge tyktarmen.<ol>
<li>Fjern det proksimale kolon. Dette vil være den del af tyktarmen tættest på ileocecal krydset.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Med pincet skubbes distalkolonen forsigtigt på 20 G-fodringsrøret, der binder tyktarmen i enden af røret ved spidsen med 4-0 silke suturtråd (Figur 1B).</li>
	<li>Vend tyktarmen vrangen ud ved hjælp af ens fingre over enden bundet og binde den anden ende med 4-0 silke sutur tråd. Brug kirurgisk saks, skåret kolon under spidsen af fodring rør(Figur 1C,D, E).</li>
	<li>Ved hjælp af stemplet på en 1,25 mL gentages sprøjte skal du forsigtigt åbne den ubundne ende af den omvendte kolon på spidsen af en 1,25 mL gentagesprøjte. Skub den omvendte kolon på enden af sprøjten og binde tæt med 4-0 silke sutur tråd(Figur 1F,G).</li>
	<li>Sæt stemplet i sprøjten og oppust tyktarmen for at danne en pølse. Oppust, indtil kolonpølsen ser turgent ud uden synlige rynker(Figur 1H).</li>
	<li>Sprøjten/tyktarmen anbringes i 15 mL rør med 5 ml cellegenvindingsopløsning på is i 20 minutter, tyktarmen pustes op og tømmes en gang hvert 5. minut(figur 1I). Pølsen skal forblive oppustet under inkubationen.</li>
	<li>Bind af ved hjælp af 4-0 silke sutur tråd under spidsen af den gentagne sprøjte med tyktarmen oppustet. Pølsen skæres af den gentagne sprøjte, og der anbringes EDTA i 15 mL rør med en 10 mL på 50 mM (2 mM for tyndtarmen) i 40 minutter, og den roteres ved 4 °C (Figur 1J, K).</li>
	<li>Dekanter EDTA-opløsningen, og udskift den med 5 ml rystebuffer. Ryst pølsen manuelt i lodret position (kraftigt) i 2 min.</li>
	<li>Affryse rysteopløsningen i et nyt 15 ml rør og gentage rystetrin for i alt 10 ml krypter i rystebuffer.</li>
	<li>Tag 20 μL af kryptaffjedringen i en petriskål og tæl antallet af krypter under et mikroskop. Kryptkoncentrationen i krypter/μL beregnes. Afhængigt af koncentrationen fortyndes prøverne for at opnå 5 krypter/μL på platingstidspunktet (1000 krypter/cm2).</li>
	<li>Rør med isolerede krypter drejes ved hjælp af bordpladecentrifuge ved 400 x g i 10 min ved 4 °C.</li>
	<li>I mellemtiden fjernes 48-brønds plade/skær/kammerdias fra inkubatoren, og den anbringes i biosikkerhedsskabet. Belægningsopløsningen aspireres ved hjælp af P200, og pladen efterlades med låget let forskudt, indtil cellerne er klar til at blive belagt.</li>
</ol>4. Dyrkning af 2D monolayer
BEMÆRK: For en detaljeret protokol om, hvordan man genererer tarm epitel monolayers fra 3D-kolonoider kontrollere protokoller af Estes og Kovbasnjuk labs (7,11).
<ol><li>Rystebufferen fjernes med 10 mL serologisk pipette. Sørg for, at pellet er intakt og kan bruge P1000 til at fjerne væske venstre. Ophæng pelletlen igen i 3 mL LWRN komplet medier og pipette op og ned med P1000. Der tilsættes 200 μL krypter til hver brønd af en forlakeret 48-brønds plade/kammerrutsjebane og inkuberes i en 5% CO2-inkubator ved 37 °C.</li>
	<li>Den følgende dag aspirere medierne ved hjælp af P200 og tilføje nye medier. Cellerne bliver sammenløbende i 24-48 timer.</li>
	<li>For cellekulturmembranindsatser tilsættes 200 μL-krypter (5 krypter/μL) oven på indsatserne og 600 μL komplette L-WRN-medier til den nederste del. Den følgende dag aspirere medierne ved hjælp af P200 og tilføje friske medier kun til det øverste kammer. Pladen inkuberes i en 5% CO 2-inkubator ved 37 °C. Transepithelial Electrical Resistance (TEER) måles hver dag ved hjælp af Epithelial Volt/Ohm meter (EVOM). BEMÆRK: Hvis kulturen har en TEER-aflæsning på over 300 Ω,cm2, er de beregnet til at blive sammenløbet. Sammenløb opnås i 3-4 dage. Skift medie hver anden dag.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Quiros, M., Nusrat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+wound-associated+cells+and+mediators+in+orchestrating+gastrointestinal+mucosal+wound+repair.">Contribution of wound-associated cells and mediators in orchestrating gastrointestinal mucosal wound repair.</a> Annual Reviews in Physiology. 81, 189-209 (2019).</li><li>Blutt, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+organoids+to+study+regenerative+responses+to+intestinal+damage.">Use of organoids to study regenerative responses to intestinal damage.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 317 (6), 845-852 (2019).</li><li>Zhang, M., Liu, Y., Chen, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+3D+human+gastrointestinal+organoids:+principle+and+applications.">Generation of 3D human gastrointestinal organoids: principle and applications.</a> Cell Regeneration. 9 (1), 6 (2020).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Zachos, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+enteroids/colonoids+and+intestinal+organoids+functionally+recapitulate+normal+intestinal+physiology+and+pathophysiology.">Human enteroids/colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (8), 3759-3766 (2016).</li><li>Kozuka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+human+and+mouse+intestinal+epithelial+cell+monolayer+platform.">Development and characterization of a human and mouse intestinal epithelial cell monolayer platform.</a> Stem Cell Reports. 9 (6), 1976-1990 (2017).</li><li>In, J. G., Foulke-Abel, J., Clarke, E., Kovbasnjuk, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+colonoid+monolayers+to+study+interactions+between+pathogens,+commensals,+and+host+intestinal+epithelium.">Human colonoid monolayers to study interactions between pathogens, commensals, and host intestinal epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (146), e59357 (2019).</li><li>Cardenas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-+and+three-dimensional+bioengineered+human+intestinal+tissue+models+for+cryptosporidium.">Two- and three-dimensional bioengineered human intestinal tissue models for cryptosporidium.</a> Methods in Molecular Biology. 2052, 373-402 (2020).</li><li>Moon, C., VanDussen, K. L., Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+primary+mouse+intestinal+epithelial+cell+monolayer+culture+system+to+evaluate+factors+that+modulate+IgA+transcytosis.">Development of a primary mouse intestinal epithelial cell monolayer culture system to evaluate factors that modulate IgA transcytosis.</a> Mucosal Immunology. 7 (4), 818-828 (2014).</li><li>VanDussen, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+enhanced+human+gastrointestinal+epithelial+culture+system+to+facilitate+patient-based+assays.">Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays.</a> Gut. 64 (6), 911-920 (2015).</li><li>Zou, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+intestinal+enteroids:+New+models+to+study+gastrointestinal+virus+infections.">Human intestinal enteroids: New models to study gastrointestinal virus infections.</a> Methods in Molecular Biology. 1576, 229-247 (2019).</li><li>Heijmans, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ER+stress+causes+rapid+loss+of+intestinal+epithelial+stemness+through+activation+of+the+unfolded+protein+response.">ER stress causes rapid loss of intestinal epithelial stemness through activation of the unfolded protein response.</a> Cell Reports. 3 (4), 1128-1139 (2013).</li><li>Nik, A. M., Carlsson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+intact+intestinal+epithelium+from+mesenchyme.">Separation of intact intestinal epithelium from mesenchyme.</a> Biotechniques. 55 (1), 42-44 (2013).</li></ol>

Forfatterne har ingen interessekonflikter.

Vores protokol giver en hurtig, reproducerbar og pålidelig metode til at generere direkte primære 2D IEC monolayers. En af de vigtigste forskelle i vores protokol sammenlignet med tidligere offentliggjorte protokoller til at generere kolon epitel monolayers er, at vi ikke skære tyktarmen i små stykker for at befri krypter. I stedet tilpassede vi en protokol til at adskille tarmepitelet fra mesenchym13 ved en kombination af kemiske og mekaniske kræfter til at frigive krypter i et ekstremt rent præparat , (Figur 2), hvilket giver forskeren ideelt materiale til at generere primære kulturer. Vores isolationsmetode kan også bruges til at generere 3D-enteroider og kolonoider. Det er vigtigt at gøre en krypt tælle hver gang et eksperiment udføres for at normalisere antallet af krypter, der bliver belagt. Variabler såsom kolon pølse turgor, hastighed af isolation, kan brugerekspertise påvirke antallet af krypterer isoleret. Den foreslåede plating kryptkoncentration, der er nævnt i protokollen, er et udgangspunkt, men enhver bruger, der skal tage højde for brugerdrevne variabler, skal optimere den. Vi har brugt denne teknik med mandlige og kvindelige WT-mus fra 8 til 20 uger, og vi har ikke set store forskelle i celleoverlevelse, i teorien har krypter isoleret fra yngre mus bedre chancer for at overleve. Krypter er belagt i overskud, da kun en lille procentdel af dem fastgøres til overfladen og overlever. En balance, hvor der er nok krypter til at have en 50% sammenløb en dag efter plating men ikke alt for mange krypter, hvor de døende krypter vil have en cytotoksisk effekt er målet. LWRN medier skal fjernes forsigtigt 24 timer efter plating at fjerne døde krypter og snavs, skal dette gøres omhyggeligt for at undgå at løsne celler, der allerede vokser som en monolayer.
Efter den første fjernelse af LWRN-medier skal brugeren beslutte, om forsøgsbetingelserne kræver primære IEC-monolag, der forbliver tættere på stamceller og tilføjer friske LWRN-medier, eller om der ønskes differentiering af monolayer, erstattes med differentieringsmedier. Den vigtigste faktor i denne protokol er at sikre kolonens integritet under isolationsprocessen. Hvis der opstår et brud, kan pølsen forkortes for at eliminere det beskadigede område. Før pølsen sættes i EDTA, skal du sørge for, at knuderne er så stramme som muligt. Hvis pølsen deflateres efter EDTA-inkubationen, kan protokollen fortsættes med ringe eller ingen effekt i det samlede kryptudbytte. Hvis den gentagne sprøjte ikke er tilgængelig, kan en almindelig mikropipettespids, der er fastgjort til en almindelig sprøjte, også bruges til inflations- og deflationsprocessen. Hvis der ikke findes en cellegendannelsesopløsning, kan inflations- og deflationstrinnene også udføres i EDTA (2mM tyndtarmen, 50 mM kolon), men denne substitution anbefales ikke. Hvis sammenløb ikke er påkrævet, kan krypter kun vokse i plader belagt med kollagen og endda i ubestrøget plader. Brug kun ubestrøget plader tilfælde er der ingen anden mulighed, men cellerne vil ikke vokse sundt, som de ville i kollagen-coatede plader. Når det kommer til kultur sundhed og stabilitet, monolayers belagt med plast er sunde i 4 til 5 dage, mens monolag belagt i transwells kan transporteres i op til 8 dage.
En af de vigtigste begrænsninger ved denne metode er de cellemedier, der kræves for at dyrke epitelkolonimonomererne. LWRN-celler er tilgængelige på ATCC, men LWRN-betinget mediegenerering er arbejdskrævende og kræver adgang til et fluorescerende spektrometer for at bestemme Wnt-aktivitet. Differentieringsmedier kræver en række reagenser, der tilsættes frisk før brug, hvilket gør det til en kedelig proces. Endelig er de fleste af disse reagenser dyre og er nemme at brænde reagenserne i et hurtigt tempo. Hvis et laboratorium ønsker at etablere denne teknik uden tidligere tarm primær celle kultur, anbefales det stærkt at finde en samarbejdspartner / college med erfaring og uddanne et af deres medlemmer.
Vedligeholdelse af 3D-kultur kan være dyrt på grund af omkostningerne ved kældermembranmatrix medium og store mængder konditionerede medier, der er nødvendige for organoidkulturer, men det har den fordel at bruge et reduceret antal mus, og de genererede strukturer kan passeres mange gange. Enteroider (afledt af tyndtarmen) er relativt nemme at isolere og vedligeholde, mens kolonoider er mere sarte, vokser i et langsommere tempo og har en mere begrænset passagekapacitet. Monolayer generation fra 3D-koloider kræver en uforholdsmæssig stor mængde af 3D-strukturer, der gør den slags eksperimenter tidskrævende og dyrt. Tværtimod, direkte epitel kolon monolayer prep er hurtig og er en hurtig måde at opnå resultaterne. Et kolon prep kan generere et sammenløbet område på 75 cm2 (10 til 15 mL konditioneret medier, erstatter en gang) 2 til 3 dage efter plating (dette område ville kræve 144 brønde af 3D-kolonoider, hvilket betyder næsten 6mL matrigel og mere end 250 mL konditioneret medier). Det lavere forbrug af medier, billig vedligeholdelse af cellekulturen og evnen til at udføre funktionelle tests og hurtig downstream-behandling er store fordele ved epitelkolonimonomerer.
Denne protokol er et værdifuldt værktøj i studiet af tarm epitelcellebiologi inden for områder som celle vedhæftning, polaritet og differentiering. Det giver den fordel at generere primære cellekulturer fra genetisk modificerede mus (knock-out, overexpressing, journalister). De primære tarmepitele monolayers giver nem adgang til de apikale og basolaterale overflader (når de er belagt på transwells), hvilket gør det muligt at studere permeabilitet, barriere og transepithelial migration af forskellige celletyper. Endelig kan denne model være nyttig på forskellige områder som værtspatogen interaktioner, epitelskader og reparation og lægemiddelopdagelse.

Tarmepitele epitelceller (IEC) linje tarmene danner en selektivt gennemtrængelig barriere, der tillader næringsstof-og vandabsorption og samtidig forhindre mikroorganismer og toksiner at komme ind i kroppen 1. Tarmslimhinden består af luminale fremskrivninger kaldet villi (kun til stede i tyndtarmen) og invaginationer ved navn krypter. Villi og overfladen af kolonkrypter er dækket af differentierede epitelceller, mens bunden af krypterne består af stamceller, der gør den hurtige fornyelse af tarmepiteen, som har en omsætning fra 3 til 7 dage. Tarmstamceller (ISC) er ikke kun vigtige for at opretholde tarmhomøostase, men for tilstrækkelig reparation af beskadiget epithelia2.
Studiet af tarm-epitheliabiologien var begrænset af manglen på primære cellekulturer, hvor transformerede cellelinjer var det eneste tilgængelige værktøj. Tarm epitel model cellelinjer er ikke i stand til præcist at kopiere fysiologien af det normale tarmepitetel. Udviklingen af 3D-kulturer afledt af ISC gav tarmslimhindebiologer in vitro-modeller, der ligner in vivo tarmslimkosale forhold3. Krypter kan let isoleres fra murinprøver, indlejret i et kældermembranmatrixmedium (f.eks. Matrigel) og dyrkes i konditionerede medier, der indeholder Wnt3a, R-spondin og Noggin, der genererer 3D-strukturer kendt som enteroider (tyndtarmen) eller tyktarmsoider (tyktarm)4. Enteroider og koloider er polariserede sfæriske strukturer, hvor det apikale domæne står over for en intern lumen, og basolateralområdet er i direkte kontakt med den ekstracellulære matrix. Enteroider og kolonoider indeholder alle større differentierede intestinale epitelundertyper som Enterocytter/Colonocytes, Paneth, Enteroendocrine og Goblet-celler, og de forekommer i relativt samme proportioner som i den del af tarmen, hvor de blev isoleret fra5. Selvom 3D-enteroider og kolonoider udgør et stort fremskridt i undersøgelsen af tarmudvikling og fysiologi, udgør disse modeller visse ulemper såsom begrænset adgang til den apikale overflade af epitelcellerne (lumen) og evnen til at skalere kulturer op eller ned for at opnå højgennemstrømningsscreening af molekyler af interesse. For at overvinde disse begrænsninger blev der genereret protokoller for at opnå primære 2D-kulturer i IEC afledt af 3D-enteroider / koloider. 2D enteroider / kolonoider vokse som ark celler ligesom model cellelinjer gør, og er ideelle til at studere tarm sår reparation, host-patogen interaktioner, og regenerativ medicin blandt andre. Flere offentliggjorte artikler beskriver, hvordan man genererer 2D monolayers fra 3D-strukturer eller direkte fra tarmkrypter (se6,7,8,9,10,11), men disse metoder har tendens til at være arbejdskrævende og svære at reproducere. En hurtig, enkel og reproducerbar metode til at opnå monolag direkte fra frisk isolerede muse tarmkrypter er skitseret i denne protokol.
Her forklarer vi i detaljer processen for kryptudvinding med minimal generering af snavs, ekstracellulært matrixvalg og forskellige overflader og applikationer til denne teknik. Denne eksperimentelle tilgang blev optimeret til kolonkrypter, men lignende resultater opnås, når de anvendes til tyndtarmen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-004CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement (50X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen from human placenta (type IV)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>85529-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP220-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s phosphate buffered saline, with Ca2+ and Mg2+ (DPBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-030-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epithelial Volt/Ohm meter</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>0-10K&#937; with STX2 (EVOM2)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>51201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-016-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Firefly Luciferase assay</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>30085-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geneticin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10131-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25060CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant EGF</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>236-EG</td>
			<td>Stock Concentration: 500&#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant Wnt-3A</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>W3a-H-005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10687010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LWRN cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular grade water</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-000-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165-5G</td>
			<td>Stock Concentration: 500mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin</td>
			<td>Conditioned media</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Lab-Tek Chamber slide system</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7182-1PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pencillin-Streptomycin (10,000U/mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30002CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospahte buffered saline, Ca2+ and Mg2+ free (PBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic 20G feeding tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-810-46</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rh-laminin-521</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A29248</td>
			<td>Stock concentration: 100&#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roboz Surgical 4-0 Silk Black Braided 100YD</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9452680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOPflash HEK293 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell Permeable supports (0.4&#181;m)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3470</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of murine primary colon epithelial monolayers from intestinal crypts

Tarmepitelet består af et enkelt lag celler, der fungerer som en barriere mellem tarmens lumen og det indre af kroppen. Forstyrrelse i kontinuiteten af denne barriere kan resultere i inflammatoriske lidelser som inflammatorisk tarmsygdom. En af begrænsningerne i studiet af tarmepitelebiologi har været manglen på primære cellekulturmodeller, som har tvunget forskere til at bruge modelcellelinjer afledt af carcinomer. Fremkomsten af tredimensionelle (3D) enteroider har givet epitelbiologer et kraftfuldt værktøj til at generere primære cellekulturer, ikke desto mindre er disse strukturer indlejret i ekstracellulær matrix og mangler den modenhed, der er karakteristisk for differentierede tarmepitele celler. Flere teknikker til at generere tarm epitel monolayers er blevet offentliggjort, men de fleste er afledt af etablerede 3D enteroids gør processen besværlig og dyr. Her beskriver vi en protokol til at generere primære epitel kolon monolag direkte fra murin tarm krypter. Vi beskriver også eksperimentelle tilgange, der kan bruges med denne model, såsom generering af sammenflydende kulturer på gennemtrængelige filtre, sammenløbet monolayer til ridsesårhelingsundersøgelser og sparsomme og sammenflydende monolayers til immunfluorescensanalyse.

For at illustrere pålideligheden af de primære epitel kolonmonolayerkulturer vises et resumé af kryptens isolation og repræsentative billeder, der er afledt af protokollen. Brugeren skal huske på, at de isolerede krypter er dyrket under sterile forhold, så en korrekt dissektion og rengøring af tyktarmen er en prioritet. Figur 1 indeholder vigtige trin under krypteringsisolering. Isolerede krypter (figur 2A) tælles nu og koncentreres (Figur 2B) for at opnå en koncentration på 5 krypter/μL. Efter en koncentreret forberedelse af krypter vil cellerne blive belagt i det ønskede format (kulturskål, membranindsatser eller kammerdias) og inkuberet med de relevante medier afhængigt af eksperimentelle behov. Figur 3 viser kulturudvikling efter 24 og 48 timers kultur i 48-brøndsplader. Cellerne inkuberes, indtil den ønskede sammenløb er nået. For at eksemplificere mulige anvendelser af denne metode tillod vi 48-brønds pladebrønde at nå sammenløb og fortsatte med at lave en ridse-såranalyse. Figur 4 viser en nyoprettet ridse (Figur 4A) i et 2D-kolonformet monolag og det samme sår 24 timer efter (Figur 4B). Det er klart, at kulturen stadig er sund og levedygtig, og at der er sårreparation. Hvis du vil generere differentierede monolag, ændres mediet fra LWRN til differentieringsmedier. Differentiering opnås ved at vise høje TEER-værdier (Figur 5A), fald i ISC-markører ((Leucine-rige repeat-holdige G-protein koblet receptor 5 (Lgr5) og Achaete-scute som 2 (Ascl2)) og forøgelse af differentieringsmarkører ((Alanyl aminopeptidase (Anpep), Mucin 2 (Muc2), lysozyme 1 (Lyz1), Saccharose iso-maltase (Sis) og Chrmogranin A (Chga))(Figur 5B,C) af PCR. Andre markører som CDX2 og KRT20 kan også inkluderes i dette panel. Ud over mRNA-ekspressionsniveauer vises udseendet af undertyper af differentierede epitelceller i 2D-kolonoider dyrket under differentieringsbetingelser også ved immunfluorescens (Muc2 og Chga; Figur 5D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62156/62156fig01.jpg"> Figur 1:Prøveforberedelse til sund generation af monolag. Prøveforberedelse er afgørende for generering af sunde monolag. De vigtigste trin i isolationsprocessen er afbildet i dette tal for at gøre det lettere for læseren. Tyktarmen er fjernet fra musen, og sørg for at der ikke er nogen pels rester. Fjern forsigtigt afføringen, og sørg for, at du ikke perforerer tyktarmen; dette er af afgørende betydning, da tyktarmen skal være i stand til at holde luft og blive oppustet og deflateret. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62156/62156fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62156/62156fig02.jpg"> Figur 2: Antal kryptisolationer og -koncentration. (A) Colon krypter efter rystelse af kolon pølser. Billedet viser et felt på en 20 μL drop. (B) Kryptkoncentration for at opnå 5 krypter/μL. Skalabjælke: 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62156/62156fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62156/62156fig03.jpg"> Figur 3: Primær vækst iIEC Monolayer( A) 2D IEC-monolag efter 24 timers formædning og fjernelse af celleaffald. (B) Sammensatte 2D IEC monolag 48 timer efter plating. Skalalinje: 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62156/62156fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62156/62156fig04.jpg"> Figur 4: Ridsesårsanalyser ved hjælp af murin primær IEC. Billeder, der viser sårheling efter en ridse blev foretaget i epitel kolon monolayer. Skalalinje: 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62156/62156fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62156/62156fig05.jpg"> Figur 5:Differentiering af epitelkolonimonomerer. Differentieringsmedier forårsager et fald i mRNA-ekspressionen af (B) stamcellemarkører og opregulering af (C) differentieringsmarkører. (D) Markører for specialiserede differentierede epitelceller som Muc2 og Chromogranin-A kan også påvises via immunfluorescens af direkte 2D-koloider. Skalalinje: 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62156/62156fig05large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Murine Primary Colon Epithelial Monolayers from Intestinal Crypts at JoVE.com

Generation of Murine Primary Colon Epithelial Monolayers from Intestinal Crypts

I denne protokol beskriver vi, hvordan man genererer murin primære epitel kolonmonomer direkte fra tarmkrypter. Vi tilbyder eksperimentelle tilgange til at generere sammenflydende monolayers på gennemtrængelige filtre, sammenflydende monolayers til ridseredning og biokemiske undersøgelser og sparsomme og sammenflydende monolayers til immunfluorescensanalyse.

Generation af Murine Primary Colon Epitel Monolayers fra Tarmkrypter

The intestinal epithelium is comprised of a single layer of cells that act as a barrier between the gut lumen and the interior of the body. Disruption in ...

Vores protokol giver en hurtig, reproducerbar og pålidelig metode til at generere direkte primære tarmepitelemonomer på forskellige overflader med minimalt snavs. De vigtigste fordele ved denne protokol er lavt forbrug af medier og lav omkostningsvedligeholdelse af cellekultur. Det er en hurtig metode til at udføre funktionelle tests og hurtige downstream-applikationer.Denne protokol vil give indsigt i undersøgelsen af sårreparation, permeabilitetsbarriere og transepithelial migration af forskellige celletyper. Denne model kan også være nyttig i værtspatogeninteraktion, beskadiget epitel og lægemiddelopdagelse. Til at begynde med tilsættes 200 mikroliter belægningsopløsning til hver brønd af en 48-brønds plade og kammerrutsjebane.Forinkubat både i en 5% kuldioxidinkubator ved 37 grader Celsius i to timer. Coat 0,4 mikrometer cellemembran skær med 200 mikroliter af kollagen opløsning. Inkubat pladen med membranindsatserne ved fire grader Celsius i 30 minutter, og overfør den derefter til en 5% kuldioxidinkubator ved 37 grader Celsius i to timer.Desinficere en aflivet mus med 70% ethanol, derefter dissekere tyktarmen fra endetarmen til cecum ved hjælp af saks og pincet. Skyl forsigtigt afføringen ud med iskold PBS i en 10 milliliter sprøjte udstyret med et 20 gauge fodringsrør. Fjern det proksimale kolon og skub det distale kolon forsigtigt på 20 gauge fodringsrøret.Bind tyktarmen i slutningen af røret med 4-0 silke sutur tråd. Vend tyktarmen vrangen ud over den bundne ende og binde den anden ende med tråd, derefter skære tyktarmen under spidsen af fodring rør ved hjælp af kirurgisk saks. Åbn forsigtigt den ubundne ende af den omvendte kolon på spidsen af en 1,25 milliliter gentages sprøjten ved hjælp af stemplet.Skub den ubundne ende af den omvendte kolon på sprøjten og binde den tæt med en tråd. Sæt stemplet ind i sprøjten og oppust tyktarmen, indtil det ser turgent uden synlige rynker. Den oppustede tyktarmspølse anbringes i et 15 milliliter rør, der indeholder fem milliliter cellegenvindingsopløsning, på is i 20 minutter.Oppust og tøm tyktarmen en gang hvert femte minut. Bind den oppustede kolon under spidsen af den gentagne sprøjte ved hjælp af 4-0 silke sutur tråd. Skær tyktarmspølsen af den gentagne sprøjte og læg den i et 15 milliliter rør, der indeholder 10 milliliter 50 millimolar EDTA i 40 minutter.Drej røret ved fire grader Celsius. Udskift EDTA-opløsningen med fem milliliter rystebuffer, og ryst pølsen manuelt i lodret position i to minutter. Dekanter rysteopløsningen i et nyt 15 milliliterrør, og gentag rystetrinnet, indtil der opsamles i alt 10 milliliter krypter og rystebuffer.Tæl antallet af krypter i 20 mikroliter af suspensionen under et mikroskop og fortynd prøven for at opnå koncentrationen af fem krypter pr. mikroliter. Centrifuge kryptprøven ved 400 gange G i 10 minutter ved fire grader Celsius. I mellemtiden skal du fjerne 48-brøndspladen og membranindsatserne fra inkubatoren og placere den i biosikkerhedsskabet.Udsug belægningsopløsningen ved hjælp af en P200-pipette, og lad pladen stå med låget lidt forskudt, indtil cellerne er klar til at blive belagt. Efter centrifugering af kryptophænget skal du fjerne rystebufferen og genbruge den intakte pellet i tre milliliter LWRN-komplette medier. Tilsæt 200 mikroliter af krypter til hver brønd af den forlakerede 48-brønds plade og kammerrutsjebane og inkubat både i en 5% kuldioxidinkubator ved 37 grader Celsius.Den næste dag kan du aspirere medierne og tilføje nye medier. Generelt bliver cellerne sammenfald i 24 til 48 timer. Til cellekulturmembranindsatser tilsættes 200 mikroliter krypter til toppen af indsatserne og 600 mikroliter af komplette LWRN-medier til bunden.Den næste dag, aspirere medierne og tilføje friske medier kun til det øverste kammer. Inkubat pladen i en 5% kuldioxid inkubator ved 37 grader Celsius. Mål transepithelial elektrisk modstand hver dag ved hjælp af en epitel volt / ohm meter.Efter isoleringen af krypterne fra et murinkolon og verificeret koncentrationen var kryptaffjedringen koncentreret til fem krypter pr. mikroliter. 48-godt plade brønde blev udsat for en ridse sår assay ved at nå cellen sammenløb. Efter 24 timer blev der observeret sårreparation, der indikerer, at kulturen var sund og levedygtig.Der blev opnået højere niveauværdier, da medierne blev ændret fra LWRN til differentieringsmedier. Der blev også observeret et fald i ISC-markører og en stigning i differentieringsmarkører, der indikerer, at de differentierede monolag blev genereret med succes. Desuden blev udseendet af undertyper af differentierede epitelceller dyrket under forskellige forhold vist ved immunfluorescens.Når du forsøger denne protokol, er det vigtigt at sikre, at tyktarmen ikke er bristet på noget tidspunkt under prep og forbliver oppustet til at frigive krypter i ekstremt ren forberedelse. Når 2d intestinal epitelcellemonomer dannes, kan vi udføre immunfluorescens, ridsesår og gennemtrængelighedsanalyser og andre downstream-applikationer. Dette vil give viden om sårheling, migration af forskellige celletyper og epitelreparation og skadesundersøgelser.

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

Isolering af Primære myofibroblasts fra mus og Human tyktarmsvæv

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Cryosectioning Method for Microdissection of Murine Colonic Mucosa

Cryosectioning Metode til mikrodissektion af murint tyktarmsslimhinde

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The ...

Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation

Intestinal epitelregenerering som reaktion på ioniserende bestråling

The intestinal epithelium consists of a single layer of cells yet contains multiple types of terminally differentiated cells, which are generated by the ...

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

Primær kultur af porcine retinale pigmentepitelceller

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...

Culture of Piglet Intestinal 3D Organoids from Cryopreserved Epithelial Crypts and Establishment of Cell Monolayers

Kultur af pattegrise Intestinal 3D organoider fra kryopræserverede epitelkrypter og etablering af cellemonolag

Intestinal organoids are increasingly being used to study the gut epithelium for digestive disease modeling, or to investigate interactions with drugs, ...

Unveiling Inflammatory Arthritis&#58; Exploring Functions of Synovial Cells

Isolation and Culture of Primary Synovial Macrophages and Fibroblasts from Murine Arthritis Tissue

Isolation and Culture of Primary Synovial Macrophages and Fibroblasts from Murine Arthritis Tissue (Video) | JoVE 

Isolering og dyrkning af primære synoviale makrofager og fibroblaster fra murine arthritisvæv

Rheumatoid arthritis is an autoimmune disease that leads to chronic inflammation of joints. Synovial macrophages and synovial fibroblasts have central ...

3D Culture of Organoids from Murine Intestinal Crypts and Single Stem Cell

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research (Video) | JoVE 

3D-dyrkning af organoider fra murinale krypter og en enkelt stamcelle til organoidforskning

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine ...

Epithelial Effects of Intestinal Inflammation on Established Murine Colonoids

Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids

Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids (Video) | JoVE 

Undersøgelse af epitelvirkningerne af tarmbetændelse in vitro på etablerede murinkolonoider

The intestinal epithelium plays an essential role in human health, providing a barrier between the host and the external environment. This highly dynamic ...