Name: generation of murine primary colon epithelial monolayers from intestinal crypts
Uploaded: 2021-02-06T14:30:00
Duration: 6 min 57 s
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Diese Arbeit wurde durch einen Crohn's and Colitis Foundation Career Development Award (544599, an MQ) und die NIH-Stipendien (DK055679, DK089763, DK059888, an AN) unterstützt. Wir danken dem Michigan Medicine Translational Tissue Modeling Laboratory für seine kontinuierliche Hilfe und den Zugang zu seinen Reagenzien und Protokollen.

Alle unten beschriebenen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee der University of Michigan genehmigt und durchgeführt.
1. Herstellung von Reagenzien zur Kryptenisolierung und -kultur (in Gewebekulturhaube vorbereiten)
<ol><li>50 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA): 50 ml 0,5 m Schaft zu 450 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung ohne Calcium (Ca2+)und Magnesium(Mg2+)hinzufügen, um 500 ml zuzubereiten. In diesem Protokoll bezieht sich PBS auf PBS ohne Kalzium und Magnesium, sofern nicht anders angegeben.</li>
	<li>Schüttelpuffer: 7,4 g Saccharose (43,3 mM) und 5 g Sorbit (54,9 mM) in PBS auflösen, um 500 ml vorzubereiten.</li>
	<li>L-WRN (L-Wnt-3A, R-Spondin und Noggin) Medien: Ergänzung Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 (DMEM/F12) (780 mL) mit 20% Fetal Bovine Serum (FBS) (200 ml), 1x handelsübliches Glutaminpräparat (10 ml), 100 U/ml Penicillin und 100 g/ml Streptomycin (10 ml) und Filtersterilisation mit 0,22 μm Filter.<ol>
<li>Holen Sie sich L-WRN-Zellen durch ATCC, wachsen Sie in T175-Kolben und wählen Sie mit Geneticin und Hygromycin. Medienwechsel und -sammlung für 12 Tage. HINWEIS: Jede Charge von Medien wird mit einem TOPflash Wnt Reporter-Assay auf Wnt-Aktivität getestet. In diesem Fall wurden die Michigan Medicine Translational Tissue Modeling Laboratory Protokolle (https://www.umichttml.org/protocols) befolgt. Die TOPflash HEK 293 Zelllinie wird in einem T75-Kolben bis zur Konfluenz gezüchtet, trypsinisiert und auf eine 96-Well-Platte plattiert. Am nächsten Tag werden verschiedene Verdünnungen der gesammelten Medien in die Zellen eingelegt und in einem 5% CO2 Inkubator bei 37 °C über Nacht inkubiert. Am nächsten Tag werden die Zellen lysiert und der Firefly Luciferase-Assay wird gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Der Assay wird mit rekombinantem Wnt-3A normalisiert. Das Medium wird in 25 mL Aliquoten in 50 mL konischen Rohren aufgeteilt und bei -80 °C gelagert.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Basismedien: Für 500 ml, Ergänzung Advanced DMEM/F12 (448 ml) mit 2x handelsüblichem Glutaminpräparat (10 ml), 20 mM HEPES (10 ml), 100 U/ml Penicillin und 100 g/ml Streptomycin (10 ml), 2 mM N-Acetyl-L-Cystein (2 ml), N2 Ergänzung (10 ml) und B27 Ergänzung (20 ml), Filter sterilisieren mit 0,22 μm Filter. Teilen Sie das Medium in 25 ml Aliquoten in 50 ml konischem Rohr und lagern Sie es bei -80 °C.</li>
	<li>LWRN-Komplettmedien: Kombinieren Sie 25 ml LWRN-Medien mit 25 ml Basismedien und ergänzen Sie sie mit 200 ng/ml Epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) (20 μL) und 2x antibiotisch-antimykotische Lösung (1 ml). Lagern Sie das komplette Medium bei 4 °C.</li>
	<li>Kollagen und Laminin: 5 mg Pulver in 5 ml filtersterilisierter 100 mM Essigsäure auflösen (60 μL Essigsäurestock zu 9,94 ml molekularem Wasser hinzufügen), um eine Stammkonzentration von 1 mg / ml zu erzeugen. Drehen Sie bei 4 °C für 4 h und machen Sie 100 μL Aliquoten in 0,2 ml Röhrchen. Bei -20 °C einfrieren. Laminin wird in einer Lagerkonzentration von 100 μg/ml gekauft.</li>
	<li>Komplette Medien ohne Wachstumsfaktoren (CMGF-): Supplement Advanced DMEM/F12 (500 mL) mit 1x handelsüblichem Glutaminpräparat (5 mL), 10 mM HEPES (5 mL), 100 U/ml Penicillin und 100 g/ml Streptomycin (5 ml).</li>
	<li>Differenzierungsmedien: Zu 9,2 ml CMGF-Medien werden 200 μL B27-Ergänzung, 100 μL N2-Ergänzung, 20 μL N-Acetyl-L-Cystein, 500 μL Noggin-Medium12 (aus Noggin-produzierenden Zellen) und 2 μL EGF hinzugefügt, um 10 ml Differenzierungsmedien herzustellen.</li>
</ol>2. Vorbereitung von Platten, Kammerträgern und Zellkulturmembraneinsätzen
<ol><li>Beschichtung von 48-Well-Platten- und Kammerträgern zur Beschichtung von 2D-Monoschichten: Verwenden Sie die Beschichtungslösung, die Aus Laminin (1:40 Verdünnung, siehe Materialtabelle)und Kollagen (1:30 Verdünnung) in kalter Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit Ca2+ und Mg2+ (DPBS) besteht. Fügen Sie 200 μL Beschichtungslösung zu jeder Vertiefung hinzu und bebrüten Sie den Platten-/Kammerträger in einem 5% CO 2-Inkubator bei 37 °C für mindestens 2 h vor.</li>
	<li>Beschichtung von 0,4 μm Zellkulturmembraneinsätzen: Kollagen in molekularem Wasser in 1:30 verdünnen und jedem Einsatz 200 μL hinzufügen. Halten Sie die Platte mit dem Membraneinsatz 30 min lang bei Eis bei 4 °C. Nach 30 min Inkubation die Platte in einem 5% CO2 Inkubator bei 37 °C für 1,5-2 h aufbewahren. Polyester- und Polycarbonat-Membraneinsätze liefern vergleichbare Ergebnisse. HINWEIS: Jede Gewebekulturplatte kann mit diesem Protokoll ausgesät werden (Up- und Downscaling kann durchgeführt werden), indem das Kollagen- / Lamininvolumen angepasst wird, um eine vollständige Abdeckung der Beschichtungsoberfläche zu erhalten.</li>
</ol>3. Krypto-Isolation
HINWEIS: Bevor Sie mit der Dissektion beginnen, bereiten Sie kollagen- und/oder lamininbeschichtete Platten-/Membraneinsätze/Kammerträger vor und lassen Sie sie in einem 5% CO2 Inkubator bei 37 °C. Bereiten Sie eine saubere Werkbank und sterile chirurgische Instrumente vor, die für die Operation geeignet sind, sowie eine biologische Sicherheitswerkbank für die Kultivierung von 2D-Monoschichten. Bestätigen Sie, dass alle anderen Standardgeräte für die 2D-Monoschichtkultur wie befeuchteter CO 2-Inkubator, Tischzentrifugen (bei 4 °C gehalten), Mikroskop und Pipetten (einschließlich serologischer Pipetten) fertig sind. 
<ol><li>Verwenden Sie C57Bl/6 Mäuse, 8-12 Wochen alt. Euthanasiern Sie Mäuse mit einer zugelassenen Methode der Euthanasie.</li>
	<li>Besprühen Sie die Mäusekadaver mit 70% igem Ethanol (EtOH) -Lösung, um den Sezierbereich zu reinigen und überschüssiges EtOH mit Papiertaschentüchern zu entfernen. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Kryptationsreagenzien (z. B. PBS, 50 mM EDTA, Schüttelpuffer) kalt gehalten werden. Diese Reagenzien können einen Tag vorher zubereitet werden und sind bei Lagerung bei 4 °C mindestens 3 Monate gut einsetzbar. Stellen Sie außerdem sicher, dass das LWRN-Komplettmedium bis zur Verwendung in einem Perlen-/Wasserbad bei 37 °C aufbewahrt wird.</li>
	<li>Sezieren Sie mit einer sauberen Dissektionsschere und Einer Zette den Dickdarm vom Rektum bis zum Blinddarm. Halten Sie das Ende des Dickdarms mit einer Zette und spülen Sie den Kot sehr vorsichtig mit eiskaltem PBS in einer 10-ml-Spritze ab, die mit einem 20-G-Ernährungsröhrchen ausgestattet ist (Abbildung 1A). Stellen Sie sicher, dass Sie den Dickdarm nicht reißen.<ol>
<li>Entfernen Sie den proximalen Dickdarm. Dies ist der Teil des Dickdarms, der der ileozekalen Verbindung am nächsten ist.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mit einer Zette den distalen Dickdarm vorsichtig auf die 20 G-Zuführsonde schieben und den Dickdarm am Ende des Sondens durch die Spitze mit 4-0 Seidennähtfaden abkneiden (Abbildung 1B).</li>
	<li>Kehren Sie den Dickdarm von innen nach außen mit den Fingern über das abgebundene Ende und binden Sie das andere Ende mit 4-0 Seidennähtfaden. Schneiden Sie mit einer chirurgischen Schere den Dickdarm unterhalb der Spitze der Ernährungssonde ab (Abbildung 1C,D, E).</li>
	<li>Öffnen Sie mit dem Kolben einer 1,25 ml Wiederholungsspritze vorsichtig das ungebundene Ende des invertierten Dickdarms auf die Spitze einer 1,25 ml Wiederholungsspritze. Schieben Sie den umgekehrten Doppelpunkt auf das Ende der Spritze und binden Sie ihn fest mit 4-0 Seidennähtgewinde (Abbildung 1F, G).</li>
	<li>Führen Sie den Kolben in die Spritze ein und blasen Sie den Dickdarm auf, um eine Wurst zu bilden. Aufblasen, bis die Darmwurst ohne sichtbare Falten turgen aussieht (Abbildung 1H).</li>
	<li>Legen Sie die Spritze/ den Dickdarm in ein 15-ml-Röhrchen mit 5 ml Zellrückgewinnungslösung für 20 minuten auf Eis, blasen Sie den Dickdarm einmal alle 5 Minuten auf und entleeren Sie sie (Abbildung 1I). Die Wurst muss während der Inkubation aufgeblasen bleiben.</li>
	<li>Mit 4-0 Seidennähtfaden unterhalb der Spitze der Wiederholungsspritze mit aufgeblasenen Dickdarm abbinden. Schneiden Sie die Wurst von der Wiederholungsspritze ab und geben Sie sie in ein 15-ml-Röhrchen mit 10 ml 50 mM (2 mM für Dünndarm) EDTA für 40 min und drehen Sie es bei 4 °C (Abbildung 1J, K).</li>
	<li>Dekantieren Sie die EDTA-Lösung und ersetzen Sie sie durch 5 ml Schüttelpuffer. Schütteln Sie die Wurst manuell in vertikaler Position (kräftig) für 2 min.</li>
	<li>Dekantieren Sie die Schüttellösung in ein neues 15-ml-Röhrchen und wiederholen Sie den Schüttelschritt für insgesamt 10 ml Krypten im Schüttelpuffer.</li>
	<li>Nehmen Sie 20 μL der Kryptensuspension in einer Petrischale und zählen Sie die Anzahl der Krypten unter einem Mikroskop. Berechnen Sie die Kryptenkonzentration in Krypten/μL. Je nach Konzentration verdünnen Sie die Proben, um zum Zeitpunkt der Beschichtung 5Krypten/μL (1000 Krypten/cm2) zu erhalten.</li>
	<li>Drehen Sie das Röhrchen mit isolierten Krypten mit einer Tischzentrifuge bei 400 x g für 10 min bei 4 °C.</li>
	<li>In der Zwischenzeit 48-Well-Platte/Insert/Kammerträger aus dem Inkubator entfernen und in die Biosicherheitswerkbank legen. Saugen Sie die Beschichtungslösung mit P200 an und lassen Sie die Platte mit dem Deckel leicht versetzt, bis die Zellen bereit sind, plattiert zu werden.</li>
</ol>4. Kultivierung von 2D-Monolayern
HINWEIS: Für ein detailliertes Protokoll zur Erzeugung von Intestinalepithel-Monoschichten aus 3D-Kolonoiden überprüfen Sie die Protokolle von Estes und Kovbasnjuk Labs (7,11).
<ol><li>Entfernen Sie den Schüttelpuffer mit einer serologischen Pipette von 10 ml. Stellen Sie sicher, dass das Pellet intakt ist und möglicherweise P1000 verwendet, um die verbleibende Flüssigkeit zu entfernen. Suspendieren Sie das Pellet in 3 ml LWRN-Komplettmedium erneut und pipetten Sie es mit P1000 auf und ab. 200 μL Krypten zu jeder Vertiefung eines vorbeschichteten 48-Well-Platten-/Kammerschlittens geben und in einem 5%igen CO 2-Inkubator bei 37 °C inkubieren.</li>
	<li>Am nächsten Tag saugen Sie das Medium mit P200 an und fügen Sie frische Medien hinzu. Die Zellen konfluenten in 24-48 h.</li>
	<li>Für Zellkulturmembraneinsätze fügen Sie 200 μL Krypten (5 Krypten/μL) an der Oberseite der Einsätze und 600 μL vollständige L-WRN-Medien an der Unterseite hinzu. Am nächsten Tag das Medium mit P200 absaugen und frisches Medium nur in die obere Kammer geben. Inkubieren Sie die Platte in einem 5% CO2 Inkubator bei 37 °C. Der transepitheliale elektrische Widerstand (TEER) wird täglich mit dem Epithelial Volt/Ohm-Messgerät (EVOM) gemessen. HINWEIS: Wenn die Kultur einen TEER-Wert von mehr als 300 Ω,cm2hat, sollen sie konfluent sein. Die Konfluenz wird in 3-4 Tagen erreicht. Wechseln Sie die Medien alle 2 Tage.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Quiros, M., Nusrat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+wound-associated+cells+and+mediators+in+orchestrating+gastrointestinal+mucosal+wound+repair.">Contribution of wound-associated cells and mediators in orchestrating gastrointestinal mucosal wound repair.</a> Annual Reviews in Physiology. 81, 189-209 (2019).</li><li>Blutt, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+organoids+to+study+regenerative+responses+to+intestinal+damage.">Use of organoids to study regenerative responses to intestinal damage.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 317 (6), 845-852 (2019).</li><li>Zhang, M., Liu, Y., Chen, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+3D+human+gastrointestinal+organoids:+principle+and+applications.">Generation of 3D human gastrointestinal organoids: principle and applications.</a> Cell Regeneration. 9 (1), 6 (2020).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Zachos, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+enteroids/colonoids+and+intestinal+organoids+functionally+recapitulate+normal+intestinal+physiology+and+pathophysiology.">Human enteroids/colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (8), 3759-3766 (2016).</li><li>Kozuka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+human+and+mouse+intestinal+epithelial+cell+monolayer+platform.">Development and characterization of a human and mouse intestinal epithelial cell monolayer platform.</a> Stem Cell Reports. 9 (6), 1976-1990 (2017).</li><li>In, J. G., Foulke-Abel, J., Clarke, E., Kovbasnjuk, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+colonoid+monolayers+to+study+interactions+between+pathogens,+commensals,+and+host+intestinal+epithelium.">Human colonoid monolayers to study interactions between pathogens, commensals, and host intestinal epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (146), e59357 (2019).</li><li>Cardenas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-+and+three-dimensional+bioengineered+human+intestinal+tissue+models+for+cryptosporidium.">Two- and three-dimensional bioengineered human intestinal tissue models for cryptosporidium.</a> Methods in Molecular Biology. 2052, 373-402 (2020).</li><li>Moon, C., VanDussen, K. L., Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+primary+mouse+intestinal+epithelial+cell+monolayer+culture+system+to+evaluate+factors+that+modulate+IgA+transcytosis.">Development of a primary mouse intestinal epithelial cell monolayer culture system to evaluate factors that modulate IgA transcytosis.</a> Mucosal Immunology. 7 (4), 818-828 (2014).</li><li>VanDussen, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+enhanced+human+gastrointestinal+epithelial+culture+system+to+facilitate+patient-based+assays.">Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays.</a> Gut. 64 (6), 911-920 (2015).</li><li>Zou, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+intestinal+enteroids:+New+models+to+study+gastrointestinal+virus+infections.">Human intestinal enteroids: New models to study gastrointestinal virus infections.</a> Methods in Molecular Biology. 1576, 229-247 (2019).</li><li>Heijmans, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ER+stress+causes+rapid+loss+of+intestinal+epithelial+stemness+through+activation+of+the+unfolded+protein+response.">ER stress causes rapid loss of intestinal epithelial stemness through activation of the unfolded protein response.</a> Cell Reports. 3 (4), 1128-1139 (2013).</li><li>Nik, A. M., Carlsson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+intact+intestinal+epithelium+from+mesenchyme.">Separation of intact intestinal epithelium from mesenchyme.</a> Biotechniques. 55 (1), 42-44 (2013).</li></ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Unser Protokoll bietet eine schnelle, reproduzierbare und zuverlässige Methode zur Erzeugung direkter primärer 2D-IEC-Monoschichten. Einer der Hauptunterschiede in unserem Protokoll im Vergleich zu zuvor veröffentlichten Protokollen zur Erzeugung von Dickdarmepithel-Monoschichten besteht darin, dass wir den Dickdarm nicht in kleine Stücke schneiden, um die Krypten zu befreien. Stattdessen passten wir ein Protokoll an, um Darmepithel von Mesenchym13 durch eine Kombination chemischer und mechanischer Kräfte zu trennen, um Krypten in einem extrem sauberen Präparat freizusetzen (Abbildung 2), und lieferten dem Forscher ideales Material, um Primärkulturen zu erzeugen. Unsere Isolationsmethode kann auch verwendet werden, um 3D-Enteroide und Koloide zu erzeugen. Es ist wichtig, jedes Mal, wenn ein Experiment durchgeführt wird, eine Kryptozählung durchzuführen, um die Anzahl der Krypten zu normalisieren, die plattiert werden. Variablen wie Colon Sausage Turgor, Isolationsgeschwindigkeit, Benutzerwissen können die Anzahl der isolierten Krypten beeinflussen. Die im Protokoll erwähnte vorgeschlagene Beschichtungskryptenkonzentration ist ein Ausgangspunkt, aber jeder Benutzer, der benutzergesteuerte Variablen berücksichtigt, muss sie optimieren. Wir haben diese Technik bei männlichen und weiblichen WT-Mäusen im Alter von 8 bis 20 Wochen angewendet und wir haben keine großen Unterschiede im Zellüberleben gesehen, theoretisch haben Krypten, die von jüngeren Mäusen isoliert wurden, bessere Überlebenschancen. Krypten sind im Übermaß plattiert, da nur ein kleiner Prozentsatz von ihnen an der Oberfläche haftet und überlebt. Ein Gleichgewicht, bei dem es genug Krypten gibt, um einen Tag nach dem Plattieren eine 50% ige Konfluenz zu haben, aber nicht zu viele Krypten, in denen die sterbenden Krypten eine zytotoxische Wirkung haben, ist das Ziel. LWRN-Medien müssen 24 Stunden nach der Beschichtung sorgfältig entfernt werden, um tote Krypten und Ablagerungen zu entfernen, dies muss sorgfältig erfolgen, um zu vermeiden, dass Zellen, die bereits als Monoschicht wachsen, abgelöst werden.
Nach der erstmaligen Entfernung von LWRN-Medien muss der Anwender entscheiden, ob die experimentellen Bedingungen primäre IEC-Monoschichten erfordern, die näher an Stammzellen bleiben und frische LWRN-Medien hinzufügen, oder wenn eine Differenzierung der Monoschicht gewünscht wird, durch Differenzierungsmedien ersetzen. Der wichtigste Faktor in diesem Protokoll ist die Sicherstellung der Integrität des Dickdarms während des Isolationsprozesses. Wenn ein Bruch auftritt, kann die Wurst verkürzt werden, um die beschädigte Stelle zu beseitigen. Bevor Sie die Wurst in EDTA geben, achten Sie darauf, dass die Knoten so dicht wie möglich sind. Wird die Wurst nach der EDTA-Inkubation entleert, kann das Protokoll mit wenig bis gar keinen Auswirkungen auf den gesamten Kryptenertrag fortgesetzt werden. Wenn die Wiederholungsspritze nicht verfügbar ist, kann eine normale Mikropipettenspitze, die an einer normalen Spritze befestigt ist, auch für den Prozess der Inflation und Deflation verwendet werden. Wenn keine Zellwiederherstellungslösung verfügbar ist, können die Inflations- und Deflationsschritte in EDTA (2mM Dünndarm, 50 mM Dickdarm) durchgeführt werden, aber diese Substitution wird nicht empfohlen. Wenn keine Konfluenz erforderlich ist, können Krypten in Platten wachsen, die nur mit Kollagen beschichtet sind, und sogar in unbeschichteten Platten. Verwenden Sie nur unbeschichtete Platten, es gibt keine andere Option, aber die Zellen werden nicht gesund wachsen, wie sie es in kollagenbeschichteten Platten tun würden. Wenn es um die Gesundheit und Stabilität der Kultur geht, sind in Kunststoff plattierte Monoschichten für 4 bis 5 Tage gesund, während Monoschichten, die in Transwells plattiert sind, bis zu 8 Tage lang getragen werden können.
Eine der Haupteinschränkungen dieser Methode sind die Zellmedien, die zum Züchten der epithelialen Dickdarmmonoschichten erforderlich sind. LWRN-Zellen sind am ATCC verfügbar, aber die LWRN-bedingte Mediengenerierung ist arbeitsintensiv und erfordert den Zugang zu einem fluoreszierenden Spektrometer, um die Wnt-Aktivität zu bestimmen. Differenzierungsmedien erfordern eine Reihe von Reagenzien, die vor der Verwendung frisch zugegeben werden, was es zu einem langwierigen Prozess macht. Schließlich sind die meisten dieser Reagenzien teuer und es ist einfach, die Reagenzien in einem schnellen Tempo zu verbrennen. Wenn ein Labor diese Technik ohne vorherige intestinale Primärzellkultur etablieren möchte, wird dringend empfohlen, einen Mitarbeiter / eine Hochschule mit Erfahrung zu finden und eines ihrer Mitglieder zu schulen.
Die Wartung der 3D-Kultur könnte aufgrund der Kosten für die Grundmembranmatrix mittlere und hohe Mengen konditionierter Medien, die für Organoidkulturen benötigt werden, teuer sein, aber es hat den Vorteil, dass eine reduzierte Anzahl von Mäusen verwendet wird und die erzeugten Strukturen viele Male passieren können. Enteroide (aus dem Dünndarm gewonnen) sind relativ einfach zu isolieren und zu pflegen, während Koloroide empfindlicher sind, langsamer wachsen und eine begrenztere Durchgangskapazität haben. Die Monolayer-Generierung aus 3D-Kolonoiden erfordert eine unverhältnismäßig große Menge an 3D-Strukturen, die diese Art von Experimenten zeitaufwendig und kostspielig machen. Im Gegenteil, die direkte Vorbereitung der epithelialen Dickdarm-Monoschicht ist schnell und ein schneller Weg, um die Ergebnisse zu erzielen. Eine Dickdarmvorbereitung kann 2 bis 3 Tage nach der Beschichtung eine konfluente Fläche von 75 cm2 (10 bis 15 ml konditionierte Medien, wird einmal ersetzt) erzeugen (dieser Bereich würde 144 Vertiefungen von 3D-Kolonoiden erfordern, was fast 6 ml Matrigel und mehr als 250 ml konditionierte Medien bedeutet). Der geringere Medienverbrauch, die kostengünstige Wartung der Zellkultur und die Fähigkeit, Funktionstests durchzuführen und eine schnelle Nachbearbeitung sind große Vorteile von epithelialen Dickdarmmonoschichten.
Dieses Protokoll ist ein wertvolles Werkzeug bei der Untersuchung der Darmepithelzellbiologie in Bereichen wie Zelladhäsion, Polarität und Differenzierung. Es bietet den Vorteil, primäre Zellkulturen aus genetisch veränderten Mäusen (Knock-out, Overexpressing, Reporter) zu erzeugen. Die primären intestinalen epithelialen Monoschichten ermöglichen einen einfachen Zugang zu den apikalen und basolateralen Oberflächen (wenn sie auf Transwells plattiert sind), was die Untersuchung der Permeabilität, Barriere und transepithelialen Migration verschiedener Zelltypen ermöglicht. Schließlich kann dieses Modell in verschiedenen Bereichen wie Wirt-Pathogen-Interaktionen, Epithelschäden und -reparatur sowie Arzneimittelforschung nützlich sein.

Darmepithelzellen (IEC) säumen den Darm und bilden eine selektiv durchlässige Barriere, die die Aufnahme von Nährstoffen und Wasser ermöglicht und gleichzeitig verhindert, dass Mikroorganismen und Toxine in den Körper gelangen 1. Die Darmschleimhaut besteht aus luminalen Projektionen, die Zotten genannt werden (nur im Dünndarm vorhanden) und Invaginationen, die Krypten genannt werden. Zotten und die Oberfläche von Dickdarmkrypten sind von differenzierten Epithelzellen bedeckt, während die Basis der Krypten aus Stammzellen besteht, die die schnelle Erneuerung des Darmepithels ausmachen, das einen Umsatz von 3 bis 7 Tagen hat. Darmstammzellen (ISC) sind nicht nur wichtig für die Aufrechterhaltung der Darmöostase, sondern auch für eine angemessene Reparatur geschädigterEpithelien 2.
Die Untersuchung der Darmepithelbiologie war durch das Fehlen primärer Zellkulturen begrenzt, wobei transformierte Zelllinien das einzige verfügbare Werkzeug waren. Intestinale Epithelmodellzelllinien sind nicht in der Lage, die Physiologie des normalen Darmepithels genau zu replizieren. Die Entwicklung von 3D-Kulturen, die von ISC abgeleitet wurden, lieferte Darmschleimhautbiologen In-vitro-Modelle, die in vivo Darmschleimhautbedingungen ähneln3. Krypten können leicht aus murinen Proben isoliert, in ein Basalmembranmatrixmedium (z. B. Matrigel) eingebettet und in konditionierten Medien gezüchtet werden, die Wnt3a, R-Spondin und Noggin enthalten, wodurch 3D-Strukturen erzeugt werden, die als Enteroide (Dünndarm) oder Koloreide (Dickdarm) bekanntsind 4. Enteroide und Koloreide sind polarisierte sphäroidale Strukturen, bei denen die apikale Domäne einem internen Lumen zugewandt ist und die basolaterale Region in direktem Kontakt mit der extrazellulären Matrix steht. Enteroide und Kolooide enthalten alle wichtigen differenzierten intestinalen epithelialen Subtypen wie Enterozyten / Kolonozyten, Paneth-, Enteroendokrin- und Speisebletzellen und sie erscheinen in relativ den gleichen Anteilen wie in dem Abschnitt des Darms, in dem sie aus5isoliert wurden. Obwohl 3D-Enteroide und Koloide einen großen Fortschritt in der Erforschung der Darmentwicklung und Physiologie darstellen, zeigen diese Modelle bestimmte Nachteile wie den begrenzten Zugang zur apikalen Oberfläche der Epithelzellen (Lumen) und die Fähigkeit, Kulturen nach oben oder unten zu skalieren, um ein Hochdurchsatz-Screening von Molekülen von Interesse zu erreichen. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurden Protokolle zur Gewinnung primärer 2D-Kulturen von IEC aus 3D-Enteroiden/Kolonoiden generiert. 2D-Enteroide / Kolooide wachsen als Zellschicht genau wie Modellzelllinien und sind ideal, um unter anderem darmwundreparaturen, Wirt-Pathogen-Interaktionen und regenerative Medizin zu untersuchen. Mehrere veröffentlichte Arbeiten beschreiben, wie man 2D-Monoschichten aus 3D-Strukturen oder direkt aus Darmkrypten erzeugt (siehe6,7,8,9,10,11), aber diese Methoden neigen dazu, arbeitsintensiv und schwer zu reproduzieren. Eine schnelle, einfache und reproduzierbare Methode, um Monoschichten direkt aus frisch isolierten Darmkrypten der Maus zu erhalten, wird in diesem Protokoll beschrieben.
Hier erklären wir im Detail den Prozess zur Kryptenextraktion mit minimaler Ablagerungserzeugung, extrazelluläre Matrixauswahl und verschiedene Oberflächen und Anwendungen für diese Technik. Dieser experimentelle Ansatz wurde für Dickdarmkrypten optimiert, aber ähnliche Ergebnisse werden erzielt, wenn sie für Dünndarm angewendet werden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-004CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement (50X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen from human placenta (type IV)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>85529-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP220-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s phosphate buffered saline, with Ca2+ and Mg2+ (DPBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-030-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epithelial Volt/Ohm meter</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>0-10K&#937; with STX2 (EVOM2)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>51201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-016-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Firefly Luciferase assay</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>30085-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geneticin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10131-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25060CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant EGF</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>236-EG</td>
			<td>Stock Concentration: 500&#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant Wnt-3A</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>W3a-H-005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10687010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LWRN cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular grade water</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-000-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165-5G</td>
			<td>Stock Concentration: 500mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin</td>
			<td>Conditioned media</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Lab-Tek Chamber slide system</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7182-1PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pencillin-Streptomycin (10,000U/mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30002CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospahte buffered saline, Ca2+ and Mg2+ free (PBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic 20G feeding tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-810-46</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rh-laminin-521</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A29248</td>
			<td>Stock concentration: 100&#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roboz Surgical 4-0 Silk Black Braided 100YD</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9452680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOPflash HEK293 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell Permeable supports (0.4&#181;m)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3470</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of murine primary colon epithelial monolayers from intestinal crypts

Das Darmepithel besteht aus einer einzigen Zellschicht, die als Barriere zwischen dem Darmlumen und dem Inneren des Körpers fungiert. Eine Störung der Kontinuität dieser Barriere kann zu entzündlichen Erkrankungen wie entzündlichen Darmerkrankungen führen. Eine der Einschränkungen bei der Untersuchung der intestinalen Epithelbiologie war das Fehlen primärer Zellkulturmodelle, die die Forscher gezwungen haben, Modellzelllinien aus Karzinomen zu verwenden. Das Aufkommen dreidimensionaler (3D) Enteroide hat Epithelbiologen ein leistungsfähiges Werkzeug zur Erzeugung primärer Zellkulturen an die Nagel gegeben, dennoch sind diese Strukturen in extrazelluläre Matrix eingebettet und haben nicht die Reife, die für differenzierte Darmepithelzellen charakteristisch ist. Mehrere Techniken zur Erzeugung von intestinalen epithelialen Monoschichten wurden veröffentlicht, aber die meisten stammen von etablierten 3D-Enteroiden, die den Prozess mühsam und teuer machen. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Erzeugung primärer epithelialer Dickdarmmonoschichten direkt aus murinen Darmkrypten. Wir beschreiben auch experimentelle Ansätze, die mit diesem Modell verwendet werden können, wie die Erzeugung von Konfluentkulturen auf permeablen Filtern, konfluente Monoschichten für Kratzwundenheilungsstudien und spärliche und konfluente Monoschichten für die Immunfluoreszenzanalyse.

Um die Zuverlässigkeit der primären epithelialen Dickdarm-Monolayer-Kulturen zu veranschaulichen, wird eine Zusammenfassung der Krypta-Isolation und repräsentative Bilder aus dem Protokoll gezeigt. Der Benutzer muss bedenken, dass die isolierten Krypten unter sterilen Bedingungen kultiviert werden, so dass eine korrekte Dissektion und Reinigung des Dickdarms eine Priorität ist. Abbildung 1 zeigt die wichtigsten Schritte während der Kryptoisolation. Isolierte Krypten (Abbildung 2A) werden nun gezählt und konzentriert (Abbildung 2B), um eine Konzentration von 5 Krypten/μL zu erhalten. Nach einer konzentrierten Aufbereitung der Krypten werden die Zellen im gewünschten Format (Kulturschale, Membraneinsätze oder Kammerträger) plattiert und je nach experimentellem Bedarf mit den entsprechenden Medien inkubiert. Abbildung 3 zeigt den Kulturverlauf nach 24 und 48 Stunden Kultur in 48-Well-Platten. Die Zellen werden inkubiert, bis die gewünschte Konfluenz erreicht ist. Um mögliche Anwendungen dieser Methode zu veranschaulichen, haben wir 48-Well-Plattenbrunnen die Konfluenz erreichen lassen und einen Kratz-Wund-Assay durchgeführt. Abbildung 4 zeigt einen frisch erzeugten Kratzer (Abbildung 4A) in einer 2D-Kolonoid-Monoschicht und die gleiche Wunde 24 h danach (Abbildung 4B). Es ist klar, dass die Kultur immer noch gesund und lebensfähig ist und es eine Wundreparatur gibt. Um differenzierte Monolayer zu erzeugen, werden Medien von LWRN auf Differenzierungsmedien umgestellt. Die Differenzierung wird durch hohe TEER-Werte (Abbildung 5A), Abnahme der ISC-Marker ((Leucin-reiche, wiederholungshaltige g-Protein-gekoppelter Rezeptor 5 (Lgr5) und Achaete-Scute wie 2 (Ascl2)) und Erhöhung der Differenzierungsmarker ((Alanylaminopeptidase (Anpep), Mucin 2 (Muc2), Lysozym 1 (Lyz1), Saccharose iso-maltase (Sis) und Chrmogranin A (Chga)) (Abbildung 5B,C) durch PCR erreicht. Weitere Marker wie CDX2 und KRT20 können ebenfalls in dieses Panel aufgenommen werden. Neben den mRNA-Expressionsniveaus wird das Auftreten von Subtypen differenzierter Epithelzellen in 2D-Kolonoiden, die unter Differenzierungsbedingungen gezüchtet wurden, auch durch Immunfluoreszenz (Muc2 und Chga; Abbildung 5D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62156/62156fig01.jpg"> Abbildung 1: Probenvorbereitung für die Erzeugung gesunder Monoschichten. Die Probenvorbereitung ist entscheidend für die Erzeugung gesunder Monoschichten. Die wichtigsten Schritte des Isolationsprozesses sind in dieser Abbildung dargestellt, um es dem Leser zu erleichtern. Der Dickdarm wird von der Maus entfernt, um sicherzustellen, dass keine Fellreste vorhanden sind. Entfernen Sie vorsichtig den Kot und stellen Sie sicher, dass Sie den Dickdarm nicht perforieren; Dies ist von entscheidender Bedeutung, da der Dickdarm in der Lage sein muss, Luft zu halten und aufgeblasen und entleert zu werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62156/62156fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62156/62156fig02.jpg"> Abbildung 2:Anzahl und Konzentration der Kryptaisolation. (A) Kolonkrypten nach dem Schütteln der Darmwürste. Das Bild zeigt ein Feld mit einem Tropfen von 20 μL. (B) Kryptenkonzentration, um 5 Krypten/μL zu erhalten. Maßstabsleiste: 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62156/62156fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62156/62156fig03.jpg"> Abbildung 3:Primäres IEC-Monoschichtwachstum. (A) 2D-IEC-Monoschichten nach 24 h Beschichtung und Entfernung von Zellabfällen. (B) Konfluente 2D IEC Monolayer 48 h nach der Beschichtung. Maßstabsleiste: 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62156/62156fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62156/62156fig04.jpg"> Abbildung 4:Kratzwunde-Assays mit muriner Primär-IEC. Bilder, die die Wundheilung nach einem Kratzer in der epithelialen Dickdarmmonoschicht zeigen. Maßstabsleiste: 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62156/62156fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62156/62156fig05.jpg"> Abbildung 5: Differenzierung von epithelialen Dickdarmmonoschichten. (A) Differenzierungsmedien erzeugen enge epitheliale Barrieren, wie TEER zeigt. Differenzierungsmedien verursachen einen Rückgang der mRNA-Expression von (B) Stammzellmarkern und eine Hochregulation von (C) Differenzierungsmarkern. (D) Marker von spezialisierten differenzierten Epithelzellen wie Muc2 und Chromogranin-A können auch über Immunfluoreszenz von direkten 2D-Kolonoiden nachgewiesen werden. Maßstabsleiste: 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62156/62156fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

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Generation of Murine Primary Colon Epithelial Monolayers from Intestinal Crypts

In diesem Protokoll beschreiben wir, wie man murine primäre epitheliale Dickdarmmonoschichten direkt aus Darmkrypten erzeugt. Wir bieten experimentelle Ansätze zur Erzeugung konfluenter Monoschichten auf permeablen Filtern, konfluente Monoschichten für die Kratzwundeheilung und biochemische Studien sowie spärliche und konfluente Monoschichten für die Immunfluoreszenzanalyse.

Erzeugung von murinen primären Dickdarmepithel-Monoschichten aus Darmkrypten

The intestinal epithelium is comprised of a single layer of cells that act as a barrier between the gut lumen and the interior of the body. Disruption in ...

Unser Protokoll bietet eine schnelle, reproduzierbare und zuverlässige Methode, um direkte primäre intestinale Epithelmonoschichten auf verschiedenen Oberflächen mit minimalen Trümmern zu erzeugen. Die Hauptvorteile dieses Protokolls sind der geringe Medienverbrauch und die geringe Wartung der Zellkultur. Es ist eine schnelle Methode, um Funktionstests und schnelle nachgelagerte Anwendungen durchzuführen.Dieses Protokoll wird Einblicke in die Untersuchung der Wundreparatur, der Permeabilitätsbarriere und der transepithelialen Migration verschiedener Zelltypen geben. Dieses Modell kann auch bei der Wirt-Pathogen-Interaktion, bei der Schädigung des Epithels und bei der Wirkstoffforschung nützlich sein. Fügen Sie zunächst 200 Mikroliter Beschichtungslösung zu jeder Vertiefung einer 48-Well-Platte und eines Kammerschlittens hinzu.Beides in einem 5%-Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius für zwei Stunden vorbebrüten. 0,4 Mikrometer Zellmembraneinsätze mit 200 Mikrolitern Kollagenlösung beschichten. Inkubieren Sie die Platte mit den Membraneinsätzen bei vier Grad Celsius für 30 Minuten und geben Sie sie dann für zwei Stunden in einen 5% Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius.Desinfizieren Sie eine eingeschläferte Maus mit 70% Ethanol und sezieren Sie dann den Dickdarm vom Rektum bis zum Blinddarm mit Hilfe von Schere und Zette. Spülen Sie den Kot vorsichtig mit eiskaltem PBS in einer 10-Milliliter-Spritze aus, die mit einem 20-Gauge-Ernährungsröhrchen ausgestattet ist. Entfernen Sie den proximalen Dickdarm und schieben Sie den distalen Dickdarm vorsichtig auf die 20-Gauge-Ernährungssonde.Binden Sie den Dickdarm am Ende des Rohres mit 4-0 Seidennähtfaden. Kehren Sie den Dickdarm von innen nach außen über das gebundene Ende und binden Sie das andere Ende mit einem Faden, dann schneiden Sie den Dickdarm unterhalb der Spitze der Ernährungssonde mit einer chirurgischen Schere. Öffnen Sie vorsichtig das ungebundene Ende des invertierten Dickdarms mit dem Kolben auf die Spitze einer 1,25-Milliliter-Wiederholungsspritze.Schieben Sie das ungebundene Ende des umgekehrten Dickdarms auf die Spritze und binden Sie es fest mit einem Faden. Führen Sie den Kolben in die Spritze ein und blasen Sie den Dickdarm auf, bis er turgent aussieht und keine sichtbaren Falten hat. Legen Sie die aufgeblasene Darmwurst in ein 15-Milliliter-Röhrchen mit fünf Millilitern Zellrückgewinnungslösung für 20 Minuten auf Eis.Blasen Sie den Dickdarm einmal alle fünf Minuten auf und entleeren Sie sie. Binden Sie den aufgeblasenen Dickdarm unterhalb der Spitze der Wiederholungsspritze mit einem 4-0 Seidennähtfaden ab. Schneiden Sie die Darmwurst von der Wiederholungsspritze ab und legen Sie sie 40 Minuten lang in ein 15-Milliliter-Röhrchen mit 10 Millilitern 50 Millimolar-EDTA.Drehen Sie das Rohr bei vier Grad Celsius. Ersetzen Sie die EDTA-Lösung durch fünf Milliliter Shake-Puffer und schütteln Sie die Wurst manuell in vertikaler Position für zwei Minuten. Dekantieren Sie die Schüttellösung in ein neues 15-Milliliter-Röhrchen und wiederholen Sie den Schüttelschritt, bis insgesamt 10 Milliliter Krypten und Schüttelpuffer gesammelt sind.Zählen Sie die Anzahl der Krypten in 20 Mikrolitern der Suspension unter einem Mikroskop und verdünnen Sie die Probe, um die Konzentration von fünf Krypten pro Mikroliter zu erhalten. Zentrifugieren Sie die Kryptenprobe bei 400 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. In der Zwischenzeit die 48-Well-Platten- und Membraneinsätze aus dem Inkubator entfernen und in die Biosicherheitswerkbank legen.Saugen Sie die Beschichtungslösung mit einer P200-Pipette an und lassen Sie die Platte mit dem Deckel leicht versetzt, bis die Zellen bereit sind, plattiert zu werden. Nach der Zentrifugation der Kryptensuspension den Schüttelpuffer entfernen und das intakte Pellet in drei Milliliter LWRN-Komplettmedien wieder auffüllen. Fügen Sie 200 Mikroliter Krypten zu jeder Vertiefung der vorbeschichteten 48-Well-Platte und des Kammerschlittens hinzu und inkubieren Sie beide in einem 5% Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius.Am nächsten Tag saugen Sie die Medien an und fügen Sie frische Medien hinzu. Im Allgemeinen konfluieren die Zellen in 24 bis 48 Stunden. Für Zellkulturmembraneinsätze fügen Sie 200 Mikroliter Krypten an der Oberseite der Einsätze und 600 Mikroliter kompletter LWRN-Medien an der Unterseite hinzu.Am nächsten Tag das Medium absaugen und frisches Medium nur in die obere Kammer geben. Inkubieren Sie die Platte in einem 5% Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius. Messen Sie jeden Tag den transepithelialen elektrischen Widerstand mit einem epithelialen Volt / Ohm-Meter.Nach der Isolierung der Krypten von einem murinen Dickdarm und der Überprüfung der Konzentration wurde die Kryptensuspension auf fünf Krypten pro Mikroliter konzentriert. 48-Well-Plattenbrunnen wurden einem Kratzwunde-Assay unterzogen, als sie den Zellkonfluenz erreichten. Nach 24 Stunden wurde eine Wundreparatur beobachtet, die darauf hindeutet, dass die Kultur gesund und lebensfähig war.Höhere Stufenwerte wurden erreicht, wenn Medien von LWRN auf Differenzierungsmedien umgestellt wurden. Auch eine Abnahme der ISC-Marker und eine Zunahme der Differenzierungsmarker wurden beobachtet, was darauf hindeutet, dass die differenzierten Monoschichten erfolgreich erzeugt wurden. Darüber hinaus wurde das Auftreten von Subtypen differenzierter Epithelzellen, die unter verschiedenen Bedingungen gezüchtet wurden, durch Immunfluoreszenz gezeigt.Wenn Sie dieses Protokoll versuchen, ist es wichtig sicherzustellen, dass der Dickdarm zu keinem Zeitpunkt während der Vorbereitung gerissen wird und aufgeblasen bleibt, um Krypten in extrem sauberer Vorbereitung freizusetzen. Sobald sich die Monoschichten der 2D-Darmepithelzellen bilden, können wir Immunfluoreszenz-, Kratzwunde- und Permeabilitätstests und andere nachgelagerte Anwendungen durchführen. Dies wird Wissen über Wundheilung, Migration verschiedener Zelltypen und Epithelreparatur- und Schadensstudien liefern.

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

Primären humanen bronchialen Epithelzellen aus Explantaten Grown

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the ...

Forschung

Biologie

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

Isolierung von Primär Myofibroblasten aus Maus und Mensch Colon Tissue

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Cryosectioning Method for Microdissection of Murine Colonic Mucosa

Kryoschneiden Verfahren zur Mikrodissektion von Murine Kolonschleimhaut

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The ...

Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation

Regeneration des Darmepithels als Reaktion auf ionisierende Bestrahlung

The intestinal epithelium consists of a single layer of cells yet contains multiple types of terminally differentiated cells, which are generated by the ...

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

Primärkultur von retinalen Pigmentepithelzellen des Schweins

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...

Culture of Piglet Intestinal 3D Organoids from Cryopreserved Epithelial Crypts and Establishment of Cell Monolayers

Kultivierung von Ferkel-Darm-3D-Organoiden aus kryokonservierten Epithelkrypten und Etablierung von Zellmonoschichten

Intestinal organoids are increasingly being used to study the gut epithelium for digestive disease modeling, or to investigate interactions with drugs, ...

Unveiling Inflammatory Arthritis&#58; Exploring Functions of Synovial Cells

Isolation and Culture of Primary Synovial Macrophages and Fibroblasts from Murine Arthritis Tissue

Isolation and Culture of Primary Synovial Macrophages and Fibroblasts from Murine Arthritis Tissue (Video) | JoVE 

Isolierung und Kultivierung von primären Synovialmakrophagen und Fibroblasten aus murinem Arthritisgewebe

Rheumatoid arthritis is an autoimmune disease that leads to chronic inflammation of joints. Synovial macrophages and synovial fibroblasts have central ...

3D Culture of Organoids from Murine Intestinal Crypts and Single Stem Cell

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research (Video) | JoVE 

Die 3D-Kultivierung von Organoiden aus murinen Darmkrypten und einer einzelnen Stammzelle für die Organoidforschung

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine ...

Epithelial Effects of Intestinal Inflammation on Established Murine Colonoids

Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids

Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids (Video) | JoVE 

Untersuchung der epithelialen Effekte von intestinalen Entzündungen in vitro auf etablierte murine Kolonoide

The intestinal epithelium plays an essential role in human health, providing a barrier between the host and the external environment. This highly dynamic ...