Name: generation of murine primary colon epithelial monolayers from intestinal crypts
Uploaded: 2021-02-06T14:30:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Murine Primary Colon Epithelial Monolayers from Intestinal Crypts at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av en Crohn's and Colitis Foundation Career Development Award (544599, til MQ) og NIH-tilskuddene (DK055679, DK089763, DK059888, til AN). Vi vil gjerne takke Michigan Medicine Translational Tissue Modeling Laboratory for deres kontinuerlige hjelp og tilgang til deres reagenser og protokoller.

Alle prosedyrer beskrevet nedenfor er godkjent og gjennomført i samsvar med retningslinjene fastsatt av University of Michigan Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Fremstilling av reagenser for kryptisolasjon og kultur (forbered deg i vevskultur hette)
<ol><li>50 mM etylendiamin tetraacetic acid (EDTA): Tilsett 50 ml 0,5 M lager til 450 ml fosfatbufret saltvann, uten kalsium(Ca. 2+) og magnesium (Mg2+) for å forberede 500 ml. I denne protokollen vil PBS referere til PBS uten kalsium og magnesium med mindre annet er oppgitt.</li>
	<li>Rist buffer: Løs opp 7,4 g sukrose (43,3 mM) og 5 g sorbitol (54,9 mM) i PBS for å forberede 500 ml.</li>
	<li>L-WRN (L-Wnt-3A, R-spondin og Noggin) medier: Supplement Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 (DMEM/F12) (780 ml) med 20% Fetal Bovine Serum (FBS) (200 ml), 1x kommersielt tilgjengelig glutamintilskudd (10 ml), 100 U/ml penicillin og, 100 g/ml streptomycin (10 ml), og filtrer steriliser med 0,22 μm filter.<ol>
<li>Få L-WRN celler gjennom ATCC, vokse i T175 kolber, og velg ved hjelp av Geneticin og Hygromycin. Media endres og samles inn i 12 dager. MERK: Hver gruppe medier testes for Wnt-aktivitet ved hjelp av en TOPflash Wnt Reporter-analyse. I dette tilfellet ble Michigan Medicine Translational Tissue Modeling Laboratory protokoller (https://www.umichttml.org/protocols) fulgt. TOPflash HEK 293 cellelinjen vokser til samløp i en T75-kolbe, trypsinisert og belagt på en 96-brønns plate. Neste dag legges forskjellige fortynninger av de innsamlede mediene til celler og inkuberes i en 5% CO2 inkubator ved 37 °C over natten. Neste dag lyser cellene, og Firefly Luciferase-analysen utføres i henhold til produsentens instruksjoner. Analysen normaliseres ved hjelp av rekombinant Wnt-3A. Media er delt inn i 25 ml aliquots i 50 ml koniske rør og lagres ved -80 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Basismedier: For 500 ml, tillegg Avansert DMEM/F12 (448 ml) med 2x kommersielt tilgjengelig glutamintilskudd (10 ml), 20 mM HEPES (10 ml), 100 U/ml penicillin og, 100 g/ml streptomycin (10 ml), 2 mM N-acetyl-L-cystein (2 ml), N2-tilskudd (10 ml) og B27-tilskudd (20 ml), filtersteriliseres med 0,22 μm filter. Del mediet i 25 ml aliquots i 50 ml konisk rør og oppbevar ved -80 °C.</li>
	<li>LWRN komplette medier: Kombiner 25 ml LWRN-medier med 25 ml basismedier og supplement med 200 ng/ml Epidermal vekstfaktor (EGF) (20μL) og 2x antibiotika-antimykotisk oppløsning (1 ml). Oppbevar hele mediet ved 4 °C.</li>
	<li>Kollagen og laminin: Løs opp 5 mg pulver i 5 ml filtersterilisert 100 mM eddiksyre (tilsett 60 μL eddiksyre til 9,94 ml molekylært vann) for å produsere en lagerkonsentrasjon på 1 mg/ml. Roter ved 4 °C i 4 timer og lag 100 μL aliquots i 0,2 ml rør. Frys ved -20 °C. Laminin kjøpes med en lagerkonsentrasjon på 100 μg/ml.</li>
	<li>Komplette medier uten vekstfaktorer (CMGF-): Supplement Advanced DMEM/F12 (500 ml) med 1x kommersielt tilgjengelig glutamintilskudd (5 ml), 10 mM HEPES (5 ml), 100 U/ml penicillin og 100 g/ml streptomycin (5 ml).</li>
	<li>Differensieringsmedier: Til 9,2 ml CMGF-medier, tilsett 200 μL B27 supplement, 100 μL N2 supplement, 20 μL N-acetyl-L-cysteine, 500 μL Noggin media12 (laget av Noggin-produserende celler) og 2 μL EGF for å lage 10 ml differensieringsmedier.</li>
</ol>2. Utarbeidelse av plater, kammersklier og cellekulturmembraninnlegg
<ol><li>Belegg 48-brønns plate- og kammersklier for plating 2D-monolager: Bruk beleggløsningen som utgjør laminin (1:40 fortynning, se Materialbord) og kollagen (1:30 fortynning) i kald Dulbeccos fosfatbufret saltvann, med Ca2+ og Mg2+ (DPBS). Tilsett 200 μL beleggløsning til hver brønn og inkuber platen /kammerskuffen i en 5% CO2 inkubator ved 37 °C i minst 2 timer.</li>
	<li>Belegg 0,4 μm cellekulturmembraninnlegg: Lag 1:30 fortynning av kollagen i molekylært vann og tilsett 200 μL til hver innsats. Oppbevar platen som inneholder membraninnsatsen på is ved 4 °C i 30 minutter. Etter 30 min inkubasjon, hold platen i en 5% CO2 inkubator ved 37 °C i 1,5-2 t. Polyester og polykarbonatmembraninnlegg gir sammenlignbare resultater. MERK: Enhver vevskulturplate kan frøs (opp og nedskalering kan utføres) ved hjelp av denne protokollen ved å justere kollagen/ lamininvolumet for å oppnå full dekning av platingoverflaten.</li>
</ol>3. Kryptisolasjon
MERK: Før du starter formidlingen, må du klargjøre kollagen- og/eller lamininbelagte plate-/membraninnlegg/kammersklie og la dem ligge i en 5 % CO 2-inkubator ved 37 °C. Forbered en ren arbeidsbenk og sterile kirurgiske instrumenter som passer for kirurgi, og et biologisk sikkerhetsskap for dyrking av 2D-monolayers. Bekreft alt annet standardutstyr for 2D-monolagskulturer som fuktet CO 2-inkubator, bordplate sentrifuger (opprettholdt ved 4 °C), mikroskop og pipetter (inkludert serologiske pipetter) er klare.
<ol><li>Bruk C57Bl/6 mus, 8-12 uker gammel. Euthanize mus ved hjelp av en godkjent metode for eutanasi.</li>
	<li>Spray musens med 70% etanol (EtOH) løsning for å rengjøre disseksjonsområdet og fjern overflødig EtOH ved hjelp av papirvev. MERK: Sørg for at kryptisolasjonsreagensene (for eksempel PBS, 50 mM EDTA, shake buffer) krypter holdes kalde. Disse reagensene kan tilberedes en dag før og er gode å bruke i minst 3 måneder når de oppbevares ved 4 °C. Sørg også for at LWRN komplette medier holdes i en perle / vannbad som opprettholdes ved 37 °C til bruk.</li>
	<li>Ved hjelp av ren disseksjon saks og tang, disseker ut tykktarmen fra endetarmen til cecum. Hold enden av tykktarmen med tang og skyll forsiktig av avføringen ved hjelp av iskald PBS i en 10 ml sprøyte, utstyrt med et 20 G fôringsrør (figur 1A). Pass på at du ikke bryter tykktarmen.<ol>
<li>Fjern det proksimale kolonet. Dette vil være den delen av tykktarmen som er nærmest det ileocecal krysset.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Med tang skyver du den distale kolon forsiktig på 20 G fôringsrøret, og binder tykktarmen på enden av røret med spissen med 4-0 silke suturtråd (Figur 1B).</li>
	<li>Snu tykktarmen innvendig og ut med fingrene over enden bundet av og bind den andre enden med 4-0 silke suturtråd. Bruk kirurgisk saks til å kutte kolon under tuppen av materøret (Figur 1C,D,E).</li>
	<li>Bruk stempelet på en 1,25 ml repetisjonssprøyte, åpne forsiktig den løsnede enden av det inverterte tykktarmen på spissen av en 1,25 ml repetisjonssprøyte. Skyv det inverterte kolonet på enden av sprøyten og bind det tett med 4-0 silke suturtråd (Figur 1F,G).</li>
	<li>Sett stempelet inn i sprøyten og blås opp tykktarmen for å danne en pølse. Blås opp til kolonpølsen ser turgent ut uten synlige rynker (Figur 1H).</li>
	<li>Plasser sprøyte/kolon i 15 ml rør med 5 ml cellegjenvinningsløsning på is i 20 minutter,blås opp og tøm tykktarmen en gang hvert 5. Pølsen må forbli oppblåst under inkubasjonen.</li>
	<li>Bind av med 4-0 silke suturtråd under spissen av repetisjonssprøyten med tykktarmen oppblåst. Klipp pølsen av den gjentatte sprøyten og legg den i 15 ml rør som inneholder 10 ml 50 mM (2 mM for tynntarmen) EDTA i 40 min og roter ved 4 °C (Figur 1J,K).</li>
	<li>Dekanter EDTA-løsningen og erstatt den med 5 ml ristebuffer. Rist pølsen manuelt i vertikal stilling (kraftig) i 2 min.</li>
	<li>Dekanter risteløsningen i et nytt 15 ml rør og gjenta ristingstrinnet i totalt 10 ml krypter i ristingsbuffer.</li>
	<li>Ta 20 μL av kryptfjæringen i en Petri-tallerken og tell antall krypter under et mikroskop. Beregn kryptkonsentrasjonen i krypter/μL. Avhengig av konsentrasjonen, fortynn prøvene for å oppnå 5 krypter / μL i øyeblikket av plating (1000 krypter / cm2).</li>
	<li>Snurr røret med isolerte krypter ved hjelp av sentrifuge ved bordplaten ved 400 x g i 10 minutter ved 4 °C.</li>
	<li>I mellomtiden fjerner du 48-brønnsplate/innsats/kammersklie fra inkubatoren og plasserer den i biosikkerhetsskapet. Aspirer beleggløsningen ved hjelp av P200 og la platen med lokket være litt forskjøvet til cellene er klare til å bli belagt.</li>
</ol>4. Culturing 2D monolayer
MERK: For en detaljert protokoll om hvordan du genererer intestinale epitelale monolayers fra 3D-kolonoider, sjekk protokoller av Estes og Kovbasnjuk labs (7,11).
<ol><li>Fjern ristebufferen ved hjelp av 10 ml serologisk pipette. Pass på at pelletsen er intakt og kan bruke P1000 til å fjerne eventuell væske som er igjen. Re-suspendere pellet i 3 ml LWRN komplette medier og pipette opp og ned med P1000. Tilsett 200 μL krypter i hver brønn av en forhåndsbelagt 48-brønns plate/kammersklie og inkuber i en 5 % CO2-inkubator ved 37 °C.</li>
	<li>Dagen etter aspirerer du mediene ved hjelp av P200 og legger til nye medier. Cellene blir flytende i 24-48 timer.</li>
	<li>For cellekulturmembraninnlegg legger du til 200 μL krypter (5 krypter /μL) øverst på innsatsene og 600 μL komplette L-WRN-medier i den nederste delen. Dagen etter aspirerer du mediene ved hjelp av P200 og legger til nye medier bare i toppkammeret. Inkuber platen i en 5% CO2 inkubator ved 37 °C. Transepithelial elektrisk motstand (TEER) måles hver dag ved hjelp av Epitelial Volt/Ohm meter (EVOM). MERK: Hvis kulturen har en TEER-lesing som er større enn 300 Ω,cm2, er det meningen at de skal være flytende. Samløp oppnås om 3-4 dager. Bytt medium annenhver dag.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Quiros, M., Nusrat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+wound-associated+cells+and+mediators+in+orchestrating+gastrointestinal+mucosal+wound+repair.">Contribution of wound-associated cells and mediators in orchestrating gastrointestinal mucosal wound repair.</a> Annual Reviews in Physiology. 81, 189-209 (2019).</li><li>Blutt, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+organoids+to+study+regenerative+responses+to+intestinal+damage.">Use of organoids to study regenerative responses to intestinal damage.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 317 (6), 845-852 (2019).</li><li>Zhang, M., Liu, Y., Chen, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+3D+human+gastrointestinal+organoids:+principle+and+applications.">Generation of 3D human gastrointestinal organoids: principle and applications.</a> Cell Regeneration. 9 (1), 6 (2020).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Zachos, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+enteroids/colonoids+and+intestinal+organoids+functionally+recapitulate+normal+intestinal+physiology+and+pathophysiology.">Human enteroids/colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (8), 3759-3766 (2016).</li><li>Kozuka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+human+and+mouse+intestinal+epithelial+cell+monolayer+platform.">Development and characterization of a human and mouse intestinal epithelial cell monolayer platform.</a> Stem Cell Reports. 9 (6), 1976-1990 (2017).</li><li>In, J. G., Foulke-Abel, J., Clarke, E., Kovbasnjuk, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+colonoid+monolayers+to+study+interactions+between+pathogens,+commensals,+and+host+intestinal+epithelium.">Human colonoid monolayers to study interactions between pathogens, commensals, and host intestinal epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (146), e59357 (2019).</li><li>Cardenas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-+and+three-dimensional+bioengineered+human+intestinal+tissue+models+for+cryptosporidium.">Two- and three-dimensional bioengineered human intestinal tissue models for cryptosporidium.</a> Methods in Molecular Biology. 2052, 373-402 (2020).</li><li>Moon, C., VanDussen, K. L., Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+primary+mouse+intestinal+epithelial+cell+monolayer+culture+system+to+evaluate+factors+that+modulate+IgA+transcytosis.">Development of a primary mouse intestinal epithelial cell monolayer culture system to evaluate factors that modulate IgA transcytosis.</a> Mucosal Immunology. 7 (4), 818-828 (2014).</li><li>VanDussen, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+enhanced+human+gastrointestinal+epithelial+culture+system+to+facilitate+patient-based+assays.">Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays.</a> Gut. 64 (6), 911-920 (2015).</li><li>Zou, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+intestinal+enteroids:+New+models+to+study+gastrointestinal+virus+infections.">Human intestinal enteroids: New models to study gastrointestinal virus infections.</a> Methods in Molecular Biology. 1576, 229-247 (2019).</li><li>Heijmans, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ER+stress+causes+rapid+loss+of+intestinal+epithelial+stemness+through+activation+of+the+unfolded+protein+response.">ER stress causes rapid loss of intestinal epithelial stemness through activation of the unfolded protein response.</a> Cell Reports. 3 (4), 1128-1139 (2013).</li><li>Nik, A. M., Carlsson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+intact+intestinal+epithelium+from+mesenchyme.">Separation of intact intestinal epithelium from mesenchyme.</a> Biotechniques. 55 (1), 42-44 (2013).</li></ol>

Forfatterne har ingen interessekonflikter.

Vår protokoll gir en rask, reproduserbar og pålitelig metode for å generere direkte primære 2D IEC monolayers. En av de viktigste forskjellene i vår protokoll sammenlignet med tidligere publiserte protokoller for å generere kolon epiteliale monolayers er at vi ikke kutter tykktarmen i små biter for å frigjøre kryptene. I stedet tilpasset vi en protokoll for å skille intestinal epitel fra mesenchyme13 ved en kombinasjon av kjemiske og mekaniske krefter for å frigjøre krypter i et ekstremt rent preparat, (Figur 2), noe som gir forskeren ideelt materiale for å generere primærkulturer. Vår isolasjonsmetode kan også brukes til å generere 3D-enteroider og kolonoider. Det er viktig å gjøre et kryptantall hver gang et eksperiment utføres for å normalisere antall krypter som blir belagt. Variabler som kolonpølse turgor, isolasjonshastighet, brukerekspertise kan påvirke antall krypter isolert. Den foreslåtte platingkryptkonsentrasjonen som er nevnt i protokollen, er et utgangspunkt, men hver bruker som skal ta hensyn til brukerdrevne variabler, må optimalisere den. Vi har brukt denne teknikken med mannlige og kvinnelige WT-mus fra 8 til 20 uker, og vi har ikke sett store forskjeller i celleoverlevelse, i teorien har krypter isolert fra yngre mus bedre sjanser til å overleve. Krypter er belagt i overkant, da bare en liten prosentandel av dem festes til overflaten og overlever. En balanse der det er nok krypter til å ha en 50% samløp en dag etter plating, men ikke for mange krypter der de døende kryptene vil ha en cytotoksisk effekt er målet. LWRN-medier må fjernes forsiktig 24 timer etter plating for å eliminere døde krypter og rusk, dette må gjøres nøye for å unngå å løsne celler som allerede vokser som monolayer.
Etter første fjerning av LWRN-medier må brukeren avgjøre om de eksperimentelle forholdene krever primære IEC-monolag som forblir nærmere stamceller og legger til friske LWRN-medier, eller om differensiering av monolayeren er ønsket, erstatt med differensieringsmedier. Den viktigste faktoren i denne protokollen er å sikre kolonets integritet under isolasjonsprosessen. Hvis det oppstår et brudd, kan pølsen forkortes for å eliminere det skadede området. Før du setter pølsen i EDTA, må du sørge for at knutene er så stramme som mulig. Hvis pølsen deflateres etter EDTA-inkubasjonen, kan protokollen fortsette med liten eller ingen effekt i det totale kryptutbyttet. Hvis den gjentatte sprøyten ikke er tilgjengelig, kan en vanlig mikropipettespiss festet til en vanlig sprøyte også brukes til prosessen med inflasjon og deflasjon. Også, hvis ingen celle utvinning løsning er tilgjengelig, kan inflasjon og deflasjon trinn gjøres i EDTA (2mM tynntarmen, 50 mM kolon), men denne substitusjonen anbefales ikke. Hvis samløp ikke er nødvendig, kan krypter vokse i plater belagt bare med kollagen og til og med i ubestrøket plater. Bruk bare ubestrøkete plater tilfeller det er ikke noe annet alternativ, men cellene vil ikke vokse sunt som de ville gjort i kollagenbelagte plater. Når det gjelder kulturhelse og stabilitet, er monolayers belagt i plast sunt i 4 til 5 dager, mens monolayers belagt i transwells kan bæres i opptil 8 dager.
En av hovedbegrensningene ved denne metoden er cellemediet som kreves for å dyrke epitelale kolonmonolayere. LWRN-celler er tilgjengelige ved ATCC, men LWRN-betinget mediegenerering er arbeidsintensiv og krever tilgang til et fluorescerende spektrometer for å bestemme Wnt-aktivitet. Differensieringsmedier krever en rekke reagenser som legges til friske før bruk, noe som gjør det til en kjedelig prosess. Til slutt er de fleste av disse reagensene kostbare og er enkle å brenne reagensene i et raskt tempo. Hvis et laboratorium ønsker å etablere denne teknikken uten tidligere tarm primærcellekultur, anbefales det på det sterkeste å finne en samarbeidspartner / høyskole med erfaring og trene et av sine medlemmer.
Vedlikehold av 3D-kultur kan være dyrt på grunn av kostnadene for kjellermembranmatrisemedium og høye mengder betingede medier som trengs for organoidkulturer, men det har fordelen av å bruke et redusert antall mus og de genererte strukturene kan passeres mange ganger. Enteroider (avledet fra tynntarmen) er relativt enkle å isolere og vedlikeholde mens kolonoider er mer delikate, vokser i et langsommere tempo og har en mer begrenset passasjekapasitet. Monolayergenerering fra 3D-kolonoider krever en uforholdsmessig stor mengde 3D-strukturer, noe som gjør denne typen eksperimenter tidkrevende og kostbare. Tvert imot er direkte epitelial kolon monolayer prep rask og er en rask måte å oppnå resultatene på. En kolonforberedelse kan generere et sammenløpsområde på 75 cm2 (10 til 15 ml betingede medier, erstatter en gang) 2 til 3 dager etter plating (dette området vil kreve 144 brønner med 3D-kolonoider, noe som betyr nesten 6 ml Matrigel og mer enn 250 ml betingede medier). Det lavere forbruket av medier, rimelig vedlikehold av cellekulturen og evnen til å utføre funksjonelle tester og rask nedstrøms prosessering er store fordeler med epitelale kolonmonolayers.
Denne protokollen er et verdifullt verktøy i studiet av intestinal epitelcellebiologi i områder som celleadhesjon, polaritet og differensiering. Det gir fordelen å generere primære cellekulturer fra genetisk modifiserte mus (knock-out, overexpressing, reportere). De primære intestinale epitelale monolayers gir enkel tilgang til de apikale og basolaterale overflatene (når de er belagt på transwells) slik at studiet av permeabilitet, barriere og transepithelial migrasjon av forskjellige celletyper. Til slutt kan denne modellen være nyttig i forskjellige felt som vertspatogeninteraksjoner, epitelskade og reparasjon og legemiddeloppdagelse.

Intestinale epitelceller (IEC) linje tarmene danner en selektivt gjennomtrengelig barriere som tillater nærings- og vannabsorpsjon samtidig som mikroorganismer og giftstoffer kommer inn i kroppen 1. Tarmslimhinnen består av lysende projeksjoner kalt villi (bare tilstede i tynntarmen) og invaginasjoner kalt krypter. Villi og overflaten av kolonkrypter er dekket av differensierte epitelceller mens bunnen av kryptene består av stamceller som gjør rask fornyelse av tarmepitelet, som har en omsetning fra 3 til 7 dager. Intestinale stamceller (ISC) er ikke bare viktige for å opprettholde tarm homeostase, men for tilstrekkelig reparasjon av skadet epithelia2.
Studie av tarmepilesibiologien var begrenset av mangelen på primærcellekulturer med transformerte cellelinjer som det eneste verktøyet som var tilgjengelig. Intestinal epitelial modellcellelinjer er ikke i stand til å nøyaktig gjenskape fysiologien til det normale tarmepitelet. Utviklingen av 3D-kulturer avledet fra ISC ga tarm slimhinnebiologer med in vitro-modeller som ligner i vivo tarm slimhinneforhold3. Krypter kan lett isoleres fra murinprøver, innebygd i et kjellermembranmatrisemedium (f.eks. matrigel) og dyrkes i betingede medier som inneholder Wnt3a, R-spondin og Noggin, og genererer 3D-strukturer kjent som enteroider (tynntarmen) eller kolonoider (tykktarmen)4. Enteroider og kolonoider er polariserte sfæroidale strukturer der det apikale domenet står overfor en intern lumen og basolateralområdet er i direkte kontakt med den ekstracellulære matrisen. Enteroider og kolonoider inneholder alle store differensierte intestinale epiteliale undertyper som Enterocytes / Colonocytes, Paneth, Enteroendocrine og Goblet celler, og de vises i relativt samme proporsjoner som de gjør i den delen av tarmen der de ble isolert fra5. Selv om 3D-enteroider og kolonoider representerer et stort fremskritt i studiet av tarmutvikling og fysiologi, presenterer disse modellene visse ulemper som begrenset tilgang til epitelcellens apikale overflate (lumen) og evnen til å skalere kulturer opp eller ned for å oppnå høygjennomstrømningsscreening av molekyler av interesse. For å overvinne disse begrensningene ble protokoller for å oppnå primære 2D-kulturer av IEC avledet fra 3D-enteroider / kolonoider generert. 2D-enteroider/kolonoider vokser som ark med celler akkurat som modellcellelinjer gjør og er ideelle for å studere blant annet tarmsårreparasjon, vertspatogeninteraksjoner og regenerativ medisin. Flere publiserte artikler beskriver hvordan man genererer 2D-monolayere fra 3D-strukturer eller direkte fra tarmkrypter, (se6,7,8,9,10,11), men disse metodene har en tendens til å være arbeidskrevende og vanskelig å reprodusere. En rask, enkel og reproduserbar metode for å oppnå monolayers direkte fra nyisolerte tarmkrypter for mus er skissert i denne protokollen.
Her forklarer vi i detalj prosessen for kryptutvinning med minimal generering av rusk, ekstracellulært matrisevalg og forskjellige overflater og applikasjoner for denne teknikken. Denne eksperimentelle tilnærmingen ble optimalisert for kolonkrypter, men lignende resultater oppnås når de brukes på tynntarmen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-004CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement (50X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen from human placenta (type IV)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>85529-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP220-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s phosphate buffered saline, with Ca2+ and Mg2+ (DPBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-030-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epithelial Volt/Ohm meter</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>0-10K&#937; with STX2 (EVOM2)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>51201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-016-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Firefly Luciferase assay</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>30085-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geneticin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10131-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25060CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant EGF</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>236-EG</td>
			<td>Stock Concentration: 500&#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant Wnt-3A</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>W3a-H-005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10687010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LWRN cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular grade water</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-000-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165-5G</td>
			<td>Stock Concentration: 500mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin</td>
			<td>Conditioned media</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Lab-Tek Chamber slide system</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7182-1PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pencillin-Streptomycin (10,000U/mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30002CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospahte buffered saline, Ca2+ and Mg2+ free (PBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic 20G feeding tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-810-46</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rh-laminin-521</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A29248</td>
			<td>Stock concentration: 100&#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roboz Surgical 4-0 Silk Black Braided 100YD</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9452680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOPflash HEK293 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell Permeable supports (0.4&#181;m)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3470</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of murine primary colon epithelial monolayers from intestinal crypts

Intestinal epitel består av et enkelt lag av celler som fungerer som en barriere mellom tarmlumen og kroppens indre. Forstyrrelser i kontinuiteten i denne barrieren kan føre til inflammatoriske lidelser som inflammatorisk tarmsykdom. En av begrensningene i studiet av intestinal epitelbiologi har vært mangelen på primærcellekulturmodeller, som har forpliktet forskere til å bruke modellcellelinjer avledet fra karsinomer. Adventen av tredimensjonale (3D) enteroider har gitt epitelbiologer et kraftig verktøy for å generere primærcellekulturer, likevel er disse strukturene innebygd i ekstracellulær matrise og mangler modenhetskarakteristikken til differensierte tarmepiteleceller. Flere teknikker for å generere intestinale epitel monolayers har blitt publisert, men de fleste er avledet fra etablerte 3D-enteroider som gjør prosessen arbeidskrevende og dyr. Her beskriver vi en protokoll for å generere primære epitelale kolonmonolayere direkte fra murine intestinale krypter. Vi beskriver også eksperimentelle tilnærminger som kan brukes med denne modellen, for eksempel generering av konfluente kulturer på gjennomtrengelige filtre, sammenfallende monolayer for ripesårhelingsstudier og sparsomme og sammenfallende monolayers for immunfluorescence analyse.

For å illustrere påliteligheten til de primære epitelale kolonmonolayerkulturene, vises et sammendrag av kryptisolasjonen og representative bilder avledet fra protokollen. Brukeren må ha i tankene at de isolerte kryptene dyrkes i sterile forhold, så en riktig disseksjon og rengjøring av tykktarmen er en prioritet. Figur 1 inneholder viktige trinn under kryptisolering. Isolerte krypter (figur 2A) telles og konsentreres nå (Figur 2B) for å oppnå en konsentrasjon på 5 krypter/μL. Etter en konsentrert forberedelse av krypter, vil cellene bli belagt i ønsket format (kulturrett, membraninnlegg eller kammersklier) og inkuberes med passende medier avhengig av eksperimentelle behov. Figur 3 viser kulturprogresjon etter 24 og 48 timers kultur i 48-brønnsplater. Cellene inkuberes til ønsket samløp er nådd. For å eksemplifisere mulige anvendelser av denne metoden tillot vi 48-brønns platebrønner å nå samløp og fortsatte å gjøre en ripesåranalyse. Figur 4 viser en nyopprettet ripe (figur 4A) i en 2D-kolonoid monolager og det samme såret 24 timer etter (Figur 4B). Det er klart at kulturen fortsatt er sunn og levedyktig, og det er sårreparasjon. For å generere differensierte monolag, endres media fra LWRN til differensieringsmedier. Differensiering oppnås ved å vise høye TEER-verdier (figur 5A), reduksjon av ISC-markører ((Leucine-rik repeterende G-protein koblet reseptor 5 (Lgr5) og Achaete-scute som 2 (Ascl2)) og økning av differensieringsmarkører (Lgr5) og Achaete-scute som 2 (Ascl2)) og økning av differensieringsmarkører ((Alanyl aminopeptidase (Anpep), Mucin 2 (Muc2), lysozyme 1 (Lyz1), Sukrose iso-maltase (Sis) og Chrmogranin A (Chga)) (Figur 5B, C) av PCR. Andre markører som CDX2 og KRT20 kan også inkluderes i dette panelet. I tillegg til mRNA-uttrykksnivåer er utseendet på undertyper av differensierte epitelceller i 2D-kolonoider dyrket i differensieringsforhold også vist ved immunfluorescens (Muc2 og Chga; Figur 5D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62156/62156fig01.jpg"> Figur 1: Prøvepreparering for generering av friske monolayers. Prøvepreparering er avgjørende for generering av sunne monolayers. Viktige trinn i isolasjonsprosessen er avbildet i denne figuren for å gjøre det enklere for leseren. Tykktarmen utskilles fra musen, og sørger for at det ikke er pelsrester. Fjern forsiktig avføringen og sørg for at du ikke perforerer tykktarmen; Dette er av avgjørende betydning da tykktarmen må kunne holde luft og bli oppblåst og deflatert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62156/62156fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62156/62156fig02.jpg"> Figur 2: Krypter isolasjonstall og konsentrasjon. (A) Colonic krypter etter å ha ristet kolon pølser. Bildet viser et felt med en 20 μL-dråpe. (B) Kryptkonsentrasjon for å oppnå 5 krypter/μL. Skalastang: 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62156/62156fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62156/62156fig03.jpg"> Figur 3: Primær IEC Monolayer-vekst. (A) 2D IEC monolayers etter 24 timers plating og fjerning av celleavfall. (B) Sammenfallende 2D IEC monolayers 48 h etter plating. Skalalinje: 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62156/62156fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62156/62156fig04.jpg"> Figur 4: Ripe såranalyser ved hjelp av murin primær IEC. Bilder som viser sårheling etter at en ripe ble laget i epitelial kolon monolayer. Skalalinje: 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62156/62156fig04large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62156/62156fig05.jpg"> Figur 5: Differensiering av epitelale kolonmonolayere. (A) Differensieringsmedier skaper tette epitelbarrierer som demonstrert av TEER. Differensieringsmedier forårsaker en dråpe i mRNA-uttrykk for (B) stamcellemarkører og oppregulering av (C) differensieringsmarkører. (D) Markører av spesialiserte differensierte epitelceller som Muc2 og Chromogranin-A kan også påvises via immunfluorescens av direkte 2D-kolonoider. Skalalinje: 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62156/62156fig05large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Murine Primary Colon Epithelial Monolayers from Intestinal Crypts at JoVE.com

Generation of Murine Primary Colon Epithelial Monolayers from Intestinal Crypts

I denne protokollen beskriver vi hvordan du genererer murine primære epitelale kolonmonolayere direkte fra tarmkrypter. Vi tilbyr eksperimentelle tilnærminger for å generere samtidige monolayers på gjennomtrengelige filtre, konfluente monolayers for riper sår healing og biokjemiske studier, og sparsomme og konfluente monolayers for immunfluorescence analyse.

Generasjon murine primær kolon epitelial monolayers fra intestinale krypter

The intestinal epithelium is comprised of a single layer of cells that act as a barrier between the gut lumen and the interior of the body. Disruption in ...

Vår protokoll gir en rask, reproduserbar og pålitelig metode for å generere direkte primære intestinale epitelmonlayers på forskjellige overflater med minimalt rusk. De viktigste fordelene med denne protokollen er lavt forbruk av medier og lavt vedlikeholdskostnader for cellekultur. Det er en rask metode for å utføre funksjonstester og raske nedstrømsapplikasjoner.Denne protokollen vil gi innsikt i studiet av sårreparasjon, permeabilitetsbarriere og transepithelial migrasjon av forskjellige celletyper. Også denne modellen kan være nyttig i vertspatogeninteraksjon, skadet epitel og narkotikaoppdagelse. Til å begynne med, tilsett 200 mikroliter beleggløsning til hver brønn av en 48-brønns plate og kammersklie.Pre-inkubere både i en 5% karbondioksidinkubator ved 37 grader Celsius i to timer. Frakk 0,4 mikrometer cellemembraninnsatser med 200 mikroliter kollagenoppløsning. Inkuber platen med membraninnsatsene ved fire grader Celsius i 30 minutter, og overfør den deretter til en 5% karbondioksidinkubator ved 37 grader Celsius i to timer.Desinfiser en euthanized mus med 70% etanol, og disseker deretter ut tykktarmen fra endetarmen til cecum ved hjelp av saks og tang. Skyll forsiktig avføringen med iskald PBS i en 10 milliliter sprøyte utstyrt med et 20 gauge fôringsrør. Fjern det proksimale tykktarmen og skyv den distale kolon forsiktig på 20 gauge fôringsrøret.Bind tykktarmen på enden av røret med 4-0 silke suturtråd. Snu tykktarmen innvendig ut over den bundet enden og bind den andre enden med tråd, og kutt deretter tykktarmen under spissen av fôringsrøret ved hjelp av kirurgisk saks. Åpne forsiktig den løsnede enden av det inverterte tykktarmen på spissen av en 1,25 milliliter repetisjonssprøyte ved hjelp av stempelet.Skyv den løsnede enden av det omvendte tykktarmen på sprøyten og bind den tett med en tråd. Sett stempelet inn i sprøyten og blås opp tykktarmen til det ser turgent ut uten synlige rynker. Legg den oppblåste kolonpølsen i et 15 milliliter rør som inneholder fem milliliter cellegjenvinningsløsning på is i 20 minutter.Blås opp og tøm tykktarmen en gang hvert femte minutt. Bind av den oppblåste kolon under spissen av repetisjonssprøyten ved hjelp av 4-0 silke suturtråd. Klipp kolonpølsen av den gjentatte sprøyten og legg den i et 15 milliliter rør som inneholder 10 milliliter 50 millimolar EDTA i 40 minutter.Roter røret ved fire grader Celsius. Bytt ut EDTA-oppløsningen med fem milliliter ristebuffer og rist pølsen manuelt i vertikal stilling i to minutter. Dekanter risteløsningen i et nytt 15 milliliterrør og gjenta ristingstrinnet til totalt 10 milliliter krypter og ristingsbuffer samles inn.Tell antall krypter i 20 mikroliter av suspensjonen under et mikroskop og fortynn prøven for å oppnå konsentrasjonen av fem krypter per mikroliter. Sentrifuger kryptprøven ved 400 ganger G i 10 minutter ved fire grader Celsius. I mellomtiden fjerner du 48-brønnsplaten og membraninnsatsene fra inkubatoren og legger den i biosikkerhetsskapet.Aspirer beleggløsningen ved hjelp av en P200 pipette og la platen med lokket være litt forskjøvet til cellene er klare til å bli belagt. Etter sentrifugering av kryptopphenget, fjern ristebufferen og resuspend den intakte pellet i tre milliliter LWRN komplette medier. Tilsett 200 mikroliter krypter til hver brønn av den forhåndsbelagte 48-brønnsplaten og kammersklie og inkuber begge i en 5% karbondioksidinkubator ved 37 grader Celsius.Neste dag aspirerer du mediene og legger til nye medier. Vanligvis blir cellene flytende i 24 til 48 timer. For cellekulturmembraninnsatser legger du til 200 mikroliter krypter øverst på innsatsene og 600 mikroliter komplette LWRN-medier til bunnen.Neste dag aspirerer du mediene og legger til nye medier bare i toppkammeret. Inkuber platen i en 5% karbondioksidinkubator ved 37 grader Celsius. Mål transepithelial elektrisk motstand hver dag ved hjelp av en epitelvolt/ohm meter.Etter å ha isolert kryptene fra et murinkolon og bekreftet konsentrasjonen, ble kryptfjæringen konsentrert til fem krypter per mikroliter. 48-brønns platebrønner ble utsatt for en ripesåranalyse da de nådde cellesamløpet. Etter 24 timer ble det observert sårreparasjon som indikerer at kulturen var sunn og levedyktig.Høyere nivåverdier ble oppnådd da medier ble endret fra LWRN til differensieringsmedier. Det ble også observert en reduksjon av ISC-markører og en økning i differensieringsmarkører som indikerer at de differensierte monolagene ble generert med hell. I tillegg ble utseendet på undertyper av differensierte epitelceller dyrket under forskjellige forhold vist ved immunfluorescens.Når du prøver denne protokollen, er det viktig å sørge for at tykktarmen ikke brister på noe tidspunkt under forberedelsen og forblir oppblåst for å frigjøre krypter i ekstremt rent preparat. Når 2d intestinal epitelcellemonolayers dannes, kan vi utføre immunfluorescens, ripesår og permeabilitetsanalyser og andre nedstrømsapplikasjoner. Dette vil gi kunnskap i sårheling, migrasjon av forskjellige celletyper og epitelreparasjons- og skadestudier.

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

Isolering av primær myofibroblasts fra Mouse and Human Colon Tissue

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Cryosectioning Method for Microdissection of Murine Colonic Mucosa

Cryosectioning Metode for mikrodisseksjon av Murine Kolon Mucosa

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The ...

Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation

Intestinal epitelial regenerering som respons på ioniserende bestråling

The intestinal epithelium consists of a single layer of cells yet contains multiple types of terminally differentiated cells, which are generated by the ...

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

Primær kultur av svin retinal pigment epitelceller

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...

Culture of Piglet Intestinal 3D Organoids from Cryopreserved Epithelial Crypts and Establishment of Cell Monolayers

Kultur av Piglet Intestinal 3D Organoids fra kryopreserverte epitelkrypter og etablering av cellemonolayers

Intestinal organoids are increasingly being used to study the gut epithelium for digestive disease modeling, or to investigate interactions with drugs, ...

Unveiling Inflammatory Arthritis&#58; Exploring Functions of Synovial Cells

Isolation and Culture of Primary Synovial Macrophages and Fibroblasts from Murine Arthritis Tissue

Isolation and Culture of Primary Synovial Macrophages and Fibroblasts from Murine Arthritis Tissue (Video) | JoVE 

Isolering og kultur av primære synoviale makrofager og fibroblaster fra murintartrittvev

Rheumatoid arthritis is an autoimmune disease that leads to chronic inflammation of joints. Synovial macrophages and synovial fibroblasts have central ...

3D Culture of Organoids from Murine Intestinal Crypts and Single Stem Cell

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research (Video) | JoVE 

3D-dyrking av organoider fra murintestinale krypter og en enkelt stamcelle for organoidforskning

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine ...

Epithelial Effects of Intestinal Inflammation on Established Murine Colonoids

Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids

Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids (Video) | JoVE 

Studere epiteleffekter av tarmbetennelse in vitro på etablerte murinkolonoider

The intestinal epithelium plays an essential role in human health, providing a barrier between the host and the external environment. This highly dynamic ...