Name: generation of murine primary colon epithelial monolayers from intestinal crypts
Uploaded: 2021-02-06T14:30:00
Duration: 6 min 57 s
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Este trabalho foi apoiado pelo Crohn's and Colitis Foundation Career Development Award (544599, to MQ) e as bolsas NIH (DK055679, DK089763, DK059888, à AN). Gostaríamos de agradecer ao Laboratório de Modelagem de Tecidos Translacionais da Medicina de Michigan por sua ajuda contínua e acesso aos seus reagentes e protocolos.

Todos os procedimentos descritos abaixo foram aprovados e conduzidos de acordo com as diretrizes estabelecidas pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Michigan.
1. Preparação de reagentes para isolamento e cultura cripta (prepare-se na capa da cultura tecidual)
<ol><li>50 mM de ácido tetraáctico de etilenodiamina (EDTA): Adicione 50 mL 0,5 M de estoque a 450 mL de salina tamponada de fosfato, sem cálcio (Ca2+) e magnésio (Mg2+) para preparar 500 mL. Neste protocolo, a PBS se referirá à PBS sem cálcio e magnésio, a menos que seja indicado de outra forma.</li>
	<li>Tampão de agitação: Dissolva 7,4 g de sacarose (43,3 mM) e sorbitol de 5 g (54,9 mM) em PBS para preparar 500 mL.</li>
	<li>L-WRN (L-WNT-3A, R-spondin e Noggin) mídia: Suplemento Avançado Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 (DMEM/F12) (780 mL) com 20% de Soro Bovino Fetal (FBS) (200 mL), 1x suplemento de glutamina comercialmente disponível (10 mL), penicilina U/mL 100 E, Estreptomicina de 100 g/mL (10 mL) e filtro esterilizado com filtro de 0,22 μm.<ol>
<li>Obter células L-WRN através de ATCC, crescer em frascos T175, e selecionar usando Geneticin e Hygromycin. A mídia é alterada e coletada por 12 dias. NOTA: Cada lote de mídia é testado para a atividade Wnt usando um ensaio TOPflash Wnt Reporter. Neste caso, foram seguidos os protocolos do Laboratório de Modelagem de Tecidos Translacionais da Medicina de Michigan (https://www.umichttml.org/protocols). A linha de células TOPflash HEK 293 é cultivada em confluência em um frasco T75, trippsinizado e banhado em uma placa de 96 poços. No dia seguinte, diferentes diluições da mídia coletada são adicionadas às células e incubadas em uma incubadora de CO2 de 5% a 37 °C durante a noite. No dia seguinte, as células são lísedas, e o ensaio Firefly Luciferase é realizado de acordo com as instruções do fabricante. O ensaio é normalizado usando Wnt-3A recombinante. A mídia é dividida em alíquotas de 25 mL em tubos cônicos de 50 mL e armazena a -80 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mídia base: Para 500 mL, suplemento Avançado DMEM/F12 (448 mL) com 2x suplemento de glutamina comercialmente disponível (10 mL), 20 mM HEPES (10 mL), 100 penicilina U/mL e, Estreptomicina de 100 g/mL (10 mL), 2 mM N-acetil-L-cisteína (2 mL), suplemento N2 (10 mL) e suplemento B27 (20 mL), esterilizador de filtro com filtro de 0,22 μm. Divida a mídia em alíquotas de 25 mL em tubo cônico de 50 mL e armazene a -80 °C.</li>
	<li>Mídia completa LWRN: Combine mídia LWRN de 25 mL com 25 mL de mídia base e suplemento com fator de crescimento epidérmico de 200 ng/mL (EGF) (20μL) e solução antimicolítica de 2x (1 mL). Armazene a mídia completa a 4 °C.</li>
	<li>Colágeno e Laminina: Dissolver 5 mg de pó em 5 mL de filtro esterilizado 100 mM de ácido acético (adicionar 60 μL de caldo de ácido acético a 9,94 mL de água de grau molecular) para produzir uma concentração de estoque de 1 mg/mL. Gire a 4 °C por 4 h e faça 100 alíquotas de μL em tubos de 0,2 mL. Congele a -20 °C. Laminin é comprado a uma concentração de estoque de 100 μg/mL.</li>
	<li>Mídia completa sem fatores de crescimento (CMGF-): Suplemento Avançado DMEM/F12 (500 mL) com 1x suplemento de glutamina comercialmente disponível (5 mL), 10 mM HEPES (5 mL), 100 U/mL penicilina e, 100 g/mL streptomicina (5 mL).</li>
	<li>Mídia de diferenciação: A 9,2 mL de cmgf-mídia, adicionar 200 μL de suplemento B27, 100 μL de suplemento N2, 20 μL de N-acetil-L-cisteína, 500 μL de mídia Noggin12 (feita de células produtoras de Noggin) e 2 μL de EGF para fazer 10 mL de mídia de diferenciação.</li>
</ol>2. Preparação de placas, lâminas de câmara e inserções de membrana de cultura celular
<ol><li>Revestimento de 48 poços de placa e lâminas de câmara para chapeamento monocamada 2D: Use a solução de revestimento que constitui diluição de laminina (diluição 1:40, ver Tabela de Materiais) e colágeno (diluição 1:30) em salina fosfato a frio de Dulbecco, com Ca2+ e Mg2+ (DPBS). Adicione 200 μL de solução de revestimento a cada poço e pré-incubar o slide de placa/câmara em uma incubadora de 5% de CO2 a 37 °C por pelo menos 2 h.</li>
	<li>Revestimento de 0,4 μm de membrana de cultura celular inserções: Faça 1:30 diluição de colágeno em água de grau molecular e adicione 200 μL a cada inserção. Mantenha a placa contendo a inserção da membrana no gelo a 4 °C por 30 minutos. Após a incubação de 30 min, mantenha a placa em uma incubadora de CO2 de 5% a 37 °C por 1,5-2 h. As inserções de poliéster e membrana de policarbonato produzem resultados comparáveis. NOTA: Qualquer placa de cultura tecidual pode ser semeada (para cima e para baixo pode ser realizada) usando este protocolo ajustando o volume de colágeno/laminina para obter cobertura completa da superfície de chapeamento.</li>
</ol>3. Isolamento da cripta
NOTA: Antes de iniciar a dissecção, prepare a placa revestida de colágeno e/ou laminina/inserções de membrana/deslizamento de câmara e deixe-os em uma incubadora de CO2 de 5% a 37 °C. Prepare um banco de trabalho limpo e instrumentos cirúrgicos estéreis apropriados para a cirurgia, e um gabinete de segurança biológica para cultivar monocamadas 2D. Confirme todos os outros equipamentos padrão para cultivo de monocamadas 2D, como incubadora de CO2 umidificada, centrífugas de mesa (mantidas a 4 °C), microscópio e pipetas (incluindo pipetas sorológicas) estão prontas.
<ol><li>Use ratos C57Bl/6, 8-12 semanas de idade. Eutanásia de camundongos usando um método aprovado de eutanásia.</li>
	<li>Pulverize as carcaças de camundongos com 70% de etanol (EtOH) solução para limpar a área de dissecção e remover o excesso de EtOH usando tecido de papel. NOTA: Certifique-se de que as criptes de isolamento da cripta (como PBS, 50 mM EDTA, shake buffer) são mantidas frias. Estes reagentes podem ser preparados um dia antes e são bons de usar por pelo menos 3 meses quando armazenados a 4 °C. Além disso, certifique-se de que a mídia completa LWRN seja mantida em um banho de contas/água mantido a 37 °C até o uso.</li>
	<li>Usando tesouras de dissecção limpa e fórceps, disseca o cólon do reto até o ceco. Segure a extremidade do cólon usando fórceps e limpe suavemente as fezes usando PBS gelado em uma seringa de 10 mL, equipada com um tubo de alimentação de 20 G(Figura 1A). Certifique-se de não romper o cólon.<ol>
<li>Remova o cólon proximal. Esta será a porção do cólon mais próxima da junção ileocecal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Com fórceps, deslize o cólon distal suavemente para o tubo de alimentação de 20 G, amarrando o cólon na extremidade do tubo pela ponta com fio de sutura de seda 4-0(Figura 1B).</li>
	<li>Inverta o cólon do avesso usando os dedos sobre a extremidade amarrado e amarre a outra extremidade com fio de sutura de seda 4-0. Utilizando tesoura cirúrgica, corte o cólon abaixo da ponta do tubo de alimentação (Figura 1C, D,E).</li>
	<li>Usando o êmbolo de uma seringa repetida de 1,25 mL, abra suavemente a extremidade desamaste do cólon invertido na ponta de uma seringa repetida de 1,25 mL. Deslize o cólon invertido na extremidade da seringa e amarre firmemente com rosca de sutura de seda 4-0(Figura 1F,G).</li>
	<li>Insira o êmbolo na seringa e infle o cólon para formar uma salsicha. Infle até que a linguiça de cólon pareça turgente sem rugas visíveis(Figura 1H).</li>
	<li>Coloque a seringa/cólon em tubo de 15 mL com 5 mL de Solução de Recuperação celular no gelo por 20 minutos, infle e desinte com o cólon uma vez a cada 5 minutos(Figura 1I). A salsicha deve permanecer inflada durante a incubação.</li>
	<li>Amarre usando fio de sutura de seda 4-0 abaixo da ponta da seringa repetida com o cólon inflado. Corte a linguiça da seringa repetida e coloque em tubo de 15 mL contendo 10 mL de 50 mM (2mM para intestino delgado) EDTA por 40 min e gire a 4 °C(Figura 1J,K).</li>
	<li>Decante a solução EDTA e substitua por 5 mL de tampão de shake. Agite a salsicha manualmente na posição vertical (vigorosamente) por 2 minutos.</li>
	<li>Decante a solução de agitação em um novo tubo de 15 mL e repita o passo de agitação para um total de 10 mL de criptas em tampão de agitação.</li>
	<li>Pegue 20 μL da suspensão da cripta em uma placa de Petri e conte o número de criptas sob um microscópio. Calcule a concentração de cripta em criptas/μL. Dependendo da concentração, dilui as amostras para obter 5 criptas/μL no momento do revestimento (1000 criptas/cm2).</li>
	<li>Gire o tubo com criptas isoladas usando centrífuga de mesa a 400 x g por 10 min a 4 °C.</li>
	<li>Enquanto isso, remova o deslizamento de placa/inserção/câmara de 48 poços da incubadora e coloque-o no armário de biossegurança. Aspire a solução de revestimento usando P200 e deixe a placa com a tampa ligeiramente compensada até que as células estejam prontas para serem banhadas.</li>
</ol>4. Culturing monocamadoreira 2D
NOTA: Para um protocolo detalhado sobre como gerar monocamadas epiteliais intestinais a partir de colonóides 3D, verifique os protocolos dos laboratórios de Estes e Kovbasnjuk (7,11).
<ol><li>Remova o tampão de agitação usando pipeta sorológica de 10 mL. Certifique-se de que a pelota está intacta e pode usar P1000 para remover qualquer líquido restante. Suspenda a pelota em 3 mL de mídia completa LWRN e pipeta para cima e para baixo com P1000. Adicione 200 μL de criptas a cada poço de um slide de placa/câmara pré-revestido de 48 poços e incubar em uma incubadora de 5% de CO2 a 37 °C.</li>
	<li>No dia seguinte, aspire a mídia usando P200 e adicione mídia fresca. As células ficam confluentes em 24-48 h.</li>
	<li>Para inserções de membrana de cultura celular, adicione 200 criptas μL (5 criptografas/μL) ao topo das pastilhas e 600 μL de mídia L-WRN completa à parte inferior. No dia seguinte, aspire a mídia usando P200 e adicione mídia fresca apenas à câmara superior. Incubar a placa em uma incubadora de CO2 de 5% a 37 °C. A Resistência Elétrica Transepitenelial (TEER) é medida todos os dias usando o medidor Epitelial Volt/Ohm (EVOM). NOTA: Se a cultura tem uma leitura TEER superior a 300 Ω,cm2,elas devem ser confluentes. A confluência é alcançada em 3-4 dias. Mudar de mídia a cada 2 dias.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Quiros, M., Nusrat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+wound-associated+cells+and+mediators+in+orchestrating+gastrointestinal+mucosal+wound+repair.">Contribution of wound-associated cells and mediators in orchestrating gastrointestinal mucosal wound repair.</a> Annual Reviews in Physiology. 81, 189-209 (2019).</li><li>Blutt, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+organoids+to+study+regenerative+responses+to+intestinal+damage.">Use of organoids to study regenerative responses to intestinal damage.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 317 (6), 845-852 (2019).</li><li>Zhang, M., Liu, Y., Chen, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+3D+human+gastrointestinal+organoids:+principle+and+applications.">Generation of 3D human gastrointestinal organoids: principle and applications.</a> Cell Regeneration. 9 (1), 6 (2020).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Zachos, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+enteroids/colonoids+and+intestinal+organoids+functionally+recapitulate+normal+intestinal+physiology+and+pathophysiology.">Human enteroids/colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (8), 3759-3766 (2016).</li><li>Kozuka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+human+and+mouse+intestinal+epithelial+cell+monolayer+platform.">Development and characterization of a human and mouse intestinal epithelial cell monolayer platform.</a> Stem Cell Reports. 9 (6), 1976-1990 (2017).</li><li>In, J. G., Foulke-Abel, J., Clarke, E., Kovbasnjuk, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+colonoid+monolayers+to+study+interactions+between+pathogens,+commensals,+and+host+intestinal+epithelium.">Human colonoid monolayers to study interactions between pathogens, commensals, and host intestinal epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (146), e59357 (2019).</li><li>Cardenas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-+and+three-dimensional+bioengineered+human+intestinal+tissue+models+for+cryptosporidium.">Two- and three-dimensional bioengineered human intestinal tissue models for cryptosporidium.</a> Methods in Molecular Biology. 2052, 373-402 (2020).</li><li>Moon, C., VanDussen, K. L., Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+primary+mouse+intestinal+epithelial+cell+monolayer+culture+system+to+evaluate+factors+that+modulate+IgA+transcytosis.">Development of a primary mouse intestinal epithelial cell monolayer culture system to evaluate factors that modulate IgA transcytosis.</a> Mucosal Immunology. 7 (4), 818-828 (2014).</li><li>VanDussen, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+enhanced+human+gastrointestinal+epithelial+culture+system+to+facilitate+patient-based+assays.">Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays.</a> Gut. 64 (6), 911-920 (2015).</li><li>Zou, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+intestinal+enteroids:+New+models+to+study+gastrointestinal+virus+infections.">Human intestinal enteroids: New models to study gastrointestinal virus infections.</a> Methods in Molecular Biology. 1576, 229-247 (2019).</li><li>Heijmans, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ER+stress+causes+rapid+loss+of+intestinal+epithelial+stemness+through+activation+of+the+unfolded+protein+response.">ER stress causes rapid loss of intestinal epithelial stemness through activation of the unfolded protein response.</a> Cell Reports. 3 (4), 1128-1139 (2013).</li><li>Nik, A. M., Carlsson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+intact+intestinal+epithelium+from+mesenchyme.">Separation of intact intestinal epithelium from mesenchyme.</a> Biotechniques. 55 (1), 42-44 (2013).</li></ol>

Os autores não têm conflitos de interesse.

Nosso protocolo fornece um método rápido, reprodutível e confiável para gerar monocamadas 2D IEC primárias diretas. Uma das principais diferenças em nosso protocolo em comparação com protocolos publicados anteriormente para gerar monocamadas epiteliais de cólon é que não cortamos o cólon em pequenas peças para liberar as criptas. Em vez disso, adaptamos um protocolo para separar o epitélio intestinal do mesenquime13 por uma combinação de forças químicas e mecânicas para liberar criptas em uma preparação extremamente limpa,(Figura 2),fornecendo ao pesquisador material ideal para gerar culturas primárias. Nosso método de isolamento também pode ser usado para gerar enteróides e colonóides 3D. É importante fazer uma contagem de cripta toda vez que um experimento é realizado para normalizar o número de criptas que estão sendo emplacar. Variáveis como salsicha de cólon turgor, velocidade de isolamento, experiência do usuário pode afetar o número de criptas isoladas. A concentração de criptografia sugerida mencionada no protocolo é um ponto de partida, mas todo usuário para responder por variáveis orientadas pelo usuário deve otimizá-la. Usamos essa técnica com camundongos WT machos e fêmeas que variam de 8 a 20 semanas e não vimos grandes diferenças na sobrevivência celular, em teoria criptas isoladas de camundongos mais jovens têm melhores chances de sobreviver. As criptas são banhadas em excesso, pois apenas uma pequena porcentagem delas se prende à superfície e sobrevive. Um equilíbrio onde há criptas suficientes para ter uma confluência de 50% um dia após o revestimento, mas não muitas criptas onde as criptas moribundas terão um efeito citotóxico é o objetivo. A mídia LWRN deve ser cuidadosamente removida 24 horas após o revestimento para eliminar criptas e detritos mortos, isso deve ser feito cuidadosamente para evitar desapegar células que já estão crescendo como uma monocamada.
Após a remoção inicial da mídia LWRN, o usuário deve decidir se as condições experimentais requerem monocamadas IEC primárias que permanecem mais próximas das células-tronco e adicionar mídia LWRN fresca ou se a diferenciação da monocamada é desejada, substituir por mídia de diferenciação. O fator mais importante neste protocolo é garantir a integridade do cólon durante o processo de isolamento. Se ocorrer uma ruptura, a salsicha pode ser encurtada para eliminar a área danificada. Antes de colocar a salsicha em EDTA certifique-se de que os nós estão o mais apertados possível. Se a salsicha for esvaziada após a incubação edta, o protocolo pode ser continuado com pouco ou nenhum efeito no rendimento global da cripta. Se a seringa repetida não estiver disponível, uma dica regular de micropipette anexada a uma seringa regular também pode ser usada para o processo de inflação e deflação. Além disso, se não houver solução de recuperação celular disponível, as etapas de inflação e deflação podem ser feitas em EDTA (intestino delgado de 2mM, cólon de 50 mM), mas essa substituição não é recomendada. Se a confluência não for necessária, as criptas podem crescer em placas revestidas apenas com colágeno e até mesmo em placas não revestidas. Só usam placas não revestidas não há outra opção, mas as células não ficarão saudáveis como em placas revestidas de colágeno. Quando se trata de saúde cultural e estabilidade, as monocamadas banhadas em plástico são saudáveis por 4 a 5 dias, enquanto monocamadas banhadas em transwells podem ser transportadas por até 8 dias.
Uma das principais limitações deste método é a mídia celular necessária para cultivar as monocamadas de cólon epitelial. As células LWRN estão disponíveis no ATCC, mas a geração de mídia condicionada LWRN é intensiva em mão-de-obra e requer acesso a um espectrômetro fluorescente para determinar a atividade Wnt. A mídia de diferenciação requer uma série de reagentes que são adicionados frescos antes do uso, o que o torna um processo tedioso. Finalmente, a maioria desses reagentes são caros e é fácil queimar os reagentes em um ritmo rápido. Se um laboratório deseja estabelecer essa técnica sem a cultura celular primária intestinal prévia, é altamente recomendável encontrar um colaborador/faculdade com experiência e treinar um de seus membros.
A manutenção da cultura 3D pode ser cara devido ao custo da matriz de membrana de porão de médio e alto volume de mídia condicionada necessária para culturas organoides, mas tem a vantagem de usar um número reduzido de camundongos e as estruturas geradas podem ser passagem muitas vezes. Os enteróides (derivados do intestino delgado) são relativamente fáceis de isolar e manter, enquanto os colonóides são mais delicados, crescem em um ritmo mais lento e têm uma capacidade de passagem mais limitada. A geração de monocamadas a partir de colonóides 3D requer uma quantidade desproporcional de estruturas 3D, que tornam esses tipos de experimentos demorados e caros. Pelo contrário, a preparação direta do monocamado de cólon epitelial é rápida e é uma maneira rápida de obter os resultados. Uma preparação de cólon pode gerar uma área confluente de 75 cm2 (10 a 15 mL de mídia condicionada, substitui uma vez) 2 a 3 dias após o revestimento (esta área exigiria 144 poços de colonóides 3D, o que significa quase 6mL de Matrigel e mais de 250 mL de mídia condicionada). O menor consumo de mídia, a manutenção de baixo custo da cultura celular e a capacidade de realizar testes funcionais e o processamento rápido a jusante são grandes vantagens das monocamadas de cólon epitelial.
Este protocolo é uma ferramenta valiosa no estudo da biologia das células epiteliais intestinais em áreas como aderência celular, polaridade e diferenciação. Ele dá a vantagem de gerar culturas celulares primárias a partir de camundongos geneticamente modificados (knock-out, superexpressivo, repórteres). As monocamadas epiteliais intestinais primárias permitem fácil acesso às superfícies apical e basolateral (quando banhadas em transwells) permitindo o estudo da permeabilidade, barreira e migração transeptelial de diferentes tipos de células. Finalmente, este modelo pode ser útil em diferentes campos, como interações hospedeiros-patógenos, danos epiteliais e reparo e descoberta de drogas.

As células epiteliais intestinais (IEC) alinham os intestinos formando uma barreira seletivamente permeável que permite a absorção de nutrientes e água, evitando que microrganismos e toxinas entrem no corpo 1. A mucosa intestinal é composta de projeções luminais chamadas villi (apenas presentes no intestino delgado) e invaginações chamadas criptas. Villi e a superfície das criptas do cólon são cobertas por células epiteliais diferenciadas, enquanto a base das criptas é composta por células-tronco que fazem a rápida renovação da epitelia intestinal, que tem um volume de negócios de 3 a 7 dias. As células-tronco intestinais (ISC) não são apenas importantes para a manutenção da homeostase intestinal, mas para o reparo adequado da epitéliodanificada 2.
O estudo da biologia da epitelia intestinal foi limitado pela falta de culturas celulares primárias, sendo as linhas celulares transformadas a única ferramenta disponível. As linhas celulares modelo epitelial intestinal não são capazes de replicar com precisão a fisiologia do epitélio intestinal normal. O desenvolvimento de culturas 3D derivadas do ISC proporcionou aos biólogos mucosas in vitro modelos in vitro que se assemelham às condições mucosas in vivo gut3. As criptas podem ser facilmente isoladas a partir de amostras de murina, embutidas em um meio de matriz de membrana de porão (por exemplo, Matrigel) e cultivadas em meios condicionados contendo Wnt3a, R-spondin e Noggin, gerando estruturas 3D conhecidas como enteróides (intestino delgado) ou colonóides (intestino grosso)4. Enteróides e colonóides são estruturas esfóides polarizadas onde o domínio apical está enfrentando um lúmen interno e a região basolateral está em contato direto com a matriz extracelular. Enteroids e colonóides contêm todos os principais subtipos epiteliais intestinais diferenciados, como Enterócitos/Colonócitos, Paneth, Enteroendocrine e Cálice e aparecem em proporções relativamente as mesmas que fazem na seção do intestino onde foram isolados a partir de5. Embora os enteróides e os colonóides 3D representem um grande avanço no estudo do desenvolvimento intestinal e da fisiologia, esses modelos apresentam certas desvantagens, como o acesso limitado à superfície apical das células epiteliais (lúmen) e a capacidade de escalar culturas para cima ou para baixo para alcançar a triagem de alto rendimento de moléculas de interesse. Para superar essas limitações, foram gerados protocolos para obtenção de culturas 2D primárias de IEC derivadas de enteróides/colonóides 3D. Enteroides/colonóides 2D crescem como folha de células, assim como as linhas celulares modelo e são ideais para estudar o reparo de feridas intestinais, interações hospedeira-patógeno e medicina regenerativa entre outras. Vários artigos publicados descrevem como gerar monocamadas 2D a partir de estruturas 3D ou diretamente de criptas intestinais, (ver6,7,8,9,10,11), mas esses métodos tendem a ser intensivos em mão-de-obra e difíceis de reproduzir. Um método rápido, simples e reprodutível para obter monocamadas diretamente de criptas intestinais de camundongos recém-isoladas é descrito neste protocolo.
Aqui explicamos em detalhes o processo de extração de cripta com geração mínima de detritos, escolha de matriz extracelular e diferentes superfícies e aplicações para esta técnica. Esta abordagem experimental foi otimizada para criptas de cólon, mas resultados semelhantes são obtidos quando aplicados para intestino delgado.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-004CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement (50X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen from human placenta (type IV)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>85529-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP220-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s phosphate buffered saline, with Ca2+ and Mg2+ (DPBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-030-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epithelial Volt/Ohm meter</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>0-10K&#937; with STX2 (EVOM2)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>51201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-016-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Firefly Luciferase assay</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>30085-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geneticin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10131-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25060CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant EGF</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>236-EG</td>
			<td>Stock Concentration: 500&#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant Wnt-3A</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>W3a-H-005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10687010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LWRN cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular grade water</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-000-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165-5G</td>
			<td>Stock Concentration: 500mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin</td>
			<td>Conditioned media</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Lab-Tek Chamber slide system</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7182-1PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pencillin-Streptomycin (10,000U/mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30002CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospahte buffered saline, Ca2+ and Mg2+ free (PBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic 20G feeding tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-810-46</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rh-laminin-521</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A29248</td>
			<td>Stock concentration: 100&#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roboz Surgical 4-0 Silk Black Braided 100YD</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9452680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOPflash HEK293 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell Permeable supports (0.4&#181;m)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3470</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of murine primary colon epithelial monolayers from intestinal crypts

O epitélio intestinal é composto por uma única camada de células que agem como uma barreira entre o lúmen intestinal e o interior do corpo. A interrupção na continuidade dessa barreira pode resultar em distúrbios inflamatórios, como doença inflamatória intestinal. Uma das limitações no estudo da biologia epitelial intestinal tem sido a falta de modelos de cultura celular primária, o que obrigou os pesquisadores a usar linhas celulares modelo derivadas de carcinomas. O advento dos enteróides tridimensionais (3D) deu aos biólogos epiteliais uma poderosa ferramenta para gerar culturas celulares primárias, no entanto, essas estruturas estão inseridas em matriz extracelular e carecem da característica de maturidade de células epiteliais intestinais diferenciadas. Várias técnicas para gerar monocamadas epiteliais intestinais foram publicadas, mas a maioria é derivada de enteróides 3D estabelecidos tornando o processo trabalhoso e caro. Aqui descrevemos um protocolo para gerar monocamadas de cólon epitelial primário diretamente de criptas intestinais murinas. Também detalhamos abordagens experimentais que podem ser utilizadas com este modelo, como a geração de culturas confluentes em filtros permeáveis, monocamada confluente para estudos de cicatrização de feridas de risco e monocamadas esparsas e confluentes para análise de imunofluorescência.

Para ilustrar a confiabilidade das culturas monocamadas de cólon epitelial primárias, um resumo do isolamento da cripta e imagens representativas derivadas do protocolo é mostrado. O usuário deve ter em mente que as criptas isoladas são cultivadas em condições estéreis, por isso uma dissecação correta e limpeza do cólon é uma prioridade. A Figura 1 apresenta passos-chave durante o isolamento da cripta. Criptas isoladas (Figura 2A) são agora contadas e concentradas(Figura 2B) para obter uma concentração de 5 criptas/μL. Após uma preparação concentrada de criptas, as células serão banhadas no formato desejado (prato de cultura, pastilhas de membrana ou lâminas de câmara) e incubadas com a mídia apropriada, dependendo das necessidades experimentais. A Figura 3 mostra a progressão cultural após 24 e 48 h de cultura em placas de 48 poços. As células são incubadas até que a confluência desejada seja alcançada. Para exemplificar possíveis aplicações deste método, permitimos que poços de placas de 48 poços de poços chegassem à confluência e passamos a fazer um ensaio de ferida de arranhão. A Figura 4 retrata um arranhão recém-criado(Figura 4A) em uma monocamada colonóide 2D e a mesma ferida 24 h depois(Figura 4B). É claro que a cultura ainda é saudável e viável e há reparação de feridas. Para gerar monocamadas diferenciadas, a mídia é alterada de LWRN para mídia de diferenciação. A diferenciação é alcançada mostrando altos valores teer(Figura 5A),diminuição dos marcadores ISC ((receptor acoplado de proteína G 5 (Lgr5) e Achaete-scute como 2 (Ascl2)) e aumento de marcadores de diferenciação ((Alanyl aminopeptidase (Anpep), Mucin 2 (Muc2), lysozyme 1 (Lyz1), Sucrose iso-maltase (Sis) e Chrmogranin A (Chga))(Figura 5B,C) por PCR. Outros marcadores como CDX2 e KRT20 também podem ser incluídos neste painel. Além dos níveis de expressão do mRNA, o aparecimento de subtipos de células epiteliais diferenciadas em colonóides 2D cultivados em condições de diferenciação também é mostrado pela imunofluorescência (Muc2 e Chga; Figura 5D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62156/62156fig01.jpg"> Figura 1: Preparação da amostra para geração de monocamadas saudáveis. A preparação da amostra é crucial para a geração de monocamadas saudáveis. As etapas-chave do processo de isolamento são retratadas nesta figura para facilitar para o leitor. O cólon é extirpado do rato, certificando-se de que não há sobras de pele. Remova cuidadosamente as fezes certificando-se de que você não perfure o cólon; isso é de vital importância, pois o cólon precisa ser capaz de segurar o ar e ser inflado e esvaziado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62156/62156fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62156/62156fig02.jpg"> Figura 2: Contagem de isolamento e concentração da cripta. (A) Criptas coloniais depois de sacudir as salsichas de cólon. A imagem mostra um campo de uma queda de 20 μL. (B) Concentração de criptografia para obter 5 criptas/μL. Barra de escala: 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62156/62156fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62156/62156fig03.jpg"> Figura 3: Crescimento da monocamada IEC Primária. (A) monocamadas 2D IEC após 24h de revestimento e remoção de detritos celulares. (B) Monocamadas confluentes 2D IEC 48 h após o revestimento. Barra de escala: 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62156/62156fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62156/62156fig04.jpg"> Figura 4: Ensaios de ferida de arranhão usando iEC primário murina. Imagens mostrando cicatrização da ferida após um arranhão foi feito em monocamada de cólon epitelial. Barra de escala: 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62156/62156fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62156/62156fig05.jpg"> Figura 5: Diferenciação de monocamadas de cólon epitelial. (A) A Mídia de diferenciação cria barreiras epiteliais apertadas, como demonstrado pelo TEER. A diferenciação da mídia causa uma queda na expressão mRNA de (B) marcadores de células-tronco e regulação de marcadores de diferenciação (C). (D) Marcadores de células epiteliais diferenciadas especializadas, como Muc2 e Cromogranin-A, também podem ser detectados através da imunofluorescência de colonóides 2D diretos. Barra de escala: 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62156/62156fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Generation of Murine Primary Colon Epithelial Monolayers from Intestinal Crypts

Neste protocolo, descrevemos como gerar monótolais de cólon epitelial primário murina diretamente de criptas intestinais. Fornecemos abordagens experimentais para gerar monocamadas confluentes em filtros permeáveis, monocamadas confluentes para cura de feridas de risco e estudos bioquímicos, e monocamadas esparsas e confluentes para análise de imunofluorescência.

Geração de Monócamas Epiteliais de Cólon Primário Murine de Criptas Intestinais

The intestinal epithelium is comprised of a single layer of cells that act as a barrier between the gut lumen and the interior of the body. Disruption in ...

Nosso protocolo fornece um método rápido, reprodutível e confiável para gerar monocamadas epiteliais primárias diretas em diferentes superfícies com detritos mínimos. As principais vantagens deste protocolo são o baixo consumo de mídia e a manutenção de baixo custo da cultura celular. É um método rápido para realizar testes funcionais e aplicações rápidas a jusante.Este protocolo fornecerá insights no estudo da reparação de feridas, barreira de permeabilidade e migração transepitelial de diferentes tipos de células. Além disso, este modelo pode ser útil na interação hospedeiro-patógeno, epitelial danificada e descoberta de drogas. Para começar, adicione 200 microliters de solução de revestimento a cada poço de uma placa de 48 poços e slide de câmara.Pré-incubar ambos em uma incubadora de dióxido de carbono de 5% a 37 graus Celsius por duas horas. Revestimento de 0,4 inserções de membrana celular de micrômetro com 200 microliters de solução de colágeno. Incubar a placa com as pastilhas de membrana a quatro graus Celsius por 30 minutos e, em seguida, transfira-a para uma incubadora de dióxido de carbono de 5% a 37 graus Celsius por duas horas.Desinfetar um rato eutanizado com 70% de etanol, em seguida, dissecar o cólon do reto para o ceco com a ajuda de tesouras e fórceps. Limpe suavemente as fezes com PBS gelado em uma seringa de 10 mililitros equipada com um tubo de alimentação de calibre 20. Remova o cólon proximal e deslize o cólon distal suavemente para o tubo de alimentação de 20 medidores.Amarre o cólon no final do tubo com rosca de seda 4-0. Inverta o cólon do avesso sobre a extremidade amarrada e amarre a outra extremidade com rosca, em seguida, corte o cólon abaixo da ponta do tubo de alimentação usando uma tesoura cirúrgica. Abra suavemente a extremidade desamaste do cólon invertido na ponta de uma seringa repetida de 1,25 mililitro usando seu êmbolo.Deslize a extremidade desamascada do cólon invertido sobre a seringa e amarre-a firmemente com um fio. Insira o êmbolo na seringa e infle o cólon até parecer turgente sem rugas visíveis. Coloque a linguiça de cólon inflada em um tubo de 15 mililitros contendo cinco mililitros de solução de recuperação celular no gelo por 20 minutos.Infle e esvazie o cólon uma vez a cada cinco minutos. Amarre o cólon inflado abaixo da ponta da seringa repetida usando rosca de sutura de seda 4-0. Corte a linguiça de cólon da seringa repetida e coloque-a em um tubo de 15 mililitros contendo 10 mililitros de 50 mililitros EDTA por 40 minutos.Gire o tubo a 4 graus Celsius. Substitua a solução EDTA por cinco mililitros de tampão de shake e agite a salsicha manualmente na posição vertical por dois minutos. Decante a solução de agitação em um novo tubo de 15 mililitros e repita o passo de agitação até que um total de 10 mililitros de criptas e tampão de agitação seja coletado.Conte o número de criptas em 20 microlitros da suspensão sob um microscópio e dilua a amostra para obter a concentração de cinco criptas por microliter. Centrifugar a amostra de cripta a 400 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius. Enquanto isso, remova as pastilhas de placa e membrana de 48 poços da incubadora e coloque-a no armário de biossegurança.Aspire a solução de revestimento usando uma pipeta P200 e deixe a placa com a tampa ligeiramente compensada até que as células estejam prontas para serem banhadas. Após a centrifugação da suspensão da cripta, remova o buffer de agitação e resuspenda a pelota intacta em três mililitros de mídia completa LWRN. Adicione 200 microliters de criptas a cada poço da placa pré-revestida de 48 poços e slide de câmara e incubar ambos em uma incubadora de dióxido de carbono de 5% a 37 graus Celsius.No dia seguinte, aspire a mídia e adicione novas mídias. Geralmente, as células se tornam confluentes em 24 a 48 horas. Para as pastilhas de membrana de cultura celular, adicione 200 microliters de criptas ao topo das pastilhas e 600 microliters de mídia LWRN completa à parte inferior.No dia seguinte, aspire a mídia e adicione mídia fresca apenas à câmara superior. Incubar a placa em uma incubadora de dióxido de carbono de 5% a 37 graus Celsius. Meça a resistência elétrica transepitelial todos os dias usando um medidor de volt/ohm epitelial.Após isolar as criptas de um cólon murino e verificar a concentração, a suspensão da cripta foi concentrada em cinco criptas por microliter. Poços de placas de 48 poços foram submetidos a um ensaio de ferida de arranhão ao atingir a confluência celular. Após 24 horas, observou-se reparo da ferida indicando que a cultura era saudável e viável.Valores de nível mais elevados foram alcançados quando a mídia foi alterada de LWRN para mídia de diferenciação. Além disso, observou-se uma diminuição dos marcadores ISC e um aumento nos marcadores de diferenciação indicando que as monocamadas diferenciadas foram geradas com sucesso. Além disso, o aparecimento de subtipos de células epiteliais diferenciadas cultivadas em diferentes condições foi demonstrada pela imunofluorescência.Ao tentar este protocolo, é importante garantir que o cólon não seja rompido em nenhum momento durante a preparação e permaneça inflado para liberar criptas em preparação extremamente limpa. Uma vez que as monocamadas de células epiteliais intestinais 2d se formam, podemos realizar ensaios de imunofluorescência, ferida de arranhão e permeabilidade e outras aplicações a jusante. Isso fornecerá conhecimento em cicatrização de feridas, migração de diferentes tipos de células e estudos de reparação epitelial e danos.

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

Primárias células epiteliais brônquicas humanas Grown a partir de explantes

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the ...

Biologia

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

Isolamento de primárias Miofibroblastos de Mouse e tecido do cólon humano

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Cryosectioning Method for Microdissection of Murine Colonic Mucosa

Método cryosectioning para Microdissection de Murino Colonic Mucosa

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The ...

Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation

Regeneração Epitelial Intestinal em Resposta à Irradiação Ionizante

The intestinal epithelium consists of a single layer of cells yet contains multiple types of terminally differentiated cells, which are generated by the ...

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

Cultura Primária de Células Epiteliais do Pigmento da Retina Suína

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...

Culture of Piglet Intestinal 3D Organoids from Cryopreserved Epithelial Crypts and Establishment of Cell Monolayers

Cultura de Organoides 3D Intestinais de Leitões a partir de Criptas Epiteliais Criopreservadas e Estabelecimento de Monocamadas Celulares

Intestinal organoids are increasingly being used to study the gut epithelium for digestive disease modeling, or to investigate interactions with drugs, ...

Unveiling Inflammatory Arthritis&#58; Exploring Functions of Synovial Cells

Isolation and Culture of Primary Synovial Macrophages and Fibroblasts from Murine Arthritis Tissue

Isolation and Culture of Primary Synovial Macrophages and Fibroblasts from Murine Arthritis Tissue (Video) | JoVE 

Isolamento e Cultura de Macrófagos e Fibroblastos Sinoviais Primários de Tecido de Artrite Murina

Rheumatoid arthritis is an autoimmune disease that leads to chronic inflammation of joints. Synovial macrophages and synovial fibroblasts have central ...

3D Culture of Organoids from Murine Intestinal Crypts and Single Stem Cell

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research (Video) | JoVE 

A Cultura 3D de Organoides de Criptas Intestinais Murinas e uma Única Célula-Tronco para Pesquisa de Organoides

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine ...

Epithelial Effects of Intestinal Inflammation on Established Murine Colonoids

Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids

Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids (Video) | JoVE 

Estudando os Efeitos Epiteliais da Inflamação Intestinal In Vitro em Colonóides Murinos Estabelecidos

The intestinal epithelium plays an essential role in human health, providing a barrier between the host and the external environment. This highly dynamic ...