Name: generation of murine primary colon epithelial monolayers from intestinal crypts
Uploaded: 2021-02-06T14:30:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Murine Primary Colon Epithelial Monolayers from Intestinal Crypts at JoVE.com

Detta arbete stöddes av crohns och Colitis Foundations karriärutvecklingspris (544599, till MQ) och NIH-bidragen (DK055679, DK089763, DK059888, till AN). Vi vill tacka Michigan Medicine Translational Tissue Modeling Laboratory för deras kontinuerliga hjälp och tillgång till deras reagenser och protokoll.

Alla procedurer som beskrivs nedan har godkänts och genomförts i enlighet med riktlinjerna från University of Michigan Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Förberedelse av reagenser för kryptisolering och odling (förbered i vävnadskulturhuva)
<ol><li>50 mM etylendiamintetraättika (EDTA): Tillsätt 50 ml 0,5 M buljong till 450 ml fosfatbuffrad saltlösning, utan kalcium (Ca2+) och magnesium (Mg2+) för att förbereda 500 ml. I detta protokoll kommer PBS att hänvisa till PBS utan kalcium och magnesium om inget annat anges.</li>
	<li>Skakbuffert: Lös upp 7,4 g sackaros (43,3 mM) och 5 g sorbitol (54,9 mM) i PBS för att förbereda 500 ml.</li>
	<li>L-WRN (L-Wnt-3A, R-spondin och Noggin) media: Supplement Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 (DMEM/F12) (780 mL) med 20% Fetala NötkreaturSserum (FBS) (200 mL), 1x kommersiellt tillgängligt glutamintillskott (10 mL), 100 U/mL penicillin och, 100 g/ml streptomycin (10 ml) och filtrera sterilisera med 0,22 μm filter.<ol>
<li>Få L-WRN-celler genom ATCC, odla i T175-flaskor och välj med Geneticin och Hygromycin. Media ändras och samlas in i 12 dagar. Obs: Varje sats media testas för Wnt-aktivitet med hjälp av en TOPflash Wnt Reporter-analys. I detta fall följdes Michigan Medicine Translational Tissue Modeling Laboratory protokoll (https://www.umichttml.org/protocols) . TOPflash HEK 293-cellinjen odlas till sammanflöde i en T75-kolv, trypsiniserad och pläterad på en 96-brunnsplatta. Följande dag tillsätts olika utspädningar av det insamlade mediet till celler och inkuberas i en 5% CO 2-inkubator vid 37 °C över natten. Nästa dag lysas cellerna upp och Firefly Luciferase-analysen utförs enligt tillverkarens instruktioner. Analysen normaliseras med rekombinant Wnt-3A. Media är indelat i 25 ml alikvoter i 50 ml koniska rör och förvaras vid -80 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Basmedia: För 500 mL, tillägg Advanced DMEM/F12 (448 mL) med 2x kommersiellt tillgängliga glutamintillskott (10 ml), 20 mM HEPES (10 mL), 100 U/mL penicillin och, 100 g/ml streptomycin (10 ml), 2 mM N-acetyl-L-cystein (2 ml), N2-tillägg (10 ml) och B27-tillägg (20 ml), filtrera sterilisera med 0,22 μm filter. Dela upp mediet i 25 ml alikvoter i 50 ml koniskt rör och förvara vid -80 °C.</li>
	<li>LWRN komplett media: Kombinera 25 ml LWRN-media med 25 ml basmedia och komplettera med 200 ng/ml epidermal tillväxtfaktor (EGF) (20 μL) och 2x antiantimykotisk lösning (1 ml). Förvara hela mediet vid 4 °C.</li>
	<li>Kollagen och laminin: Lös upp 5 mg pulver i 5 ml filtersteriliserat 100 mM ättiksyra (tillsätt 60 μL ättiksyralager till 9,94 ml molekylvatten) för att producera en lagerkoncentration på 1 mg/ml. Rotera vid 4 °C i 4 timmar och gör 100 μL alikvoter i 0,2 ml-rör. Frys vid -20 °C. Laminin köps i en lagerkoncentration på 100 μg/ml.</li>
	<li>Komplett media utan tillväxtfaktorer (CMGF-): Tillägg Advanced DMEM/F12 (500 mL) med 1x kommersiellt tillgängliga glutamin tillägg (5 mL), 10 mM HEPES (5 mL), 100 U/mL penicillin och, 100 g/mL streptomycin (5 mL).</li>
	<li>Differentieringsmedier: Till 9,2 ml CMGF- media, tillsätt 200 μL B27-tillägg, 100 μL N2-tillägg, 20 μL N-acetyl-L-cystein, 500 μL Noggin-media12 (tillverkad av Noggin-producerande celler) och 2 μL EGF för att göra 10 ml differentieringsmedier.</li>
</ol>2. Förberedelse av plattor, kammarutschbanor och cellkulturmembraninsatser
<ol><li>Beläggning 48-brunnsplatta och kammarrutschbanor för plätering av 2D-monoskikt: Använd beläggningslösningen som utgör laminin (1:40 utspädning, se Materialförteckning)och kollagen (1:30 utspädning) i kall Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning, med Ca2+ och Mg2+ (DPBS). Tillsätt 200 μL beläggningslösning till varje brunn och förinkubera plattan/kammarrreglaget i en 5% CO2-inkubator vid 37 °C i minst 2 timmar.</li>
	<li>Beläggning 0,4 μm cellkulturmembraninsatser: Gör 1:30 utspädning av kollagen i molekylärt vatten och tillsätt 200 μL till varje insats. Håll plattan som innehåller membraninsatsen på is vid 4 °C i 30 min. Efter 30 min inkubation, håll plattan i en 5% CO2 inkubator vid 37 °C i 1,5-2 h. Polyester- och polykarbonatmembraninsatser ger jämförbara resultat. OBS: Alla vävnadskulturplåtar kan sås (upp och ner kan utföras) med hjälp av detta protokoll genom att justera kollagen/ lamininvolymen för att få full täckning av pläteringsytan.</li>
</ol>3. Kryptisolering
OBS: Innan dissekeringen påbörjas bereder du kollagen och/eller lamininbelagda platta/membraninsatser/kammarutschbana och lämnar dem i en 5% CO2-inkubator vid 37 °C. Förbered en ren arbetsbänk och sterila kirurgiska instrument som är lämpliga för kirurgi och ett biologiskt säkerhetsskåp för odling av 2D-monoskikt. Bekräfta att all annan standardutrustning för 2D-monoskiktsodling, såsom fuktad CO 2-inkubator, centrifuger av bordsskiva (bibehållen vid 4 °C), mikroskop och pipetter (inklusive serologiska pipetter) är klara. 
<ol><li>Använd C57Bl/6 möss, 8-12 veckor gamla. Avliva möss med en godkänd dödshjälpsmetod.</li>
	<li>Spraya mössens slaktkroppar med 70% etanollösning (EtOH) för att rengöra dissekeringsområdet och ta bort överskott av EtOH med pappersvävnad. OBS: Se till att kryptisoleringsreagenserna (t.ex. PBS, 50 mM EDTA, skakbuffert) hålls kalla. Dessa reagenser kan beredas en dag tidigare och är bra att använda i minst 3 månader när de förvaras vid 4 °C. Se också till att LWRN-hela mediet hålls i ett pärl-/vattenbad som hålls vid 37 °C tills det används.</li>
	<li>Använd ren dissekeringssax och tång, dissekera ut tjocktarmen från ändtarmen till cecum. Håll kolonens ände med tång och spola mycket försiktigt av avföringen med iskallt PBS i en 10 ml spruta, försedd med ett 20 G matningsrör (Figur 1A). Se till att inte brista i tjocktarmen.<ol>
<li>Ta bort det proximala tjocktarmen. Detta kommer att vara den del av tjocktarmen närmast den ileocecal korsningen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Med tång, skjut försiktigt det distala kolonet på 20 G-matningsröret och bind av tjocktarmen i slutet av röret vid spetsen med 4-0 silkessuturtråd (Figur 1B).</li>
	<li>Vänd kolonet ut och in med fingrarna över änden bundet och bind den andra änden med 4-0 silkessuturtråd. Använd kirurgisk sax, skär kolon under spetsen av matningsröret(Figur 1C,D,E).</li>
	<li>Använd kolven på en 1,25 ml upprepad spruta och öppna försiktigt den obundna änden av det inverterade tjocktarmen på spetsen av en 1,25 ml upprepad spruta. Skjut in det inverterade tjocktarmen på sprutans ände och knyt tätt med 4-0 silkessuturtråd(Bild 1F,G).</li>
	<li>Sätt in kolven i sprutan och blås upp tjocktarmen för att bilda en korv. Blås upp tills kolonkorven ser turgent ut utan synliga rynkor (Figur 1H).</li>
	<li>Placera sprutan/kolonet i 15 ml rör med 5 ml cellåtervinningslösning på is i 20 minuter, blås upp och töm kolonet en gång var 5:e minut (figur 1I). Korven måste förbli uppblåst under inkubationen.</li>
	<li>Bind av med 4-0 silkessuturtråd under spetsen av den upprepade sprutan med tjocktarmen uppblåst. Skär korven av den upprepade sprutan och placera i 15 ml rör som innehåller 10 ml 50 mM (2mM för tunntarmen) EDTA i 40 min och rotera vid 4 °C (Figur 1J,K).</li>
	<li>Dekantera EDTA-lösningen och ersätt med 5 ml skakbuffert. Skaka korven manuellt i vertikalt läge (kraftigt) i 2 min.</li>
	<li>Dekantera skaklösningen till ett nytt 15 ml-rör och upprepa skakningar för totalt 10 ml krypter i skakbuffert.</li>
	<li>Ta 20 μL av kryptupphängningen i en Petri-skål och räkna antalet krypter under ett mikroskop. Beräkna kryptkoncentrationen i krypter/μL. Beroende på koncentrationen späd ut proverna för att erhålla 5 krypter/ μL vid pläteringsögonblicket (1000 krypter/cm2).</li>
	<li>Snurra röret med isolerade krypter med hjälp av bordscentrifug vid 400 x g i 10 min vid 4 °C.</li>
	<li>Under tiden, ta bort 48-brunnsplatta / insats / kammarbild från inkubatorn och placera den i biosäkerhetsskåp. Aspirera beläggningslösningen med P200 och lämna plattan med locket något förskjutet tills cellerna är redo att pläteras.</li>
</ol>4. Odling av 2D-monoskikt
OBS: För ett detaljerat protokoll om hur man genererar intestinala epitelmonoskikt från 3D-kolonoider kontrollera protokoll av Estes och Kovbasnjuk labs (7,11).
<ol><li>Ta bort skakbufferten med 10 ml serologisk pipett. Se till att pelleten är intakt och kan använda P1000 för att avlägsna eventuell vätska kvar. Suspendera pelleten igen i 3 ml LWRN komplett media och pipett upp och ner med P1000. Tillsätt 200 μL krypter till varje brunn på en förbelagd 48-brunnsplatta/kammarrutschbana och inkubera i en 5% CO2-inkubator vid 37 °C.</li>
	<li>Följande dag aspirerar du på media med P200 och lägger till nya medier. Cellerna blir konfluenta i 24-48 h.</li>
	<li>För cellkulturmembraninsatser, tillsätt 200 μL-krypter (5 krypter/μL) ovanpå skären och 600 μL komplett L-WRN-media till den nedre delen. Följande dag aspirerar du på media med P200 och lägger till nya medier endast i den övre kammaren. Inkubera plattan i en 5% CO2 inkubator vid 37 °C. Transepithelial elektrisk resistans (TEER) mäts varje dag med epitelial volt/ohm meter (EVOM). OBS: Om kulturen har en TEER-avläsning som är större än 300 Ω,cm2, är de avsedda att vara konfluenta. Oförutsedda resultat uppnås på 3-4 dagar. Byt media varannan dag.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Quiros, M., Nusrat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+wound-associated+cells+and+mediators+in+orchestrating+gastrointestinal+mucosal+wound+repair.">Contribution of wound-associated cells and mediators in orchestrating gastrointestinal mucosal wound repair.</a> Annual Reviews in Physiology. 81, 189-209 (2019).</li><li>Blutt, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+organoids+to+study+regenerative+responses+to+intestinal+damage.">Use of organoids to study regenerative responses to intestinal damage.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 317 (6), 845-852 (2019).</li><li>Zhang, M., Liu, Y., Chen, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+3D+human+gastrointestinal+organoids:+principle+and+applications.">Generation of 3D human gastrointestinal organoids: principle and applications.</a> Cell Regeneration. 9 (1), 6 (2020).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Zachos, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+enteroids/colonoids+and+intestinal+organoids+functionally+recapitulate+normal+intestinal+physiology+and+pathophysiology.">Human enteroids/colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (8), 3759-3766 (2016).</li><li>Kozuka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+human+and+mouse+intestinal+epithelial+cell+monolayer+platform.">Development and characterization of a human and mouse intestinal epithelial cell monolayer platform.</a> Stem Cell Reports. 9 (6), 1976-1990 (2017).</li><li>In, J. G., Foulke-Abel, J., Clarke, E., Kovbasnjuk, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+colonoid+monolayers+to+study+interactions+between+pathogens,+commensals,+and+host+intestinal+epithelium.">Human colonoid monolayers to study interactions between pathogens, commensals, and host intestinal epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (146), e59357 (2019).</li><li>Cardenas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-+and+three-dimensional+bioengineered+human+intestinal+tissue+models+for+cryptosporidium.">Two- and three-dimensional bioengineered human intestinal tissue models for cryptosporidium.</a> Methods in Molecular Biology. 2052, 373-402 (2020).</li><li>Moon, C., VanDussen, K. L., Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+primary+mouse+intestinal+epithelial+cell+monolayer+culture+system+to+evaluate+factors+that+modulate+IgA+transcytosis.">Development of a primary mouse intestinal epithelial cell monolayer culture system to evaluate factors that modulate IgA transcytosis.</a> Mucosal Immunology. 7 (4), 818-828 (2014).</li><li>VanDussen, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+enhanced+human+gastrointestinal+epithelial+culture+system+to+facilitate+patient-based+assays.">Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays.</a> Gut. 64 (6), 911-920 (2015).</li><li>Zou, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+intestinal+enteroids:+New+models+to+study+gastrointestinal+virus+infections.">Human intestinal enteroids: New models to study gastrointestinal virus infections.</a> Methods in Molecular Biology. 1576, 229-247 (2019).</li><li>Heijmans, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ER+stress+causes+rapid+loss+of+intestinal+epithelial+stemness+through+activation+of+the+unfolded+protein+response.">ER stress causes rapid loss of intestinal epithelial stemness through activation of the unfolded protein response.</a> Cell Reports. 3 (4), 1128-1139 (2013).</li><li>Nik, A. M., Carlsson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+intact+intestinal+epithelium+from+mesenchyme.">Separation of intact intestinal epithelium from mesenchyme.</a> Biotechniques. 55 (1), 42-44 (2013).</li></ol>

Författarna har inga intressekonflikter.

Vårt protokoll ger en snabb, reproducerbar och pålitlig metod för att generera direkta primära 2D IEC monolager. En av de största skillnaderna i vårt protokoll jämfört med tidigare publicerade protokoll för att generera kolon epitelmonalayers är att vi inte skär kolonet i små bitar för att frigöra krypterna. Istället anpassade vi ett protokoll för att separera intestinalt epitel från mesenkym13 genom en kombination av kemiska och mekaniska krafter för att frigöra krypter i en extremt ren beredning, (Figur 2), vilket ger forskaren idealiskt material för att generera primära kulturer. Vår isoleringsmetod kan också användas för att generera 3D-enteroider och kolonoider. Det är viktigt att göra ett kryptantal varje gång ett experiment utförs för att normalisera antalet krypter som pläteras. Variabler som kolonkorv turgor, isoleringshastighet, användarexpertis kan påverka antalet krypter som isolerats. Den föreslagna pläteringskrypteringskoncentrationen som nämns i protokollet är en utgångspunkt, men varje användare som ska ta hänsyn till användardrivna variabler måste optimera den. Vi har använt denna teknik med manliga och kvinnliga WT-möss från 8 till 20 veckor och vi har inte sett några större skillnader i cellöverlevnad, i teorin har krypter isolerade från yngre möss bättre chanser att överleva. Krypter är pläterade i överskott eftersom endast en liten andel av dem fäster på ytan och överlever. En balans där det finns tillräckligt med krypter för att ha en 50% sammanflöde en dag efter plätering men inte för många krypter där de döende krypterna kommer att ha en cytotoxisk effekt är målet. LWRN-media måste försiktigt avlägsnas 24 timmar efter plätering för att eliminera döda krypter och skräp, detta måste göras noggrant för att undvika att avlägsna celler som redan växer som monoskikt.
Efter inledande borttagning av LWRN-media måste användaren bestämma om försöksförhållandena kräver primära IEC-monoskikt som förblir närmare stamceller och lägger till färska LWRN-medier eller om differentiering av monoskiktet önskas, ersätt med differentieringsmedier. Den enskilt viktigaste faktorn i detta protokoll är att säkerställa kolonets integritet under isoleringsprocessen. Om en bristning uppstår kan korven förkortas för att eliminera det skadade området. Innan du lägger korven i EDTA, se till att knutarna är så snäva som möjligt. Om korven töms efter EDTA-inkubationen kan protokollet fortsättas med liten eller ingen effekt i den totala kryptutbytet. Om den upprepade sprutan inte är tillgänglig kan en vanlig mikropipettspets som är fäst vid en vanlig spruta också användas för inflations- och deflationsprocessen. Om ingen cellåterställningslösning finns tillgänglig kan inflations- och deflationsstegen också göras i EDTA (2mM tunntarmen, 50 mM tjocktarmen), men denna ersättning rekommenderas inte. Om confluency inte krävs kan krypter växa i plattor belagda endast med kollagen och även i obelagda plattor. Använd endast obelagda tallrikar det finns inget annat alternativ, men cellerna kommer inte att växa friska som de skulle i kollagenbelagda plattor. När det gäller kulturens hälsa och stabilitet är monoskikt pläterade i plast friska i 4 till 5 dagar medan monoskikt pläterade i transwells kan bäras i upp till 8 dagar.
En av de viktigaste begränsningarna med denna metod är de cellmedier som krävs för att växa epitelkolonmonalayers. LWRN-celler finns tillgängliga på ATCC, men LWRN-konditionerad mediegenerering är arbetsintensiv och kräver tillgång till en fluorescerande spektrometer för att bestämma Wnt-aktivitet. Differentieringsmedia kräver ett antal reagenser som läggs till färska före användning, vilket gör det till en tråkig process. Slutligen är de flesta av dessa reagenser kostsamma och är lätta att bränna reagenserna i snabb takt. Om ett laboratorium vill etablera denna teknik utan tidigare intestinal primärcellskultur, rekommenderas det starkt att hitta en samarbetspartner / högskola med erfarenhet och träna en av sina medlemmar.
Underhåll av 3D-kultur kan vara dyrt på grund av kostnaden för källarmembranmatrismedel och stora volymer av konditionerade medier som behövs för organoidkulturer, men det har fördelen att använda ett minskat antal möss och de genererade strukturerna kan passeras många gånger. Enteroider (härledda från tunntarmen) är relativt lätta att isolera och underhålla medan kolonoider är mer känsliga, växer i långsammare takt och har en mer begränsad passagekapacitet. Monolayergenerering från 3D-koloider kräver en oproportionerlig mängd 3D-strukturer, vilket gör dessa typer av experiment tidskrävande och kostsamma. Tvärtom är direkt epitelial kolon monolayer prep snabb och är ett snabbt sätt att få resultaten. En kolonprep kan generera ett sammanflödesområde på 75 cm2 (10 till 15 ml konditionerat medium, ersätter en gång) 2 till 3 dagar efter plätering (detta område skulle kräva 144 brunnar av 3D-kolonoider, vilket innebär nästan 6mL Matrigel och mer än 250 mL konditionerade medier). Den lägre förbrukningen av media, lågkostnadsunderhåll av cellkulturen och förmågan att utföra funktionella tester och snabb bearbetning nedströms är stora fördelar med epitelkolonmonoskikt.
Detta protokoll är ett värdefullt verktyg i studien av intestinal epitelcellbiologi inom områden som cell-vidhäftning, polaritet och differentiering. Det ger fördelen att generera primära cellkulturer från genetiskt modifierade möss (knock-out, overexpressing, reportrar). De primära intestinala epitelmonalskikten ger enkel åtkomst till de apatiska och basolaterala ytorna (när de pläterats på transwells) vilket möjliggör studier av permeabilitet, barriär och transepithelial migration av olika celltyper. Slutligen kan denna modell vara användbar inom olika områden som värdpatogena interaktioner, epitelskador och reparation och läkemedelsupptäckt.

Intestinala epitelceller (IEC) fodrar tarmarna som bildar en selektivt genomsläpplig barriär som tillåter närings- och vattenabsorption samtidigt som mikroorganismer och toxiner förhindras att komma in i kroppen 1. Tarmslemhinnan består av luminala projektioner som kallas villi (endast närvarande i tunntarmen) och invaginationer som heter krypter. Villi och ytan av kolonkrypter täcks av differentierade epitelceller medan basen av krypterna består av stamceller som gör den snabba förnyelsen av tarmeptanelia, som har en omsättning från 3 till 7 dagar. Intestinala stamceller (ISC) är inte bara viktiga för att upprätthålla tarmhomeostas utan för adekvat reparation av skadad epithelia2.
Studiet av intestinal epitelbiologi begränsades av bristen på primära cellkulturer med omvandlade cellinjer som det enda tillgängliga verktyget. Intestinala epitelial modell cellinjer kan inte exakt replikera fysiologin av normala intestinala epitel. Utvecklingen av 3D-kulturer som härrör från ISC gav intestinala slemhinnor biologer med in vitro-modeller som liknar in vivo tarmslemhinnorvillkor 3. Krypter kan lätt isoleras från murinprover, inbäddade i ett källarmembranmatrismedium (t.ex. Matrigel) och odlas i konditionerade medier som innehåller Wnt3a, R-spondin och Noggin, vilket genererar 3D-strukturer som kallas enteroider (tunntarmen) eller kolonoider (tjocktarmen)4. Enteroider och koloider är polariserade sfäroidala strukturer där den apatiska domänen står inför en intern lumen och den basolaterala regionen är i direkt kontakt med den extracellulära matrisen. Enteroider och koloider innehåller alla större differentierade intestinala epiteliala undertyper som Enterocyter/Colonocytes, Paneth, Enteroendocrine och Goblet celler och de förekommer i relativt samma proportioner som de gör i den del av tarmen där de isolerades från5. Även om 3D-enteroider och koloider representerar ett stort framsteg i studien av tarmutveckling och fysiologi, presenterar dessa modeller vissa nackdelar som begränsad tillgång till epitelcellernas apiska yta (lumen) och förmågan att skala kulturer upp eller ner för att uppnå screening med hög genomströmning av molekyler av intresse. För att övervinna dessa begränsningar genererades protokoll för att erhålla primära 2D kulturer av IEC härrör från 3D enteroider/kolonoider. 2D-enteroider/koloider växer som cellark precis som modellcelllinjer gör och är idealiska för att studera tarmsårsreparation, värdpatogena interaktioner och regenerativ medicin bland andra. Flera publicerade artiklar beskriver hur man genererar 2D-monoskikt från 3D-strukturer eller direkt från tarmkryptrar,(se 6,7,8,9,10,11) men dessa metoder tenderar att vara arbetsintensiva och svåra att reproducera. En snabb, enkel och reproducerbar metod för att erhålla monolager direkt från nyisolerade mus intestinala krypter beskrivs i detta protokoll.
Här förklarar vi i detalj processen för kryptutsugning med minimal generering av skräp, extracellulär matrisval och olika ytor och applikationer för denna teknik. Detta experimentella tillvägagångssätt optimerades för kolonkrypter, men liknande resultat erhålls när de tillämpas för tunntarmen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-004CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement (50X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen from human placenta (type IV)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>85529-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP220-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s phosphate buffered saline, with Ca2+ and Mg2+ (DPBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-030-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epithelial Volt/Ohm meter</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>0-10K&#937; with STX2 (EVOM2)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>51201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-016-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Firefly Luciferase assay</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>30085-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geneticin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10131-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25060CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant EGF</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>236-EG</td>
			<td>Stock Concentration: 500&#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant Wnt-3A</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>W3a-H-005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10687010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LWRN cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular grade water</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-000-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165-5G</td>
			<td>Stock Concentration: 500mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin</td>
			<td>Conditioned media</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Lab-Tek Chamber slide system</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7182-1PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pencillin-Streptomycin (10,000U/mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30002CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospahte buffered saline, Ca2+ and Mg2+ free (PBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic 20G feeding tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-810-46</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rh-laminin-521</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A29248</td>
			<td>Stock concentration: 100&#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roboz Surgical 4-0 Silk Black Braided 100YD</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9452680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOPflash HEK293 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell Permeable supports (0.4&#181;m)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3470</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of murine primary colon epithelial monolayers from intestinal crypts

Tarmepiteleriet består av ett enda lager av celler som fungerar som en barriär mellan tarmlumen och kroppens inre. Störningar i kontinuiteten i denna barriär kan leda till inflammatoriska störningar som inflammatorisk tarmsjukdom. En av begränsningarna i studien av intestinal epitelbiologi har varit bristen på primära cellkulturmodeller, vilket har tvingat forskare att använda modellcelllinjer som härrör från carcinom. Tillkomsten av tredimensionella (3D) enteroider har gett epitelbiologer ett kraftfullt verktyg för att generera primära cellkulturer, men dessa strukturer är inbäddade i extracellulär matris och saknar mognadsegenskaperna hos differentierade intestinala epitelceller. Flera tekniker för att generera intestinala epitelmonoskikt har publicerats, men de flesta härrör från etablerade 3D-enteroider som gör processen mödosam och dyr. Här beskriver vi ett protokoll för att generera primära epitelial kolon monolayers direkt från murine intestinala krypter. Vi beskriver också experimentella metoder som kan användas med denna modell som generering av sammanflödeskulturer på genomsläppliga filter, konfluent monoskikt för scratch wound healing studier och glesa och konfluenta monolayers för immunofluorescens analys.

För att illustrera tillförlitligheten hos de primära epitelialkolon monolayer kulturer visas en sammanfattning av krypt isolering och representativa bilder som härrör från protokollet. Användaren måste ha i åtanke att de isolerade krypterna odlas under sterila förhållanden, så en korrekt dissekering och rengöring av tjocktarmen är en prioritet. Bild 1 innehåller viktiga steg under kryptisolering. Isolerade krypter (figur 2A) räknas och koncentreras nu (figur 2B) för att erhålla en koncentration på 5 krypter/μL. Efter en koncentrerad beredning av krypter kommer cellerna att pläteras i önskat format (odlingsfat, membraninsatser eller kammarbilder) och inkuberas med lämpligt medium beroende på experimentella behov. Figur 3 visar kulturprogression efter 24 och 48 h kultur i 48-brunnsplattor. Cellerna inkuberas tills önskad sammanflöde uppnås. För att exemplifiera möjliga tillämpningar av denna metod tillät vi 48-brunnar att nå sammanflöde och fortsatte att göra en skrapsåranalys. Figur 4 visar en nyskapad repa (figur 4A) i en 2D-kolonoid monoskikt och samma sår 24 timmar efter (Figur 4B). Det är uppenbart att kulturen fortfarande är hälsosam och livskraftig och det finns sårreparation. För att generera differentierade monolager ändras mediet från LWRN till differentieringsmedia. Differentiering uppnås genom att visa höga TEER-värden (figur 5A), minskning av ISC-markörer ((Leucinrik upprepad G-proteinkopplat receptor 5 (Lgr5) och Achaete-scute som 2 (Ascl2)) och ökning av differentieringsmarkörer ((Alanyl aminopeptidas (Anpep), Mucin 2 (Muc2), lysozyme 1 (Lyz1), Sackaros iso-maltase (Sis) och Chrmogranin A (Chga)) (Figur 5B, C) av PCR. Andra markörer som CDX2 och KRT20 kan också inkluderas i denna panel. Förutom mRNA uttryck nivåer, utseendet på undertyper av differentierade epitelial celler i 2D-koloider odlas i differentiering villkor visas också av immunofluorescens (Muc2 och Chga; Figur 5D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62156/62156fig01.jpg"> Figur 1: Provberedning för friska monolagergenerering. Provberedning är avgörande för generering av friska monoskikt. Viktiga steg i isoleringsprocessen visas i den här figuren för att göra det enklare för läsaren. Tjocktarmen är struken från musen, vilket ser till att det inte finns några päls rester. Ta försiktigt bort avföringen och se till att du inte perforerar tjocktarmen; Detta är av avgörande betydelse eftersom tjocktarmen måste kunna hålla luft och blåsas upp och deflateras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62156/62156fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62156/62156fig02.jpg"> Figur 2:Antal krypterisolering och koncentration. A)Colonic krypter efter skakning av kolonkorvarna. Bilden visar ett fält med en droppe på 20 μL. (B) Kryptkoncentration för att erhålla 5 krypter/μL. Skalstreck: 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62156/62156fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62156/62156fig03.jpg"> Figur 3:Primär IEC Monolayer-tillväxt. (A) 2D IEC monoskikt efter 24 h plätering och avlägsnande av cellskräp. b)Sammanflöde 2D IEC monoskikt 48 timmar efter plätering. Skalbar: 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62156/62156fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62156/62156fig04.jpg"> Figur 4: Skrapsår med hjälp av murin primär IEC. Bilder som visar sårläkning efter en repa gjordes i epitelial kolon monolayer. Skalbar: 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62156/62156fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62156/62156fig05.jpg"> Figur 5: Differentiering av epitelkolonmonoskikt. (A) Differentieringsmedier skapar snäva epitelbarriärer som visas av TEER. Differentieringsmedier orsakar en minskning av mRNA-uttrycket av (B) stamcellsmarkörer och uppreglering av (C) differentieringsmarkörer. (D) Markörer för specialiserade differentierade epitelceller som Muc2 och Chromogranin-A kan också detekteras via immunofluorescens av direkta 2D-kolonoider. Skalbar: 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62156/62156fig05large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Murine Primary Colon Epithelial Monolayers from Intestinal Crypts at JoVE.com

Generation of Murine Primary Colon Epithelial Monolayers from Intestinal Crypts

I detta protokoll beskriver vi hur man genererar murin primära epitelial kolon monolayers direkt från intestinala krypter. Vi tillhandahåller experimentella metoder för att generera konfluenta monoskikt på genomsläppliga filter, sammanflöde av monoskikt för repsårläkning och biokemiska studier samt glesa och konfluenta monoskikt för immunofluorescensanalys.

Generation av Murine Primary Colon Epitelial Monolayers från intestinala krypter

The intestinal epithelium is comprised of a single layer of cells that act as a barrier between the gut lumen and the interior of the body. Disruption in ...

Vårt protokoll ger en snabb, reproducerbar och pålitlig metod för att generera direkta primära intestinala epitelmonoskikt på olika ytor med minimalt skräp. De främsta fördelarna med detta protokoll är låg förbrukning av media och lågkostnadsunderhåll av cellkulturen. Det är en snabb metod för att utföra funktionella tester och snabba nedströmsapplikationer.Detta protokoll kommer att ge insikt i studien av sår reparation, permeabilitet barriär och transepithelial migrering av olika celltyper. Denna modell kan också vara användbar i värdpatogeninteraktion, skadad epitelial och läkemedelsupptäckt. Till att börja med tillsätt 200 mikroliter beläggningslösning till varje brunn på en 48-brunnsplatta och kammarrutschbana.Förinkubera båda i en 5%koldioxidinkubator vid 37 grader Celsius i två timmar. Täck 0,4 mikrometer cellmembraninsatser med 200 mikroliter kollagenlösning. Inkubera plattan med membraninsatserna vid fyra grader Celsius i 30 minuter och överför den sedan till en 5%koldioxidinkubator vid 37 grader Celsius i två timmar.Desinficera en avlivad mus med 70% etanol och dissekera sedan ut tjocktarmen från ändtarmen till cecum med hjälp av sax och tång. Spola försiktigt ut avföringen med iskallt PBS i en 10 milliliter spruta utrustad med ett 20 gauge matningsrör. Ta bort det proximala tjocktarmen och skjut försiktigt det distala tjocktarmen på 20 gauge matningsröret.Knyt kolonet i slutet av röret med 4-0 silkessuturtråd. Vänd kolonet ut och in över den bundna änden och bind den andra änden med tråd och skär sedan tjocktarmen under spetsen av matningsröret med hjälp av kirurgisk sax. Öppna försiktigt den obundna änden av det inverterade tjocktarmen på spetsen av en 1,25 milliliter upprepad spruta med hjälp av kolven.Skjut den obundna änden av det inverterade tjocktarmen på sprutan och bind den tätt med en tråd. Sätt in kolven i sprutan och blås upp tjocktarmen tills den ser turgent ut utan synliga rynkor. Placera den uppblåsta kolonkorven i ett 15 milliliter rör som innehåller fem milliliter cellåtervinningslösning på is i 20 minuter.Blås upp och töm kolonet en gång var femte minut. Bind av det uppblåsta tjocktarmen under spetsen av den upprepade sprutan med 4-0 silkessuturtråd. Skär av kolonkorven från den upprepade sprutan och placera den i ett 15 milliliter rör som innehåller 10 milliliter 50 millimolar EDTA i 40 minuter.Rotera röret vid fyra grader Celsius. Byt ut EDTA-lösningen mot fem milliliter skakbuffert och skaka korven manuellt i vertikalt läge i två minuter. Dekantera skaklösningen i ett nytt 15 milliliterrör och upprepa skaksteget tills totalt 10 milliliter krypter och skakbuffert samlas in.Räkna antalet krypter i 20 mikroskop av suspensionen under ett mikroskop och späd provet för att erhålla koncentrationen av fem krypter per mikroliter. Centrifugera kryptprovet vid 400 gånger G i 10 minuter vid fyra grader Celsius. Under tiden, ta bort 48-brunnsplattan och membraninsatserna från inkubatorn och placera den i biosäkerhetsskåpet.Aspirera beläggningslösningen med en P200-pipett och lämna plattan med locket något förskjutet tills cellerna är redo att pläteras. Efter centrifugation av kryptupphängningen, ta bort skakbufferten och återanvänd den intakta pelleten i tre milliliter LWRN-komplett media. Tillsätt 200 mikroliter krypter till varje brunn på den förbelagda 48-brunnsplattan och kammarutschbanan och inkubera båda i en 5%koldioxidinkubator vid 37 grader Celsius.Nästa dag aspirerar du på media och lägger till nya medier. I allmänhet blir cellerna konfluenta på 24 till 48 timmar. För cellkulturmembraninsatser lägger du till 200 mikroliter krypter högst upp på skären och 600 mikroliter komplettA LWRN-media längst ner.Nästa dag aspirerar du media och lägger till nya medier endast i den övre kammaren. Inkubera plattan i en 5%koldioxidinkubator vid 37 grader Celsius. Mät transepithelial elektrisk resistans varje dag med hjälp av en epitelvolt/ohm-mätare.Efter att krypterna isolerats från ett murinkolon och verifierat koncentrationen, koncentrerades kryptupphängningen till fem krypter per mikroliter. 48-brunnar plattbrunnar utsattes för en skrapsårsanalys när cellkonfluensen nåddes. Efter 24 timmar observerades sår reparation som anger att kulturen var friska och livskraftiga.Högre nivåvärden uppnåddes när media ändrades från LWRN till differentieringsmedia. Dessutom observerades en minskning av ISC-markörer och en ökning av differentieringsmarkörer som indikerar att de differentierade monoskikten genererades framgångsrikt. Dessutom visades utseendet på subtyper av differentierade epitelial celler odlas under olika förhållanden av immunofluorescence.När du försöker detta protokoll är det viktigt att se till att tjocktarmen inte spricker vid någon tidpunkt under förberedelsen och förblir uppblåst för att släppa krypter i extremt ren förberedelse. När 2d intestinala epitelial cell monolayers bildas, kan vi utföra immunofluorescens, repsår och permeabilitet analyser och andra nedströms applikationer. Detta kommer att ge kunskap inom sårläkning, migrering av olika celltyper och epitelreparations- och skadestudier.

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

Primär mänskliga Bronkial epitelceller vuxit från explants

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

Isolering av primära Myofibroblaster från mus och Human Colon Tissue

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Cryosectioning Method for Microdissection of Murine Colonic Mucosa

Cryosectioning Förfarande för Microdissection av murin kolonslemhinna

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The ...

Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation

Intestinal epitelregenerering som svar på joniserande bestrålning

The intestinal epithelium consists of a single layer of cells yet contains multiple types of terminally differentiated cells, which are generated by the ...

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

Primär odling av svin retinala pigmentepitelceller

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...

Culture of Piglet Intestinal 3D Organoids from Cryopreserved Epithelial Crypts and Establishment of Cell Monolayers

Odling av Piglet Intestinal 3D-organoider från kryokonserverade epitelkrypter och etablering av cellmonolager

Intestinal organoids are increasingly being used to study the gut epithelium for digestive disease modeling, or to investigate interactions with drugs, ...

Unveiling Inflammatory Arthritis&#58; Exploring Functions of Synovial Cells

Isolation and Culture of Primary Synovial Macrophages and Fibroblasts from Murine Arthritis Tissue

Isolation and Culture of Primary Synovial Macrophages and Fibroblasts from Murine Arthritis Tissue (Video) | JoVE 

Isolering och odling av primära synoviala makrofager och fibroblaster från murin artritvävnad

Rheumatoid arthritis is an autoimmune disease that leads to chronic inflammation of joints. Synovial macrophages and synovial fibroblasts have central ...

3D Culture of Organoids from Murine Intestinal Crypts and Single Stem Cell

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research (Video) | JoVE 

3D-odling av organoider från murina tarmkrypter och en enda stamcell för organoidforskning

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine ...

Epithelial Effects of Intestinal Inflammation on Established Murine Colonoids

Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids

Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids (Video) | JoVE 

Studera epiteleffekterna av tarminflammation in vitro på etablerade murina kolonioider

The intestinal epithelium plays an essential role in human health, providing a barrier between the host and the external environment. This highly dynamic ...