Name: visualizing the effects of oxidative damage on drosophila egg chambers using live imaging
Uploaded: 2021-04-10T15:00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Effects of Oxidative Damage on Drosophila Egg Chambers using Live Imaging at JoVE.com

Vorremmo ringraziare il Dr. Jeremy Smyth per il supporto all'imaging e Ann C. Shenk per le illustrazioni, la produzione e la videografia. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health (1R01GM127938 to R.T.C.).

1. Preparazione della dissezione e dei mezzi di imaging
NOTA: I supporti più adatti a questo esperimento di imaging dal vivo contengono il supporto Drosophila di Schneider contenente il 15% di siero bovino fetale inattivato dal calore, 0,6x Pen-Strep e 200 μg/mL di insulina bovina, di seguito denominata supporto di Complete Schneider.
<ol><li>Eseguire la preparazione del supporto in condizioni sterili per assicurarsi che non sia contaminato. Il supporto è stato sviluppato per supportare Drosophila ovarioles per lunghi periodi di tempo9.</li>
	<li>Aggiungere il 15% di siero bovino fetale inattivato dal calore, 0,6x Pen-Strep e 200 μg/mL di insulina bovina al supporto schneider.</li>
	<li>Mescolare bene il contenuto e conservare a 4 °C durante la notte. NOTA: L'insulina non si dissolve completamente nel supporto di Schneider completo e noterai un precipitato che si deposita nella parte inferiore del tubo.</li>
	<li>Fare aliquote del supporto, assicurandosi di lasciare il precipitato in quanto interferirà con l'imaging. NOTA: Questa soluzione può essere utilizzata entro un mese se conservata in aliquote a 4 °C.</li>
</ol>2. Raccolta di Drosophila per la dissezione
NOTA: Le procedure dettagliate di raccolta e dissezione della Drosophila si trovano anchein Weil etal.
<ol><li>Per un'imaging ottimale delle cellule germinali femminili, preparare prima una fiala contenente cibo di mosca di farina di mais standard e un tampone di pasta di lievito umido che è la consistenza del burro di arachidi. Ciò garantisce che le mosche femminili siano ben nutrite e producano tutte le fasi di sviluppo del follicolo per l'imaging.</li>
	<li>Per mosche ottimali e sane, raccogli femmine vecchie di 0-1 giorno e trasferisci con i maschi in una fiala di cibo a mosca contenente pasta di lievito umido. NOTA: Assicurarsi che le mosche addormentate non contattino la pasta di lievito in quanto possono attaccarsi ad essa.</li>
	<li>Nutrire le mosche 3-7 giorni, cambiando quotidianamente il flaconcino e la pasta di lievito. NOTA: Assicurarsi che la pasta di lievito contatti il fly food in modo che non si asciughi.</li>
</ol>3. Dissezione dell'ovaio Drosophila
NOTA: È importante preparare le soluzioni multimediali fresche perché il perossido di idrogeno è suscettibile all'ossidazione e TMRE si degrada nel tempo.
<ol><li>Poco prima della dissezione, nel supporto di Schneider completo, preparare una nuova aliquota di 2 μM H2O2 soluzione, un'aliquota fresca di 46 nM tetrametillrhodamina, estere etilico (TMRE) e una nuova aliquota di una soluzione TMRE da 46 nM contenente 2 μM H2O2.
</li>
	<li>Per la dissezione dell'ovaio, utilizzare due paia di pinza fine e un paio di aghi di tungsteno affilati elettroliticamente12. Per sezionare le ovaie, riempire 2-3 pozzali di un piatto di sezionatura del fondo di vetro (vetro da orologio) con Schneider completo che è stato riscaldato a temperatura ambiente.</li>
	<li>Anestetizza la fiala delle mosche ingrassate con anidride carbonica e segrega il numero desiderato di mosche femminili da sezionare. Posizionare una singola mosca nel supporto utilizzando le forcep.</li>
	<li>Al microscopio sezionato, afferrare delicatamente la mosca dal torace usando un paio di forcep fini. Con l'altra coppia di forcep, afferrare il posteriore e tirare delicatamente per rimuovere le ovaie. NOTA: se le ovaie non escono senza intoppi usando questo metodo, l'intero addome può anche essere rimosso dalla mosca e le ovaie possono essere delicatamente spremute da entrambe le estremità dell'addome usando le forcep.</li>
	<li>Rimuovere qualsiasi cuticola o tessuto estraneo, quindi trasferire le ovaie in un nuovo pozzo contenente mezzi freschi. Le ovaie dovrebbero ancora muoversi dalla torcia muscolare circostante.</li>
</ol>4. Preparazione degli ovariole per l'imaging
<ol><li>Utilizzando aghi di tungsteno affilati, prendere delicatamente in giro gli ovarioli a parte, facendo attenzione a rimuovere la torcia muscolare circostante (Figura 1).</li>
	<li>Prendere delicatamente in giro qualsiasi falesia muscolare e fibre nervose attaccate alle ovaiole isolate (Figura 2). NOTA: Se la chiave muscolare non viene rimossa, l'ovariolo si contrae e si muove, causando problemi con l'acquisizione dell'immagine (Video 1).</li>
	<li>Se le strutture subcellulari di interesse sono etichettate in modo endogeno, procedere al passaggio 4.4. Se le strutture di interesse saranno etichettate con un colorante fluorescente, procedere alla sezione 5.</li>
	<li>Una volta che gli ovariole sono stati sezionati in modo pulito, utilizzando una micropipetta, trasferirli in una goccia di 100 μL del supporto di imaging di Complete Schneider nella depressione del vetro di un piatto inferiore di vetro. Le singole ovaiole affonderanno sul fondo della goccia.</li>
	<li>Procedere alla sezione 6 per l'imaging. NOTA: Per l'imaging di mitocondri e particelle di beatitudine Clu, non devono trascorrere più di cinque-dieci minuti dall'inizio della dissezione all'imaging.</li>
</ol>5. Colorazione dei mitocondri con TMRE
NOTA: Ulteriori procedure dettagliate sulla colorazione in diretta dei mitocondri con coloranti fluorescenti possono essere trovate in Parker et al.
<ol><li>Dopo il passaggio 4.3, trasferire gli ovarioli isolati in una goccia di 100 μL di 46 nM TMRE media nella depressione del vetro di un piatto inferiore di vetro. Le singole ovaiole affonderanno sul fondo della goccia.</li>
	<li>Incubare a temperatura ambiente per 20 minuti. Posizionare il coperchio sul piatto con fondo di vetro e posizionare il piatto in una scatola coperta per tutta la durata dell'esperimento per proteggersi dalla luce. NOTA: Dopo l'incubazione, i campioni possono essere immagini direttamente senza lavaggi.</li>
	<li>Ripetere i passaggi 5.1-5.2 per preparare almeno due piatti di ovariole etichettate TMRE, uno per servire come gruppo sperimentale e uno per fungere da controllo.</li>
</ol>6. Acquisizione di immagini dal vivo
<ol><li>Una volta montati gli ovariole, posizionare una delle stoviglie inferiori in vetro sul microscopio e configurare i parametri di imaging in base alle esigenze. Le lunghezze d'onda ottimali di eccitazione/emissione per il TMRE qui utilizzato sono di 549 nm/574 nm.</li>
	<li>Dopo aver individuato il campo visivo desiderato, acquisire immagini fisse o brevi video di uno o più ovarioli come desiderato come record di condizioni di pre-trattamento.</li>
</ol>7. Aggiunta di perossido di idrogeno durante l'imaging
<ol><li>Sospendere l'imaging dal vivo, rimuovere il coperchio dal piatto inferiore di vetro e aggiungere con cura 100 μL di 2 μM H2O2 soluzione al piatto utilizzando una micropipetta se si imaging strutture etichettate in modo endogeno. Se si imaging mitocondri, aggiungere con cura 100 μL di 46 nM TMRE con soluzione 2 μM H2O2 al piatto utilizzando una micropipetta (Video 2).<ol>
<li>Evitare di rompere la superficie della goccia multimediale esistente o di aggiungere lasoluzione tropporapidamente in modo da non spostare gli ovariole appoggiati sul fondo del piatto ( Video 2 ).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sostituire il coperchio del piatto (coperchio del piatto), spostare e rifocalizzare il campo visivo desiderato, se necessario, e riprendere l'imaging (Video 3, Video 4, Figura 3, Figura 4).<ol>
<li>Fare attenzione a riprendere l'imaging il più rapidamente possibile dopo l'aggiunta di H2O2 in quanto il trattamento sperimentale è sensibile al tempo (Video 5).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Acquisire immagini fisse o brevi video di uno o più ovariole come desiderato. Ciò servirà come registrazione delle condizioni post-trattamento.</li>
	<li>Per il controllo, posizionare il secondo piatto inferiore in vetro sul microscopio e ripetere la sezione 6.</li>
	<li>Ripetere il passaggio 7.1, questa volta aggiungendo 100 μL di supporti solo TMRE al piatto. Se si imaging di strutture etichettate in modo endogeno, aggiungere 100 μL della soluzione di sola supporto di Schneider complete.</li>
	<li>Ripetere i passaggi 7.2 e 7.3 per acquisire i dati per il gruppo di controllo. NOTA: Per l'imaging di mitocondri e particelle di beatitudine di Clu, non devono trascorrere più di tre-cinque minuti dall'aggiunta di perossido di idrogeno all'imaging.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Winterbourn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+of+iron+and+hydrogen+peroxide:+the+Fenton+reaction.">Toxicity of iron and hydrogen peroxide: the Fenton reaction.</a> Toxicology Letters. 82-83, 969-974 (1995).</li><li>Cox, R. T., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Balbiani+body+and+the+fusome+mediate+mitochondrial+inheritance+during+Drosophila+oogenesis.">A Balbiani body and the fusome mediate mitochondrial inheritance during Drosophila oogenesis.</a> Development. 130 (8), 1579-1590 (2003).</li><li>Cox, R. T., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clueless,+a+conserved+Drosophila+gene+required+for+mitochondrial+subcellular+localization,+interacts+genetically+with+parkin.">Clueless, a conserved Drosophila gene required for mitochondrial subcellular localization, interacts genetically with parkin.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 2 (9-10), 490-499 (2009).</li><li>Sen, A., Kalvakuri, S., Bodmer, R., Cox, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clueless,+a+protein+required+for+mitochondrial+function,+interacts+with+the+PINK1-Parkin+complex+in+Drosophila.">Clueless, a protein required for mitochondrial function, interacts with the PINK1-Parkin complex in Drosophila.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 8 (6), 577-589 (2015).</li><li>Sheard, K. M., Thibault-Sennett, S. A., Sen, A., Shewmaker, F., Cox, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clueless+forms+dynamic,+insulin-responsive+bliss+particles+sensitive+to+stress.">Clueless forms dynamic, insulin-responsive bliss particles sensitive to stress.</a> Developmental Biology. 459 (2), 149-160 (2020).</li><li>Sen, A., Cox, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clueless+is+a+conserved+ribonucleoprotein+that+binds+the+ribosome+at+the+mitochondrial+outer+membrane.">Clueless is a conserved ribonucleoprotein that binds the ribosome at the mitochondrial outer membrane.</a> Biology Open. 5 (2), 195-203 (2016).</li><li>Parton, R. M., Valles, A. M., Dobbie, I. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Drosophila+egg+chambers+for+imaging.">Isolation of Drosophila egg chambers for imaging.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (4), 5402 (2010).</li><li>Morris, L. X., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+live+imaging+provides+new+insight+into+stem+cell+regulation+and+germline-soma+coordination+in+the+Drosophila+ovary.">Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary.</a> Development. 138 (11), 2207-2215 (2011).</li><li>Prasad, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+of+border+cell+migration+analyzed+using+time-lapse+live-cell+imaging.">Cellular and molecular mechanisms of border cell migration analyzed using time-lapse live-cell imaging.</a> Developmental Cell. 12 (6), 997-1005 (2007).</li><li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+individual+Drosophila+egg+chambers+for+live+imaging.">Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), e3679 (2012).</li><li>Parker, D. J., Moran, A., Mitra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+Mitochondrial+Structure+and+Function+in+Drosophila+Ovaries.">Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), e54989 (2017).</li><li>Brady, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+making+fine,+durable+dissecting+needles+by+sharpening+tungsten+wire+electrolytically.">A simple technique for making fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically.</a> Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).</li><li>Hudson, A. M., Petrella, L. N., Tanaka, A. J., Cooley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mononuclear+muscle+cells+in+Drosophila+ovaries+revealed+by+GFP+protein+traps.">Mononuclear muscle cells in Drosophila ovaries revealed by GFP protein traps.</a> Developmental Biology. 314 (2), 329-340 (2008).</li><li>Wang, S., Hazelrigg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implications+for+bcd+mRNA+localization+from+spatial+distribution+of+exu+protein+in+Drosophila+oogenesis.">Implications for bcd mRNA localization from spatial distribution of exu protein in Drosophila oogenesis.</a> Nature. 369 (6479), 400-403 (1994).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo protocollo potrebbe essere un'utile aggiunta come controllo per gli artefatti a causa della dissezione dell'ovaio e dell'incubazione tissutale per qualsiasi esperimento di imaging dal vivo. I passaggi critici sono simili a quelli trovati per altri protocolli di imaging dal vivo. Imparare a sezionare intere ovaie di Drosophila richiede pratica; tuttavia, questa abilità può di solito essere appresa abbastanza rapidamente con gli strumenti di dissezione appropriati. Più difficile da padroneggiare è rimuovere il muscolo avvolgente le ovaie e ogni ovariolo13. Questo deve essere fatto per garantire che le contrazioni muscolari non interferiscano con l'acquisizione di immagini. Se l'uso di aghi di tungsteno affilati per fare questo non si rivela un successo, il germario sulla punta dell'ovariolo può essere afferrato con pinza e l'ovariolo estratto dalla toria muscolare. Tuttavia, questa tecnica è problematica se si vogliono esaminare le prime fasi di sviluppo perché possono danneggiarsi. Un altro passo fondamentale è quello di non spostare gli ovariole appoggiati sul fondo del piatto quando si aggiunge H2O2. Un ulteriore aspetto importante è condiviso da tutte le immagini dal vivo: il ricercatore dovrebbe garantire che la struttura di interesse sia fluorescentmente ben etichettata prima del trattamento. I piatti qui utilizzati(Table of Materials) sonocomunemente usati per l'imaging dal vivo; tuttavia, qualsiasi piatto o scivolo con una coverlip di vetro sul fondo o anche una grande coverlip di vetro dovrebbe funzionare purché la goccia di supporto possa essere coperta per evitare l'evaporazione del mezzo. Mentre usiamo un particolare microscopio, qualsiasi microscopio invertito con un obiettivo di ingrandimento sufficiente per vedere la struttura subcellulare in questione e una fotocamera collegata che ha una risoluzione e una velocità di acquisizione dell'immagine sufficienti dovrebbe funzionare.
Mentre il nostro laboratorio è principalmente interessato alla funzione mitocondriale, questo metodo potrebbe essere utile esaminando la dinamica e la localizzazione di qualsiasi struttura subcellulare o organelli, come il nucleo, il citoscheletro o il reticolo endoplasmatico. Tuttavia, questo metodo ha dei limiti. Per aggiungere perossido di idrogeno, il tessuto deve essere in un supporto acquoso. Un metodo alternativo per l'imaging dal vivo è quello di utilizzare l'olio di alocarbonio, che è stato determinante nel descrivere molti processi importanti nelle ovariole di Drosophila tra cui il primo esempio di movimento dinamico della GFP in un organismomodello 7,14. Inoltre, l'aggiunta di perossido di idrogeno ai mezzi provoca un danno ossidativo diffuso che può essere un insulto troppo generale al tessuto per essere informativo per il processo cellulare di interesse, in particolare per esperimenti più lunghi che esaminano lo sviluppo. Anche se potrebbe non essere possibile eseguire esperimenti che richiedono la visualizzazione della cellula per lunghi periodi di tempo a causa di questo danno ossidativo rapido, esteso e probabilmente irreversibile, abbiamo visto che il trattamento acuto di perossido di idrogeno che abbiamo descritto è applicabile alla maggior parte degli stadi di oogenesi in quanto siamo in grado di vedere gli stessi effetti nella maggior parte delle fasi del periodo di imaging. Dato il basso costo e la facilità del protocollo, può essere un controllo utile per i danni e può essere utilizzato come trattamento prima della fissazione e dell'etichettatura degli anticorpi.
Nelle nostre mani, il trattamento H2O2 imita i cambiamenti nella delocalizzazione mitocondriale e nella dispersione delle particelle di beatitudine di Clu che vediamo in vari mutanti Drosophila. Imita anche i risultati che vediamo per i nuovi ricercatori nelle tecniche di dissezione dell'apprendimento in laboratorio. Pertanto, questo metodo ha rivelato chiaramente che la preparazione del campione e lo stress cellulare generale possono portare a cambiamenti imprevisti e precedentemente inspiegabili alla delocalizzazione mitocondriale e alla presenza di particelle di beatitudine. Spostando questa tecnica in avanti, le concentrazioni di perossido di idrogeno potrebbero essere modulate utilizzando una concentrazione più o meno elevata. Se si vede un effetto cellulare usando una concentrazione inferiore, è possibile che il fenotipo di stress possa essere reversibile sostituendo il supporto con quello di Complete Schneider. Diversi fattori di stress cellulare come carbonil cianuro m-clorofenil hydrazone (CCCP), arsenite o semplice shock termico potrebbero rivelarsi utili per lo stress cellulare generale per altre strutture subcellulari. Poiché l'imaging vivo di tessuti ex vivo richiede manipolazione manuale e incubazione in diversi mezzi, questo controllo dovrebbe essere un'aggiunta utile per garantire che eventuali osservazioni siano il più vicino possibile alla normale fisiologia.

Più stressanti cellulari diversi possono insorgere durante la coltura sperimentale e la manipolazione dei tessuti ex vivo, tra cui shock termico, stress ossidativo, stress osmotico, stress nutrizionale e condizioni di tossicità. L'imaging dal vivo è un potente strumento utilizzato per visualizzare i cambiamenti in tempo reale nei tessuti ex vivo dopo il trattamento sperimentale e la manipolazione. Le dissezioni e la manipolazione dei tessuti fini prendono pratica e la quantità di tempo dalla dissezione all'imaging può variare a seconda dell'esperienza. La logica per lo sviluppo di questo metodo si basa sulla preoccupazione che la preparazione del tessuto per l'imaging vivo possa causare stress cellulare durante la dissezione e la preparazione dell'imaging. Ciò potrebbe essere particolarmente problematico per i processi sensibili ai cambiamenti nel metabolismo cellulare e ai livelli di ossigeno disponibili, come la funzione mitocondriale. Sebbene avere un campione parallelo di tipo selvatico sia un controllo importante, c'è ancora la possibilità che alcuni o tutti i cambiamenti osservati nelle strutture subcellulari possano essere dovuti a danni o stress cellulare dalla dissezione e non riflettano la fisiologia normale o il trattamento o la mutazione in fase di studio.
Per affrontare questo potenziale problema, utilizziamo l'aggiunta di perossido di idrogeno durante l'imaging dal vivo al fine di indurre danni ossidativicellulari 1. Lo scopo di questo metodo è quello di indurre danni ai tessuti al fine di monitorare l'effetto sulle strutture subcellulari. Questo protocollo è utile per due scopi: 1) determinare se i cambiamenti nella localizzazione subcellulare della struttura di interesse sono dovuti allo stress causato dalla dissezione inesperta e 2) una volta che il ricercatore è fiducioso con le tecniche di dissezione descritte per monitorare l'effetto dello stress controllato sulla struttura di interesse. Qui mostriamo due esempi di come l'aumento dei danni ossidativi causi cambiamenti in due strutture subcellulari, i mitocondri e le particelle di beatitudine di Clu. Per fare questo, usiamo l'ovaio Drosophila che è un modello comune per gli studi di imaging dal vivo. Il primo esempio esamina la localizzazione mitocondriale. Nella nostra esperienza, la normale localizzazione mitocondriale nelle cellule germinali femminili è altamente sensibile alle perturbazioni e può agire come un presagio dello stress cellulare. I mitocondri nelle cellule germinali femminili di Drosophila sono normalmente dispersi uniformemente in tutto il citoplasma2. L'aggiunta di perossido di idrogeno fa sì che gli organelli localizzino e si ammalino rapidamente in modo simile a variemutazioni 3,4,5. Il secondo esempio sono le particelle di beatitudine formate da Clueless (Clu). Clu è una ribonucleoproteina diffusa in tutto il citoplasma; tuttavia, forma anche particelle associate ai mitocondri in condizioni cellulari ottimali5. Poiché la presenza di particelle di Clu dipende da condizioni cellulari sane, le abbiamo definite particelle di "beatitudine"3,5,6. L'aggiunta di perossido di idrogeno fa sì che queste particelle si disperdono rapidamente e diventino omogenee nelcitoplasma 5. Nel corso dei nostri studi, abbiamo osservato cambiamenti nella localizzazione di entrambe queste strutture subcellulari, ma solo dopo aver eseguito studi di imaging dal vivo potremmo apprezzare appieno l'effetto dello stress cellulare e dei danni ossidativi sulla localizzazione e sulla dinamica dei mitocondri e delle particelle di beatitudine.
L'utilità di questo protocollo come aggiunta a metodi già stabiliti o alternativi dipende da diversi fattori. In primo luogo, il protocollo di imaging deve essere suscettibile di aggiunta di farmaci. Se il campione è montato sotto un coverslip e in olio di alocarbonio, questo metodo non sarebbe possibile7. L'aggiunta di H2O2 provoca un rapido aumento dei danni ossidativi, pertanto questo lassorario potrebbe non essere appropriato. Il danno ossidativo può essere considerato una procura per l'ipossia; tuttavia, potrebbe essere troppo duro o troppo generalizzato per funzionare come un controllo appropriato per i danni per alcuni componenti subcellulari. Infine, per gli esperimenti di imaging che durano ore come quelli che seguono un processo di sviluppo,l'addizionedi H 2 O 2 può esseretroppo forte(ad esempio 8). Testare una curva di concentrazione può superare questa limitazione.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Active dry yeast</td>
			<td>Red Star&#174;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 gas</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>99.9% purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 pad</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope, Nikon SMZ645 model</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting needles - PrecisionGlide needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305165</td>
			<td>B-D 21G1 size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting needles - PrecisionGlide syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td>Luer-Lok tip, 3 mL size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting needles - tungsten wire</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>73800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 forceps (2 pairs)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NI-150 High Intensity Illuminator</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10082-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Schneider&#39;s Drosophila Media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>21720-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution, 30% (w/w) in H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning disk microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Equivalent scopes may also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lonza BioWhittaker Antibiotics: Penicillin-Streptomycin mixtures</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17-602E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatTek Corporation Glass Bottom Dishes, 35 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;NC9344527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes and tips of appropiate size</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes, 1.7 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE)</td>
			<td>AnaSpec</td>
			<td>AS-88061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w[1118]</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>5905</td>
			<td>Wild-type flies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y w; clu[CA06604]</td>
			<td></td>
			<td>Available upon request.</td>
			<td>Clu::GFP trap flies</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing the effects of oxidative damage on drosophila egg chambers using live imaging

L'imaging dal vivo delle ovaie di Drosophila melanogaster è stato determinante nella comprensione di una varietà di processi cellulari di base durante lo sviluppo, tra cui il movimento delle particelle di ribonucleoproteina, la localizzazione dell'mRNA, il movimento degli organelli e la dinamica citoscheletrica. Esistono diversi metodi per l'imaging dal vivo che sono stati sviluppati. A causa del fatto che ogni metodo prevede la sezionatura di singoli ovariole poste in mezzi o olio di alocarbonio, i danni cellulari dovuti all'ipossia e / o alla manipolazione fisica si verificheranno inevitabilmente nel tempo. Un effetto a valle dell'ipossia è quello di aumentare il danno ossidativo nelle cellule. Lo scopo di questo protocollo è quello di utilizzare l'imaging vivo per visualizzare gli effetti del danno ossidativo sulla localizzazione e la dinamica delle strutture subcellulari nelle ovaie di Drosophila dopo l'induzione di danni cellulari controllati. Qui, usiamo il perossido di idrogeno per indurre danni ossidativi cellulari e dare esempi degli effetti di tali danni su due strutture subcellulari, i mitocondri e le particelle di beatitudine di Clu. Tuttavia, questo metodo è applicabile a qualsiasi struttura subcellulare. I limiti sono che il perossido di idrogeno può essere aggiunto solo ai mezzi acquosi e non funzionerebbe per l'imaging che utilizza olio di alocarbonio. I vantaggi sono che il perossido di idrogeno è prontamente disponibile ed economico, agisce rapidamente, le sue concentrazioni possono essere modulate e il danno ossidativo è una buona approssimazione dei danni causati dall'ipossia e dai danni generali ai tessuti dovuti alla manipolazione.

I protocolli descritti possono essere utilizzati per studiare gli effetti del perossido di idrogeno durante l'imaging dal vivo delle ovaie di Drosophila. Come illustrato nella figura 3, Figura 4, Video 3 e Video 4, questa procedura fornisce un mezzo efficace per visualizzare i cambiamenti e le dinamiche dei tessuti dopo il trattamento sperimentale in tempo reale. È importante sottolineare che questo protocollo è specifico per l'aggiunta di H2O2 agli ovariole durante l'imaging; tuttavia, può essere adattato per l'aggiunta esogena di altri farmaci o reagenti di interesse. Inoltre, i follicoli possono essere etichettati con qualsiasi colorante fluorescente di interesse (ad esempio, tetrametillrhodamina (TMRE), LysoTracker) prima dell'imaging (Video 3). I passaggi più critici per ottenere risultati di imaging chiari sono 1) la corretta dissezione e isolamento di singoli ovarioli con tutti gli elementi contrattili rimossi(Figura 1 e Figura 2) e 2) la velocità con cui l'imaging viene riavviato dopo l'aggiunta di perossido di idrogeno. Video 4 è un'illustrazione di un follicolo correttamente sezionato che rimane costante per tutta la durata dell'imaging rispetto al Video 1, che illustra un follicolo scarsamente sezionato che esce dal campo visivo durante l'imaging. Il video 5 è un'illustrazione in cui gli effetti H2O2 sui mitocondri con etichetta TMRE sono già progrediti prima dell'inizio dell'imaging a causa di un tempo trascorso troppo. Rispetto al Video 3 in cui l'imaging è stato riavviato subito dopo l'aggiunta di perossido di idrogeno (tempo 0) e intatti, i mitocondri dispersi sono ancora visibili, i mitocondri nel Video 5 hanno già iniziato a ciuffare visibilmente e perdere il loro potenziale di membrana al riavvio dell'imaging. Questo problema è principalmente attribuito all'interruzione delle posizioni del campione durante l'aggiunta di H2O2 e può essere alleviato seguendo la tecnica per mantenere intatti il supporto di imaging e la posizione del campione (Video 2). Da notare, negli esperimenti di controllo eseguiti senza H2O2 aggiunto al supporto, i mitocondri nei follicoli rimangono correttamente dispersi e il colorante TMRE rimane sequestrato nei mitocondri.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62157/62157fig01.jpg"> Figura 1: Isolamento delle singole ovaiole dalle ovaie di Drosophila. (A) Cartone animato che indica un paio di ovaie, un singolo ovariolo (freccia) con il germario sulla punta (punta di freccia) e le due falesie muscolari che circondano l'ovariolo (marrone, epiteliale) e l'ovaio (marrone, peritoneale). (B) Ovaia drosofila sezionata. (C) Successiva separazione dell'ovaio preso in giro in singoli ovarioles (freccia). Barra di scala = 100 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62157/62157fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62157/62157fig02.jpg"> Figura 2: Rimozione delle fibre nervose e degli elementi contrattili dalle singole ovaiole. (A) Ovariolo singolo con resti di tessuto nervoso e la tora muscolare ancora attaccata (freccia). (B) Rimozione delicata di tutto il tessuto rimanente attaccato all'ovariolo in A (freccia). Barra di scala = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62157/62157fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62157/62157fig03.jpg"> Figura 3: H2O2 causa una delocalizzazione mitocondriale. (A-A")Ala immagini vive di un follicolo cluCA06604 ben nutrito (moscerini Clu::GFP). L'aggiunta di H2O2 fa sì che i mitocondri si aglucino per tutta la durata dell'imaging. L'etichettatura TMRE dei mitocondri indica che i mitocondri sono inizialmente dispersi al tempo 0 (A), e che i mitocondri iniziano a ciuffarsi dopo l'aggiunta di H2O2 (A′) In un secondo momento, l'etichettatura TMRE diventa imprevedibile a causa della perdita del potenziale della membrana da parte dei mitocondri e quindi della loro capacità di sequestrere il colorante (A"). Bianco = TMRE (A-A"). Barre di scala: 10 μm in (A) per A-A"5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62157/62157fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62157/62157fig04.jpg"> Figura 4: H2O2 disperde Clu. (A-A") Ala immagini vive di un follicolo cluCA06604 ben nutrito. L'aggiunta di H2O2 fa sì che le particelle si disperdono e diventino omogenee nel citoplasma per tutta la durata dell'imaging. Bianco = Clu::GFP (A-A"). Barra di scala: 40 μm in (A) per A-A"5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62157/62157fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Video 1: Follicolo da una femmina cluCA06604. Come descritto nella figura 2 , la mancatarimozione degli elementi contrattili delle fibre nervose dai singoli ovarioli causerà una marcata deriva e movimento degli ovarioli durante l'imaging e la conseguente incapacità di analizzare i dati di imaging. Bianco = Clu::GFP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62157/Video%201%20-%20Failure%20to%20remove%20contractile%20elements.mov" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo video.</a>
Video 2: Corretta aggiunta di H2O2 al piatto campione. Il perossido di idrogeno deve essere aggiunto alla piastra del campione utilizzando una micropipetta di dimensioni appropriata. Erogazione H2O2 senza rompere la superficie del supporto. Si fa attenzione a evitare di rompere la superficie del supporto di imaging per ridurre al minimo la deriva del campione durante l'aggiunta di perossido di idrogeno. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62157/Video%202%20-%20Proper%20Addition%20of%20H2O2%20to%20Sample%20Dish.mp4" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo video.</a>
Video 3: Aggiunta H2O2 durante l'imaging di follicoli etichettati TMRE. Follicolo da una femmina cluCA06604 macchiata di TMRE. H2O2 causa la delocalizzazione mitocondriale nei follicoli di Drosophila. Bianco = colorante TMRE. Immagine di un fotogramma per 15 s per 20 minuti e il video è di 10 fotogrammi al secondo5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62157/Video%203%20-%20H2O2%20stresses%20mitochondria.avi" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo video.</a>
Video 4: Aggiunta H2O2 durante l'imaging dei follicoli Clu::GFP. Follicolo da una femmina cluCA06604. H2O2 disperde le particelle di Clu come descritto nella figura 4. Bianco = Clu::GFP. Immagine di un fotogramma per 15 s per 15 minuti e il video è di 10 fotogrammi al secondo. 5<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62157/Video%204%20-%20H2O2%20disperses%20particles.avi" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo video.</a> 
Video 5: Imaging ritardato dopo l'aggiuntadi H2O2. Follicolo da una femmina cluCA06604. L'aggiunta di idrogeno-perossido ai follicoli è un trattamento sensibile al tempo. Il riavvio dell'imaging è stato ritardato in questo video a causa dello spostamento del campione durante l'aggiunta di H2O2. I mitocondri hanno già iniziato a ciuffare visibilmente e a perdere il loro potenziale di membrana al riavvio dell'imaging al tempo 0 (rispetto al tempo 0 nel Video 3). La mancata ripresa rapida dell'imaging dopo il trattamento comporterà risultati imprecisi e inutilizzabili, poiché i primi effetti sperimentali verranno persi prima dell'imaging. Bianco = TMRE. Immagine di un fotogramma per 15 s per 20 minuti e il video è di 10 fotogrammi al secondo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62157/Video%205%20-%20Delayed%20imaging%20after%20H2O2%20addition.mov" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo video.</a>

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Visualizing the Effects of Oxidative Damage on Drosophila Egg Chambers using Live Imaging

L'obiettivo di questo protocollo è quello di utilizzare l'imaging vivo per visualizzare gli effetti dei danni ossidativi sulla localizzazione e dinamica delle strutture subcellulari nelle ovaie di Drosophila.

Visualizzazione degli effetti dei danni ossidativi sulle camere delle uova Drosophila utilizzando l&apos;imaging dal vivo

Live imaging of Drosophila melanogaster ovaries has been instrumental in understanding a variety of basic cellular processes during development, including ...

Il nostro laboratorio utilizza Drosophila melanogaster per identificare e caratterizzare geni e percorsi che regolano la funzione mitocondriale durante lo sviluppo e l'omeostasi fisiologica. Il protocollo qui presentato utilizza l'imaging dal vivo con aggiunta di perossido di idrogeno per visualizzare gli effetti dei danni ossidativi sulla localizzazione e la dinamica delle strutture subcellulari nell'ovaio adulto drosophila. Usiamo spesso protocolli di imaging per studiare come le mutazioni alterano la normale localizzazione mitocondriale e il movimento nelle cellule germinali femminili.Nel corso dei nostri studi abbiamo scoperto che lo stress introdotto dalla dissezione o da altri fattori di stress cellulare ha avuto un profondo impatto sulla localizzazione mitocondriale. Come controllo per identificare se lo stress generale, al contrario del trattamento sperimentale, è la causa di eventuali cambiamenti nella localizzazione o nel comportamento delle strutture subcellulari. Abbiamo sviluppato questo protocollo per introdurre lo stress di controllo utilizzando il perossido di idrogeno.In questo video, dimostreremo come il danno ossidativo indotto dal perossido di idrogeno cambia la distribuzione dei mitocondri e della ribonucleoproteina Clu. I supporti più adatti a questa tecnica di imaging dal vivo contenevano i supporti Drosophila di Schneider contenenti il 15% di siero bovino fetale inattivato dal calore, 0,6 X Pen-Strep e 200 microgrammi per insulina bovina microliter, di seguito denominata supporto Schneider completo. L'esecuzione della preparazione dei supporti in condizioni sterili garantirà che non sia contaminata.Mescolare bene il contenuto e conservare durante la notte a quattro gradi. L'insulina non si dissolve completamente nel supporto Schneider completo e noterai un precipitato depositarsi nella parte inferiore del tubo. Fai aliquote, assicurandoti di lasciare questo precipitato in quanto interferirà con l'imaging.Questa soluzione può essere utilizzata per un mese se conservata in aliquote a quattro gradi. Per un'imaging ottimale delle cellule germinali femminili, preparare prima una fiala contenente un tampone di pasta di lievito umido che è la consistenza del burro di arachidi. Ciò garantisce che le femmine siano ben nutrite e producano tutte le fasi di sviluppo del follicolo per l'imaging.Per mosche ottimali e sane, raccogli da zero a un giorno le femmine vecchie e trasferisci con i maschi in una fiala di cibo a mosca contenente pasta di lievito umido. Assicurarsi che le mosche addormentate non contattino la pasta di lievito in quanto possono attaccarsi ad essa. Nutrire le mosche da tre a sette giorni, cambiando la pasta di lievito ogni giorno.Assicurarsi che la pasta di lievito contatti il fly food, in modo che non si asciughi. Per indurre danni ossidativi, utilizzeremo una soluzione stock di perossido di idrogeno al 30% e per visualizzare i mitocondri, useremo una soluzione stock di TMRE da 100 millimolare. È importante preparare le soluzioni multimediali fresche perché il perossido di idrogeno è suscettibile all'ossidazione e il TMRE si degrada nel tempo.Poco prima della dissezione, in completo supporto schneider, preparare una nuova aliquota di due perossido di idrogeno micromolare, un'aliquota fresca di 46 nanomolare TMRE e un'aliquota fresca di 46 nanomolare TMRE più due perossido di idrogeno micromolare. Per la dissezione dell'ovaio avrai bisogno di due paia di pinza fine e un paio di aghi di tungsteno elettroliticamente affilati. Per sezionare le ovaie riempire un bicchiere da orologio con il supporto Schneider completo che è stato riscaldato a temperatura ambiente, quindi posizionare una singola mosca nel supporto utilizzando le forcep.Afferrare delicatamente la mosca dal torace usando un paio di forcep fini. Con le altre forcep, afferrare il posteriore e tirare delicatamente per rimuovere le ovaie. Rimuovere qualsiasi cuticola o tessuto estraneo, quindi trasferire l'ovaio in un nuovo pozzo contenente mezzi freschi.Le ovaie dovrebbero ancora muoversi dalla torcia muscolare circostante. Usando gli aghi di tungsteno affilati, stuzzicare delicatamente gli ovariole, facendo attenzione a rimuovere la torcia muscolare circostante. Se la toria muscolare non viene rimossa, come dimostrato qui, l'ovaria si contrae, causando problemi con l'acquisizione dell'immagine.Una volta che le ovariole sono state sezionate in modo pulito, trasferirle in una goccia di 100 microliter di supporto su un piatto MatTek se si visualizzano strutture etichettate in modo endogeno. Trasferire gli ovarioli in una goccia di 100 microliter di supporti TMRE su un piatto MatTek se si visualizzano mitocondri etichettati con TMRE. Gli ovariole affonderanno sul fondo della goccia.È importante praticare le dissezioni per iniziare a immaginare il tessuto il più rapidamente possibile. Una volta montati gli ovariole, posizionare il piatto sul microscopio invertito e acquisire immagini fisse o brevi video come registrazione delle condizioni di pretrattamento. Una volta fatto questo, mettere in pausa l'imaging dal vivo, rimuovere il coperchio e aggiungere con cura 100 microlitri della soluzione preparata perossido di idrogeno micromolare.Evitare di rompere la superficie della goccia multimediale esistente o di aggiungere la soluzione troppo rapidamente, in modo da non spostare gli ovariole appoggiati sul fondo. Sostituire il coperchio del piatto, spostare e rifocalizzare l'ovariolo desiderato e riprendere l'imaging. Fai attenzione a riprendere l'imaging il più rapidamente possibile, poiché il trattamento sperimentale è sensibile al tempo.Ecco le immagini fisse di un film, scattate dopo il trattamento con perossido di idrogeno. I mitocondri e le cellule germinali femminili sono dispersi in tutto il citoplasma quando le mosche sono ben nutrite e sane. Dopo l'aggiunta di perossido di idrogeno, il danno ossidativo fa sì che i mitocondri si agluclino, che possono essere visti con la velocità di 10 minuti dopo il trattamento.Dopo 20 minuti, il danno causa la dissipazione del potenziale della membrana mitocondriale. Pertanto, la maggior parte dei mitocondri svanisce. In questo film dal vivo del processo, i mitocondri possono essere visti rapidamente aggrapparsi e la maggior parte dei mitocondri alla fine svanisce.Il lampeggiamento pulsante nel citoplasma, in particolare nelle cellule follicolari circostanti, appare caratteristico dell'aggiunta di TMRE. Come accennato in precedenza, l'imaging deve avvenire rapidamente dopo l'aggiunta di perossido di idrogeno. Come mostrato qui, se trascorre troppo tempo, il potenziale della membrana mitocondriale è già perso e l'etichettatura TMRE si dissipa, rendendo i dati imprecabili.In queste immagini fisse video, le particelle di Clu etichettate endogenamente GFP sono robuste e abbondanti nel germoplasma delle femmine ben nutrite. Dopo l'aggiunta di perossido di idrogeno, le particelle di Clu si disperdono entro 10 minuti. Questo è dimostrato nel video di accompagnamento.Dopo l'aggiunta di perossido di idrogeno, le particelle di beatitudine di Clu si disperdono rapidamente. Abbiamo trovato questo protocollo uno strumento utile per garantire un'imaging accurata della localizzazione di tipo selvaggio di mitocondri e particelle di beatitudine Clu nelle cellule germinali femminili di Drosophila. Questo protocollo dovrebbe essere applicabile per un'ampia gamma di studi di imaging vivo e potrebbe essere utilizzato anche per trattare i tessuti prima della fissazione.I passaggi più importanti sono isolare gli ovarioli liberi dalla fodera muscolare, aggiungere delicatamente il perossido di idrogeno, in modo da non rimuovere gli ovariole e immagine rapidamente dopo l'aggiunta di perossido di idrogeno. Speriamo che lo troverai un controllo utile per l'imaging dal vivo di una varietà di strutture subcellulari. Grazie per la visione e buona fortuna con i tuoi esperimenti.

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