Name: ros live cell imaging during neuronal development
Uploaded: 2021-02-09T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about ROS Live Cell Imaging During Neuronal Development at JoVE.com

وقد دعم هذا العمل المعاهد الوطنية للصحة (المنحة R01NS117701)، والمؤسسة الوطنية للعلوم (المنحة 1146944-IOS)، وصندوق أبحاث الحبل الشوكي وإصابات الدماغ في إنديانا (منحة 20000289)، ومؤسسة أبحاث بوردو (منحة 209911)، ومكتب نائب الرئيس التنفيذي للبحوث والشراكات في جامعة بوردو (منحة 210362). نشكر الدكتور كوري ج. ويفر وهايلي رودر على إنشاء بروتوكول ثقافة سمك الحمار الوحشي RGC. نشكر هالي رودر بالإضافة إلى ذلك على توفير بيانات الشكل 4. نشكر ليا بياسي وكيني نغوين على المساعدة في ثقافة RGC. نشكر جنتري لي لتحرير النص. نشكر الدكتور توبياس ديك لتوفير roGFP2-Orp1 والدكتور تشينغ دينغ لأجهزة الكمبيوتر 2 + ناقلات تحتوي على roGFP2-Orp1. يتم إنشاء الشكل 2 مع Biorender.com.

تمت مراجعة جميع التجارب على الحيوانات أخلاقيا والموافقة عليها من قبل لجنة بوردو لرعاية الحيوانات واستخدامها (PACUC) ، وفقا للمبادئ التوجيهية للمعهد الوطني للصحة مع البروتوكول 2006002050 الموافقة عليه في 07/24/2020.
1. إعداد الحلول
<ol><li>E2 وسائل الإعلام (1x)<ol>
<li>إعداد حلول E2A 100x (500 مل) و500x E...

<ol>
	<li>B&#243;rquez, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+role+of+redox+signaling+in+neuronal+development.">Dissecting the role of redox signaling in neuronal development.</a> Journal of Neurochemistry. 137 (4), 506-517 (2016).</li><li>Bedard, K., Krause, K. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NOX+family+of+ROS-generating+NADPH+oxidases:+Physiology+and+pathophysiology.">The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: Physiology and pathophysiology.</a> Physiological Reviews. 87 (1), 245-313 (2007).</li><li>Weaver, C. J., Leung, Y. F., Suter, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+dynamics+of+NADPH+oxidases+during+early+zebrafish+development.">Expression dynamics of NADPH oxidases during early zebrafish development.</a> Journal of Comparative Neurology. 524 (10), 2130-2141 (2016).</li><li>Terzi, A., Suter, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+NADPH+oxidases+in+neuronal+development.">The role of NADPH oxidases in neuronal development.</a> Free Radical Biology and Medicine. 154, 33-47 (2020).</li><li>Infanger, D. W., Sharma, R. V., Davisson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidases+of+the+brain:+Distribution,+regulation,+and+function.">NADPH oxidases of the brain: Distribution, regulation, and function.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 8 (9-10), 1583-1596 (2006).</li><li>Coyoy, A., Olguin-Albuerne, M., Martinez-Briseno, P., Moran, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+reactive+oxygen+species+and+NADPH-oxidase+in+the+development+of+rat+cerebellum.">Role of reactive oxygen species and NADPH-oxidase in the development of rat cerebellum.</a> Neurochemistry International. 62 (7), 998-1011 (2013).</li><li>Le Belle, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferative+neural+stem+cells+have+high+endogenous+ROS+levels+that+regulate+self-renewal+and+neurogenesis+in+a+PI3K/Akt-dependant+manner.">Proliferative neural stem cells have high endogenous ROS levels that regulate self-renewal and neurogenesis in a PI3K/Akt-dependant manner.</a> Cell Stem Cell. 8 (1), 59-71 (2011).</li><li>Nayernia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+neural+precursor+cell+pool+in+NADPH+oxidase+2-deficiency:+from+mouse+brain+to+neural+differentiation+of+patient+derived+iPSC.">Decreased neural precursor cell pool in NADPH oxidase 2-deficiency: from mouse brain to neural differentiation of patient derived iPSC.</a> Redox Biology. 13, 82-93 (2017).</li><li>Wilson, C., Nunez, M. T., Gonz&#225;lez-Billault, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+NADPH+oxidase+to+the+establishment+of+hippocampal+neuronal+polarity+in+culture.">Contribution of NADPH oxidase to the establishment of hippocampal neuronal polarity in culture.</a> Journal of Cell Science. 128 (16), 2989-2995 (2015).</li><li>Munnamalai, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+interactions+between+Nox2-type+NADPH+oxidase+and+the+F-actin+cytoskeleton+in+neuronal+growth+cones.">Bidirectional interactions between Nox2-type NADPH oxidase and the F-actin cytoskeleton in neuronal growth cones.</a> Journal of Neurochemistry. 130 (4), 526-540 (2014).</li><li>Kishida, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+plasticity+deficits+and+mild+memory+impairments+in+mouse+models+of+chronic+granulomatous+disease.">Synaptic plasticity deficits and mild memory impairments in mouse models of chronic granulomatous disease.</a> Molecular and Cellular Biology. 26 (15), 5908-5920 (2006).</li><li>Ravelli, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nox2-dependent+neuroinflammation+in+an+EAE+model+of+multiple+sclerosis.">Nox2-dependent neuroinflammation in an EAE model of multiple sclerosis.</a> Translational Neuroscience. 10 (1), 1-9 (2019).</li><li>Park, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nox2-derived+radicals+contribute+to+neurovascular+and+behavioral+dysfunction+in+mice+overexpressing+the+amyloid+precursor+protein.">Nox2-derived radicals contribute to neurovascular and behavioral dysfunction in mice overexpressing the amyloid precursor protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (4), 1347-1352 (2008).</li><li>Schiavone, S., Neri, M., Trabace, L., Turillazzi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NADPH+oxidase+NOX2+mediates+loss+of+parvalbumin+interneurons+in+traumatic+brain+injury:+Human+autoptic+immunohistochemical+evidence.">The NADPH oxidase NOX2 mediates loss of parvalbumin interneurons in traumatic brain injury: Human autoptic immunohistochemical evidence.</a> Scientific Reports. 7 (1), 8752 (2017).</li><li>Gutscher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity-based+protein+thiol+oxidation+by+H2O2-scavenging+peroxidases.">Proximity-based protein thiol oxidation by H2O2-scavenging peroxidases.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (46), 31532-31540 (2009).</li><li>Bilan, D. S., Belousov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+redox+biology:+from+imaging+to+manipulation.">New tools for redox biology: from imaging to manipulation.</a> Free Radical Biology and Medicine. 109, 167-188 (2016).</li><li>Abu-Siniyeh, A., Al-Zyoud, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highlights+on+selected+microscopy+techniques+to+study+zebrafish+developmental+biology.">Highlights on selected microscopy techniques to study zebrafish developmental biology.</a> Laboratory Animal Research. 36 (1), 12 (2020).</li><li>Sassen, W. A., Koster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+toolbox+for+genetic+manipulation+of+zebrafish.">A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish.</a> Advances in Genomics and Genetics. 5, 151-163 (2015).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).</li><li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regular+care+and+maintenance+of+a+Zebrafish+(Danio+rerio)+laboratory:+An+introduction.">Regular care and maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+neuron+culture+for+nerve+growth+and+axon+guidance+studies+in+Zebrafish+(Danio+rerio).">Primary neuron culture for nerve growth and axon guidance studies in Zebrafish (Danio rerio).</a> PLoS One. 8 (3), 57539 (2013).</li><li>Zhang, L., Leung, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdissection+of+zebrafish+embryonic+eye+tissues.">Microdissection of zebrafish embryonic eye tissues.</a> Journal of Visualized Experiments. (40), e2028 (2010).</li><li>Suter, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+of+neuronal+growth+cone+motility+and+duidance+in+vitro.">Live cell imaging of neuronal growth cone motility and duidance in vitro.</a> Cell Migration: Methods in Molecular Biology. , 65-86 (2011).</li><li>Weaver, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=nox2/cybb+deficiency+affects+zebrafish+retinotectal+connectivity.">nox2/cybb deficiency affects zebrafish retinotectal connectivity.</a> Journal of Neuroscience. 38 (26), 5854-5871 (2018).</li><li>Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+EGSH+and+H2O2+with+roGFP2-based+redox+probes.">Measuring EGSH and H2O2 with roGFP2-based redox probes.</a> Free Radical Biology and Medicine. 51, 1943-1951 (2011).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenylthiourea+specifically+reduces+zebrafish+eye+size.">Phenylthiourea specifically reduces zebrafish eye size.</a> PLoS One. 7 (6), 40132 (2012).</li><li>Ermakova, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+fluorescent+genetically+encoded+indicator+for+intracellular+hydrogen+peroxide.">Red fluorescent genetically encoded indicator for intracellular hydrogen peroxide.</a> Nature Communications. 5, 5222 (2014).</li><li>Oparka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+ROS+levels+using+CM-H2DCFDA+and+HyPer.">Quantifying ROS levels using CM-H2DCFDA and HyPer.</a> Methods. 109, 3-11 (2016).</li><li>Dickinson, B. C., Peltier, J., Stone, D., Schaffer, D. V., Chang, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nox2+redox+signaling+maintains+essential+cell+populations+in+the+brain.">Nox2 redox signaling maintains essential cell populations in the brain.</a> Nature Chemical Biology. 7 (2), 106-112 (2011).</li><li>Cannon, M. B., Remington, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox-sensitive+green+fluorescent+protein:+Probes+for+dynamic+intracellular+redox+responses.+A+review.">Redox-sensitive green fluorescent protein: Probes for dynamic intracellular redox responses. A review.</a> Methods in Molecular Biology. 476, 51-65 (2009).</li><li>Meyer, A. J., Dick, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein-based+redox+probes.">Fluorescent protein-based redox probes.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 13 (5), 621-650 (2010).</li><li>Panieri, E., Millia, C., Santoro, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+quantification+of+subcellular+H2O2+and+glutathione+redox+potential+in+living+cardiovascular+tissues.">Real-time quantification of subcellular H2O2 and glutathione redox potential in living cardiovascular tissues.</a> Free Radical Biology and Medicine. 109, 189-200 (2017).</li><li>Breus, O., Dickmeis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+thiol+redox-sensors+in+the+zebrafish+model:+Lessons+for+embryonic+development+and+regeneration.">Genetically encoded thiol redox-sensors in the zebrafish model: Lessons for embryonic development and regeneration.</a> Biological Chemistry. , (2020).</li><li>Morgan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+basal+H2O2+levels+with+peroxiredoxin-based+probes.">Real-time monitoring of basal H2O2 levels with peroxiredoxin-based probes.</a> Nature Chemical Biology. 12 (6), 437-443 (2016).</li><li>Terzi, A., Roeder, H., Weaver, C. J., Suter, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+NADPH+oxidase+2+regulates+growth+cone+guidance+downstream+of+slit2/robo2.">Neuronal NADPH oxidase 2 regulates growth cone guidance downstream of slit2/robo2.</a> Developmental Neurobiology. , (2020).</li><li>Bilan, D. S., Belousov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HyPer+family+probes:+State+of+the+art.">HyPer family probes: State of the art.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 24 (13), 731-751 (2016).</li><li>Ermankova, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SypHer3s:+a+genetically+encoded+fluorescent+ratiometric+probe+with+enhanced+brightness+and+an+improved+dynamic+range.">SypHer3s: a genetically encoded fluorescent ratiometric probe with enhanced brightness and an improved dynamic range.</a> Chemistry Communications. 54 (23), 2898-2901 (2018).</li><li>Pak, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+genetically+encoded+indicator+for+hydrogen+peroxide+identifies+roles+for+the+oxidant+in+cell+migration+and+mitochondrial+function.">Ultrasensitive genetically encoded indicator for hydrogen peroxide identifies roles for the oxidant in cell migration and mitochondrial function.</a> Cell Metabolism. 31 (3), 642-653 (2020).</li><li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tol2kit:+A+multisite+gateway-based+construction+Kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs.">The Tol2kit: A multisite gateway-based construction Kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).</li></ol>

هناك العديد من الخطوات الحاسمة التي تحتاج إلى الاهتمام في جميع أنحاء هذا البروتوكول. ونعتقد أن النظر في هذه النقاط سيحسن التدفق التجريبي. بالنسبة لثقافة RGC الأولية ، فإن عقم ZFCM (-) مهم جدا ، نظرا لأن هذه الوسائط الثقافية لا تحتوي على المضادات الحيوية ويمكن أن يحدث التلوث قبل أو أثناء التصوير...

أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) الإشارات ينظم تطوير وأداء الجهاز العصبي1. مصدر ROS الخلوية الهامة هي NADPH oxidases (NOX)، والتي هي بروتينات ترانسميمبرين توليد سوبر أكسيد وبيروكسيد الهيدروجين (H2O2)2. توجد إنزيمات NOX في جميع أنحاء الجهاز العصبي المركزي (CNS) ، ويساهم ROS المشتقة من NOX في تطوير الخلايا العصبية3و4و5و6. وقد ثبت صيانة وتمايز الخلايا الجذعية العصبية، وإنشاء قطبية الخلايا العصبية، و نمو نيوريت، و اللدونة متشابك تتطلب مستويات كافية من ROS7،8،9،10،11. من ناحية أخرى، إنتاج غير المنضبط من ROS بواسطة NOXes تسهم في الاضطرابات العصبية بما في ذلك مرض الزهايمر، والتصلب المتعدد، وإصابات الدماغالرضية 12،13،14. وبالتالي، فإن إنتاج ROS ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية أمر بالغ الأهمية للحفاظ على ظروف صحية.
وقد سهل تطوير أجهزة الاستشعار البيولوجية المشفرة وراثيا الكشف عن ال ROS الخلوية بشكل كبير. ومن المزايا الهامة لأجهزة الاستشعار البيولوجية المشفرة وراثيا زيادة الاستبانة الزمنية والمكانية لإشارة ROS، حيث يمكن استهداف أجهزة الاستشعار هذه على وجه التحديد إلى مواقع متميزة. GFP الحساسة للأكسدة (roGFP) هو نوع واحد من هذه أجهزة الاستشعار الحيوية ROS. البديل roGFP2-Orp1 يكشف على وجه التحديد H2O2 من خلال مجالها Orp1، وهو بروتين الأسرة بيروكسيريدوكسيني الجلوتاثيون من الخميرة15،16. يتم نقل أكسدة البروتين Orp1 إلى roGFP2 لتغيير تشكيله (الشكل 1A). ويعرض المسبار قمتين للإثارة بالقرب من 405 نانومتر و480 نانومتر، وذروة انبعاث واحدة عند 515 نانومتر. عند الأكسدة ، تتغير كثافة الفلورسينس حول قمم الإثارة: في حين يزيد الإثارة 405 نانومتر ، ينخفض 480 نانومتر من الإثارة. وهكذا، roGFP2-Orp1 هو حساس حيوي نسبة، ويتم الكشف عن H2O2-levels بنسبة كثافة الفلورية متحمس في أطوال موجية مختلفة اثنين(الشكل 1B). عموما، roGFP2-Orp1 هو أداة متعددة الاستخدامات للتصوير ROS التي يمكن استخدامها بكفاءة في الجسم الحي.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62165/62165fig01.jpg"> الشكل 1: التمثيل التخطيطي وأطياف الإثارة من roGFP2-Orp1. (A) نقل الأكسدة يحدث بين Orp1 و roGFP2 ردا على H2O2, مما يؤدي إلى تغييرات تشكيلية في roGFP2. (ب) تعرض أطياف الإثارة من roGFP2-Orp1 قمتين للإثارة عند 405 نانومتر و480 نانومتر وذروة انبعاث واحدة عند 515 نانومتر. عند الأكسدة بواسطة H2O2، يزيد الإثارة 405 نانومتر في حين ينخفض 480 نانومتر من الإثارة. ينتج عن ذلك قراءات معدلية لوجود H2O2. تم تعديل الرقم من بيلان وبيلوسوف (2017)16 ومورغان وآخرين (2011)25. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62165/62165fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
نظام نموذج دانيو ريو (حمار وحشي) له العديد من المزايا لتطبيق أجهزة الاستشعار البيولوجية المشفرة وراثيا. الشفافية البصرية للأجنة واليرقات تمكن التصوير غير الغازي في الجسم الحي. ويجري تطوير أدوات التصوير الجديدة لتحقيق دقة أعلى وأعمق اختراق17. وعلاوة على ذلك، هناك أدوات راسخة للتلاعب الجيني (التعبير ميرنا خارج الرحم، Tol2 transgenesis، الخ) وتحرير الجينوم (TALENs، CRISPR/Cas9، الخ)، الذي يعزز جيل الحيوانات المعدلةوراثيا 18. كما تتطور أجنة حمار وحشي خارج الأم، وهذا النظام يسمح كذلك سهولة الوصول والتلاعب في الأجنة. على سبيل المثال، يمكن بسهولة حقن المرحلة من خلية واحدة والعلاجات الدوائية.
هنا، استخدمنا حمار وحشي للتعبير عن عابر H2O2-محددة الاستشعار الحيوي roGFP2-Orp1 عن طريق حقن في الحمض النووي الريبي المختبرة المنسوخة. ويمكن استخدام هذه الأجنة في كل من التصوير المختبري للخلايا العصبية المستزرعة والتصوير في الجسم الحي (الشكل 2). نحن نصف بروتوكولا لتشريح وصفيح خلايا العقدة الشبكية (RGCs) من أجنة حمار وحشي يليه تقييم H2O2-levels في الخلايا العصبية المستزرعة. ثم نقدم طريقة للتصوير الحي للأجنة واليرقات المعبرة عن roGFP2-Orp1 باستخدام المجهر البؤري. هذا النهج لا يسمح فقط لتحديد الفسيولوجية H2O2-مستويات ولكن أيضا التغيرات المحتملة التي تحدث في مراحل النمو المختلفة أو الظروف. بشكل عام، يوفر هذا النظام طريقة موثوقة للكشف عن H2O2 في الخلايا الحية والحيوانات لدراسة دور H2O2 في التنمية والصحة والمرض.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62165/62165fig03.jpg"> الشكل 2. الخطوط العريضة للنهج التجريبي. لفترة وجيزة، بعد جمع الأجنة، يتم حقن roGFP2-Orp1 مرنا في صفار من خلية واحدة مرحلة أجنة حمار وحشي. يمكن استخدام الأجنة النامية لكل من (أ) في المختبر و (ب) في التصوير الحي. (أ)تستخدم الأجنة الإيجابية GFP لتشريح شبكية العين لجمع RGC في 34 hpf. لوحات RGCs المفككة على أغطية مغلفة ب PDL/laminin في وسائط ZFCM (+). يمكن إجراء تصوير مخروط النمو حيث تقوم RGCs بتوسيع محاورها المحورية بعد 6-24 ساعة من الطلاء. يمكن أن تخضع الخلايا لعلاجات مختلفة لقياس التغيرات المحتملة في H2O2-levels. هنا، قمنا بقياس H2O2-مستويات في المخاريط نمو RGCs (الأحمر). (ب)تستخدم الأجنة الإيجابية GFP للتصوير في الجسم الحي. في العمر المطلوب، يمكن تخدير الأجنة وتركيبها على أطباق قاع زجاجية مقاس 35 ملم للتصوير البؤري. هنا، يتم تركيب الأجنة بطنية لتصوير الشبكية. التخطيطي يظهر تطور الشبكية في حمار وحشي. تشكل RGCs طبقة خلايا العقدة (GCL) ، وهي الطبقة الأعمق في شبكية العين. محاور RGC تتطور إلى العصب البصري لعبور خط الوسط، وتشكيل chiasm البصرية. ثم، محاور RGC تنمو ظهريا لجعل نقاط الاشتباك العصبي في استئصال البصرية في الدماغ المتوسط. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62165/62165fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35-mm culture dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83-3900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm glass bottom dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP160-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillary Tubes</td>
			<td>Sutter/Fisher Scientific</td>
			<td>NC9029378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2850-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Petri Dishes (100 x 15 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>26140087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma Aldich</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection Mold</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>TU-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23017-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scanning Confocal Microscopy</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium with phenol red</td>
			<td>Gibco/Fisher Scientific</td>
			<td>11-415-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium without phenol red</td>
			<td>Gibco/Fisher Scientific</td>
			<td>21-083-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting agarose</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V2111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMessage mMachine SP6 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0189S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Hyclone/Fisher Scientific</td>
			<td>SH3025601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td>Sigma Aldich</td>
			<td>P0290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma Aldich</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic PicoPump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PV820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine (PDL)</td>
			<td>Sigma Aldich</td>
			<td>P7280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QiaQUICK PCR Purification Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse slit2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>5444-SL-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Sigma Aldich</td>
			<td>P5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steritop 0.22 &#181;m filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>S2GPT05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE Buffer</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine Methanesulfonate</td>
			<td>Sigma Aldich</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Pipette Puller</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>700C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ros live cell imaging during neuronal development

أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) هي جزيئات إشارات راسخة ، وهي مهمة في التطور الطبيعي ، وداء التوازن ، وعلم وظائف الأعضاء. من بين ROS مختلفة، بيروكسيد الهيدروجين (H2O2)يتميز أفضل فيما يتعلق بأدوار في الإشارات الخلوية. وقد تورط H2O2 خلال التنمية في عدة أنواع. فعلى سبيل المثال، تم الكشف عن زيادة عابرة في H2O2 في أجنة حمار وحشي خلال الأيام الأولى بعد الإخصاب. وعلاوة على ذلك، استنزاف مصدر الخلوية الهامة H2O2، NADPH oxidase (NOX)، يضعف تطور الجهاز العصبي مثل التمايز، والنمو المحوري، والتوجيه من خلايا العقدة الشبكية (RGCs) على حد سواء في الجسم الحي وفي المختبر. هنا ، نصف طريقة لتصوير مستويات H2O2 داخل الخلايا في الخلايا العصبية المستزرعة حمار وحشي ويرقات كاملة أثناء التطوير باستخدام جهاز الاستشعار الحيوي H2O2المشفر وراثيا ، roGFP2-Orp1. يمكن التعبير عن هذا المسبار بشكل عابر أو ثابت في يرقات حمار وحشي. وعلاوة على ذلك، يقلل قراءات قياس النسب من احتمال اكتشاف القطع الأثرية بسبب التعبير الجيني التفاضلي أو آثار الحجم. أولا، نحن نظهر كيفية عزل وزراعة RGCs المستمدة من أجنة حمار وحشي التي تعبر عن عابر roGFP2-Orp1. ثم نستخدم يرقات كاملة لمراقبة مستويات H2O2 على مستوى الأنسجة. وقد تم التحقق من صحة جهاز الاستشعار بإضافة H2O2. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام هذه المنهجية لقياس مستويات H2O2 في أنواع خلايا وأنسجة محددة عن طريق توليد معدلة وراثيا مع تعبير حساس حيوي خاص بالأنسجة. وبما أن سمك الحمار الوحشي يسهل التلاعب الجيني والتنموي، فإن النهج الذي يظهر هنا يمكن أن يكون بمثابة خط أنابيب لاختبار دور H2O2 أثناء التطور العصبي والجنيني العام في الفقاريات.

RGCs حمار وحشي مثقف تمديد محاور في غضون 1D. صورة نسبة 405/480 ممثل H2O2-الاستشعار الحيوي هو مبين في الشكل 4A. جسم الخلية، محور عصبي، ومخاريط النمو مرئية بوضوح في الخلايا العصبية الفردية. يمكن أن تخضع هذه الخلايا العصبية لعلاجات مختلفة مع مرور الوقت لمراقبة H2O2 ...

Watch this Scientific Journal Video about ROS Live Cell Imaging During Neuronal Development at JoVE.com

ROS Live Cell Imaging During Neuronal Development

يصف هذا البروتوكول استخدام بيروكسيد الهيدروجين المشفر وراثيا (H2O2)- الاستشعار الحيوي في الخلايا العصبية ويرقات سمك الحمار الوحشي المستزرعة لتقييم أدوار الإشارات الفسيولوجية ل H2O2 أثناء تطور الجهاز العصبي. ويمكن تطبيقه على أنواع مختلفة من الخلايا وتعديلها مع العلاجات التجريبية لدراسة أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) في التنمية العامة.

ROS تصوير الخلايا الحية أثناء تطوير الخلايا العصبية

Reactive oxygen species (ROS) are well-established signaling molecules, which are important in normal development, homeostasis, and physiology. Among the ...

يصف بروتوكولنا استخدام جهاز استشعار حيوي لبيروكسيد الهيدروجين في الخلايا العصبية واليرقات المستزرعة لسمك الحمار الوحشي. سيساعد هذا البروتوكول الباحثين على تشريح دور أنواع الأكسجين التفاعلية في علم وظائف الأعضاء الطبيعي والفيزيولوجيا المرضية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي الكشف في الوقت الحقيقي عن بيروكسيد الهيدروجين في الحيوانات الحية والخلايا المستزرعة.يمكن تطبيق هذه الطريقة على الحيوانات الأخرى ، مثل نظام نموذج القوارض. لإعداد الأغطية، استخدم الأغطية المطهرة بالأحماض المخزنة في الإيثانول بنسبة 100٪. استخدام ملقط لإزالة غطاء واحد من حاوية التخزين، واللهب لإزالة الإيثانول المتبقية.الهواء يجفف الغطاء تماما عن طريق وضعه في زاوية داخل طبق ثقافة 35 ملليمتر. إعداد Poly-D-Lysine أو PDL أو حل العمل. تطبيق PDL إلى مركز كل غطاء، وتجنب انتشار الحل إلى حواف واحتضان PDL لمدة 20 إلى 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.تأكد من أن PDL لا تجف. غسل PDL مع 0.5 ملليلتر من الماء العقيم والسماح للوحات تجف تماما. إعداد حل عمل صفمين.وتطبيقه على وسط كل coverslip، مع التأكد من تجنب انتشار الحل إلى الحواف. احتضان لوحات في 37 درجة مئوية في حاضنة مرطب لمدة ساعتين إلى ست ساعات، وتجنب تجفيف محلول صفح. لإجراء تشريح الجنين في خلايا العقدة الشبكية لوحة أو RGCs، وإعداد وتسمية أربعة أطباق زراعة الأنسجة 35 ملليمتر وملئها مع أربعة ملليلتر من الإيثانول 70٪.E2 وسائل الإعلام واحد. E2 وسائل الإعلام اثنين. و E2 وسائل الإعلام ثلاثة، في يوم تشريح.احتفظ بالأطباق في الثلاجة. عندما تكون أجنة حمار وحشي بعد 34 ساعة من الإخصاب ، خذ أطباق الثقافة المغلفة باللحنين من الحاضنة. وغسل الغطاء ينزلق ثلاث مرات مع 0.5 ملليلتر من برنامج تلفزيوني 1X.بعد الغسيل النهائي، أضف أربعة ملليلترات من وسائط ZFCM+إلى كل طبق ثقافة. تجنب تجفيف اللوحة. استرداد أطباق الثقافة المبردة المعدة والسماح لهم التوازن إلى درجة حرارة الغرفة.املأ أربعة إلى ستة أنابيب PCR مع 15 ميكرولتر من وسائط ZFCM+. استرجع أجنة حمار وحشي من الحاضنة وانغمس في أجنة في طبق زراعة أنسجة 35 ملليمتر يحتوي على 70٪ إيثانول لمدة 5-10 ثوان لتعقيمه. باستخدام نقل ماصة، نقل الأجنة إلى وسائل الإعلام E2 طبق واحد، تحتوي على وسائل الإعلام E2 عقيمة لغسل الإيثانول الزائد.ثم، نقل الأجنة إلى وسائل الإعلام E2 طبقين وإزالة المشيمات مع ملقط حاد. وأخيرا، نقل الأجنة إلى وسائل الإعلام E2 ثلاثة طبق لإجراء تشريح. باستخدام زوج من ملقط غرامة، ووضع وعقد الأجنة الأمامية إلى صفار مع واحدة من ملقط.وإزالة الذيل الخلفي إلى كيس صفار مع ملقط أخرى. الاستيلاء على الرقبة مع ملقط وخلع الرأس لفضح الدماغ والعينين لوسائل الإعلام E2. مع غيض من ملقط غرامة، لفة بلطف العينين من الرأس في حين عقد الأنسجة الجمجمة إلى أسفل مع ملقط الثاني.نقل أربع عيون إلى واحد من الأنابيب التي أعدت سابقا تحتوي على ZFCM + triturate بلطف صعودا وهبوطا مع ماصة P20 حوالي 45 مرة لتفكك الخلايا. نقل ZFCM + مع الخلايا المفككة إلى مركز الأغطية. الحفاظ على الثقافات على أعلى مقاعد البدلاء في 22 درجة مئوية على رف رغوة البوليسترين لامتصاص الاهتزازات.في يوم التصوير، تحقق من الخلايا تحت المجهر للتحقق من نمو محاور RGC. لتصوير الخلايا الحية، نقل الأغطية من طبق الثقافة إلى غرفة تصوير الخلايا الحية. استخدم مجهر مقلوب مجهزا بمرشح أحمر OG-590 Longpass الهدف من DIC وكاميرا EMCCD.قبل التصوير، استبدل جهاز ZFCM+medium ب ZFCM-After لتحديد موضع الخلايا بهدف 10X، والحصول على صور عند تكبير 60X باستخدام هدف غمر الزيت. استخدم تكبير إضافي 1.5X. أولا الحصول على الصور DIC.ثم، صورة roGFP2-Orp1، وذلك باستخدام مجموعة مرشح المناسبة. بعد التقاط المجموعة الأولى من الصور، تبادل الوسائط مع الوسائط التي تحتوي على حلول علاج مختلفة. يجب تغيير الوسائط كل 30 دقيقة من التصوير لتجنب تغيرات الحموضة والأوسمولارية.للتصوير في الجسم الحي، احتفظ بالأجنة بعد الإخصاب على مدار 22 إلى 24 ساعة في وسائط E3، التي تحتوي على 0.003٪ من فينيل ثيوريا بدون أزرق الميثيلين. تبادل وسائل الإعلام وإزالة الأجنة الميتة يوميا. في العمر المطلوب، تخدير وتركيب الأجنة في 1٪ agarose على 35 ملليمتر الزجاج أسفل أطباق الثقافة.يمكن توجيه الأجنة بشكل ظهري أو بطني أو أفقي، اعتمادا على المنطقة ذات الاهتمام للتصوير. بعد agarose الصلبة، وملء الأطباق مع وسائل الإعلام E3 دون الأزرق الميثيلين، ولكن مع 0.016٪ tricaine. إعداد المجهر للتصوير.استخدم مجهرا ضوئيا مقلوبا بالليزر لتصوير الأجنة المثبتة في الجزء السفلي من قطرة الآغاروز. تثير roGFP2-Orp1، والحصول على الصور المقابلة مع مرشحات الانبعاثات المطلوبة. الحصول على مداخن ض مع سمك مقطع متر صغير خمسة من خلال الجزء المطلوب من الأجنة.بعد التصوير، قم بإزالة الأجنة من أغاروز مع ملقط ناعم وإبقائها في الحاضنة والوسائط الزرقاء الخالية من الميثيلين مع فينيل ثيوريا حتى العمر المطلوب. تظهر هنا صورة تمثيلية للمسان الحيوي لبيروكسيد الهيدروجين والمبروكس الممتد لسمك الحمار الوحشي المستزرع RGC. جسم الخلية، محور عصبي، ومخاريط النمو مرئية بوضوح في الخلايا العصبية الفردية.إضافة بيروكسيد الهيدروجين إلى وسائل الإعلام الثقافة يزيد من قيم النسبة، مما يدل على أنه يمكن الكشف عن التغيرات في الوقت الحقيقي مع هذا النظام. يظهر القياس الكمي لمستويات بيروكسيد الهيدروجين في لوحة B.To تحديد مستويات بيروكسيد الهيدروجين في أجنة حمار وحشي كاملة ، تم حقن الحمض النووي الريبي خلال مرحلة الخلية الواحدة ، مما تسبب في تعبير جميع الأنسجة عن جهاز الاستشعار الحيوي roGFP2-Orp1. تظهر منطقة رأس يرقات حمار وحشي في نقطتين زمنيتين مختلفتين ، مع التركيز على مستويات بيروكسيد الهيدروجين في شبكية العين.تم قياس المستويات القاعدية لبيروكسيد الهيدروجين في أجنة حمار وحشي في يومين بعد الإخصاب وخمسة أيام بعد الإخصاب. وفي اليومين التاليين للتخصيب، كانت قيم النسبة أقل بكثير مما كانت عليه في خمسة أيام بعد الإخصاب. وعلاوة على ذلك، أظهر كل مستوى مختلف من الزيادة في محتوى بيروكسيد الهيدروجين الشبكية.استخدام ملقط ناعم لإزالة العينين وتفكك لطيف للعيون مع ماصة هي الخطوات الأكثر أهمية في هذا الإجراء. يمكن أن يتبع هذا البروتوكول علاجات المخدرات للتحقيق في العوامل التي ينطوي عليها إشارة ROS.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

تعيش خلية التصوير الحسي للخلايا السليمة في الجهاز السلائف ذبابة الفاكهة شرانق

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

يعيش بين محاور التصوير الجذر الظهرية بعد بضع الجذور

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

عالية الدقة التصوير لايف من سلوك خلية في الظهارة العصبية النامية

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

فيفو السابقين التصوير لايف من الانقسامات الخلوية واحدة في الظهارة العصبية ماوس

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

التصوير حية من الانقسام في تطوير الجنينية الماوس اللحاء

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

الاستفادة المشتركة منهجيات لتحديد دور البلازما غشاء تسليم خلال أكسون التشعب والعصبية التشكل

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

تحليل الجذعية الصرف في الأعمدة والطبقات

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

في تصوير الكالسيوم فيفو خلايا الشعر الخط الجانبي في الزرد اليرقات

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

إعداد الكبار Drosophila melanogaster لتصوير الدماغ كله أثناء السلوك والمحفزات الاستجابات

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...