Name: ros live cell imaging during neuronal development
Uploaded: 2021-02-09T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about ROS Live Cell Imaging During Neuronal Development at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (Grant R01NS117701), National Science Foundation (Grant 1146944-IOS), Indiana Traumatic Spinal Cord and Brain Injury Research Fund (Grant 20000289), Purdue Research Foundation (Grant 209911) og kontoret for Executive Vice President for Research and Partnerships ved Purdue University (Grant 210362). Vi takker Dr. Cory J. Weaver og Haley Roeder for at etablere zebrafisk RGC kultur protokol. Vi takker Haley Roeder yderligere for at levere dataene i figur 4. Vi takker Leah Biasi og Kenny Nguyen for hjælpen med RGC-kulturen. Vi takker Gentry Lee for at redigere teksten. Vi takker Dr. Tobias Dick for at give roGFP2-Orp1 og Dr. Qing Deng for pCS2 + vektor, der indeholder roGFP2-Orp1. Figur 2 oprettes med Biorender.com.

Alle dyreforsøg blev etisk gennemgået og godkendt af Purdue Animal Care and Use Committee (PACUC) i henhold til NIH-retningslinjerne med protokollen 2006002050 godkendt den 24.7.2020.
1. Udarbejdelse af løsninger
<ol><li>E2-medier (1x)<ol>
<li>Forbered 100x E2A-løsninger (500 mL), 500x E2B (100 mL) og 500x E2C (100 mL) ved at kombinere alle komponenter, der er vist i tabel 1. Autoklave E2A-, E2B- og E2C-løsninger. Opbevares ved 4 °C.</li>
		<li>Til 1x E2-medier: Kombin...

<ol>
	<li>B&#243;rquez, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+role+of+redox+signaling+in+neuronal+development.">Dissecting the role of redox signaling in neuronal development.</a> Journal of Neurochemistry. 137 (4), 506-517 (2016).</li><li>Bedard, K., Krause, K. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NOX+family+of+ROS-generating+NADPH+oxidases:+Physiology+and+pathophysiology.">The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: Physiology and pathophysiology.</a> Physiological Reviews. 87 (1), 245-313 (2007).</li><li>Weaver, C. J., Leung, Y. F., Suter, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+dynamics+of+NADPH+oxidases+during+early+zebrafish+development.">Expression dynamics of NADPH oxidases during early zebrafish development.</a> Journal of Comparative Neurology. 524 (10), 2130-2141 (2016).</li><li>Terzi, A., Suter, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+NADPH+oxidases+in+neuronal+development.">The role of NADPH oxidases in neuronal development.</a> Free Radical Biology and Medicine. 154, 33-47 (2020).</li><li>Infanger, D. W., Sharma, R. V., Davisson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidases+of+the+brain:+Distribution,+regulation,+and+function.">NADPH oxidases of the brain: Distribution, regulation, and function.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 8 (9-10), 1583-1596 (2006).</li><li>Coyoy, A., Olguin-Albuerne, M., Martinez-Briseno, P., Moran, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+reactive+oxygen+species+and+NADPH-oxidase+in+the+development+of+rat+cerebellum.">Role of reactive oxygen species and NADPH-oxidase in the development of rat cerebellum.</a> Neurochemistry International. 62 (7), 998-1011 (2013).</li><li>Le Belle, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferative+neural+stem+cells+have+high+endogenous+ROS+levels+that+regulate+self-renewal+and+neurogenesis+in+a+PI3K/Akt-dependant+manner.">Proliferative neural stem cells have high endogenous ROS levels that regulate self-renewal and neurogenesis in a PI3K/Akt-dependant manner.</a> Cell Stem Cell. 8 (1), 59-71 (2011).</li><li>Nayernia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+neural+precursor+cell+pool+in+NADPH+oxidase+2-deficiency:+from+mouse+brain+to+neural+differentiation+of+patient+derived+iPSC.">Decreased neural precursor cell pool in NADPH oxidase 2-deficiency: from mouse brain to neural differentiation of patient derived iPSC.</a> Redox Biology. 13, 82-93 (2017).</li><li>Wilson, C., Nunez, M. T., Gonz&#225;lez-Billault, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+NADPH+oxidase+to+the+establishment+of+hippocampal+neuronal+polarity+in+culture.">Contribution of NADPH oxidase to the establishment of hippocampal neuronal polarity in culture.</a> Journal of Cell Science. 128 (16), 2989-2995 (2015).</li><li>Munnamalai, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+interactions+between+Nox2-type+NADPH+oxidase+and+the+F-actin+cytoskeleton+in+neuronal+growth+cones.">Bidirectional interactions between Nox2-type NADPH oxidase and the F-actin cytoskeleton in neuronal growth cones.</a> Journal of Neurochemistry. 130 (4), 526-540 (2014).</li><li>Kishida, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+plasticity+deficits+and+mild+memory+impairments+in+mouse+models+of+chronic+granulomatous+disease.">Synaptic plasticity deficits and mild memory impairments in mouse models of chronic granulomatous disease.</a> Molecular and Cellular Biology. 26 (15), 5908-5920 (2006).</li><li>Ravelli, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nox2-dependent+neuroinflammation+in+an+EAE+model+of+multiple+sclerosis.">Nox2-dependent neuroinflammation in an EAE model of multiple sclerosis.</a> Translational Neuroscience. 10 (1), 1-9 (2019).</li><li>Park, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nox2-derived+radicals+contribute+to+neurovascular+and+behavioral+dysfunction+in+mice+overexpressing+the+amyloid+precursor+protein.">Nox2-derived radicals contribute to neurovascular and behavioral dysfunction in mice overexpressing the amyloid precursor protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (4), 1347-1352 (2008).</li><li>Schiavone, S., Neri, M., Trabace, L., Turillazzi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NADPH+oxidase+NOX2+mediates+loss+of+parvalbumin+interneurons+in+traumatic+brain+injury:+Human+autoptic+immunohistochemical+evidence.">The NADPH oxidase NOX2 mediates loss of parvalbumin interneurons in traumatic brain injury: Human autoptic immunohistochemical evidence.</a> Scientific Reports. 7 (1), 8752 (2017).</li><li>Gutscher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity-based+protein+thiol+oxidation+by+H2O2-scavenging+peroxidases.">Proximity-based protein thiol oxidation by H2O2-scavenging peroxidases.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (46), 31532-31540 (2009).</li><li>Bilan, D. S., Belousov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+redox+biology:+from+imaging+to+manipulation.">New tools for redox biology: from imaging to manipulation.</a> Free Radical Biology and Medicine. 109, 167-188 (2016).</li><li>Abu-Siniyeh, A., Al-Zyoud, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highlights+on+selected+microscopy+techniques+to+study+zebrafish+developmental+biology.">Highlights on selected microscopy techniques to study zebrafish developmental biology.</a> Laboratory Animal Research. 36 (1), 12 (2020).</li><li>Sassen, W. A., Koster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+toolbox+for+genetic+manipulation+of+zebrafish.">A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish.</a> Advances in Genomics and Genetics. 5, 151-163 (2015).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).</li><li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regular+care+and+maintenance+of+a+Zebrafish+(Danio+rerio)+laboratory:+An+introduction.">Regular care and maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+neuron+culture+for+nerve+growth+and+axon+guidance+studies+in+Zebrafish+(Danio+rerio).">Primary neuron culture for nerve growth and axon guidance studies in Zebrafish (Danio rerio).</a> PLoS One. 8 (3), 57539 (2013).</li><li>Zhang, L., Leung, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdissection+of+zebrafish+embryonic+eye+tissues.">Microdissection of zebrafish embryonic eye tissues.</a> Journal of Visualized Experiments. (40), e2028 (2010).</li><li>Suter, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+of+neuronal+growth+cone+motility+and+duidance+in+vitro.">Live cell imaging of neuronal growth cone motility and duidance in vitro.</a> Cell Migration: Methods in Molecular Biology. , 65-86 (2011).</li><li>Weaver, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=nox2/cybb+deficiency+affects+zebrafish+retinotectal+connectivity.">nox2/cybb deficiency affects zebrafish retinotectal connectivity.</a> Journal of Neuroscience. 38 (26), 5854-5871 (2018).</li><li>Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+EGSH+and+H2O2+with+roGFP2-based+redox+probes.">Measuring EGSH and H2O2 with roGFP2-based redox probes.</a> Free Radical Biology and Medicine. 51, 1943-1951 (2011).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenylthiourea+specifically+reduces+zebrafish+eye+size.">Phenylthiourea specifically reduces zebrafish eye size.</a> PLoS One. 7 (6), 40132 (2012).</li><li>Ermakova, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+fluorescent+genetically+encoded+indicator+for+intracellular+hydrogen+peroxide.">Red fluorescent genetically encoded indicator for intracellular hydrogen peroxide.</a> Nature Communications. 5, 5222 (2014).</li><li>Oparka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+ROS+levels+using+CM-H2DCFDA+and+HyPer.">Quantifying ROS levels using CM-H2DCFDA and HyPer.</a> Methods. 109, 3-11 (2016).</li><li>Dickinson, B. C., Peltier, J., Stone, D., Schaffer, D. V., Chang, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nox2+redox+signaling+maintains+essential+cell+populations+in+the+brain.">Nox2 redox signaling maintains essential cell populations in the brain.</a> Nature Chemical Biology. 7 (2), 106-112 (2011).</li><li>Cannon, M. B., Remington, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox-sensitive+green+fluorescent+protein:+Probes+for+dynamic+intracellular+redox+responses.+A+review.">Redox-sensitive green fluorescent protein: Probes for dynamic intracellular redox responses. A review.</a> Methods in Molecular Biology. 476, 51-65 (2009).</li><li>Meyer, A. J., Dick, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein-based+redox+probes.">Fluorescent protein-based redox probes.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 13 (5), 621-650 (2010).</li><li>Panieri, E., Millia, C., Santoro, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+quantification+of+subcellular+H2O2+and+glutathione+redox+potential+in+living+cardiovascular+tissues.">Real-time quantification of subcellular H2O2 and glutathione redox potential in living cardiovascular tissues.</a> Free Radical Biology and Medicine. 109, 189-200 (2017).</li><li>Breus, O., Dickmeis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+thiol+redox-sensors+in+the+zebrafish+model:+Lessons+for+embryonic+development+and+regeneration.">Genetically encoded thiol redox-sensors in the zebrafish model: Lessons for embryonic development and regeneration.</a> Biological Chemistry. , (2020).</li><li>Morgan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+basal+H2O2+levels+with+peroxiredoxin-based+probes.">Real-time monitoring of basal H2O2 levels with peroxiredoxin-based probes.</a> Nature Chemical Biology. 12 (6), 437-443 (2016).</li><li>Terzi, A., Roeder, H., Weaver, C. J., Suter, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+NADPH+oxidase+2+regulates+growth+cone+guidance+downstream+of+slit2/robo2.">Neuronal NADPH oxidase 2 regulates growth cone guidance downstream of slit2/robo2.</a> Developmental Neurobiology. , (2020).</li><li>Bilan, D. S., Belousov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HyPer+family+probes:+State+of+the+art.">HyPer family probes: State of the art.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 24 (13), 731-751 (2016).</li><li>Ermankova, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SypHer3s:+a+genetically+encoded+fluorescent+ratiometric+probe+with+enhanced+brightness+and+an+improved+dynamic+range.">SypHer3s: a genetically encoded fluorescent ratiometric probe with enhanced brightness and an improved dynamic range.</a> Chemistry Communications. 54 (23), 2898-2901 (2018).</li><li>Pak, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+genetically+encoded+indicator+for+hydrogen+peroxide+identifies+roles+for+the+oxidant+in+cell+migration+and+mitochondrial+function.">Ultrasensitive genetically encoded indicator for hydrogen peroxide identifies roles for the oxidant in cell migration and mitochondrial function.</a> Cell Metabolism. 31 (3), 642-653 (2020).</li><li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tol2kit:+A+multisite+gateway-based+construction+Kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs.">The Tol2kit: A multisite gateway-based construction Kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).</li></ol>

Der er flere kritiske trin, der kræver opmærksomhed i hele denne protokol. Vi mener, at overvejer disse punkter vil forbedre den eksperimentelle flow. For primær RGC-kultur er steriliteten af ZFCM(-) meget vigtig, da dette kulturmedie ikke indeholder antibiotika, og forurening kan forekomme før eller under billeddannelse. For at undgå det anbefaler vi kun at forberede og bruge ZFCM(-) inde i et biosikkerhedsskab og regelmæssigt lave friske ZFCM(-) medier (trin 1.5). Desuden bør lamininbestandene holdes på -80 °C...

Reaktive iltarter (ROS) signalering regulerer udviklingen og funktionen af nervesystemet1. En vigtig cellulær ROS-kilde er NADPH-oxider (NOX), som er transmembranproteiner, der genererer superoxid og hydrogenperoxid (H2O2)2. NOX enzymer findes i hele centralnervesystemet (CNS), og NOX-afledt ROS bidrager til neuronal udvikling3,4,5,6. Vedligeholdelse og differentiering af neurale stamceller, etablering af neuronal polaritet, neuritvækst og synaptisk plasticitet har vist sig at kræve passende niveauer af ROS7,8,9,10,11. På den anden side bidrager ukontrolleret produktion af ROS af NOX'er til neurodegenerative lidelser, herunder Alzheimers sygdom, multipel sklerose og traumatisk hjerneskade12,13,14. Derfor er produktion af fysiologisk relevant ROS afgørende for at opretholde sunde forhold.
Udvikling af genetisk kodede biosensorer lettede detektionen af cellulær ROS meget. En vigtig fordel ved genetisk kodede biosensorer er den øgede tidsmæssige og rumlige opløsning af ROS-signalet, da disse sensorer specifikt kan målrettes mod forskellige steder. Redox-følsomme GFP (roGFP) er en type af sådanne ROS biosensorer. Den roGFP2-Orp1 variant specifikt registrerer H2O2 gennem sin Orp1 domæne, som er en glutathion peroxiredoxin familie protein fra gær15,16. Oxidationen af Orp1-proteinet overføres til roGFP2 for at ændre dets kropsbygning (Figur 1A). Sonden udviser to excitation toppe nær 405 nm og 480 nm, og en enkelt emission peak på 515 nm. Ved oxidation ændres fluorescensintensiteten omkring excitationstoppene: mens 405 nm excitation øges, falder 480 nm excitation. RoGFP2-Orp1 er således en ratiometrisk biosensor, og H2O2-niveaueropdages ved forholdet mellem fluorescensintensiteter, der er ophidset ved to forskellige bølgelængder (figur 1B). Samlet set roGFP2-Orp1 er et alsidigt værktøj til ROS billedbehandling, der kan udnyttes effektivt in vivo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62165/62165fig01.jpg"> Figur 1: Skematisk repræsentation og excitationsspektre af roGFP2-Orp1. (A) Oxidantoverførsel finder sted mellem Orp1 og roGFP2 som svar på H2O2, hvilket fører til konformationsmæssige ændringer i roGFP2. (B) Den excitation spektre af roGFP2-Orp1 udviser to excitation toppe på 405 nm og 480 nm og enkelt emission peak på 515 nm. Ved oxidation med H2O2øges 405 nm excitationen, mens 480 nm excitation falder. Dette resulterer i en ratiometrisk udlæsning for H2O2 tilstedeværelse. Tallet er blevet ændret fra Bilan og Belousov (2017)16 og Morgan et al. (2011)25. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62165/62165fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Danio rerio (zebrafisk) modelsystemet har flere fordele ved at anvende genetisk kodede biosensorer. Den optiske gennemsigtighed af embryoner og larver muliggør ikke-invasiv in vivo-billeddannelse. Der udvikles nye billedbehandlingsværktøjer for at opnå højere opløsning og dybere gennemtrængning17. Desuden findes der etablerede værktøjer til genmanipulation (ektopisk mRNA-ekspression, Tol2-transgenese osv.) og genomredigering (TALEN'er, CRISPR/Cas9 osv.), som fremmer generering af transgene dyr18. Efterhånden som zebrafiskembryoner udvikler sig uden for moderen, giver dette system yderligere lettere adgang til og manipulation af embryonerne. For eksempel kan en-celle fase injektioner og medicinske behandlinger nemt gøres.
Her brugte vi zebrafisk til forbigående at udtrykke H2O2-specifikbiosensor roGFP2-Orp1 ved at injicere in vitro-transskriberet mRNA. Disse embryoner kan anvendes til både in vitro-billeddannelse af dyrkede neuroner og in vivo-billeddannelse (figur 2). Vi beskriver en protokol til dissekering og plating nethinde ganglion celler (RGCs) fra zebrafisk embryoner efterfulgt af en vurdering H2O2-niveaueri dyrkede neuroner. Derefter præsenterer vi en metode til in vivo-billeddannelse af roGFP2-Orp1-udtrykkende embryoner og larver ved hjælp af konfokal mikroskopi. Denne tilgang gør det ikke kun muligt at bestemme fysiologiske H2O2-niveauer,men også potentielle ændringer, der forekommer i forskellige udviklingsstadier eller forhold. Samlet set giver dette system en pålidelig metode til påvisning af H2O2 i levende celler og dyr til at studere H 2 O2'srolle inden for udvikling, sundhed og sygdom.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62165/62165fig03.jpg"> Figur 2. Oversigt over den eksperimentelle tilgang. Kort efter embryonindsamling injiceres roGFP2-Orp1 mRNA i æggeblommen på zebrafiskembryoner i en cellefase. Udvikling af embryoner kan anvendes til både (A) in vitro og (B) in vivo billeddannelse. (A) GFP-positive embryoner anvendes til dissekere nethinder til RGC-indsamling ved 34 hkf. Dissociated RGCs er belagt på PDL/laminin-coated coverslips i ZFCM (+) medier. Vækst kegle billeddannelse kan udføres som RGCs udvide deres axoner efter 6-24 timer af plating. Celler kan udsættes for forskellige behandlinger for at måle de potentielle ændringer i H2O2-niveauer. Her målte vi H2O2-niveauer i vækstkeglerne på RDC'er (rød). (B) GFP-positive embryoner anvendes til in vivo-billeddannelse. I den ønskede alder kan embryoner bedøves og monteres på 35 mm glasbundretter til konfokal billeddannelse. Her er embryoner monteret ventrally for nethinde billeddannelse. Skematisk viser nethinde udvikling i zebrafisk. RGCs danner ganglion cellelag (GCL), som er det inderste lag i nethinden. RGC axoner udvikler sig til synsnerve til at krydse midterlinjen og danner optisk chiasm. Derefter vokser RGC axoner dorsalt for at lave synapser i det optiske tectum i mellemskraben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62165/62165fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35-mm culture dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83-3900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm glass bottom dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP160-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillary Tubes</td>
			<td>Sutter/Fisher Scientific</td>
			<td>NC9029378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2850-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Petri Dishes (100 x 15 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>26140087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma Aldich</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection Mold</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>TU-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23017-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scanning Confocal Microscopy</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium with phenol red</td>
			<td>Gibco/Fisher Scientific</td>
			<td>11-415-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium without phenol red</td>
			<td>Gibco/Fisher Scientific</td>
			<td>21-083-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting agarose</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V2111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMessage mMachine SP6 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0189S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Hyclone/Fisher Scientific</td>
			<td>SH3025601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td>Sigma Aldich</td>
			<td>P0290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma Aldich</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic PicoPump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PV820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine (PDL)</td>
			<td>Sigma Aldich</td>
			<td>P7280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QiaQUICK PCR Purification Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse slit2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>5444-SL-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Sigma Aldich</td>
			<td>P5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steritop 0.22 &#181;m filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>S2GPT05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE Buffer</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine Methanesulfonate</td>
			<td>Sigma Aldich</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Pipette Puller</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>700C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ros live cell imaging during neuronal development

Reaktive iltarter (ROS) er veletablerede signalmolekyler, som er vigtige i normal udvikling, homøostase og fysiologi. Blandt de forskellige ROS er brintoverilte (H2O2) bedst karakteriseret med hensyn til roller i cellulær signalering. H2O2 har været impliceret under udviklingen i flere arter. For eksempel er der påvist en forbigående stigning i H2O2 i zebrafiskembryoner i de første dage efter befrugtningen. Desuden nedbryder en vigtig cellulær H2O2 kilde, NADPH oxidase (NOX), forringer nervesystemet udvikling såsom differentiering, axonal vækst, og vejledning af nethinde ganglion celler (RGCs) både in vivo og in vitro. Her beskriver vi en metode til billeddannelse intracellulær H2O2 niveauer i dyrkede zebrafisk neuroner og hele larver under udvikling ved hjælp af genetisk kodet H2O2-specifikbiosensor, roGFP2-Orp1. Denne sonde kan være forbigående eller stabilt udtrykt i zebrafisk larver. Desuden mindsker den ratiometriske udlæsning sandsynligheden for at opdage artefakter på grund af differentialgenudtryk eller volumeneffekter. For det første demonstrerer vi, hvordan man isolerer og dyrker RDC'er afledt af zebrafiskembryoner, der forbigående udtrykker roGFP2-Orp1. Derefter bruger vi hele larver til at overvåge H2O2-niveauer på vævsniveau. Sensoren er blevet valideret ved tilsætning af H2O2. Desuden kunne denne metode anvendes til at måle H2O2-niveauer i specifikke celletyper og væv ved at generere transgene dyr med vævsspecifik biosensorudtryk. Da zebrafisk fremmer genetiske og udviklingsmæssige manipulationer, kan den fremgangsmåde, der demonstreres her, tjene som en rørledning til at teste H 2 O2'srolle under neuronal og generel embryonal udvikling i hvirveldyr.

Dyrkede zebrafisk-RDC'er strækker axoner inden for 1d. Et repræsentativt billede af forholdet H2O 2 -biosensor i forholdet 405/480 er vist i figur 4A. Cellekroppen, axonen og vækstkeglerne er tydeligt synlige i individuelle neuroner. Disse neuroner kan udsættes for forskellige behandlinger over tid for at overvåge H2O2 ændringer. Vi har tidligere konstateret, at tilføjelse af 100 μM H2O2 til kulturmedier øger forholde...

Watch this Scientific Journal Video about ROS Live Cell Imaging During Neuronal Development at JoVE.com

ROS Live Cell Imaging During Neuronal Development

Denne protokol beskriver brugen af en genetisk kodet brintoverilte (H2O2)-biosensor i dyrkede zebrafisk neuroner og larver til vurdering af de fysiologiske signalroller af H2O2 under udvikling af nervesystemet. Det kan anvendes til forskellige celletyper og modificeres med eksperimentelle behandlinger for at studere reaktive iltarter (ROS) i generel udvikling.

ROS Live Cell Imaging Under Neuronal Development

Reactive oxygen species (ROS) are well-established signaling molecules, which are important in normal development, homeostasis, and physiology. Among the ...

Vores protokol beskriver brugen af en brintoverilte biosensor i dyrkede zebrafisk neuroner og larver. Denne protokol vil hjælpe forskere med at dissekere den rolle, som reaktive iltarter spiller i normal fysiologi og patofysiologi. Den største fordel ved denne teknik er realtidsdetektionen af hydrogenperoxid i levende dyr og dyrkede celler.Denne metode kan anvendes på andre dyr, som gnavermodelsystem. For at forberede coverslips skal du bruge syrerensede coverslips, der opbevares i 100% ethanol. Brug tang til at fjerne en coverlip fra opbevaringsbeholderen, og flamme det til at fjerne resterende ethanol.Lufttørre coverslip helt ved at placere den i en vinkel inde i en 35 millimeter kultur parabol. Forbered Poly-D-Lysin eller PDL, eller arbejd løsning. Påfør PDL til midten af hver coverlip, undgå spredning af opløsningen til kanterne og inkuber PDL i 20 til 30 minutter ved stuetemperatur.Sørg for, at PDL ikke tørrer ud. Vask PDL med 0,5 milliliter sterilt vand og lad pladerne tørre helt. Forbered laminin arbejdsløsning.Og anvende det til midten af hver coverslip, og sørg for at undgå spredning af opløsning til kanterne. Inkubat pladerne ved 37 grader Celsius i en befugtet inkubator i to til seks timer, undgå tørring af lamininopløsningen. For at udføre en embryodissektion i plade nethinde ganglion celler eller RGCs, forberede og mærke fire 35 millimeter væv kultur retter og fylde dem med fire milliliter af 70% ethanol.E2 medier et. E2 medier to. Og E2 medier tre, på dagen for dissektion.Opvasken i køleskabet. Når zebrafiskembryoner er 34 timer efter befrugtning, skal du tage kulturretterne belagt med laminin ud af inkubatoren. Og vask dækslet glider tre gange med 0,5 milliliter 1X PBS.Efter den endelige vask tilsættes fire milliliter ZFCM+-medier til hver kulturret. Undgå at tørre pladen. Hent de tilberedte kølekulturretter og lad dem ekvilibrere til stuetemperatur.Fyld fire til seks PCR-rør med 15 mikroliter ZFCM+-medier. Hent zebrafiskembryoner fra inkubatoren og nedsænk embryoner i en 35 millimeter vævskulturskål, der indeholder 70% ethanol i 5-10 sekunder for at sterilisere den. Ved hjælp af en overførsel af pipette overføres embryoner til E2-mediet en skål, der indeholder sterile E2-medier til at vaske overskydende ethanol af.Overfør derefter embryonerne til E2-mediet to skåle og fjern deres chorions med skarpe pincet. Endelig overføre embryoner til E2 medier tre parabol til at udføre dissektioner. Brug et par fine pincet, position og hold embryoner foran æggeblommen med en af pincet.Og fjern halen bagest til æggeblommesækken med de andre pincet. Grib halsen med pincet og tage hovedet til at udsætte hjernen og øjnene til E2 medier. Med spidsen af fine pincet ruller forsigtigt øjnene fra hovedet, mens du holder kranievævet nede med en anden pincet.Overfør fire øjne til et af de tidligere forberedte rør, der indeholder ZFCM+Forsigtigt triturat op og ned med en p20-pipette ca. 45 gange for at adskille celler. Overfør ZFCM+med de dissociated celler til midten af coverlips. Vedligehold kulturer på bænken toppen ved 22 grader Celsius på en polystyren skum rack til at absorbere vibrationer.På billeddagen skal du kontrollere celler under mikroskopet for at validere væksten af RGC axoner. For levende celle billeddannelse, overføre coverslips fra kultur parabol til en levende celle billeddannelse kammer. Brug et omvendt mikroskop udstyret med et DIC-objektivt OG-590 Longpass rødt filter og et EMCCD-kamera.Før billedbehandling, erstatte ZFCM + medium med ZFCM-Efter placering af cellerne med 10X mål, erhverve billeder ved 60X forstørrelse ved hjælp af en olie nedsænkning mål. Brug en ekstra forstørrelse på 1,5X. Først erhverve DIC billeder.Derefter billedet roGFP2-Orp1, ved hjælp af de relevante filter sæt. Efter at have taget det første sæt billeder, udveksle medier med medier, der indeholder forskellige behandlingsløsninger. Medier bør ændres hvert 30. minut af billedbehandling for at undgå ændringer i pH og osmolaritet.For in vivo billeddannelse, holde 22 til 24-timers post-befrugtning embryoner i E3 medier, der indeholder 0,003%phenyl thiourea uden methylenblåt. Udveksle medier og fjerne døde embryoner dagligt. I den ønskede alder bedøves og monteres embryoner i 1%agarose på 35 millimeter glasbundskulturretter.Embryoner kan være orienteret dorsalt, ventrally, eller sideværts, afhængigt af regionen af interesse for billeddannelse. Efter agarose størkner, fyldes opvasken med E3 medier uden methylenblåt, men med 0,016%tricain. Sæt mikroskopet op til billeddannelse.Brug et omvendt laserscanningskonfokalt mikroskop til at afbilde embryoner monteret på bunden af en agarosedråbe. Excite roGFP2-Orp1, og erhverve tilsvarende billeder med de ønskede emissionsfiltre. Erhverve z-stakke med fem mikro meter sektion tykkelse gennem den ønskede del af embryoner.Efter billeddannelse fjernes embryoner fra Agarose med fine pincet og opbevares i inkubatoren og methylenblåt frie medier med phenyl thiourea indtil den ønskede alder. Et repræsentativt billede af brintoverilte biosensor og dyrkede zebrafisk RGC udvidede axoner er vist her. Cellekroppen, axonen og vækstkeglerne er tydeligt synlige i individuelle neuroner.Tilsætningen af brintoverilte til kulturmediet øger forholdsværdierne, hvilket viser, at ændringer i realtid kan påvises med dette system. Kvantificering af brintoverilteniveauer er vist i panelet B.To bestemme hydrogenperoxidniveauer i hele zebrafiskembryoner, mRNA blev injiceret i den ene cellefase, hvilket fik alle væv til at udtrykke roGFP2-Orp1 biosensoren. Hovedregionen af zebrafisklarver vises på to forskellige tidspunkter med fokus på hydrogenperoxidniveauerne i nethinden.De basale niveauer af brintoverilte i zebrafiskembryoner på to dage efter befrugtningen og fem dage efter befrugtningen blev målt. På to dage efter befrugtningen var forholdets værdier betydeligt lavere end ved fem dage efter befrugtningen. Desuden viste hvert dyr en forskellig stigning i deres nethinde hydrogenperoxidindhold.Brug af fine pincet til at fjerne øjnene og blid dissociation af øjnene med pipetten er de mest kritiske trin i denne procedure. Denne protokol kan efterfølges af medicinske behandlinger for at undersøge de faktorer, der er involveret i ROS signalering.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

Høj opløsning Live-Imaging af celle adfærd i udviklingslandene neuroepitel

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Ex vivo Live-Imaging af Single celledelinger i Mouse neuroepithelium

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Live-Imaging mitosens i udviklingslandene mus embryonale Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

Udnytte Kombineret Metoder til Definer rolle plasmamembranen Delivery Under Axon Forgrening og neuronal Morfogenese

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

Analyse Dendritiske Morfologi i Kolonner og Lag

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

I Vivo Calcium billeddannelse af laterale-line hårcellerne i larve zebrafisk

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Forberedelse voksen Drosophila melanogaster til hele hjernen Imaging under adfærd og Stimuli Svar

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...