Name: ros live cell imaging during neuronal development
Uploaded: 2021-02-09T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about ROS Live Cell Imaging During Neuronal Development at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (Grant R01NS117701), National Science Foundation (Grant 1146944-IOS), het Indiana Traumatic Spinal Cord and Brain Injury Research Fund (Grant 20000289), de Purdue Research Foundation (Grant 209911) en het Office of the Executive Vice President for Research and Partnerships aan purdue University (Grant 210362). We danken Dr. Cory J. Weaver en Haley Roeder voor het opstellen van het zebravis RGC cultuurprotocol. We danken Haley Roeder bovendien voor het verstrekken van de gegevens van figuur 4. We danken Leah Biasi en Kenny Nguyen voor de hulp bij de RGC-cultuur. We danken Gentry Lee voor het bewerken van de tekst. We danken Dr. Tobias Dick voor het leveren van roGFP2-Orp1 en Dr. Qing Deng voor pCS2+ vector met roGFP2-Orp1. Figuur 2 is gemaakt met Biorender.com.

Alle dierproeven werden ethisch beoordeeld en goedgekeurd door het Purdue Animal Care and Use Committee (PACUC), volgens de NIH-richtlijnen met het protocol 2006002050 goedgekeurd op 24-07-2020.
1. Voorbereiding van oplossingen
<ol><li>E2 media (1x)<ol>
<li>Bereid oplossingen van 100x E2A (500 mL), 500x E2B (100 mL) en 500x E2C (100 mL) voor door alle in tabel 1afgebeelde componenten te combineren. Autoclaaf E2A, E2B en E2C oplossingen. Bewaren bij 4 °C.</li>
		<li>Voor 1x ...

<ol>
	<li>B&#243;rquez, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+role+of+redox+signaling+in+neuronal+development.">Dissecting the role of redox signaling in neuronal development.</a> Journal of Neurochemistry. 137 (4), 506-517 (2016).</li><li>Bedard, K., Krause, K. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NOX+family+of+ROS-generating+NADPH+oxidases:+Physiology+and+pathophysiology.">The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: Physiology and pathophysiology.</a> Physiological Reviews. 87 (1), 245-313 (2007).</li><li>Weaver, C. J., Leung, Y. F., Suter, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+dynamics+of+NADPH+oxidases+during+early+zebrafish+development.">Expression dynamics of NADPH oxidases during early zebrafish development.</a> Journal of Comparative Neurology. 524 (10), 2130-2141 (2016).</li><li>Terzi, A., Suter, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+NADPH+oxidases+in+neuronal+development.">The role of NADPH oxidases in neuronal development.</a> Free Radical Biology and Medicine. 154, 33-47 (2020).</li><li>Infanger, D. W., Sharma, R. V., Davisson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidases+of+the+brain:+Distribution,+regulation,+and+function.">NADPH oxidases of the brain: Distribution, regulation, and function.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 8 (9-10), 1583-1596 (2006).</li><li>Coyoy, A., Olguin-Albuerne, M., Martinez-Briseno, P., Moran, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+reactive+oxygen+species+and+NADPH-oxidase+in+the+development+of+rat+cerebellum.">Role of reactive oxygen species and NADPH-oxidase in the development of rat cerebellum.</a> Neurochemistry International. 62 (7), 998-1011 (2013).</li><li>Le Belle, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferative+neural+stem+cells+have+high+endogenous+ROS+levels+that+regulate+self-renewal+and+neurogenesis+in+a+PI3K/Akt-dependant+manner.">Proliferative neural stem cells have high endogenous ROS levels that regulate self-renewal and neurogenesis in a PI3K/Akt-dependant manner.</a> Cell Stem Cell. 8 (1), 59-71 (2011).</li><li>Nayernia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+neural+precursor+cell+pool+in+NADPH+oxidase+2-deficiency:+from+mouse+brain+to+neural+differentiation+of+patient+derived+iPSC.">Decreased neural precursor cell pool in NADPH oxidase 2-deficiency: from mouse brain to neural differentiation of patient derived iPSC.</a> Redox Biology. 13, 82-93 (2017).</li><li>Wilson, C., Nunez, M. T., Gonz&#225;lez-Billault, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+NADPH+oxidase+to+the+establishment+of+hippocampal+neuronal+polarity+in+culture.">Contribution of NADPH oxidase to the establishment of hippocampal neuronal polarity in culture.</a> Journal of Cell Science. 128 (16), 2989-2995 (2015).</li><li>Munnamalai, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+interactions+between+Nox2-type+NADPH+oxidase+and+the+F-actin+cytoskeleton+in+neuronal+growth+cones.">Bidirectional interactions between Nox2-type NADPH oxidase and the F-actin cytoskeleton in neuronal growth cones.</a> Journal of Neurochemistry. 130 (4), 526-540 (2014).</li><li>Kishida, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+plasticity+deficits+and+mild+memory+impairments+in+mouse+models+of+chronic+granulomatous+disease.">Synaptic plasticity deficits and mild memory impairments in mouse models of chronic granulomatous disease.</a> Molecular and Cellular Biology. 26 (15), 5908-5920 (2006).</li><li>Ravelli, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nox2-dependent+neuroinflammation+in+an+EAE+model+of+multiple+sclerosis.">Nox2-dependent neuroinflammation in an EAE model of multiple sclerosis.</a> Translational Neuroscience. 10 (1), 1-9 (2019).</li><li>Park, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nox2-derived+radicals+contribute+to+neurovascular+and+behavioral+dysfunction+in+mice+overexpressing+the+amyloid+precursor+protein.">Nox2-derived radicals contribute to neurovascular and behavioral dysfunction in mice overexpressing the amyloid precursor protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (4), 1347-1352 (2008).</li><li>Schiavone, S., Neri, M., Trabace, L., Turillazzi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NADPH+oxidase+NOX2+mediates+loss+of+parvalbumin+interneurons+in+traumatic+brain+injury:+Human+autoptic+immunohistochemical+evidence.">The NADPH oxidase NOX2 mediates loss of parvalbumin interneurons in traumatic brain injury: Human autoptic immunohistochemical evidence.</a> Scientific Reports. 7 (1), 8752 (2017).</li><li>Gutscher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity-based+protein+thiol+oxidation+by+H2O2-scavenging+peroxidases.">Proximity-based protein thiol oxidation by H2O2-scavenging peroxidases.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (46), 31532-31540 (2009).</li><li>Bilan, D. S., Belousov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+redox+biology:+from+imaging+to+manipulation.">New tools for redox biology: from imaging to manipulation.</a> Free Radical Biology and Medicine. 109, 167-188 (2016).</li><li>Abu-Siniyeh, A., Al-Zyoud, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highlights+on+selected+microscopy+techniques+to+study+zebrafish+developmental+biology.">Highlights on selected microscopy techniques to study zebrafish developmental biology.</a> Laboratory Animal Research. 36 (1), 12 (2020).</li><li>Sassen, W. A., Koster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+toolbox+for+genetic+manipulation+of+zebrafish.">A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish.</a> Advances in Genomics and Genetics. 5, 151-163 (2015).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).</li><li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regular+care+and+maintenance+of+a+Zebrafish+(Danio+rerio)+laboratory:+An+introduction.">Regular care and maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+neuron+culture+for+nerve+growth+and+axon+guidance+studies+in+Zebrafish+(Danio+rerio).">Primary neuron culture for nerve growth and axon guidance studies in Zebrafish (Danio rerio).</a> PLoS One. 8 (3), 57539 (2013).</li><li>Zhang, L., Leung, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdissection+of+zebrafish+embryonic+eye+tissues.">Microdissection of zebrafish embryonic eye tissues.</a> Journal of Visualized Experiments. (40), e2028 (2010).</li><li>Suter, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+of+neuronal+growth+cone+motility+and+duidance+in+vitro.">Live cell imaging of neuronal growth cone motility and duidance in vitro.</a> Cell Migration: Methods in Molecular Biology. , 65-86 (2011).</li><li>Weaver, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=nox2/cybb+deficiency+affects+zebrafish+retinotectal+connectivity.">nox2/cybb deficiency affects zebrafish retinotectal connectivity.</a> Journal of Neuroscience. 38 (26), 5854-5871 (2018).</li><li>Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+EGSH+and+H2O2+with+roGFP2-based+redox+probes.">Measuring EGSH and H2O2 with roGFP2-based redox probes.</a> Free Radical Biology and Medicine. 51, 1943-1951 (2011).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenylthiourea+specifically+reduces+zebrafish+eye+size.">Phenylthiourea specifically reduces zebrafish eye size.</a> PLoS One. 7 (6), 40132 (2012).</li><li>Ermakova, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+fluorescent+genetically+encoded+indicator+for+intracellular+hydrogen+peroxide.">Red fluorescent genetically encoded indicator for intracellular hydrogen peroxide.</a> Nature Communications. 5, 5222 (2014).</li><li>Oparka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+ROS+levels+using+CM-H2DCFDA+and+HyPer.">Quantifying ROS levels using CM-H2DCFDA and HyPer.</a> Methods. 109, 3-11 (2016).</li><li>Dickinson, B. C., Peltier, J., Stone, D., Schaffer, D. V., Chang, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nox2+redox+signaling+maintains+essential+cell+populations+in+the+brain.">Nox2 redox signaling maintains essential cell populations in the brain.</a> Nature Chemical Biology. 7 (2), 106-112 (2011).</li><li>Cannon, M. B., Remington, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox-sensitive+green+fluorescent+protein:+Probes+for+dynamic+intracellular+redox+responses.+A+review.">Redox-sensitive green fluorescent protein: Probes for dynamic intracellular redox responses. A review.</a> Methods in Molecular Biology. 476, 51-65 (2009).</li><li>Meyer, A. J., Dick, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein-based+redox+probes.">Fluorescent protein-based redox probes.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 13 (5), 621-650 (2010).</li><li>Panieri, E., Millia, C., Santoro, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+quantification+of+subcellular+H2O2+and+glutathione+redox+potential+in+living+cardiovascular+tissues.">Real-time quantification of subcellular H2O2 and glutathione redox potential in living cardiovascular tissues.</a> Free Radical Biology and Medicine. 109, 189-200 (2017).</li><li>Breus, O., Dickmeis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+thiol+redox-sensors+in+the+zebrafish+model:+Lessons+for+embryonic+development+and+regeneration.">Genetically encoded thiol redox-sensors in the zebrafish model: Lessons for embryonic development and regeneration.</a> Biological Chemistry. , (2020).</li><li>Morgan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+basal+H2O2+levels+with+peroxiredoxin-based+probes.">Real-time monitoring of basal H2O2 levels with peroxiredoxin-based probes.</a> Nature Chemical Biology. 12 (6), 437-443 (2016).</li><li>Terzi, A., Roeder, H., Weaver, C. J., Suter, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+NADPH+oxidase+2+regulates+growth+cone+guidance+downstream+of+slit2/robo2.">Neuronal NADPH oxidase 2 regulates growth cone guidance downstream of slit2/robo2.</a> Developmental Neurobiology. , (2020).</li><li>Bilan, D. S., Belousov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HyPer+family+probes:+State+of+the+art.">HyPer family probes: State of the art.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 24 (13), 731-751 (2016).</li><li>Ermankova, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SypHer3s:+a+genetically+encoded+fluorescent+ratiometric+probe+with+enhanced+brightness+and+an+improved+dynamic+range.">SypHer3s: a genetically encoded fluorescent ratiometric probe with enhanced brightness and an improved dynamic range.</a> Chemistry Communications. 54 (23), 2898-2901 (2018).</li><li>Pak, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+genetically+encoded+indicator+for+hydrogen+peroxide+identifies+roles+for+the+oxidant+in+cell+migration+and+mitochondrial+function.">Ultrasensitive genetically encoded indicator for hydrogen peroxide identifies roles for the oxidant in cell migration and mitochondrial function.</a> Cell Metabolism. 31 (3), 642-653 (2020).</li><li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tol2kit:+A+multisite+gateway-based+construction+Kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs.">The Tol2kit: A multisite gateway-based construction Kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).</li></ol>

Er zijn verschillende kritieke stappen die aandacht nodig hebben in dit protocol. Wij zijn van mening dat het overwegen van deze punten de experimentele stroom zal verbeteren. Voor primaire RGC-cultuur is de steriliteit van de ZFCM(-) erg belangrijk, omdat dit kweekmedium geen antibiotica bevat en besmetting voor of tijdens beeldvorming kan optreden. Om dit te voorkomen, adviseren wij om ZFCM(-) alleen in een bioveiligheidskast te bereiden en te gebruiken en regelmatig verse ZFCM(-) media te maken (stap 1.5). Bovendien m...

Reactive oxygen species (ROS) signalering reguleert de ontwikkeling en werking van het zenuwstelsel1. Een belangrijke cellulaire ROS-bron zijn NADPH-oxidasen (NOX), transmembrane-eiwitten die superoxide en waterstofperoxide genereren (H2O2)2. NOX-enzymen worden gevonden in het centrale zenuwstelsel (CZS) en NOX-afgeleide ROS dragen bij aan neuronale ontwikkeling3,4,5,6. Onderhoud en differentiatie van neurale stamcellen, het vaststellen van neuronale polariteit, neurietuitgroei en synaptische plasticiteit hebben voldoende ros7,8,9,10,11nodig . Aan de andere kant draagt ongecontroleerde productie van ROS door NOXen bij aan neurodegeneratieve aandoeningen, waaronder de ziekte van Alzheimer, multiple sclerose en traumatisch hersenletsel12,13,14. Daarom is de productie van fysiologisch relevante ROS van cruciaal belang voor het behoud van gezonde omstandigheden.
De ontwikkeling van genetisch gecodeerde biosensoren vergemakkelijkte de detectie van cellulaire ROS aanzienlijk. Een belangrijk voordeel van genetisch gecodeerde biosensoren is de verhoogde temporele en ruimtelijke resolutie van het ROS-signaal, omdat deze sensoren specifiek op verschillende locaties kunnen worden gericht. Redox-gevoelige GFP (roGFP) is een type van dergelijke ROS-biosensoren. De roGFP2-Orp1-variant detecteert specifiek H2O2 via zijn Orp1-domein, een glutathion peroxiredoxinefamilie-eiwit uit gist15,16. De oxidatie van het Orp1-eiwit wordt overgebracht naar roGFP2 om de conformatie ervan te wijzigen (figuur 1A). De sonde vertoont twee excitatiepieken in de buurt van 405 nm en 480 nm en een enkele emissiepiek bij 515 nm. Bij oxidatie verandert de fluorescentie-intensiteit rond excitatiepieken: terwijl 405 nm excitatie toeneemt, neemt 480 nm excitatie af. RoGFP2-Orp1 is dus een ratiometrische biosensor en H2O2-niveaus worden gedetecteerd door de verhouding van fluorescentieintensiteiten opgewekt op twee verschillende golflengten (Figuur 1B). Over het algemeen is roGFP2-Orp1 een veelzijdig hulpmiddel voor ROS-beeldvorming dat efficiënt in vivokan worden gebruikt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62165/62165fig01.jpg"> Figuur 1: Schematische representatie en excitatiespectra van roGFP2-Orp1. (A) Oxidant transfer vindt plaats tussen Orp1 en roGFP2 als reactie op H2O2, wat leidt tot conformationele veranderingen in roGFP2. (B) De excitatiespectra van de roGFP2-Orp1 vertoont twee excitatiepieken bij 405 nm en 480 nm en enkele emissiepiek bij 515 nm. Bij oxidatie door H2O2neemt de excitatie van 405 nm toe terwijl de excitatie van 480 nm afneemt. Dit resulteert in een ratiometrische uitlezing voor H2O2 aanwezigheid. Het cijfer is gewijzigd van Bilan en Belousov (2017)16 en Morgan et al. (2011)25. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62165/62165fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>
Het Danio rerio (zebravis) modelsysteem heeft verschillende voordelen voor het toepassen van genetisch gecodeerde biosensoren. De optische transparantie van de embryo's en larven maakt niet-invasieve in vivo beeldvorming mogelijk. Er worden nieuwe beeldvormingstools ontwikkeld om een hogere resolutie en diepere penetratie te bereiken17. Verder zijn er gevestigde instrumenten voor genetische manipulatie (ectopische mRNA-expressie, Tol2-transgenese, enz.) en genoombewerking (TALEN's, CRISPR/Cas9, enz.), die de generatie van transgene dierenbevordert 18. Naarmate de zebravisembryo's zich buiten de moeder ontwikkelen, maakt dit systeem verder gemakkelijkere toegang tot en manipulatie van de embryo's mogelijk. Bijvoorbeeld, eencellige stadium injecties en medicamenteuze behandelingen kunnen gemakkelijk worden gedaan.
Hier gebruikten we zebravissen om de H 2O2-specifiekebiosensor roGFP2-Orp1 tijdelijk uit te drukken door in vitro getranscribeerd mRNA te injecteren. Deze embryo's kunnen worden gebruikt voor zowel in vitro beeldvorming van gekweekte neuronen als in vivo beeldvorming (figuur 2). We beschrijven een protocol voor het ontleden en plateren van retinale ganglioncellen (RGCs) uit zebravisembryo's, gevolgd door het beoordelen van H2O2-niveaus in gekweekte neuronen. Vervolgens presenteren we een methode voor in vivo beeldvorming van roGFP2-Orp1-uitdrukkende embryo's en larven met behulp van confocale microscopie. Deze aanpak maakt het niet alleen mogelijk om fysiologische H2O2-niveauste bepalen, maar ook potentiële veranderingen die optreden in verschillende ontwikkelingsstadia of omstandigheden. Over het algemeen biedt dit systeem een betrouwbare methode voor het detecteren van H2O2 in levende cellen en dieren om de rol van H2O2 in ontwikkeling, gezondheid en ziekte te bestuderen.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62165/62165fig03.jpg"> Figuur 2. Schets van de experimentele aanpak. Kort na het verzamelen van embryo's wordt roGFP2-Orp1 mRNA geïnjecteerd in de dooier van zebravisembryo's in één celstadium. Het ontwikkelen van embryo's kan worden gebruikt voor zowel (A) in vitro als (B) in vivo beeldvorming. (A) GFP-positieve embryo's worden gebruikt om netvlies te ontleden voor RGC-verzameling bij 34 hpf. Gedissocieerde RGCs worden geplateerd op PDL/laminine-gecoate coverslips in ZFCM (+) media. Groeikegelbeeldvorming kan worden uitgevoerd terwijl RGC's hun axonen verlengen na 6-24 uur plateren. Cellen kunnen worden onderworpen aan verschillende behandelingen om de potentiële veranderingen in H 2 O2-niveauste meten. Hier hebben we H 2 O2-niveausgemeten in de groeikegels van RGCs (rood). (B) GFP-positieve embryo's worden gebruikt voor in vivo beeldvorming. Op de gewenste leeftijd kunnen embryo's worden verdoofd en gemonteerd op glazen bodemschalen van 35 mm voor confocale beeldvorming. Hier worden embryo's ventrally gemonteerd voor retinale beeldvorming. Schematisch toont retinale ontwikkeling bij zebravissen. RGCs vormen ganglioncellaag (GCL), de binnenste laag in het netvlies. RGC axonen ontwikkelen zich tot oogzenuw om de middellijn te kruisen en vormen optisch chiasme. Vervolgens groeien RGC axonen dorsaal om synapsen te maken in het optische tectum in de middenhersenen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62165/62165fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35-mm culture dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83-3900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm glass bottom dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP160-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillary Tubes</td>
			<td>Sutter/Fisher Scientific</td>
			<td>NC9029378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2850-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Petri Dishes (100 x 15 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>26140087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma Aldich</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection Mold</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>TU-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23017-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scanning Confocal Microscopy</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium with phenol red</td>
			<td>Gibco/Fisher Scientific</td>
			<td>11-415-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium without phenol red</td>
			<td>Gibco/Fisher Scientific</td>
			<td>21-083-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting agarose</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V2111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMessage mMachine SP6 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0189S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Hyclone/Fisher Scientific</td>
			<td>SH3025601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td>Sigma Aldich</td>
			<td>P0290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma Aldich</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic PicoPump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PV820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine (PDL)</td>
			<td>Sigma Aldich</td>
			<td>P7280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QiaQUICK PCR Purification Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse slit2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>5444-SL-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Sigma Aldich</td>
			<td>P5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steritop 0.22 &#181;m filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>S2GPT05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE Buffer</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine Methanesulfonate</td>
			<td>Sigma Aldich</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Pipette Puller</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>700C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ros live cell imaging during neuronal development

Reactieve zuurstofsoorten (ROS) zijn gevestigde signaalmoleculen, die belangrijk zijn in de normale ontwikkeling, homeostase en fysiologie. Onder de verschillende ROS wordt waterstofperoxide (H2O2) het best gekarakteriseerd met betrekking tot rollen in cellulaire signalering. H2O2 is betrokken geweest bij de ontwikkeling van verschillende soorten. Zo is in de eerste dagen na de bevruchting een voorbijgaande toename vanH2 O2 waargenomen bij zebravisembryo's. Bovendien, het uitputten van een belangrijke cellulaire H2O2 bron, NADPH oxidase (NOX), vermindert de ontwikkeling van het zenuwstelsel, zoals de differentiatie, axonale groei, en begeleiding van retinale ganglioncellen (RGCs) zowel in vivo als in vitro. Hier beschrijven we een methode voor beeldvorming van intracellulaire H2O2-niveaus in gekweekte zebravisneuronen en hele larven tijdens de ontwikkeling met behulp van de genetisch gecodeerde H2O2-specifiekebiosensor, roGFP2-Orp1. Deze sonde kan tijdelijk of stabiel worden uitgedrukt in zebravislarven. Bovendien vermindert de ratiometrische uitlezing de kans op het detecteren van artefacten als gevolg van differentiële genexpressie of volume-effecten. Ten eerste laten we zien hoe we RGC's kunnen isoleren en kweeken die zijn afgeleid van zebravisembryo's die roGFP2-Orp1 tijdelijk uitdrukken. Vervolgens gebruiken we hele larven om H 2O 2-niveausop weefselniveau te controleren. De sensor is gevalideerd door de toevoeging van H2O2. Bovendien zou deze methode kunnen worden gebruikt om H 2 O2-niveausin specifieke celtypen en weefsels te meten door transgene dieren te genereren met weefselspecifieke biosensorexpressie. Aangezien zebravissen genetische en ontwikkelingsmanipulaties vergemakkelijken, zou de hier aangetoonde aanpak kunnen dienen als een pijplijn om de rol van H2O2 tijdens neuronale en algemene embryonale ontwikkeling bij gewervelde dieren te testen.

Gekweekte zebravis RGCs strekken axonen uit binnen 1d. Figuur 4A geeft een representatief beeld van de verhouding 405/480 van deH2 O2-biosensor . Het cellichaam, axon en groeikegels zijn duidelijk zichtbaar in individuele neuronen. Deze neuronen kunnen in de loop van de tijd aan verschillende behandelingen worden onderworpen om H 2 O2-veranderingente controleren. We ontdekten eerder dat het toevoegen van 100 μM H2O2 aan cult...

Watch this Scientific Journal Video about ROS Live Cell Imaging During Neuronal Development at JoVE.com

ROS Live Cell Imaging During Neuronal Development

Dit protocol beschrijft het gebruik van een genetisch gecodeerd waterstofperoxide (H2O2)-biosensor in gekweekte zebravisneuronen en larven voor het beoordelen van de fysiologische signaleringsrollen van H2O2 tijdens de ontwikkeling van het zenuwstelsel. Het kan worden toegepast op verschillende celtypen en worden aangepast met experimentele behandelingen om reactieve zuurstofsoorten (ROS) in de algemene ontwikkeling te bestuderen.

ROS Live Cell Imaging tijdens neuronale ontwikkeling

Reactive oxygen species (ROS) are well-established signaling molecules, which are important in normal development, homeostasis, and physiology. Among the ...

Ons protocol beschrijft het gebruik van een waterstofperoxide biosensor in gekweekte zebravisneuronen en larven. Dit protocol zal onderzoekers helpen om de rol van reactieve zuurstofsoorten in de normale fysiologie en pathofysiologie te ontleden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de realtime detectie van waterstofperoxide in levende dieren en gekweekte cellen.Deze methode kan worden toegepast op andere dieren, zoals het knaagdiermodelsysteem. Gebruik voor het bereiden van de afdeklips zuur gereinigde afdeklips die zijn opgeslagen in 100% ethanol. Gebruik een tang om één afdeklip uit de opslagcontainer te verwijderen en vlam deze om resterende ethanol te verwijderen.Droog de hoezen volledig aan de lucht door deze schuin in een kweekschaal van 35 millimeter te plaatsen. Bereid Poly-D-Lysine of PDL, of werkoplossing. Breng PDL aan op het midden van elke afdeklip, vermijd verspreiding van de oplossing naar de randen en incubeer de PDL gedurende 20 tot 30 minuten bij kamertemperatuur.Zorg ervoor dat de PDL niet uitdroogt. Was de PDL met 0,5 milliliter steriel water en laat de platen volledig drogen. Bereid lagmijn werkoplossing voor.En breng het aan op het midden van elke coverslip, zorg ervoor dat de verspreiding van de oplossing naar de randen wordt vermeden. Incubeer de platen op 37 graden Celsius in een bevochtigde incubator gedurende twee tot zes uur, vermijd het drogen van de laminineoplossing. Om een embryodissectie uit te voeren in netvliesganglioncellen of RGC's, bereidt en labelt u vier 35 millimeter weefselkweekgerechten en vult u deze met vier milliliter 70% ethanol.E2 media één. E2 media twee. En E2 media drie, op de dag van ontleding.Bewaar de borden in de koelkast. Wanneer zebravisembryo's 34 uur na de bevruchting zijn, haal dan de kweekschotels bedekt met lag uit de incubator. En was de afdekstrips drie keer met 0,5 milliliter 1X PBS.Voeg na de laatste wasbeurt vier milliliter ZFCM+media toe aan elke kweekschotel. Vermijd het drogen van de plaat. Haal de bereide gekoelde kweekgerechten op en laat ze op kamertemperatuur komen.Vul vier tot zes PCR-buizen met 15 microliters ZFCM+media. Haal zebravisembryo's uit de incubator en dompel embryo's onder in een 35 millimeter weefselkweekschaal met 70% ethanol gedurende 5-10 seconden om het te steriliseren. Breng embryo's met behulp van een pipet over naar de E2 media één schaal, die steriele E2-media bevat om overtollige ethanol af te wassen.Breng vervolgens de embryo's over naar de E2 media twee schotel en verwijder hun koraal met scherpe tang. Breng ten slotte embryo's over naar de E2-media drie schotel om dissecties uit te voeren. Gebruik een paar fijne tangen en plaats embryo's voor of achter de dooier met een van de tangen.En verwijder de staartposter naar de dooierzak met de andere tang. Pak de nek met een tang en doe het hoofd eraf om de hersenen en ogen bloot te stellen aan de E2-media. Rol met de punt van de fijne tang voorzichtig de ogen van het hoofd terwijl u het schedelweefsel met een tweede tang naar beneden houdt.Breng vier ogen over naar een van de eerder voorbereide buizen met ZFCM + Triturate voorzichtig op en neer met een p20 pipet ongeveer 45 keer om cellen te dissocieren. Breng de ZFCM+ met de gedissocieerde cellen over naar het midden van de coverslips. Houd culturen op de banktop op 22 graden Celsius op een polystyreenschuimrek om trillingen te absorberen.Controleer op de dag van beeldvorming cellen onder de microscoop om de groei van RGC-axonen te valideren. Voor live celbeeldvorming, breng de coverslips van de kweekschaal naar een live cel beeldvormingskamer. Gebruik een omgekeerde microscoop uitgerust met een DIC objectief OG-590 Longpass rood filter en een EMCCD camera.Vervang vóór beeldvorming het ZFCM+medium door ZFCM-Na het positioneren van de cellen met de 10X-doelstelling, verkrijgt u beelden bij 60X-vergroting met behulp van een olie-onderdompelingsdoelstelling. Gebruik een extra vergroting van 1,5x. Koop eerst DIC-afbeeldingen.Afbeelding roGFP2-Orp1, met behulp van de juiste filterset. Na het maken van de eerste set afbeeldingen, wissel je media uit met media met verschillende behandelingsoplossingen. Media moeten elke 30 minuten van beeldvorming worden gewijzigd om pH- en osmolariteitsveranderingen te voorkomen.Voor in vivo beeldvorming, houd 22 tot 24-uurs embryo's na de bevruchting in E3-media, die 0,003% fenylthiothourea bevatten zonder methyleenblauw. Wissel media uit en verwijder dagelijks dode embryo's. Op de gewenste leeftijd, verdoven en mount embryo's in 1% agarose op 35 millimeter glazen bodem kweek gerechten.Embryo's kunnen dorsaal, ventrally of lateraal worden georiënteerd, afhankelijk van de regio die van belang is voor beeldvorming. Nadat de agarose stolt, vul de gerechten met E3-media zonder methyleenblauw, maar met 0,016%tricaine. Zet de microscoop klaar voor beeldvorming.Gebruik een omgekeerde laserscan confocale microscoop om embryo's te zien die op de bodem van een agarosedruppel zijn gemonteerd. Prikkel roGFP2-Orp1 en verkrijg overeenkomstige beelden met de gewenste emissiefilters. Verkrijg z-stacks met een doorsnededikte van vijf micrometer door het gewenste deel van de embryo's.Verwijder na beeldvorming embryo's uit Agarose met fijne tang en bewaar ze in de incubator en methyleenblauwvrije media met fenylthiothine tot de gewenste leeftijd. Een representatief beeld van de waterstofperoxide biosensor en gekweekte zebravis RGC verlengde axonen is hier te zien. Het cellichaam, axon en groeikegels zijn duidelijk zichtbaar in individuele neuronen.De toevoeging van waterstofperoxide aan de cultuurmedia verhoogt de verhoudingswaarden, wat aantoont dat real-time veranderingen met dit systeem kunnen worden gedetecteerd. Kwantificering van waterstofperoxideniveaus wordt getoond in panel B.To waterstofperoxideniveaus in hele zebravisembryo's te bepalen, werd het mRNA geïnjecteerd tijdens de fase van één cel, waardoor alle weefsels de roGFP2-Orp1-biosensor uitdrukken. Het hoofdgebied van zebravislarven wordt op twee verschillende tijdstippen getoond, gericht op de waterstofperoxideniveaus in het netvlies.De basale niveaus van waterstofperoxide in de zebravisembryo's na de bevruchting en vijf dagen na de bevruchting werden gemeten. Na twee dagen na de bevruchting waren de verhoudingswaarden aanzienlijk lager dan bij vijf dagen na de bevruchting. Bovendien vertoonde elk dier een andere mate van toename van hun retinale waterstofperoxidegehalte.Het gebruik van fijne tangen voor het verwijderen van de ogen en zachte dissociatie van de ogen met de pipet zijn de meest kritieke stappen in deze procedure. Dit protocol kan worden gevolgd door medicamenteuze behandelingen om de factoren te onderzoeken die betrokken zijn bij ROS-signalering.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell imaging van zintuig voorloper cellen in Intact Drosophila Poppen

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

Live-Imaging van de dorsale wortel Axonen na Rhizotomy

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

Met een hoge resolutie Live-Imaging van cel gedrag in de ontwikkelingslanden Neuroepithelium

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Ex vivo Live-Imaging van Single Cell Divisies in Muis neuroepithelium

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Live-Imaging van mitose in het ontwikkelen van muis embryonale Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

Gebruik makend van gecombineerde methoden om de rol van de plasmamembraan Delivery Tijdens Axon vertakking en neuronale Morphogenesis Definieer

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

Het analyseren van dendrietmorfologie in Kolommen en Lagen

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

In Vivo Calcium beeldvorming van dwarslijn haarcellen in larvale zebravis

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Volwassen Drosophila melanogaster voorbereiden op whole brain imaging tijdens gedrags- en stimulireacties

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...