Name: ros live cell imaging during neuronal development
Uploaded: 2021-02-09T14:30:00
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Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (Grant R01NS117701), der National Science Foundation (Grant 1146944-IOS), dem Indiana Traumatic Spinal Cord and Brain Injury Research Fund (Grant 20000289), der Purdue Research Foundation (Grant 209911) und dem Office of the Executive Vice President for Research and Partnerships an der Purdue University (Grant 210362) unterstützt. Wir danken Dr. Cory J. Weaver und Haley Roeder für die Etablierung des Zebrafisch-RGC-Kulturprotokolls. Wir danken Haley Roeder zusätzlich für die Bereitstellung der Daten von Abbildung 4. Wir danken Leah Biasi und Kenny Nguyen für die Hilfe bei der RGC-Kultur. Wir danken Gentry Lee für die Bearbeitung des Textes. Wir danken Dr. Tobias Dick für die Bereitstellung von roGFP2-Orp1 und Dr. Qing Deng für pCS2+ Vektoren, die roGFP2-Orp1 enthalten. Abbildung 2 wird mit Biorender.com erstellt.

Alle Tierversuche wurden vom Purdue Animal Care and Use Committee (PACUC) ethisch überprüft und genehmigt, wobei die NIH-Richtlinien mit dem Protokoll 2006002050 am 24.07.2020 genehmigt wurden.
1. Herstellung von Lösungen
<ol><li>E2 Medien (1x)<ol>
<li>Bereiten Sie 100x E2A (500 ml), 500 x E2B (100 ml) und 500 x E2C (100 ml) Lösungen vor, indem Sie alle in Tabelle 1aufgeführten Komponenten kombinieren. Autoklav E2A, E2B und E2C Lösungen. Bei 4 °C lagern.</li>
		<li>F?...

<ol>
	<li>B&#243;rquez, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+role+of+redox+signaling+in+neuronal+development.">Dissecting the role of redox signaling in neuronal development.</a> Journal of Neurochemistry. 137 (4), 506-517 (2016).</li><li>Bedard, K., Krause, K. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NOX+family+of+ROS-generating+NADPH+oxidases:+Physiology+and+pathophysiology.">The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: Physiology and pathophysiology.</a> Physiological Reviews. 87 (1), 245-313 (2007).</li><li>Weaver, C. J., Leung, Y. F., Suter, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+dynamics+of+NADPH+oxidases+during+early+zebrafish+development.">Expression dynamics of NADPH oxidases during early zebrafish development.</a> Journal of Comparative Neurology. 524 (10), 2130-2141 (2016).</li><li>Terzi, A., Suter, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+NADPH+oxidases+in+neuronal+development.">The role of NADPH oxidases in neuronal development.</a> Free Radical Biology and Medicine. 154, 33-47 (2020).</li><li>Infanger, D. W., Sharma, R. V., Davisson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidases+of+the+brain:+Distribution,+regulation,+and+function.">NADPH oxidases of the brain: Distribution, regulation, and function.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 8 (9-10), 1583-1596 (2006).</li><li>Coyoy, A., Olguin-Albuerne, M., Martinez-Briseno, P., Moran, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+reactive+oxygen+species+and+NADPH-oxidase+in+the+development+of+rat+cerebellum.">Role of reactive oxygen species and NADPH-oxidase in the development of rat cerebellum.</a> Neurochemistry International. 62 (7), 998-1011 (2013).</li><li>Le Belle, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferative+neural+stem+cells+have+high+endogenous+ROS+levels+that+regulate+self-renewal+and+neurogenesis+in+a+PI3K/Akt-dependant+manner.">Proliferative neural stem cells have high endogenous ROS levels that regulate self-renewal and neurogenesis in a PI3K/Akt-dependant manner.</a> Cell Stem Cell. 8 (1), 59-71 (2011).</li><li>Nayernia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+neural+precursor+cell+pool+in+NADPH+oxidase+2-deficiency:+from+mouse+brain+to+neural+differentiation+of+patient+derived+iPSC.">Decreased neural precursor cell pool in NADPH oxidase 2-deficiency: from mouse brain to neural differentiation of patient derived iPSC.</a> Redox Biology. 13, 82-93 (2017).</li><li>Wilson, C., Nunez, M. T., Gonz&#225;lez-Billault, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+NADPH+oxidase+to+the+establishment+of+hippocampal+neuronal+polarity+in+culture.">Contribution of NADPH oxidase to the establishment of hippocampal neuronal polarity in culture.</a> Journal of Cell Science. 128 (16), 2989-2995 (2015).</li><li>Munnamalai, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+interactions+between+Nox2-type+NADPH+oxidase+and+the+F-actin+cytoskeleton+in+neuronal+growth+cones.">Bidirectional interactions between Nox2-type NADPH oxidase and the F-actin cytoskeleton in neuronal growth cones.</a> Journal of Neurochemistry. 130 (4), 526-540 (2014).</li><li>Kishida, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+plasticity+deficits+and+mild+memory+impairments+in+mouse+models+of+chronic+granulomatous+disease.">Synaptic plasticity deficits and mild memory impairments in mouse models of chronic granulomatous disease.</a> Molecular and Cellular Biology. 26 (15), 5908-5920 (2006).</li><li>Ravelli, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nox2-dependent+neuroinflammation+in+an+EAE+model+of+multiple+sclerosis.">Nox2-dependent neuroinflammation in an EAE model of multiple sclerosis.</a> Translational Neuroscience. 10 (1), 1-9 (2019).</li><li>Park, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nox2-derived+radicals+contribute+to+neurovascular+and+behavioral+dysfunction+in+mice+overexpressing+the+amyloid+precursor+protein.">Nox2-derived radicals contribute to neurovascular and behavioral dysfunction in mice overexpressing the amyloid precursor protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (4), 1347-1352 (2008).</li><li>Schiavone, S., Neri, M., Trabace, L., Turillazzi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NADPH+oxidase+NOX2+mediates+loss+of+parvalbumin+interneurons+in+traumatic+brain+injury:+Human+autoptic+immunohistochemical+evidence.">The NADPH oxidase NOX2 mediates loss of parvalbumin interneurons in traumatic brain injury: Human autoptic immunohistochemical evidence.</a> Scientific Reports. 7 (1), 8752 (2017).</li><li>Gutscher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity-based+protein+thiol+oxidation+by+H2O2-scavenging+peroxidases.">Proximity-based protein thiol oxidation by H2O2-scavenging peroxidases.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (46), 31532-31540 (2009).</li><li>Bilan, D. S., Belousov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+redox+biology:+from+imaging+to+manipulation.">New tools for redox biology: from imaging to manipulation.</a> Free Radical Biology and Medicine. 109, 167-188 (2016).</li><li>Abu-Siniyeh, A., Al-Zyoud, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highlights+on+selected+microscopy+techniques+to+study+zebrafish+developmental+biology.">Highlights on selected microscopy techniques to study zebrafish developmental biology.</a> Laboratory Animal Research. 36 (1), 12 (2020).</li><li>Sassen, W. A., Koster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+toolbox+for+genetic+manipulation+of+zebrafish.">A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish.</a> Advances in Genomics and Genetics. 5, 151-163 (2015).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).</li><li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regular+care+and+maintenance+of+a+Zebrafish+(Danio+rerio)+laboratory:+An+introduction.">Regular care and maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+neuron+culture+for+nerve+growth+and+axon+guidance+studies+in+Zebrafish+(Danio+rerio).">Primary neuron culture for nerve growth and axon guidance studies in Zebrafish (Danio rerio).</a> PLoS One. 8 (3), 57539 (2013).</li><li>Zhang, L., Leung, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdissection+of+zebrafish+embryonic+eye+tissues.">Microdissection of zebrafish embryonic eye tissues.</a> Journal of Visualized Experiments. (40), e2028 (2010).</li><li>Suter, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+of+neuronal+growth+cone+motility+and+duidance+in+vitro.">Live cell imaging of neuronal growth cone motility and duidance in vitro.</a> Cell Migration: Methods in Molecular Biology. , 65-86 (2011).</li><li>Weaver, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=nox2/cybb+deficiency+affects+zebrafish+retinotectal+connectivity.">nox2/cybb deficiency affects zebrafish retinotectal connectivity.</a> Journal of Neuroscience. 38 (26), 5854-5871 (2018).</li><li>Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+EGSH+and+H2O2+with+roGFP2-based+redox+probes.">Measuring EGSH and H2O2 with roGFP2-based redox probes.</a> Free Radical Biology and Medicine. 51, 1943-1951 (2011).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenylthiourea+specifically+reduces+zebrafish+eye+size.">Phenylthiourea specifically reduces zebrafish eye size.</a> PLoS One. 7 (6), 40132 (2012).</li><li>Ermakova, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+fluorescent+genetically+encoded+indicator+for+intracellular+hydrogen+peroxide.">Red fluorescent genetically encoded indicator for intracellular hydrogen peroxide.</a> Nature Communications. 5, 5222 (2014).</li><li>Oparka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+ROS+levels+using+CM-H2DCFDA+and+HyPer.">Quantifying ROS levels using CM-H2DCFDA and HyPer.</a> Methods. 109, 3-11 (2016).</li><li>Dickinson, B. C., Peltier, J., Stone, D., Schaffer, D. V., Chang, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nox2+redox+signaling+maintains+essential+cell+populations+in+the+brain.">Nox2 redox signaling maintains essential cell populations in the brain.</a> Nature Chemical Biology. 7 (2), 106-112 (2011).</li><li>Cannon, M. B., Remington, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox-sensitive+green+fluorescent+protein:+Probes+for+dynamic+intracellular+redox+responses.+A+review.">Redox-sensitive green fluorescent protein: Probes for dynamic intracellular redox responses. A review.</a> Methods in Molecular Biology. 476, 51-65 (2009).</li><li>Meyer, A. J., Dick, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein-based+redox+probes.">Fluorescent protein-based redox probes.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 13 (5), 621-650 (2010).</li><li>Panieri, E., Millia, C., Santoro, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+quantification+of+subcellular+H2O2+and+glutathione+redox+potential+in+living+cardiovascular+tissues.">Real-time quantification of subcellular H2O2 and glutathione redox potential in living cardiovascular tissues.</a> Free Radical Biology and Medicine. 109, 189-200 (2017).</li><li>Breus, O., Dickmeis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+thiol+redox-sensors+in+the+zebrafish+model:+Lessons+for+embryonic+development+and+regeneration.">Genetically encoded thiol redox-sensors in the zebrafish model: Lessons for embryonic development and regeneration.</a> Biological Chemistry. , (2020).</li><li>Morgan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+basal+H2O2+levels+with+peroxiredoxin-based+probes.">Real-time monitoring of basal H2O2 levels with peroxiredoxin-based probes.</a> Nature Chemical Biology. 12 (6), 437-443 (2016).</li><li>Terzi, A., Roeder, H., Weaver, C. J., Suter, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+NADPH+oxidase+2+regulates+growth+cone+guidance+downstream+of+slit2/robo2.">Neuronal NADPH oxidase 2 regulates growth cone guidance downstream of slit2/robo2.</a> Developmental Neurobiology. , (2020).</li><li>Bilan, D. S., Belousov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HyPer+family+probes:+State+of+the+art.">HyPer family probes: State of the art.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 24 (13), 731-751 (2016).</li><li>Ermankova, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SypHer3s:+a+genetically+encoded+fluorescent+ratiometric+probe+with+enhanced+brightness+and+an+improved+dynamic+range.">SypHer3s: a genetically encoded fluorescent ratiometric probe with enhanced brightness and an improved dynamic range.</a> Chemistry Communications. 54 (23), 2898-2901 (2018).</li><li>Pak, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+genetically+encoded+indicator+for+hydrogen+peroxide+identifies+roles+for+the+oxidant+in+cell+migration+and+mitochondrial+function.">Ultrasensitive genetically encoded indicator for hydrogen peroxide identifies roles for the oxidant in cell migration and mitochondrial function.</a> Cell Metabolism. 31 (3), 642-653 (2020).</li><li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tol2kit:+A+multisite+gateway-based+construction+Kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs.">The Tol2kit: A multisite gateway-based construction Kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).</li></ol>

Es gibt mehrere kritische Schritte, die in diesem Protokoll beachtet werden müssen. Wir glauben, dass die Berücksichtigung dieser Punkte den experimentellen Fluss verbessern wird. Für die primäre RGC-Kultur ist die Sterilität des ZFCM(-) sehr wichtig, da dieses Nährmedium keine Antibiotika enthält und vor oder während der Bildgebung eine Kontamination auftreten kann. Um dies zu vermeiden, empfehlen wir, ZFCM(-) nur in einer Biosicherheitswerkbank vorzubereiten und zu verwenden und regelmäßig frische ZFCM(-)-Med...

Die Signalisierung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) reguliert die Entwicklung und Funktion des Nervensystems1. Eine wichtige zelluläre ROS-Quelle sind NADPH-Oxidasen (NOX), bei denen es sich um Transmembranproteine handelt, die Superoxid und Wasserstoffperoxid(H2O2)2erzeugen. NOX-Enzyme finden sich im gesamten zentralen Nervensystem (ZNS), und NOX-abgeleitetes ROS trägt zur neuronalen Entwicklung bei3,4,5,6. Es wurde gezeigt, dass die Erhaltung und Differenzierung neuronaler Stammzellen, die Etablierung neuronaler Polarität, Neuritenauswuchs und synaptischer Plastizität ausreichende Mengen an ROS7,8,9,10,11erfordern . Auf der anderen Seite trägt die unkontrollierte Produktion von ROS durch NOXen zu neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer, Multipler Sklerose und traumatischen Hirnverletzungen bei12,13,14. Daher ist die Produktion von physiologisch relevantem ROS entscheidend für die Aufrechterhaltung gesunder Bedingungen.
Die Entwicklung genetisch kodierter Biosensoren erleichterte den Nachweis von zellulärem ROS erheblich. Ein wichtiger Vorteil genetisch kodierter Biosensoren ist die erhöhte zeitliche und räumliche Auflösung des ROS-Signals, da diese Sensoren gezielt auf unterschiedliche Orte ausgerichtet werden können. Redox-sensitive GFP (roGFP) ist eine Art solcher ROS-Biosensoren. Die roGFP2-Orp1-Variante detektiert spezifischH2O2durch seine Orp1-Domäne, die ein Glutathion-Peroxiredoxin-Familienprotein aus Hefe15,16ist. Die Oxidation des Orp1-Proteins wird auf roGFP2 übertragen, um seine Konformation zu verändern (Abbildung 1A). Die Sonde weist zwei Anregungsspitzen nahe 405 nm und 480 nm sowie einen einzigen Emissionspeak bei 515 nm auf. Bei der Oxidation ändert sich die Fluoreszenzintensität um Anregungsspitzen: Während die Anregung um 405 nm zunimmt, nimmt die Anregung um 480 nm ab. Somit ist roGFP2-Orp1 ein ratiometrischer Biosensor, undH2O2-Spiegelwerden durch das Verhältnis der Fluoreszenzdicken detektiert, die bei zwei verschiedenen Wellenlängen angeregt werden ( Abbildung1B). Insgesamt ist roGFP2-Orp1 ein vielseitiges Werkzeug für die ROS-Bildgebung, das in vivoeffizient eingesetzt werden kann.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62165/62165fig01.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung und Anregungsspektren von roGFP2-Orp1. (A) Oxidationsmitteltransfer findet zwischen Orp1 und roGFP2 als Reaktion aufH2O2statt, was zu Konformationsänderungen in roGFP2 führt. (B) Die Anregungsspektren des roGFP2-Orp1 weisen zwei Anregungspeaks bei 405 nm und 480 nm und einen einzelnen Emissionspeak bei 515 nm auf. Bei Oxidation durchH2O2nimmt die 405 nm Anregung zu, während die 480 nm Anregung abnimmt. Daraus ergibt sich eine ratiometrische Auslesung für H2O2-Anwesenheit. Die Figur wurde von Bilan und Belousov (2017)16 und Morgan et al. (2011)25modifiziert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62165/62165fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Das Modellsystem Danio rerio (Zebrafisch) hat mehrere Vorteile für die Anwendung genetisch kodierter Biosensoren. Die optische Transparenz der Embryonen und Larven ermöglicht eine nicht-invasive In-vivo-Bildgebung. Neue Bildgebungswerkzeuge werden entwickelt, um eine höhere Auflösung und eine tiefere Durchdringung zu erreichen17. Darüber hinaus gibt es etablierte Werkzeuge zur genetischen Manipulation (ektopische mRNA-Expression, Tol2-Transgenese usw.) und Genom-Editing (TALENs, CRISPR/Cas9 usw.), die die Erzeugung transgener Tiere fördern18. Da sich die Zebrafischembryonen außerhalb der Mutter entwickeln, ermöglicht dieses System einen leichteren Zugang und eine einfachere Manipulation der Embryonen. Zum Beispiel können Injektionen und medikamentöse Behandlungen im Einzelzellstadium leicht durchgeführt werden.
Hier verwendeten wir Zebrafische, um denH2O2-spezifischenBiosensor roGFP2-Orp1 transient zu exprimieren, indem wir in vitro-transkribierte mRNA injizierten. Diese Embryonen können sowohl für die In-vitro-Bildgebung von kultivierten Neuronen als auch für die In-vivo-Bildgebung verwendet werden (Abbildung 2). Wir beschreiben ein Protokoll zur Sezierung und Beschichtung von retinalen Ganglienzellen (RGCs) aus Zebrafischembryonen, gefolgt von der Beurteilung derH2O2-Spiegelin kultivierten Neuronen. Anschließend stellen wir eine Methode zur In-vivo-Bildgebung von roGFP2-Orp1-exprimierenden Embryonen und Larven mittels konfokaler Mikroskopie vor. Dieser Ansatz ermöglicht nicht nur dieBestimmung physiologischerH2O2-Spiegel,sondern auch potenzielle Veränderungen, die in verschiedenen Entwicklungsstadien oder -bedingungen auftreten. Insgesamt bietet dieses System eine zuverlässige Methode zum Nachweis vonH2O2inlebenden Zellen und Tieren, um die Rolle vonH2O2in Entwicklung, Gesundheit und Krankheit zu untersuchen.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62165/62165fig03.jpg"> Abbildung 2. Überblick über den experimentellen Ansatz. Kurz gesagt, nach der Embryoentnahme wird roGFP2-Orp1 mRNA in das Eigelb von einzelligen Zebrafischembryonen injiziert. Sich entwickelnde Embryonen können sowohl für (A) in vitro als auch (B) in vivo Bildgebung verwendet werden. (A) GFP-positive Embryonen werden verwendet, um Netzhäute für die RGC-Sammlung bei 34 HPF zu sezieren. Dissoziierte RGCs werden auf PDL/Laminin-beschichteten Deckschichten in ZFCM(+)-Medien plattiert. Wachstumskegelbildgebung kann durchgeführt werden, wenn RGCs ihre Axone nach 6-24 Stunden Beschichtung erweitern. Zellen können verschiedenen Behandlungen unterzogen werden, um die möglichen Veränderungen derH2O2-Spiegelzu messen. Hier haben wirH2O2-Spiegelin den Wachstumskegeln von RGCs (rot) gemessen. (B) GFP-positive Embryonen werden für die In-vivo-Bildgebung verwendet. Im gewünschten Alter können Embryonen betäubt und auf 35 mm Glasbodenschalen für die konfokale Bildgebung montiert werden. Hier werden Embryonen ventral für die netzhautale Bildgebung montiert. Schematisch zeigt die Netzhautentwicklung bei Zebrafischen. RGCs bilden die Ganglienzellschicht (GCL), die die innerste Schicht in der Netzhaut ist. RGC-Axone entwickeln sich zu Sehnerven, um die Mittellinie zu überqueren und optisches Chiasmus zu bilden. Dann wachsen RGC-Axone dorsal, um Synapsen im optischen Tectum im Mittelhirn zu bilden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62165/62165fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35-mm culture dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83-3900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm glass bottom dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP160-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillary Tubes</td>
			<td>Sutter/Fisher Scientific</td>
			<td>NC9029378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2850-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Petri Dishes (100 x 15 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>26140087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma Aldich</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection Mold</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>TU-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23017-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scanning Confocal Microscopy</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium with phenol red</td>
			<td>Gibco/Fisher Scientific</td>
			<td>11-415-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium without phenol red</td>
			<td>Gibco/Fisher Scientific</td>
			<td>21-083-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting agarose</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V2111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMessage mMachine SP6 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0189S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Hyclone/Fisher Scientific</td>
			<td>SH3025601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td>Sigma Aldich</td>
			<td>P0290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma Aldich</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic PicoPump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PV820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine (PDL)</td>
			<td>Sigma Aldich</td>
			<td>P7280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QiaQUICK PCR Purification Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse slit2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>5444-SL-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Sigma Aldich</td>
			<td>P5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steritop 0.22 &#181;m filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>S2GPT05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE Buffer</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine Methanesulfonate</td>
			<td>Sigma Aldich</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Pipette Puller</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>700C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ros live cell imaging during neuronal development

Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) sind gut etablierte Signalmoleküle, die für die normale Entwicklung, Homöostase und Physiologie wichtig sind. Unter den verschiedenen ROS istWasserstoffperoxid (H2O2) am besten in Bezug auf die Rolle in der zellulären Signalübertragung charakterisiert. H2O2 wurde während der Entwicklung an mehreren Arten beteiligt. Beispielsweise wurde in denersten Tagen nach der Befruchtung ein vorübergehender Anstieg vonH2O2 in Zebrafischembryonen nachgewiesen. Darüber hinaus beeinträchtigt die Erschöpfung einer wichtigen zellulärenH2O2-Quelle,der NADPH-Oxidase (NOX), die Entwicklung des Nervensystems wie die Differenzierung, das axonale Wachstum und die Führung von retinalen Ganglienzellen (RGCs) sowohl in vivo als auch in vitro. Hier beschreiben wir eine Methode zurAbbildung intrazellulärer H2O2-Spiegel in kultivierten Zebrafischneuronen und ganzen Larven während der Entwicklung unter Verwendung des genetisch kodiertenH2O2-spezifischenBiosensors roGFP2-Orp1. Diese Sonde kann vorübergehend oder stabil in Zebrafischlarven exprimiert werden. Darüber hinaus verringert die ratiometrische Auslesung die Wahrscheinlichkeit, Artefakte aufgrund differentieller Genexpression oder Volumeneffekte zu erkennen. Zunächst zeigen wir, wie man RGCs aus Zebrafischembryonen isoliert und kultiviert, die vorübergehend roGFP2-Orp1 exprimieren. Dann verwenden wir ganze Larven, um H2O2-Spiegelauf Gewebeebene zu überwachen. Der Sensor wurde durch Zugabe vonH2O2validiert. Darüber hinaus könnte diese Methodik verwendet werden, umH2O2-Spiegelin bestimmten Zelltypen und Geweben zu messen, indem transgene Tiere mit gewebespezifischer Biosensorexpression erzeugt werden. Da Zebrafische genetische und entwicklungswirkende Manipulationen erleichtern, könnte der hier demonstrierte Ansatz als Pipeline dienen, um die Rolle vonH2O2 während der neuronalen und allgemeinen Embryonalentwicklung bei Wirbeltieren zu testen.

Kultivierte Zebrafisch-RGCs verlängern Axone innerhalb von 1d. Ein repräsentatives 405/480-Verhältnisbild des H2O2-Biosensors ist in Abbildung 4A dargestellt. Zellkörper, Axon und Wachstumskegel sind in einzelnen Neuronen deutlich sichtbar. Diese Neuronen können im Laufe der Zeit verschiedenen Behandlungen unterzogen werden, umH2O2-Veränderungenzu überwachen. Wir haben bereits festgestellt, dass die Zugabe von 100 μMH2O2 zu Nähr...

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ROS Live Cell Imaging During Neuronal Development

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung eines genetisch kodierten Wasserstoffperoxid (H2O2)-Biosensors in kultivierten Zebrafischneuronen und Larven zur Beurteilung der physiologischen Signalfunktionen vonH2O2während der Entwicklung des Nervensystems. Es kann auf verschiedene Zelltypen angewendet und mit experimentellen Behandlungen modifiziert werden, um reaktive Sauerstoffspezies (ROS) in der allgemeinen Entwicklung zu untersuchen.

ROS Live Cell Imaging während der neuronalen Entwicklung

Reactive oxygen species (ROS) are well-established signaling molecules, which are important in normal development, homeostasis, and physiology. Among the ...

Unser Protokoll beschreibt die Verwendung eines Wasserstoffperoxid-Biosensors in kultivierten Zebrafischneuronen und Larven. Dieses Protokoll wird den Forschern helfen, die Rolle reaktiver Sauerstoffspezies in der normalen Physiologie und Pathophysiologie zu analysieren. Der Hauptvorteil dieser Technik ist der Echtzeit-Nachweis von Wasserstoffperoxid in lebenden Tieren und kultivierten Zellen.Diese Methode kann auf andere Tiere angewendet werden, wie z.B. das Nagetiermodellsystem. Um die Coverlips vorzubereiten, verwenden Sie säuregereinigte Coverlips, die in 100% Ethanol gelagert sind. Verwenden Sie eine Wende, um einen Abdeckr aus dem Aufbewahrungsbehälter zu entfernen, und flammen Sie ihn auf, um Ethanolreste zu entfernen.Trocknen Sie den Abdeckr vollständig an der Luft, indem Sie ihn schräg in eine 35-Millimeter-Kulturschale legen. Bereiten Sie Poly-D-Lysin oder PDL oder Arbeitslösung vor. Tragen Sie PDL auf die Mitte jedes Coverlips auf, vermeiden Sie eine Ausbreitung der Lösung auf die Kanten und inkubieren Sie die PDL für 20 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur.Stellen Sie sicher, dass die PDL nicht austrocknet. Waschen Sie die PDL mit 0,5 Millilitern sterilem Wasser und lassen Sie die Platten vollständig trocknen. Bereiten Sie Laminin Arbeitslösung vor.Und tragen Sie es auf die Mitte jedes Coverlips auf, um die Ausbreitung der Lösung auf die Kanten zu vermeiden. Inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator für zwei bis sechs Stunden, vermeiden Sie eine Trocknung der Lamininlösung. Um eine Embryodissektion in Platten-Netzhautganglienzellen oder RGCs durchzuführen, bereiten Sie vier 35-Millimeter-Gewebekulturschalen vor, etikettieren sie und füllen Sie sie mit vier Millilitern 70% Ethanol.E2 Media eins. E2 Medien zwei. Und E2 Medien drei, am Tag der Sezierung.Bewahren Sie das Geschirr im Kühlschrank auf. Wenn Zebrafischembryonen 34 Stunden nach der Befruchtung sind, nehmen Sie die mit Laminin beschichteten Kulturschalen aus dem Inkubator. Und waschen Sie den Bezug dreimal mit 0,5 Millilitern 1X PBS.Nach der endgültigen Wäsche vier Milliliter ZFCM+media in jede Kulturschale geben. Vermeiden Sie das Trocknen der Platte. Holen Sie die vorbereiteten gekühlten Kulturgerichte und lassen Sie sie auf Raumtemperatur ausgleichen.Füllen Sie vier bis sechs PCR-Röhrchen mit 15 Mikrolitern ZFCM+media. Holen Sie Zebrafischembryonen aus dem Inkubator und tauchen Sie die Embryonen für 5-10 Sekunden in eine 35-Millimeter-Gewebekulturschale mit 70% Ethanol, um sie zu sterilisieren. Übertragen Sie die Embryonen mit einem Pipettentransfer auf das E2-Medium in einer Schüssel, die sterile E2-Medien enthält, um überschüssiges Ethanol abzuwaschen.Dann übertragen Sie die Embryonen auf die E2-Medien zwei Schalen und entfernen Sie ihre Chorionen mit einer scharfen Zette. Schließlich übertragen Sie embryonen auf die E2-Medien drei Schalen, um Dissektionen durchzuführen. Positionieren und halten Sie die Embryonen mit einer der Zangen mit einer der Zangen vor dem Eigelb.Und entfernen Sie den Schwanz hinter dem Dottersack mit der anderen Zette. Schnappen Sie sich den Hals mit einer Zette und nehmen Sie den Kopf ab, um das Gehirn und die Augen dem E2-Medium auszusetzen. Rollen Sie mit der Spitze einer feinen Zette sanft die Augen vom Kopf ab, während Sie das Schädelgewebe mit einer zweiten Zette nach unten halten.Vier Augen in eines der zuvor vorbereiteten Röhrchen geben, die ZFCM+Gently triturate mit einer p20-Pipette etwa 45 Mal auf und ab, um Zellen zu dissoziieren. Übertragen Sie das ZFCM+ mit den dissoziierten Zellen in die Mitte der Abdeckungsrutsche. Halten Sie Kulturen auf der Tischplatte bei 22 Grad Celsius auf einem Polystyrolschaumgestell, um Vibrationen zu absorbieren.Überprüfen Sie am Tag der Bildgebung die Zellen unter dem Mikroskop, um das Wachstum von RGC-Axonen zu validieren. Für die Lebendzellbildgebung übertragen Sie die Coverlips von der Kulturschale in eine Lebendzellbildgebungskammer. Verwenden Sie ein invertiertes Mikroskop, das mit einem DIC-Objektiv OG-590 Longpass-Rotfilter und einer EMCCD-Kamera ausgestattet ist.Ersetzen Sie vor der Bildgebung das ZFCM+medium durch ZFCM-Nachdem Sie die Zellen mit dem 10X-Objektiv positioniert haben, erfassen Sie Bilder mit 60-facher Vergrößerung mit einem Ölimmersionsobjektiv. Verwenden Sie eine zusätzliche 1,5-fache Vergrößerung. Erfassen Sie zunächst DIC-Bilder.Stellen Sie dann roGFP2-Orp1 mit dem entsprechenden Filterset dar. Nachdem Sie den ersten Satz von Bildern genommen haben, tauschen Sie Medien mit Medien aus, die verschiedene Behandlungslösungen enthalten. Die Medien sollten alle 30 Minuten der Bildgebung gewechselt werden, um pH- und Osmolaritätsänderungen zu vermeiden.Für die In-vivo-Bildgebung 22 bis 24 Stunden nach der Befruchtung Embryonen in E3-Medien aufbewahren, die 0,003% Phenylthioharnstoff ohne Methylenblau enthalten. Tauschen Sie täglich Medien aus und entfernen Sie tote Embryonen. Im gewünschten Alter embryonieren und montieren Sie Embryonen in 1% Agarose auf 35 Millimeter Glasbodenkulturschalen.Embryonen können dorsal, ventral oder seitlich ausgerichtet sein, abhängig von der Region, die für die Bildgebung von Interesse ist. Nachdem die Agarose erstarrt ist, füllen Sie das Geschirr mit E3-Medien ohne Methylenblau, aber mit 0,016% Tricain. Stellen Sie das Mikroskop für die Bildgebung auf.Verwenden Sie ein invertiertes laserscannendes konfokales Mikroskop, um Embryonen abbilden, die auf dem Boden eines Agarosetropfens montiert sind. Regen Sie roGFP2-Orp1 an und erfassen Sie entsprechende Bilder mit den gewünschten Emissionsfiltern. Erwerben Sie Z-Stacks mit einer Schnittstärke von fünf Mikrometern durch den gewünschten Teil der Embryonen.Nach der Bildgebung embryonieren Sie mit einer feinen Zette aus Agarose und halten sie im Inkubator und methylenblauen freien Medien mit Phenylthioharnstoff bis zum gewünschten Alter. Ein repräsentatives Bild des Wasserstoffperoxid-Biosensors und der kultivierten Zebrafisch-RGC-verlängerten Axone ist hier zu sehen. Zellkörper, Axon und Wachstumskegel sind in einzelnen Neuronen deutlich sichtbar.Die Zugabe von Wasserstoffperoxid zu den Nährmedien erhöht die Verhältniswerte und zeigt, dass mit diesem System Veränderungen in Echtzeit erkannt werden können. Die Quantifizierung des Wasserstoffperoxidgehalts wird in Panel-B.To Bestimmung des Wasserstoffperoxidgehalts in ganzen Zebrafischembryonen gezeigt, die mRNA wurde während der einzelligen Phase injiziert, wodurch alle Gewebe den roGFP2-Orp1-Biosensor exprimieren. Die Kopfregion von Zebrafischlarven wird zu zwei verschiedenen Zeitpunkten gezeigt, wobei der Schwerpunkt auf dem Wasserstoffperoxidgehalt in der Netzhaut liegt.Die Basalwerte von Wasserstoffperoxid in den Zebrafischembryonen wurden zwei Tage nach der Befruchtung und fünf Tage nach der Befruchtung gemessen. An zwei Tagen nach der Befruchtung waren die Verhältniswerte signifikant niedriger als an fünf Tagen nach der Befruchtung. Darüber hinaus zeigte jedes Tier einen unterschiedlichen Anstieg seines retinalen Wasserstoffperoxidgehalts.Die Verwendung einer feinen Zette zum Entfernen der Augen und eine sanfte Dissoziation der Augen mit der Pipette sind die kritischsten Schritte bei diesem Verfahren. Diesem Protokoll können medikamentöse Behandlungen folgen, um die Faktoren zu untersuchen, die an der ROS-Signalisierung beteiligt sind.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-Cell-Imaging von Sinnesorgan Vorläuferzellen im Intact Drosophila Puppen

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Forschung

Neurowissenschaften

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

Live-Imaging von Spinalganglien Axone nach Rhizotomie

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

Hochauflösende Live-Bildgebung von Zell-Verhalten in der Entwicklung von Neuroepithel

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Ex vivo Live-Imaging von Single Cell Divisionen in Maus Neuroepithel

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Live-Imaging der Mitose in der Entwicklung von embryonalen Maus-Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

Kombinierte Methodiken Verwendung der Rolle der Plasmamembran Lieferung Während Axon Branching und Neuronale Morphogenese zu definieren

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

Analyse dendritischer Morphologie in Spalten und Schichten

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

In Vivo Calcium Imaging der Seitenlinie Haarzellen im Larvenstadium Zebrafisch

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Vorbereitung von Adult Drosophila melanogaster für die Bildgebung des gesamten Gehirns während des Verhaltens und der Stimuli-Reaktionen

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...