Name: ros live cell imaging during neuronal development
Uploaded: 2021-02-09T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about ROS Live Cell Imaging During Neuronal Development at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health (Grant R01NS117701), dalla National Science Foundation (Grant 1146944-IOS), dall'Indiana Traumatic Spinal Cord and Brain Injury Research Fund (Grant 20000289), dalla Purdue Research Foundation (Grant 209911) e dall'Ufficio del Vice Presidente Esecutivo per la Ricerca e i Partenariati presso la Purdue University (Grant 210362). Ringraziamo il Dr. Cory J. Weaver e Haley Roeder per aver stabilito il protocollo culturale RGC zebrafish. Ringraziamo inoltre Haley Roeder per aver fornito i dati della Figura 4. Ringraziamo Leah Biasi e Kenny Nguyen per l'aiuto con la cultura RGC. Ringraziamo Gentry Lee per aver modificato il testo. Ringraziamo il Dr. Tobias Dick per aver fornito roGFP2-Orp1 e Dr. Qing Deng per il vettore pCS2+ contenente roGFP2-Orp1. La figura 2 viene creata con Biorender.com.

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati esaminati e approvati eticamente dal Purdue Animal Care and Use Committee (PACUC), seguendo le linee guida NIH con il protocollo 2006002050 approvato il 24/07/2020.
1. Preparazione di soluzioni
<ol><li>Supporti E2 (1x)<ol>
<li>Preparare soluzioni E2A (500 mL), 500x E2B (100 mL) e 500x E2C (100 mL) combinando tutti i componenti mostrati nella tabella 1. Soluzioni Autoclave E2A, E2B ed E2C. Conservare a 4 °C.</li>
		<li>Per 1 sup...

<ol>
	<li>B&#243;rquez, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+role+of+redox+signaling+in+neuronal+development.">Dissecting the role of redox signaling in neuronal development.</a> Journal of Neurochemistry. 137 (4), 506-517 (2016).</li><li>Bedard, K., Krause, K. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NOX+family+of+ROS-generating+NADPH+oxidases:+Physiology+and+pathophysiology.">The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: Physiology and pathophysiology.</a> Physiological Reviews. 87 (1), 245-313 (2007).</li><li>Weaver, C. J., Leung, Y. F., Suter, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+dynamics+of+NADPH+oxidases+during+early+zebrafish+development.">Expression dynamics of NADPH oxidases during early zebrafish development.</a> Journal of Comparative Neurology. 524 (10), 2130-2141 (2016).</li><li>Terzi, A., Suter, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+NADPH+oxidases+in+neuronal+development.">The role of NADPH oxidases in neuronal development.</a> Free Radical Biology and Medicine. 154, 33-47 (2020).</li><li>Infanger, D. W., Sharma, R. V., Davisson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidases+of+the+brain:+Distribution,+regulation,+and+function.">NADPH oxidases of the brain: Distribution, regulation, and function.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 8 (9-10), 1583-1596 (2006).</li><li>Coyoy, A., Olguin-Albuerne, M., Martinez-Briseno, P., Moran, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+reactive+oxygen+species+and+NADPH-oxidase+in+the+development+of+rat+cerebellum.">Role of reactive oxygen species and NADPH-oxidase in the development of rat cerebellum.</a> Neurochemistry International. 62 (7), 998-1011 (2013).</li><li>Le Belle, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferative+neural+stem+cells+have+high+endogenous+ROS+levels+that+regulate+self-renewal+and+neurogenesis+in+a+PI3K/Akt-dependant+manner.">Proliferative neural stem cells have high endogenous ROS levels that regulate self-renewal and neurogenesis in a PI3K/Akt-dependant manner.</a> Cell Stem Cell. 8 (1), 59-71 (2011).</li><li>Nayernia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+neural+precursor+cell+pool+in+NADPH+oxidase+2-deficiency:+from+mouse+brain+to+neural+differentiation+of+patient+derived+iPSC.">Decreased neural precursor cell pool in NADPH oxidase 2-deficiency: from mouse brain to neural differentiation of patient derived iPSC.</a> Redox Biology. 13, 82-93 (2017).</li><li>Wilson, C., Nunez, M. T., Gonz&#225;lez-Billault, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+NADPH+oxidase+to+the+establishment+of+hippocampal+neuronal+polarity+in+culture.">Contribution of NADPH oxidase to the establishment of hippocampal neuronal polarity in culture.</a> Journal of Cell Science. 128 (16), 2989-2995 (2015).</li><li>Munnamalai, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+interactions+between+Nox2-type+NADPH+oxidase+and+the+F-actin+cytoskeleton+in+neuronal+growth+cones.">Bidirectional interactions between Nox2-type NADPH oxidase and the F-actin cytoskeleton in neuronal growth cones.</a> Journal of Neurochemistry. 130 (4), 526-540 (2014).</li><li>Kishida, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+plasticity+deficits+and+mild+memory+impairments+in+mouse+models+of+chronic+granulomatous+disease.">Synaptic plasticity deficits and mild memory impairments in mouse models of chronic granulomatous disease.</a> Molecular and Cellular Biology. 26 (15), 5908-5920 (2006).</li><li>Ravelli, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nox2-dependent+neuroinflammation+in+an+EAE+model+of+multiple+sclerosis.">Nox2-dependent neuroinflammation in an EAE model of multiple sclerosis.</a> Translational Neuroscience. 10 (1), 1-9 (2019).</li><li>Park, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nox2-derived+radicals+contribute+to+neurovascular+and+behavioral+dysfunction+in+mice+overexpressing+the+amyloid+precursor+protein.">Nox2-derived radicals contribute to neurovascular and behavioral dysfunction in mice overexpressing the amyloid precursor protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (4), 1347-1352 (2008).</li><li>Schiavone, S., Neri, M., Trabace, L., Turillazzi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NADPH+oxidase+NOX2+mediates+loss+of+parvalbumin+interneurons+in+traumatic+brain+injury:+Human+autoptic+immunohistochemical+evidence.">The NADPH oxidase NOX2 mediates loss of parvalbumin interneurons in traumatic brain injury: Human autoptic immunohistochemical evidence.</a> Scientific Reports. 7 (1), 8752 (2017).</li><li>Gutscher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity-based+protein+thiol+oxidation+by+H2O2-scavenging+peroxidases.">Proximity-based protein thiol oxidation by H2O2-scavenging peroxidases.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (46), 31532-31540 (2009).</li><li>Bilan, D. S., Belousov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+redox+biology:+from+imaging+to+manipulation.">New tools for redox biology: from imaging to manipulation.</a> Free Radical Biology and Medicine. 109, 167-188 (2016).</li><li>Abu-Siniyeh, A., Al-Zyoud, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highlights+on+selected+microscopy+techniques+to+study+zebrafish+developmental+biology.">Highlights on selected microscopy techniques to study zebrafish developmental biology.</a> Laboratory Animal Research. 36 (1), 12 (2020).</li><li>Sassen, W. A., Koster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+toolbox+for+genetic+manipulation+of+zebrafish.">A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish.</a> Advances in Genomics and Genetics. 5, 151-163 (2015).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).</li><li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regular+care+and+maintenance+of+a+Zebrafish+(Danio+rerio)+laboratory:+An+introduction.">Regular care and maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+neuron+culture+for+nerve+growth+and+axon+guidance+studies+in+Zebrafish+(Danio+rerio).">Primary neuron culture for nerve growth and axon guidance studies in Zebrafish (Danio rerio).</a> PLoS One. 8 (3), 57539 (2013).</li><li>Zhang, L., Leung, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdissection+of+zebrafish+embryonic+eye+tissues.">Microdissection of zebrafish embryonic eye tissues.</a> Journal of Visualized Experiments. (40), e2028 (2010).</li><li>Suter, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+of+neuronal+growth+cone+motility+and+duidance+in+vitro.">Live cell imaging of neuronal growth cone motility and duidance in vitro.</a> Cell Migration: Methods in Molecular Biology. , 65-86 (2011).</li><li>Weaver, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=nox2/cybb+deficiency+affects+zebrafish+retinotectal+connectivity.">nox2/cybb deficiency affects zebrafish retinotectal connectivity.</a> Journal of Neuroscience. 38 (26), 5854-5871 (2018).</li><li>Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+EGSH+and+H2O2+with+roGFP2-based+redox+probes.">Measuring EGSH and H2O2 with roGFP2-based redox probes.</a> Free Radical Biology and Medicine. 51, 1943-1951 (2011).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenylthiourea+specifically+reduces+zebrafish+eye+size.">Phenylthiourea specifically reduces zebrafish eye size.</a> PLoS One. 7 (6), 40132 (2012).</li><li>Ermakova, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+fluorescent+genetically+encoded+indicator+for+intracellular+hydrogen+peroxide.">Red fluorescent genetically encoded indicator for intracellular hydrogen peroxide.</a> Nature Communications. 5, 5222 (2014).</li><li>Oparka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+ROS+levels+using+CM-H2DCFDA+and+HyPer.">Quantifying ROS levels using CM-H2DCFDA and HyPer.</a> Methods. 109, 3-11 (2016).</li><li>Dickinson, B. C., Peltier, J., Stone, D., Schaffer, D. V., Chang, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nox2+redox+signaling+maintains+essential+cell+populations+in+the+brain.">Nox2 redox signaling maintains essential cell populations in the brain.</a> Nature Chemical Biology. 7 (2), 106-112 (2011).</li><li>Cannon, M. B., Remington, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox-sensitive+green+fluorescent+protein:+Probes+for+dynamic+intracellular+redox+responses.+A+review.">Redox-sensitive green fluorescent protein: Probes for dynamic intracellular redox responses. A review.</a> Methods in Molecular Biology. 476, 51-65 (2009).</li><li>Meyer, A. J., Dick, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein-based+redox+probes.">Fluorescent protein-based redox probes.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 13 (5), 621-650 (2010).</li><li>Panieri, E., Millia, C., Santoro, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+quantification+of+subcellular+H2O2+and+glutathione+redox+potential+in+living+cardiovascular+tissues.">Real-time quantification of subcellular H2O2 and glutathione redox potential in living cardiovascular tissues.</a> Free Radical Biology and Medicine. 109, 189-200 (2017).</li><li>Breus, O., Dickmeis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+thiol+redox-sensors+in+the+zebrafish+model:+Lessons+for+embryonic+development+and+regeneration.">Genetically encoded thiol redox-sensors in the zebrafish model: Lessons for embryonic development and regeneration.</a> Biological Chemistry. , (2020).</li><li>Morgan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+basal+H2O2+levels+with+peroxiredoxin-based+probes.">Real-time monitoring of basal H2O2 levels with peroxiredoxin-based probes.</a> Nature Chemical Biology. 12 (6), 437-443 (2016).</li><li>Terzi, A., Roeder, H., Weaver, C. J., Suter, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+NADPH+oxidase+2+regulates+growth+cone+guidance+downstream+of+slit2/robo2.">Neuronal NADPH oxidase 2 regulates growth cone guidance downstream of slit2/robo2.</a> Developmental Neurobiology. , (2020).</li><li>Bilan, D. S., Belousov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HyPer+family+probes:+State+of+the+art.">HyPer family probes: State of the art.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 24 (13), 731-751 (2016).</li><li>Ermankova, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SypHer3s:+a+genetically+encoded+fluorescent+ratiometric+probe+with+enhanced+brightness+and+an+improved+dynamic+range.">SypHer3s: a genetically encoded fluorescent ratiometric probe with enhanced brightness and an improved dynamic range.</a> Chemistry Communications. 54 (23), 2898-2901 (2018).</li><li>Pak, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+genetically+encoded+indicator+for+hydrogen+peroxide+identifies+roles+for+the+oxidant+in+cell+migration+and+mitochondrial+function.">Ultrasensitive genetically encoded indicator for hydrogen peroxide identifies roles for the oxidant in cell migration and mitochondrial function.</a> Cell Metabolism. 31 (3), 642-653 (2020).</li><li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tol2kit:+A+multisite+gateway-based+construction+Kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs.">The Tol2kit: A multisite gateway-based construction Kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).</li></ol>

Ci sono diversi passaggi critici che necessitano di attenzione in tutto questo protocollo. Riteniamo che considerare questi punti migliorerà il flusso sperimentale. Per la coltura RGC primaria, la sterilità dello ZFCM(-) è molto importante, poiché questo supporto di coltura non contiene antibiotici e la contaminazione può verificarsi prima o durante l'imaging. Per evitarlo, si consiglia di preparare e utilizzare ZFCM(-) solo all'interno di un armadio di biosicurezza e realizzare regolarmente nuovi supporti ZFCM(-) (...

La segnalazione reattiva delle specie di ossigeno (ROS) regola lo sviluppo e il funzionamento del sistemanervoso 1. Un'importante fonte cellulare di ROS sono le ossidasi NADPH (NOX), che sono proteine transmembrana che generano superossido e perossido di idrogeno (H2O2)2. Gli enzimi NOX si trovano in tutto il sistema nervoso centrale (SNC) e il ROS derivato dal NOX contribuisce allo svilupponeuronale 3,4,5,6. Il mantenimento e la differenziazione delle cellule staminali neurali, stabilendo polarità neuronale, crescita della neurite e plasticità sinaptica hanno dimostrato di richiedere livelli adeguati di ROS7,8,9,10,11. D'altra parte, la produzione incontrollata di ROS da parte dei NOX contribuisce a disturbi neurodegenerativi tra cui il morbo di Alzheimer, la sclerosi multipla e la lesione cerebraletraumatica 12,13,14. Pertanto, la produzione di ROS fisiologicamente rilevante è fondamentale per mantenere condizioni sane.
Lo sviluppo di biosensori geneticamente codificati ha facilitato notevolmente il rilevamento del ROS cellulare. Un importante vantaggio dei biosensori geneticamente codificati è l'aumento della risoluzione temporale e spaziale del segnale ROS, poiché questi sensori possono essere specificamente mirati a posizioni distinte. La GFP sensibile ai redox (roGFP) è un tipo di biosensori ROS di questo tipo. La variante roGFP2-Orp1 rileva specificamente H2O2 attraverso il suo dominio Orp1, che è una proteina della famiglia glutatione perossiredossina dallievito 15,16. L'ossidazione della proteina Orp1 viene trasferita al roGFP2 per alterarne la conformazione (Figura 1A). La sonda presenta due picchi di eccitazione vicino a 405 nm e 480 nm e un singolo picco di emissione a 515 nm. All'ossidazione, l'intensità di fluorescenza intorno ai picchi di eccitazione cambia: mentre aumenta l'eccitazione di 405 nm, diminuisce l'eccitazione di 480 nm. Pertanto, roGFP2-Orp1 è un biosensore ratiometrico, e i livelli H2O2 sonorilevati dal rapporto di intensità di fluorescenza eccitate a due diverse lunghezze d'onda (Figura 1B). Nel complesso, roGFP2-Orp1 è uno strumento versatile per l'imaging ROS che può essere utilizzato in modo efficiente in vivo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62165/62165fig01.jpg"> Figura 1: Rappresentazione schematica e spettri di eccitazione del trasferimento ossidante roGFP2-Orp1. (A) avviene tra Orp1 e roGFP2 in risposta a H2O2,portando a cambiamenti conformazionali nel roGFP2. (B) Gli spettri di eccitazione del roGFP2-Orp1 presentano due picchi di eccitazione a 405 nm e 480 nm e un picco di emissione singola a 515 nm. All'ossidazione di H2O2, l'eccitazione di 405 nm aumenta mentre l'eccitazione di 480 nm diminuisce. Ciò si traduce in una lettura ratiometrica per la presenza di H2O2. La cifra è stata modificata da Bilan e Belousov (2017)16 e Morgan et al. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62165/62165fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Il sistema di modelli Danio rerio (zebrafish) presenta diversi vantaggi per l'applicazione di biosensori geneticamente codificati. La trasparenza ottica degli embrioni e delle larve consente l'imaging in vivo non invasivo. Sono in fase di sviluppo nuovi strumenti di imaging per ottenere una risoluzione più elevata e una penetrazionepiù profonda 17. Inoltre, esistono strumenti consolidati per la manipolazione genetica (espressione ectopica di mRNA, transgenesi Tol2, ecc.) e l'editing del genoma (TALEN, CRISPR / Cas9, ecc.), che promuove la generazione di animali transgenici18. Man mano che gli embrioni di zebrafish si sviluppano al di fuori della madre, questo sistema consente ulteriormente un accesso e una manipolazione più facili degli embrioni. Ad esempio, le iniezioni a uno stadio e i trattamenti farmacologici possono essere facilmente eseguiti.
Qui, abbiamo usato il pesce zebra per esprimere transitoriamente il biosensore specifico H2O2roGFP2-Orp1 iniettando mRNA trascritto in vitro. Questi embrioni possono essere utilizzati sia per l'imaging in vitro di neuroni coltivati che per l'imaging in vivo ( Figura2). Descriviamo un protocollo per la sezionatura e la placcatura delle cellule gangliari retiniche (GRGC) da embrioni di zebrafish seguito dalla valutazione dei livelli di H2O2nei neuroni coltivati. Quindi, presentiamo un metodo per l'imaging in vivo di embrioni e larve che esprimono roGFP2-Orp1 usando la microscopia confocale. Questo approccio non solo consente di determinare i livelli fisiologici di H2O2,ma anche i potenziali cambiamenti che si verificano in diversi stadi o condizioni di sviluppo. Nel complesso, questo sistema fornisce un metodo affidabile per rilevare H2O2 in cellule vive e animali per studiare il ruolo di H2O2 nello sviluppo, nella salute e nelle malattie.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62165/62165fig03.jpg"> Figura 2. Schema dell'approccio sperimentale. In breve, dopo la raccolta dell'embrione, l'mRNA roGFP2-Orp1 viene iniettato nel tuorlo di embrioni zebrafish a una cellula. Gli embrioni in via di sviluppo possono essere utilizzati sia perl'imaging in vitro ( A ) che perl'imaging in vivo ( B ). (A) Gli embrioni positivi alla GFP vengono utilizzati per sezionare retine per la raccolta RGC a 34 hpf. Le RGC dissociate sono placcate su coverlips rivestite in PDL/laminina in supporti ZFCM (+). L'imaging del cono di crescita può essere condotto mentre le RGC estendono i loro assoni dopo 6-24 ore di placcatura. Le cellule possono essere sottoposte a diversi trattamenti per misurare i potenziali cambiamenti nei livelli H2O2. Qui, abbiamo misurato ilivelli H 2O2nei coni di crescita delle GRGC (rosso). (B) Gli embrioni positivi alla GFP sono utilizzati per l'imaging in vivo. All'età desiderata, gli embrioni possono essere anestetizzati e montati su piatti di fondo in vetro da 35 mm per l'imaging confocale. Qui, gli embrioni sono montati ventralmente per l'imaging retinale. Schema mostra lo sviluppo retinale nel pesce zebra. Le GRGC formano lo strato cellulare ganglionale (GCL), che è lo strato più interno della retina. Gli assoni RGC si sviluppano nel nervo ottico per attraversare la linea mediana, formando chiasmo ottico. Quindi, gli assoni RGC crescono dorsalmente per fare sinapsi nel tectum ottico nel midbrain. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62165/62165fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35-mm culture dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83-3900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm glass bottom dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP160-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillary Tubes</td>
			<td>Sutter/Fisher Scientific</td>
			<td>NC9029378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2850-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Petri Dishes (100 x 15 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>26140087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma Aldich</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection Mold</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>TU-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23017-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scanning Confocal Microscopy</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium with phenol red</td>
			<td>Gibco/Fisher Scientific</td>
			<td>11-415-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium without phenol red</td>
			<td>Gibco/Fisher Scientific</td>
			<td>21-083-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting agarose</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V2111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMessage mMachine SP6 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0189S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Hyclone/Fisher Scientific</td>
			<td>SH3025601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td>Sigma Aldich</td>
			<td>P0290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma Aldich</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic PicoPump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PV820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine (PDL)</td>
			<td>Sigma Aldich</td>
			<td>P7280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QiaQUICK PCR Purification Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse slit2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>5444-SL-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Sigma Aldich</td>
			<td>P5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steritop 0.22 &#181;m filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>S2GPT05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE Buffer</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine Methanesulfonate</td>
			<td>Sigma Aldich</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Pipette Puller</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>700C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ros live cell imaging during neuronal development

Le specie reattive dell'ossigeno (ROS) sono molecole di segnalazione ben consolidate, che sono importanti nello sviluppo normale, nell'omeostasi e nella fisiologia. Tra i diversi ROS, il perossido di idrogeno (H2O2) è meglio caratterizzato rispetto ai ruoli nella segnalazione cellulare. H2O2 è stato implicato durante lo sviluppo in diverse specie. Ad esempio, un aumento transitorio di H2O2 è stato rilevato negli embrioni di zebrafish durante i primi giorni successivi alla fecondazione. Inoltre, l'esaurimento di un'importante sorgente cellulare H2O2, la NADPH ossidasi (NOX), compromette lo sviluppo del sistema nervoso come la differenziazione, la crescita assonale e la guida delle cellule gangliari retiniche (GRGC) sia in vivo che in vitro. Qui descriviamo un metodo per l'imaging dei livelli intracellulari H2O2 nei neuroni zebrafish coltivati e nelle larve intere durante lo sviluppo utilizzando il biosensore specifico di H2O2geneticamente codificato, roGFP2-Orp1. Questa sonda può essere espressa transitoriamente o stabilmente nelle larve di zebrafish. Inoltre, la lettura ratiometrica riduce la probabilità di rilevare artefatti dovuti all'espressione genica differenziale o agli effetti di volume. In primo luogo, dimostriamo come isolare e coltura le RGC derivate da embrioni di zebrafish che esprimono transitoriamente roGFP2-Orp1. Quindi, usiamo larve intere per monitorare i livelli di H2O2 a livello di tessuto. Il sensore è stato convalidato con l'aggiunta di H2O2. Inoltre, questa metodologia potrebbe essere utilizzata per misurare i livelli di H2O2 in specifici tipi cellulari e tessuti generando animali transgenici con espressione biosensore specifica del tessuto. Poiché i pesci zebra facilitano le manipolazioni genetiche e dello sviluppo, l'approccio dimostrato qui potrebbe servire come pipeline per testare il ruolo di H2O2 durante lo sviluppo embrionale neuronale e generale nei vertebrati.

Le RGC zebrafish coltivate estendono gli assoni entro 1 d. Un'immagine rappresentativa del rapporto 405/480 del biosensore H2O2è illustrata nella figura 4A. Il corpo cellulare, l'assone e i coni di crescita sono chiaramente visibili nei singoli neuroni. Questi neuroni possono essere sottoposti a diversi trattamenti nel tempo per monitorare i cambiamentiH 2O2. In precedenza abbiamo scoperto che l'aggiunta di 100 μM H2O 2 ai supporti<sub...

Watch this Scientific Journal Video about ROS Live Cell Imaging During Neuronal Development at JoVE.com

ROS Live Cell Imaging During Neuronal Development

Questo protocollo descrive l'uso di un perossido di idrogeno geneticamente codificato (H2O2)biosensore nei neuroni e nelle larve di zebrafish coltivati per valutare i ruoli fisiologici di segnalazione di H2O2 durante lo sviluppo del sistema nervoso. Può essere applicato a diversi tipi di cellule e modificato con trattamenti sperimentali per studiare specie reattive dell'ossigeno (ROS) in generale sviluppo.

Imaging cellulare vivo ROS durante lo sviluppo neuronale

Reactive oxygen species (ROS) are well-established signaling molecules, which are important in normal development, homeostasis, and physiology. Among the ...

Il nostro protocollo descrive l'uso di un biosensore di perossido di idrogeno in neuroni e larve di zebrafish coltivati. Questo protocollo aiuterà i ricercatori a sezionare il ruolo delle specie reattive dell'ossigeno nella fisiologia e fisiopatologia normali. Il principale vantaggio di questa tecnica è il rilevamento in tempo reale del perossido di idrogeno negli animali viventi e nelle cellule coltivate.Questo metodo può essere applicato ad altri animali, come il sistema di modelli di roditori. Per preparare i copricapo, utilizzare coverlips puliti con acido conservati in 100%etanolo. Utilizzare le forcep per rimuovere una coverlip dal contenitore di stoccaggio e fiammarla per rimuovere l'etanolo residuo.Asciugare completamente il coverslip posizionandolo ad angolo all'interno di un piatto di coltura di 35 millimetri. Preparare poli-D-lysine o PDL o soluzione di lavoro. Applicare PDL al centro di ogni coverlip, evitando la diffusione della soluzione ai bordi e incubare il PDL per 20-30 minuti a temperatura ambiente.Assicurarsi che il PDL non si asciughi. Lavare il PDL con 0,5 millilitri di acqua sterile e lasciare asciugare completamente le piastre. Preparare la soluzione di lavoro laminina.E applicarlo al centro di ogni coverlip, assicurandosi di evitare la diffusione della soluzione ai bordi. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato per due o sei ore, evitare un'essiccazione della soluzione laminina. Per eseguire una dissezione embrionale in cellule gangliari retiniche a piastre o RGC, preparare ed etichettare quattro piatti di coltura tissutale da 35 millimetri e riempirli con quattro millilitri di etanolo al 70%.E2 media uno. E2 media due. E E2 media tre, il giorno della dissezione.Tieni i piatti in frigo. Quando gli embrioni di zebrafish sono 34 ore dopo la fecondazione, togliere dall'incubatrice i piatti di coltura ricoperti di laminina. E lavare la copertura scivola tre volte con 0,5 millilitri di 1X PBS.Dopo il lavaggio finale, aggiungere quattro millilitri di ZFCM + media a ogni piatto di coltura. Evitare di asciugare la piastra. Recupera i piatti di coltura refrigerati preparati e lasciali equilibrare a temperatura ambiente.Riempire da quattro a sei tubi PCR con 15 microlitri di supporti ZFCM+. Recupera embrioni di zebrafish dall'incubatrice e immergi gli embrioni in un piatto di coltura tissutale da 35 millimetri contenente il 70% di etanolo per 5-10 secondi per sterilizzarlo. Utilizzando un trasferimento di pipetta, trasferire gli embrioni sul supporto E2 un piatto, contenente mezzi E2 sterili per lavare via l'etanolo in eccesso.Quindi, trasferire gli embrioni sul supporto E2 due piatti e rimuovere i loro corioni con force affilate.i. Infine, trasferire gli embrioni sul supporto E2 tre piatti per eseguire dissezioni. Usando un paio di forcep fini, posizionare e tenere gli embrioni anteriori al tuorlo con una delle forcep.E rimuovere la coda posteriore al sacco tuorlo con le altre forcep. Afferra il collo con le alessa e togliti la testa per esporre il cervello e gli occhi ai media E2. Con la punta delle forcep sottili, rotolare delicatamente gli occhi dalla testa tenendo il tessuto cranici verso il basso con una seconda forza.Trasferire quattro occhi su uno dei tubi precedentemente preparati contenenti ZFCM+Triturare delicatamente su e giù con una pipetta p20 circa 45 volte per dissociare le cellule. Trasferire lo ZFCM+ con le celle dissociate al centro dei copripaspa. Mantenere le colture sul piano del banco a 22 gradi Celsius su un rack in schiuma di polistirolo per assorbire le vibrazioni.Il giorno dell'imaging, controllare le cellule al microscopio per convalidare la crescita degli assoni RGC. Per l'imaging di cellule vive, trasferire i coprispavimenti dal piatto di coltura a una camera di imaging cellulare viva. Utilizzare un microscopio invertito dotato di un filtro rosso DIC oG-590 Longpass e di una fotocamera EMCCD.Prima dell'imaging, sostituire zfcm+medium con ZFCM-After posizionando le celle con l'obiettivo 10X, acquisire immagini con ingrandimento 60X utilizzando un obiettivo di immersione dell'olio. Utilizzare un ingrandimento aggiuntivo di 1,5X. Acquisire prima le immagini DIC.Quindi, image roGFP2-Orp1, utilizzando il set di filtri appropriato. Dopo aver scattato la prima serie di immagini, scambia i media con supporti contenenti diverse soluzioni di trattamento. I supporti devono essere cambiati ogni 30 minuti di imaging per evitare cambiamenti di pH e osmolarità.Per l'imaging in vivo, conservare embrioni post-fecondazione da 22 a 24 ore in mezzi E3, contenenti 0,003%fenil tiourea senza blu di metilene. Scambia media e rimuovi quotidianamente embrioni morti. All'età desiderata, anestetizza e monta embrioni in 1%agarosio su piatti di coltura del fondo di vetro da 35 millimetri.Gli embrioni possono essere orientati dorsalmente, ventralmente o lateralmente, a seconda della regione di interesse per l'imaging. Dopo che l'agarosio si solidifica, riempire i piatti con mezzi E3 senza blu metilene, ma con 0,016%tricaina. Impostare il microscopio per l'imaging.Utilizzare un microscopio confocale a scansione laser invertita per immagini embrioni montati sul fondo di una goccia di agarosio. Eccitare roGFP2-Orp1 e acquisire immagini corrispondenti con i filtri di emissione desiderati. Acquisire pile z con cinque micrometro di spessore della sezione attraverso la parte desiderata degli embrioni.Dopo l'imaging, rimuovere gli embrioni dall'Agarosio con forceps fini e tenerli nell'incubatrice e media senza blu di metilene con fenil tiourea fino all'età desiderata. Qui viene mostrata un'immagine rappresentativa del biosensore perossido di idrogeno e degli assoni estesi RGC di zebrafish coltivati. Il corpo cellulare, l'assone e i coni di crescita sono chiaramente visibili nei singoli neuroni.L'aggiunta di perossido di idrogeno ai mezzi di coltura aumenta i valori del rapporto, dimostrando che i cambiamenti in tempo reale possono essere rilevati con questo sistema. La quantificazione dei livelli di perossido di idrogeno è mostrata nel pannello B.To determinare i livelli di perossido di idrogeno in interi embrioni di zebrafish, l'mRNA è stato iniettato durante la fase di una cellula, facendo sì che tutti i tessuti esprimesse il biosensore roGFP2-Orp1. La regione testa delle larve di zebrafish è mostrata in due diversi punti di tempo, concentrandosi sui livelli di perossido di idrogeno nella retina.Sono stati misurati i livelli basali di perossido di idrogeno negli embrioni di zebrafish a due giorni dopo la fecondazione e cinque giorni dopo la fecondazione. A due giorni dalla fecondazione, i valori del rapporto erano significativamente inferiori rispetto a cinque giorni dopo la fecondazione. Inoltre, ogni animale ha mostrato un diverso livello di aumento del contenuto di perossido di idrogeno retinico.L'uso di forcep fini per rimuovere gli occhi e una delicata dissociazione degli occhi con la pipetta sono i passaggi più critici in questa procedura. Questo protocollo può essere seguito da trattamenti farmacologici per indagare i fattori coinvolti nella segnalazione ROS.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cellula Imaging di cellule sensoriali Precursore in Organo intatto Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Ricerca

Neuroscienze

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

Imaging in diretta degli assoni spinali dopo rizotomia

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

Imaging ad alta risoluzione dal vivo del comportamento delle cellule in via di sviluppo neuroepitelio

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Ex vivo Imaging in diretta di divisioni cellulari singoli in mouse neuroepitelio

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Immagini dal vivo della mitosi in via di sviluppo embrionali di topo Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

Utilizzando metodologie combinati per definire il ruolo della membrana plasmatica di consegna Durante Axon ramificazione e neuronale morfogenesi

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

Analizzando dendritiche Morfologia in colonne e strati

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

Nel calcio in Vivo Imaging delle cellule ciliate linea laterale in Zebrafish larvale

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Preparazione della Drosophila melanogaster adulta per l'imaging cerebrale intero durante il comportamento e le risposte agli stimoli

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...