Name: ros live cell imaging during neuronal development
Uploaded: 2021-02-09T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about ROS Live Cell Imaging During Neuronal Development at JoVE.com

이 작품은 국립 보건원 (그랜트 R01NS117701), 국립 과학 재단 (그랜트 1146944-IOS), 인디애나 외상척수및 뇌 손상 연구 기금 (그랜트 20000289), Purdue 연구 재단 (그랜트 209911), Purdue 대학의 연구 및 파트너십 담당 수석 부사장 (그랜트 210362)에 의해 지원되었다. 우리는 제브라피시 RGC 문화 프로토콜을 수립한 코리 J. 위버 박사와 헤일리 로더 박사에게 감사드립니다. 그림 4의 데이터를 제공해 주신 헤일리 로더에게 감사드립니다. 우리는 RGC 문화에 대한 도움레아 바이어시와 케니 응우옌에게 감사드립니다. 글편집에 감사드립니다. 우리는 roGFP2-Orp1 및 roGFP2-Orp1을 포함하는 pCS2+ 벡터에 대한 박사 칭 덩을 제공 토비아스 딕 박사에게 감사드립니다. 그림 2는 Biorender.com 함께 만들어집니다.

모든 동물 실험은 2020년 07/24/24에 승인된 프로토콜을 2006002050 가진 NIH 지침에 따라 Purdue 동물 관리 및 사용 위원회(PACUC)에 의해 윤리적으로 검토되고 승인되었습니다.
1. 솔루션 준비
<ol><li>E2 미디어 (1x)<ol>
<li>표1에 표시된 모든 구성 요소를 결합하여 100x E2A(500mL), 500x E2B(100mL) 및 500x E2C(100mL) 솔루션을 준비한다. 오토클레이브 E2A, E2B 및 E2C 솔루션. 4 °C에 보관하십?...

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	<li>B&#243;rquez, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+role+of+redox+signaling+in+neuronal+development.">Dissecting the role of redox signaling in neuronal development.</a> Journal of Neurochemistry. 137 (4), 506-517 (2016).</li><li>Bedard, K., Krause, K. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NOX+family+of+ROS-generating+NADPH+oxidases:+Physiology+and+pathophysiology.">The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: Physiology and pathophysiology.</a> Physiological Reviews. 87 (1), 245-313 (2007).</li><li>Weaver, C. J., Leung, Y. F., Suter, D. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=nox2/cybb+deficiency+affects+zebrafish+retinotectal+connectivity.">nox2/cybb deficiency affects zebrafish retinotectal connectivity.</a> Journal of Neuroscience. 38 (26), 5854-5871 (2018).</li><li>Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+fluorescent+genetically+encoded+indicator+for+intracellular+hydrogen+peroxide.">Red fluorescent genetically encoded indicator for intracellular hydrogen peroxide.</a> Nature Communications. 5, 5222 (2014).</li><li>Oparka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+ROS+levels+using+CM-H2DCFDA+and+HyPer.">Quantifying ROS levels using CM-H2DCFDA and HyPer.</a> Methods. 109, 3-11 (2016).</li><li>Dickinson, B. C., Peltier, J., Stone, D., Schaffer, D. V., Chang, C. 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J., Suter, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+NADPH+oxidase+2+regulates+growth+cone+guidance+downstream+of+slit2/robo2.">Neuronal NADPH oxidase 2 regulates growth cone guidance downstream of slit2/robo2.</a> Developmental Neurobiology. , (2020).</li><li>Bilan, D. S., Belousov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HyPer+family+probes:+State+of+the+art.">HyPer family probes: State of the art.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 24 (13), 731-751 (2016).</li><li>Ermankova, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SypHer3s:+a+genetically+encoded+fluorescent+ratiometric+probe+with+enhanced+brightness+and+an+improved+dynamic+range.">SypHer3s: a genetically encoded fluorescent ratiometric probe with enhanced brightness and an improved dynamic range.</a> Chemistry Communications. 54 (23), 2898-2901 (2018).</li><li>Pak, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+genetically+encoded+indicator+for+hydrogen+peroxide+identifies+roles+for+the+oxidant+in+cell+migration+and+mitochondrial+function.">Ultrasensitive genetically encoded indicator for hydrogen peroxide identifies roles for the oxidant in cell migration and mitochondrial function.</a> Cell Metabolism. 31 (3), 642-653 (2020).</li><li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tol2kit:+A+multisite+gateway-based+construction+Kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs.">The Tol2kit: A multisite gateway-based construction Kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).</li></ol>

이 프로토콜 전체에 주의를 기울여야 하는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 우리는 이러한 점을 고려하면 실험 흐름을 향상시킬 것이라고 믿습니다. 1 차적인 RGC 배양에 대 한, ZFCM의 멸균 (-) 매우 중요 한, 이 배양 매체 항생제를 포함 하지 않기 때문에 오염 이미징 전후 또는 동안 발생할 수 있습니다. 이를 방지하기 위해 생물 안전 캐비닛 내에서만 ZFCM(-)을 준비하고 사용하는 것이 좋습니다. 또?...

반응성 산소 종(ROS) 신호는 신경계1의개발 및 기능을 조절한다. 중요한 세포 ROS 공급원은 NADPH 산화효소(NOX)로, 이는 과산화수소와 과산화수소(H2O2)2를생성하는 막 단백질이다. NOX 효소는 중추 신경계(CNS)를 통해 발견되며, NOX 유래 ROS는 뉴런 개발에기여3,4,5,6. 신경 줄기 세포의 유지 보수 및 분화, 신경 극성 확립, 중성염 아웃성장 및 시냅스 가소성은 ROS7,8,9,10,11의적절한 수준을 요구하는 것으로 나타났다. 한편, NOXes에 의한 ROS의 통제되지 않은 생산은 알츠하이머병, 다발성 경화증 및 외상성 뇌 손상을 포함한 신경 퇴행성 질환에 기여한다12,13,14. 따라서 생리학적으로 관련된 ROS의 생산은 건강한 상태를 유지하는 데 중요합니다.
유전자 인코딩 된 바이오 센서의 개발은 세포 ROS의 검출을 크게 촉진시켰습니다. 유전자 인코딩 된 바이오 센서의 한 가지 중요한 장점은 이러한 센서가 특히 뚜렷한 위치를 대상으로 할 수 있기 때문에 ROS 신호의 증가 된 시간적 및 공간 해상도입니다. 레독스에 민감한 GFP(roGFP)는 이러한 ROS 바이오 센서의 한 유형입니다. roGFP2-Orp1 변이체는 효모15,16에서글루타티온 peroxiredoxin 가족 단백질인 Orp1 도메인을 통해 H2O2를 구체적으로 검출한다. Orp1 단백질의 산화는 그것의 형성을 바꾸기 위하여 roGFP2로 옮겨져(도 1A). 이 프로브는 405nm와 480nm 근처의 두 개의 여기 봉우리와 515 nm에서 단일 방출 피크를 전시합니다. 산화 시, 흥분 피크 주위 형광 강도 변경: 동안 405 nm 흥분 증가, 480 nm 흥분 감소. 따라서, roGFP2-Orp1은 비율인식 생체센서이며,H2O-2-레벨은두 개의 상이한 파장(도1B)에서흥분되는 형광 강도의 비율에 의해 검출된다. 전반적으로 roGFP2-Orp1은 생체 내에서효율적으로 활용할 수 있는 ROS 이미징을 위한 다목적 도구입니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62165/62165fig01.jpg"> 그림 1: roGFP2-Orp1의 회로도 표현 및 여기 스펙트럼. (A)Oxidant 전송은 H 2 O2에대한 응답으로 Orp1과 roGFP2 사이에 발생하여 roGFP2의 형성적 변화를 초래한다. (B)roGFP2-Orp1의 흥분 스펙트럼은 405 nm와 480 nm및 515 nm에서 단일 방출 피크에서 두 개의 여기 피크를 나타낸다. H2O2에의해 산화시, 405 nm 흥분 증가 하는 동안 480 nm 흥분 감소. 이렇게 하면 H2 O2존재에 대한 비율 측정 판독이 발생합니다. 이 수치는 빌란과 벨로소프(2017)16및 모건 외(2011)25에서수정되었다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62165/62165fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
Danio rerio (제브라피시) 모델 시스템은 유전자 인코딩 된 바이오 센서를 적용하는 데 몇 가지 장점이 있습니다. 배아와 애벌레의 광학적 투명성은 비침습적 생체 내 이미징을 가능하게 합니다. 새로운 이미징 도구는 더 높은 해상도와 더 깊은 침투를 달성하기 위해 개발되고있다17. 또한, 유전자 조작을 위한 확립된 도구(ectopic mRNA 발현, 톨2 전세대 등) 및 게놈 편집(TALENs, CRISPR/Cas9 등) 및 게놈 편집(TALEN, CRISPR/Cas9 등)이 있어 트랜스제닉 동물의 생성을 촉진하는18. 제브라피쉬 배아가 어머니 밖에서 발전함에 따라 이 시스템은 배아의 접근과 조작을 더욱 쉽게 할 수 있습니다. 예를 들어, 1 세포 단계 주사 및 약물 치료는 쉽게 할 수 있습니다.
여기서, 우리는 체외 전사 mRNA에 주입하여 H2O2-특정바이오 센서 roGFP2-Orp1을 일시적으로 표현하기 위해 제브라피쉬를 사용했습니다. 이러한 배아는 배양된 뉴런의 체외 이미징과 생체 내이미징(도 2)에 모두 사용될 수 있다. 우리는 제브라피시 배아에서 망막 신경절 세포 (RGC)를 해부하고 도금하기위한 프로토콜을 설명하고 배양 뉴런에서 H2O2-수준을 평가합니다. 그런 다음, 우리는 공초점 현미경 검사를 사용하여 roGFP2-Orp1 표현 배아 및 애벌레의 생체 내 이미징을 위한 방법을 제시합니다. 이 접근은 생리적인 H2O2-수준을 결정할 뿐만 아니라 다른 발달 단계 또는 조건에서 생기는 잠재적인 변경을 결정할 수 있습니다. 전반적으로, 이 시스템은 살아있는 세포및 동물에서H2O2를 검출하는 신뢰할 수 있는 방법을 제공하여 개발, 건강 및 질병에서 H 2 O2의역할을 연구한다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62165/62165fig03.jpg"> 그림 2. 실험적 접근 방식의 개요입니다. 간단히, 배아 수집 후, roGFP2-Orp1 mRNA는 1 세포 단계 제브라피시 배아의 노른자로 주입된다. 개발 배아는 생체 외에서 (A)및(B)생체 내 이미징 모두에 사용할 수 있습니다. (A)GFP 양성 배아는 34hpf에서 RGC 수집을 위한 망막을 해부하는 데 사용된다. 해리된 RG는 ZFCM(+) 미디어의 PDL/라미닌 코팅 커버립에 도금됩니다. RGCs가 도금 6-24 h 후 축축을 확장함에 따라 성장 콘 이미징을 수행할 수 있습니다. 세포는 H2O 2-level의 잠재적인 변화를 측정하기 위해 다른 치료를 받을 수 있습니다. 여기서, 우리는 RGC (빨간색)의 성장 콘에서 H2O2-수준을 측정했습니다. (B)GFP 양성 배아는 생체 내 이미징에 사용된다. 원하는 나이에, 태아는 공초점 화상 진찰을 위한 35 mm 유리 바닥 접시에 마취하고 장착될 수 있습니다. 여기서 배아는 망막 이미징을 위해 통풍구로 장착됩니다. 회로도는 제브라피시의 망막 발달을 보여줍니다. RGC는 망막에서 가장 안쪽 층인 신경절 세포 층(GCL)을 형성합니다. RGC 축축은 시신경으로 발전하여 중선을 넘어 시구를 형성합니다. 그런 다음 RGC 축축은 중뇌의 광학 텍텀에서 시냅스를 만들기 위해 등등으로 자랍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62165/62165fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35-mm culture dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83-3900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm glass bottom dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP160-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillary Tubes</td>
			<td>Sutter/Fisher Scientific</td>
			<td>NC9029378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2850-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Petri Dishes (100 x 15 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>26140087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma Aldich</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection Mold</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>TU-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23017-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scanning Confocal Microscopy</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium with phenol red</td>
			<td>Gibco/Fisher Scientific</td>
			<td>11-415-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium without phenol red</td>
			<td>Gibco/Fisher Scientific</td>
			<td>21-083-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting agarose</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V2111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMessage mMachine SP6 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0189S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Hyclone/Fisher Scientific</td>
			<td>SH3025601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td>Sigma Aldich</td>
			<td>P0290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma Aldich</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic PicoPump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PV820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine (PDL)</td>
			<td>Sigma Aldich</td>
			<td>P7280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QiaQUICK PCR Purification Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse slit2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>5444-SL-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Sigma Aldich</td>
			<td>P5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steritop 0.22 &#181;m filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>S2GPT05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE Buffer</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine Methanesulfonate</td>
			<td>Sigma Aldich</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Pipette Puller</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>700C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ros live cell imaging during neuronal development

반응성 산소 종 (ROS)은 정상적인 발달, 항상성 및 생리학에서 중요한 잘 확립 된 신호 분자입니다. 상이한 ROS 중, 과산화수소(H2 O2)는세포 신호의 역할에 대하여 가장 잘 특징지었습니다. H2O2는 여러 종의 발달 중에 연루되었습니다. 예를 들어, H 2O2의일시적인 증가는 수정 후 첫 날 동안 제브라피시 배아에서 검출되었다. 더욱이, 중요한 세포H2O2 소스, NADPH 산화효소(NOX)를 고갈시키는 것은 생체내 및 체외 에서 모두 분화, 축축한 성장 및 망막 신경절 세포(RGC)의 지도와 같은 신경계 발달을손상시합니다. 여기서, 우리는 유전자 인코딩 된 H 2O 2-특정 바이오 센서, roGFP2-Orp1을 사용하여 개발 중에 배양 된 제브라피시 뉴런 및 전체 애벌레에서 세포 내 H2O2수준을 이미징하는 방법을 설명합니다. 이 프로브는 제브라피시 애벌레에서 일시적으로 또는 안정적으로 표현될 수 있다. 더욱이, 비율 측정 판독은 차등 유전자 발현 또는 부피 효과로 인해 유물을 검출할 확률을 감소시다. 첫째, 우리는 일시적으로 roGFP2-Orp1을 표현하는 제브라피시 배아에서 파생된 RG를 분리하고 배양하는 방법을 보여줍니다. 그런 다음 전체 애벌레를 사용하여 조직 수준에서 H2O2 수준을 모니터링합니다. 센서는 H 2O2의첨가에 의해 검증되었습니다. 추가적으로, 이 방법론은 조직 특정 biosensor 발현을 가진 형질전환 동물을 생성해서 특정 세포 모형 및 조직에 있는 H2O2 수준을 측정하기 위하여 이용될 수 있었습니다. Zebrafish가 유전 및 발달 조작을 용이하게 하기 때문에, 여기에서 입증된 접근은 척추동물에 있는 신경 및 일반적인 배아 발달 도중 H2O2의 역할을 시험하는 파이프라인 역할을 할 수 있었습니다.

배양 된 제브라피시 RG는 1d 내에서 축축을 확장합니다. H2 O2-바이오센서의대표적인 405/480 비율 이미지가 도 4A에도시된다. 세포 몸, 축 사, 그리고 성장 콘은 명확 하 게 개별 뉴런에서 볼 수 있습니다. 이러한 뉴런은 H2O2 변화를 모니터링하기 위해 시간이 지남에 따라 다른 치료를 받을 수 있습니다. 앞서 문화매체에 100μMH2 O2를첨가하?...

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ROS Live Cell Imaging During Neuronal Development

이 프로토콜은 신경계 발달 중H2 O2의생리적 신호 역할을 평가하기 위한 배양 된 제브라피시 뉴런 및 애벌레에서 유전으로 인코딩 된 과산화수소 (H2O2)-바이오센서의 사용을 설명합니다. 그것은 다른 세포 유형에 적용 하 고 일반적인 개발에 반응성 산소 종 (ROS)를 공부 하는 실험 치료와 함께 수정 될 수 있습니다.

신경 발달 도중 ROS 살아있는 세포 화상 진찰

Reactive oxygen species (ROS) are well-established signaling molecules, which are important in normal development, homeostasis, and physiology. Among the ...

우리의 프로토콜은 배양 된 제브라피시 뉴런과 애벌레에 과산화수소 바이오 센서의 사용을 설명합니다. 이 프로토콜은 연구원이 일반적인 생리학 및 병리 생리학에 있는 반응성 산소 종의 역할을 해부하는 것을 도울 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 살아있는 동물과 배양 된 세포에서 과산화수소의 실시간 검출입니다.이 방법은 설치류 모델 시스템과 같은 다른 동물에 적용할 수 있습니다. 커버립을 준비하려면 100% 에탄올에 저장된 산성 세척 커버립을 사용하십시오. 집게를 사용하여 저장 용기에서 하나의 커버슬립을 제거하고 화염을 일으켜 잔류 에탄올을 제거합니다.35mm 배양 접시 안에 비스듬히 배치하여 커버슬립을 완전히 건조시합니다. 폴리-D-리신 또는 PDL 또는 작업 솔루션을 준비합니다. 각 커버슬립의 중앙에 PDL을 적용하여 용액이 가장자리에 퍼지지 않도록 하고 실온에서 20~30분 동안 PDL을 배양합니다.PDL이 건조되지 않았는지 확인합니다. 멸균 수의 0.5 밀리리터로 PDL을 세척하고 접시가 완전히 건조하게하십시오. 라미닌 작업 솔루션을 준비합니다.그리고 각 커버 슬립의 중심에 적용하여 가장자리에 솔루션이 확산되는 것을 방지하십시오. 가습된 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 2~6시간 동안 플레이트를 배양하고 라미닌 용액의 건조를 피하십시오. 플레이트 망막 신경절 세포 또는 RGCs에서 배아 해부를 수행하려면 4 개의 35 mm 조직 배양 접시를 준비하고 라벨을 붙이고 70 %의 4 밀리리터로 채웁니다.E2 미디어 1. E2 미디어 2. 그리고 E2 미디어 3, 해부의 날에.냉장고에 요리를 보관하십시오. 제브라피시 배아는 수정 후 34시간 인큐베이터에서 라미닌으로 코팅된 배양 요리를 섭취하십시오. 그리고 1X PBS의 0.5 밀리리터로 커버 슬립을 세 번 씻으시다.마지막 세척 후 각 문화 요리에 ZFCM+미디어 4밀리리터를 추가합니다. 접시를 말리지 마십시오. 준비된 냉장 문화 요리를 회수하고 실온에 평형하게 해보세요.ZFCM+미디어의 15마이크로리터로 4~6개의 PCR 튜브를 채웁니다. 인큐베이터에서 제브라피시 배아를 회수하고 배아를 살균하기 위해 5-10초 동안 70%에탄올을 함유한 35mm 조직 배양 접시에 배아를 담급합니다. 파이펫의 전송을 사용하여, 여분의 에탄올을 씻어 멸균 E2 미디어를 포함하는 E2 미디어 하나의 접시에 배아를 전송.그런 다음 배아를 E2 미디어 2 접시로 옮기고 날카로운 집게로 축을 제거합니다. 마지막으로, 배아를 E2 미디어로 옮기면 3개의 접시를 사용하여 해부를 수행합니다. 한 쌍의 미세 한 포셉을 사용하여 포셉 중 하나를 사용하여 노른자에 배아를 앞쪽으로 배치하고 보유합니다.그리고 다른 집게와 노른자 낭에 꼬리 후방을 제거합니다. 집게로 목을 잡고 머리를 떼어 뇌와 눈을 E2 미디어에 노출시하십시오. 미세 한 집게의 끝으로, 두 번째 집게와 함께 두개골 조직을 아래로 잡고 있는 동안 머리에서 눈을 부드럽게 굴려.ZFCM+를 포함하는 이전에 준비된 튜브 중 하나에 4개의 눈을 옮기는 것은 세포를 해리하기 위하여 p20 파이펫으로 위아래로 부드럽게 세트리트합니다. 분리된 셀을 커버립의 중심으로 ZFCM+를 전송합니다. 진동을 흡수하기 위해 폴리스티렌 폼 랙에서 22도의 벤치 탑에서 배양을 유지합니다.이미징 의 날에, RGC 축축의 성장을 검증하기 위해 현미경의 밑에 세포를 확인하십시오. 라이브 셀 이미징의 경우, 배양 접시에서 라이브 세포 이미징 챔버로 커버립을 전송합니다. DIC 목표 OG-590 롱패스 레드 필터와 EMCCD 카메라를 장착한 반전 현미경을 사용하십시오.이미징 하기 전에 ZFCM+배지를 ZFCM-After를 10X 목표로 셀을 포지셔닝한 후 오일 침지 목표를 사용하여 60X 배율로 이미지를 획득합니다. 추가 1.5배 배율을 사용합니다. 먼저 DIC 이미지를 획득합니다.이어서, 적절한 필터 세트를 사용하여 이미지 roGFP2-Orp1. 이미지의 첫 번째 세트를 촬영 한 후, 다른 치료 솔루션을 포함하는 미디어와 미디어를 교환. pH 및 진동 변화를 피하기 위해 30분마다 미디어를 변경해야 합니다.생체 내 이미징의 경우, E3 미디어에서 22-24시간 후 수정 배아를 보관하여 메틸렌 블루없이 0.003%phenyl thiourea를 함유합니다. 미디어를 교환하고 매일 죽은 배아를 제거합니다. 원하는 나이에 35mm 유리 바닥 배양 접시에 1%아가로즈에 태아를 마취하고 장착합니다.배아는 화상 진찰을 위한 관심의 지역에 따라서, 등등, 환기, 또는 측면에 지향될 수 있습니다. 아가로즈가 고화된 후, 메틸렌 블루없이 E3 미디어로 요리를 채우지 만 0.016 % 트리카인으로 채웁니다. 이미징을 위한 현미경을 설정합니다.반전 된 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 사용하여 아가로즈 드롭의 바닥에 장착 된 배아를 이미지하십시오. roGFP2-Orp1을 흥분시키고 원하는 방출 필터로 해당 이미지를 수집합니다. 배아의 원하는 부분을 통해 5 마이크로 미터 단면 두께로 z 스택을 획득하십시오.이미징 후, 미세 한 포셉아가있는 아가로즈에서 배아를 제거하고 원하는 나이까지 페닐 티우레아와 인큐베이터와 메틸렌 블루 무료 미디어에 보관하십시오. 과산화수소 바이오센서 및 배양 된 제브라피시 RGC 확장 축축의 대표적인 이미지가 여기에 나와 있다. 세포 몸, 축 사, 그리고 성장 콘은 명확 하 게 개별 뉴런에서 볼 수 있습니다.배양 매체에 과산화수소를 첨가하면 비율 값이 증가하여 이 시스템을 통해 실시간 변화를 감지할 수 있음을 보여준다. 과산화수소 수준의 정량화는 패널에 표시되어 B.To 전체 제브라피시 배아에서 과산화수소 수준을 결정하고, mRNA는 한 세포 단계에서 주입되어 모든 조직이 roGFP2-Orp1 바이오 센서를 발현하게 합니다. 제브라피시 애벌레의 머리 부위는 망막의 과산화수소 수준에 초점을 맞추고 두 개의 서로 다른 시점에서 표시됩니다.제브라피시 배아의 과산화수소의 기저 수준을 2일 후 수정 및 5일 후 수정시 측정했다. 2일 후 수정시, 비비율값은 수정 후 5일보다 현저히 낮았다. 또한, 각 동물은 망막 과산화수소 함량이 다른 수준을 보였다.눈을 제거하기위한 미세 한 집게를 사용하고 파이펫으로 눈의 부드러운 해리는이 절차에서 가장 중요한 단계입니다. 이 프로토콜은 ROS 신호에 관련되게 관련되는 요인을 조사하기 위하여 약 처리에 선행될 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

손상의 감각 오르간 전구체 세포 라이브 셀 이미징 Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

연구

신경과학

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

Rhizotomy 후 도설 루트 Axons의 라이브 영상

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

개발 Neuroepithelium의 세포 문제의 고해상도 라이브 영상

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

생체 마우스 Neuroepithelium에서 단일 세포 분열의 라이브 영상

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

개발 마우스 배아의 피질 유사 분열의 라이브 영상

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

결합 된 방법론을 활용하여 축삭 분기 및 신경 세포 형태 형성 동안 플라즈마 멤브레인 배달의 역할을 정의합니다

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

열 및 레이어에 수지상 형태학 분석

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

애벌레 Zebrafish의 측면 라인 세포의 생체 내 칼슘 이미징

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

행동과 자극 반응 도중 전체 두뇌 화상 진찰을 위한 성인 Drosophila melanogaster를 준비합니다

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...