Name: ros live cell imaging during neuronal development
Uploaded: 2021-02-09T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about ROS Live Cell Imaging During Neuronal Development at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (Grant R01NS117701), National Science Foundation (Grant 1146944-IOS), Indiana Traumatic Spinal Cord and Brain Injury Research Fund (Grant 20000289), Purdue Research Foundation (Grant 209911) og Office of the Executive Vice President for Research and Partnerships ved Purdue University (Grant 210362). Vi takker Dr. Cory J. Weaver og Haley Roeder for å etablere sebrafisk RGC kulturprotokoll. Vi takker Haley Roeder i tillegg for å ha gitt dataene til figur 4. Vi takker Leah Biasi og Kenny Nguyen for hjelpen med RGC-kulturen. Vi takker Gentry Lee for at han redigerte teksten. Vi takker Dr. Tobias Dick for å ha levert roGFP2-Orp1 og Dr. Qing Deng for pCS2+ vektor som inneholder roGFP2-Orp1. Figur 2 opprettes med Biorender.com.

Alle dyreforsøk ble etisk gjennomgått og godkjent av Purdue Animal Care and Use Committee (PACUC), etter NIH-retningslinjer med protokollen 2006002050 godkjent 24.07.2020.
1. Utarbeidelse av løsninger
<ol><li>E2-medier (1x)<ol>
<li>Forbered 100x E2A (500 ml), 500x E2B (100 ml) og 500x E2C (100 ml) ved å kombinere alle komponentene som vises i tabell 1. Autoklaver E2A-, E2B- og E2C-løsninger. Oppbevars ved 4 °C.</li>
		<li>For 1x E2-medier: Kombiner 5 ml 100x E2A, 1 ml ...

<ol>
	<li>B&#243;rquez, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+role+of+redox+signaling+in+neuronal+development.">Dissecting the role of redox signaling in neuronal development.</a> Journal of Neurochemistry. 137 (4), 506-517 (2016).</li><li>Bedard, K., Krause, K. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NOX+family+of+ROS-generating+NADPH+oxidases:+Physiology+and+pathophysiology.">The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: Physiology and pathophysiology.</a> Physiological Reviews. 87 (1), 245-313 (2007).</li><li>Weaver, C. J., Leung, Y. F., Suter, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+dynamics+of+NADPH+oxidases+during+early+zebrafish+development.">Expression dynamics of NADPH oxidases during early zebrafish development.</a> Journal of Comparative Neurology. 524 (10), 2130-2141 (2016).</li><li>Terzi, A., Suter, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+NADPH+oxidases+in+neuronal+development.">The role of NADPH oxidases in neuronal development.</a> Free Radical Biology and Medicine. 154, 33-47 (2020).</li><li>Infanger, D. W., Sharma, R. V., Davisson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidases+of+the+brain:+Distribution,+regulation,+and+function.">NADPH oxidases of the brain: Distribution, regulation, and function.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 8 (9-10), 1583-1596 (2006).</li><li>Coyoy, A., Olguin-Albuerne, M., Martinez-Briseno, P., Moran, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+reactive+oxygen+species+and+NADPH-oxidase+in+the+development+of+rat+cerebellum.">Role of reactive oxygen species and NADPH-oxidase in the development of rat cerebellum.</a> Neurochemistry International. 62 (7), 998-1011 (2013).</li><li>Le Belle, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferative+neural+stem+cells+have+high+endogenous+ROS+levels+that+regulate+self-renewal+and+neurogenesis+in+a+PI3K/Akt-dependant+manner.">Proliferative neural stem cells have high endogenous ROS levels that regulate self-renewal and neurogenesis in a PI3K/Akt-dependant manner.</a> Cell Stem Cell. 8 (1), 59-71 (2011).</li><li>Nayernia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+neural+precursor+cell+pool+in+NADPH+oxidase+2-deficiency:+from+mouse+brain+to+neural+differentiation+of+patient+derived+iPSC.">Decreased neural precursor cell pool in NADPH oxidase 2-deficiency: from mouse brain to neural differentiation of patient derived iPSC.</a> Redox Biology. 13, 82-93 (2017).</li><li>Wilson, C., Nunez, M. T., Gonz&#225;lez-Billault, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+NADPH+oxidase+to+the+establishment+of+hippocampal+neuronal+polarity+in+culture.">Contribution of NADPH oxidase to the establishment of hippocampal neuronal polarity in culture.</a> Journal of Cell Science. 128 (16), 2989-2995 (2015).</li><li>Munnamalai, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+interactions+between+Nox2-type+NADPH+oxidase+and+the+F-actin+cytoskeleton+in+neuronal+growth+cones.">Bidirectional interactions between Nox2-type NADPH oxidase and the F-actin cytoskeleton in neuronal growth cones.</a> Journal of Neurochemistry. 130 (4), 526-540 (2014).</li><li>Kishida, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+plasticity+deficits+and+mild+memory+impairments+in+mouse+models+of+chronic+granulomatous+disease.">Synaptic plasticity deficits and mild memory impairments in mouse models of chronic granulomatous disease.</a> Molecular and Cellular Biology. 26 (15), 5908-5920 (2006).</li><li>Ravelli, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nox2-dependent+neuroinflammation+in+an+EAE+model+of+multiple+sclerosis.">Nox2-dependent neuroinflammation in an EAE model of multiple sclerosis.</a> Translational Neuroscience. 10 (1), 1-9 (2019).</li><li>Park, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nox2-derived+radicals+contribute+to+neurovascular+and+behavioral+dysfunction+in+mice+overexpressing+the+amyloid+precursor+protein.">Nox2-derived radicals contribute to neurovascular and behavioral dysfunction in mice overexpressing the amyloid precursor protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (4), 1347-1352 (2008).</li><li>Schiavone, S., Neri, M., Trabace, L., Turillazzi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NADPH+oxidase+NOX2+mediates+loss+of+parvalbumin+interneurons+in+traumatic+brain+injury:+Human+autoptic+immunohistochemical+evidence.">The NADPH oxidase NOX2 mediates loss of parvalbumin interneurons in traumatic brain injury: Human autoptic immunohistochemical evidence.</a> Scientific Reports. 7 (1), 8752 (2017).</li><li>Gutscher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity-based+protein+thiol+oxidation+by+H2O2-scavenging+peroxidases.">Proximity-based protein thiol oxidation by H2O2-scavenging peroxidases.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (46), 31532-31540 (2009).</li><li>Bilan, D. S., Belousov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+redox+biology:+from+imaging+to+manipulation.">New tools for redox biology: from imaging to manipulation.</a> Free Radical Biology and Medicine. 109, 167-188 (2016).</li><li>Abu-Siniyeh, A., Al-Zyoud, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highlights+on+selected+microscopy+techniques+to+study+zebrafish+developmental+biology.">Highlights on selected microscopy techniques to study zebrafish developmental biology.</a> Laboratory Animal Research. 36 (1), 12 (2020).</li><li>Sassen, W. A., Koster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+toolbox+for+genetic+manipulation+of+zebrafish.">A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish.</a> Advances in Genomics and Genetics. 5, 151-163 (2015).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).</li><li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regular+care+and+maintenance+of+a+Zebrafish+(Danio+rerio)+laboratory:+An+introduction.">Regular care and maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+neuron+culture+for+nerve+growth+and+axon+guidance+studies+in+Zebrafish+(Danio+rerio).">Primary neuron culture for nerve growth and axon guidance studies in Zebrafish (Danio rerio).</a> PLoS One. 8 (3), 57539 (2013).</li><li>Zhang, L., Leung, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdissection+of+zebrafish+embryonic+eye+tissues.">Microdissection of zebrafish embryonic eye tissues.</a> Journal of Visualized Experiments. (40), e2028 (2010).</li><li>Suter, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+of+neuronal+growth+cone+motility+and+duidance+in+vitro.">Live cell imaging of neuronal growth cone motility and duidance in vitro.</a> Cell Migration: Methods in Molecular Biology. , 65-86 (2011).</li><li>Weaver, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=nox2/cybb+deficiency+affects+zebrafish+retinotectal+connectivity.">nox2/cybb deficiency affects zebrafish retinotectal connectivity.</a> Journal of Neuroscience. 38 (26), 5854-5871 (2018).</li><li>Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+EGSH+and+H2O2+with+roGFP2-based+redox+probes.">Measuring EGSH and H2O2 with roGFP2-based redox probes.</a> Free Radical Biology and Medicine. 51, 1943-1951 (2011).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenylthiourea+specifically+reduces+zebrafish+eye+size.">Phenylthiourea specifically reduces zebrafish eye size.</a> PLoS One. 7 (6), 40132 (2012).</li><li>Ermakova, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+fluorescent+genetically+encoded+indicator+for+intracellular+hydrogen+peroxide.">Red fluorescent genetically encoded indicator for intracellular hydrogen peroxide.</a> Nature Communications. 5, 5222 (2014).</li><li>Oparka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+ROS+levels+using+CM-H2DCFDA+and+HyPer.">Quantifying ROS levels using CM-H2DCFDA and HyPer.</a> Methods. 109, 3-11 (2016).</li><li>Dickinson, B. C., Peltier, J., Stone, D., Schaffer, D. V., Chang, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nox2+redox+signaling+maintains+essential+cell+populations+in+the+brain.">Nox2 redox signaling maintains essential cell populations in the brain.</a> Nature Chemical Biology. 7 (2), 106-112 (2011).</li><li>Cannon, M. B., Remington, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox-sensitive+green+fluorescent+protein:+Probes+for+dynamic+intracellular+redox+responses.+A+review.">Redox-sensitive green fluorescent protein: Probes for dynamic intracellular redox responses. A review.</a> Methods in Molecular Biology. 476, 51-65 (2009).</li><li>Meyer, A. J., Dick, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein-based+redox+probes.">Fluorescent protein-based redox probes.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 13 (5), 621-650 (2010).</li><li>Panieri, E., Millia, C., Santoro, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+quantification+of+subcellular+H2O2+and+glutathione+redox+potential+in+living+cardiovascular+tissues.">Real-time quantification of subcellular H2O2 and glutathione redox potential in living cardiovascular tissues.</a> Free Radical Biology and Medicine. 109, 189-200 (2017).</li><li>Breus, O., Dickmeis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+thiol+redox-sensors+in+the+zebrafish+model:+Lessons+for+embryonic+development+and+regeneration.">Genetically encoded thiol redox-sensors in the zebrafish model: Lessons for embryonic development and regeneration.</a> Biological Chemistry. , (2020).</li><li>Morgan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+basal+H2O2+levels+with+peroxiredoxin-based+probes.">Real-time monitoring of basal H2O2 levels with peroxiredoxin-based probes.</a> Nature Chemical Biology. 12 (6), 437-443 (2016).</li><li>Terzi, A., Roeder, H., Weaver, C. J., Suter, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+NADPH+oxidase+2+regulates+growth+cone+guidance+downstream+of+slit2/robo2.">Neuronal NADPH oxidase 2 regulates growth cone guidance downstream of slit2/robo2.</a> Developmental Neurobiology. , (2020).</li><li>Bilan, D. S., Belousov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HyPer+family+probes:+State+of+the+art.">HyPer family probes: State of the art.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 24 (13), 731-751 (2016).</li><li>Ermankova, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SypHer3s:+a+genetically+encoded+fluorescent+ratiometric+probe+with+enhanced+brightness+and+an+improved+dynamic+range.">SypHer3s: a genetically encoded fluorescent ratiometric probe with enhanced brightness and an improved dynamic range.</a> Chemistry Communications. 54 (23), 2898-2901 (2018).</li><li>Pak, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+genetically+encoded+indicator+for+hydrogen+peroxide+identifies+roles+for+the+oxidant+in+cell+migration+and+mitochondrial+function.">Ultrasensitive genetically encoded indicator for hydrogen peroxide identifies roles for the oxidant in cell migration and mitochondrial function.</a> Cell Metabolism. 31 (3), 642-653 (2020).</li><li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tol2kit:+A+multisite+gateway-based+construction+Kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs.">The Tol2kit: A multisite gateway-based construction Kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).</li></ol>

Det er flere kritiske trinn som trenger oppmerksomhet gjennom hele denne protokollen. Vi tror at å vurdere disse punktene vil forbedre den eksperimentelle strømmen. For primær RGC-kultur er steriliteten til ZFCM(-) svært viktig, siden dette kulturmediet ikke inneholder antibiotika og forurensning kan oppstå før eller under avbildning. For å unngå det, anbefaler vi å forberede og bruke ZFCM (-) bare inne i et biosikkerhetsskap og lage ferske ZFCM (-) medier regelmessig (trinn 1.5). I tillegg bør lamininlagrene h...

Reaktive oksygenarter (ROS) som signaliserer regulerer utvikling og funksjon av nervesystemet1. En viktig cellulær ROS-kilde er NADPH oksidase (NOX), som er transmembrane proteiner som genererer superoksid og hydrogenperoksid(H2O2)2. NOX enzymer finnes i hele sentralnervesystemet (CNS), og NOX-avledet ROS bidrar til nevronutvikling3,4,5,6. Vedlikehold og differensiering av nevrale stamceller, etablering av nevronal polaritet, nevrittutvekst og synaptisk plastisitet har vist seg å kreve tilstrekkelige nivåer av ROS7,8,9,10,11. På den annen side bidrar ukontrollert produksjon av ROS av NOXer til nevrodegenerative lidelser, inkludert Alzheimers sykdom, multippel sklerose og traumatisk hjerneskade12,13,14. Derfor er produksjon av fysiologisk relevant ROS avgjørende for å opprettholde sunne forhold.
Utvikling av genetisk kodede biosensorer forenklet påvisning av cellulær ROS sterkt. En viktig fordel med genetisk kodede biosensorer er den økte tidsmessige og romlige oppløsningen til ROS-signalet, da disse sensorene kan målrettes spesifikt mot forskjellige steder. Redoksensitiv GFP (roGFP) er en type slike ROS biosensorer. RoGFP2-Orp1-varianten oppdager spesielt H2O2 gjennom Orp1-domenet, som er et glutathione peroxiredoxin-familieprotein fra gjær15,16. Oksidasjonen av Orp1-proteinet overføres til roGFP2 for å endre konformasjonen (figur 1A). Sonden viser to eksitasjonstopper nær 405 nm og 480 nm, og en enkelt utslippstopp på 515 nm. Ved oksidasjon endres fluorescensintensiteten rundt eksitasjonstopper: mens 405 nm eksitasjon øker, reduseres 480 nm eksitasjon. Dermed er roGFP2-Orp1 en ratiometrisk biosensor, og H2O2-nivåer oppdages av forholdet mellom fluorescensintensiteter begeistret ved to forskjellige bølgelengder (Figur 1B). Totalt sett er roGFP2-Orp1 et allsidig verktøy for ROS-avbildning som kan brukes effektivt in vivo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62165/62165fig01.jpg"> Figur 1: Skjematisk representasjon og eksitasjonsspektra av roGFP2-Orp1. (A) Oksidantoverføring skjer mellom Orp1 og roGFP2 som svar på H2O2, noe som fører til konformasjonsendringer i roGFP2. (B) Eksitasjonsspektraet til roGFP2-Orp1 viser to eksitasjonstopper på 405 nm og 480 nm og enkeltutslippstopp på 515 nm. Ved oksidasjon med H2O2øker eksitasjonen på 405 nm mens eksitasjonen på 480 nm minker. Dette resulterer i en ratiometric avlesning for H2O2 tilstedeværelse. Figuren er modifisert fra Bilan og Belousov (2017)16 og Morgan et al. (2011)25. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62165/62165fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Danio rerio (sebrafish) modellsystemet har flere fordeler for å bruke genetisk kodede biosensorer. Den optiske gjennomsiktigheten til embryoer og larver muliggjør ikke-invasiv in vivo-avbildning. Nye bildeverktøy utvikles for å oppnå høyere oppløsning og dypere penetrasjon17. Videre er det etablerte verktøy for genetisk manipulasjon (ektopisk mRNA-uttrykk, Tol2 transgenese, etc.) og genomredigering (TALENer, CRISPR / Cas9, etc.), som fremmer generering av transgene dyr18. Etter hvert som sebrafiskembryoene utvikler seg utenfor moren, gir dette systemet ytterligere enklere tilgang og manipulering av embryoene. For eksempel kan encellede injeksjoner og narkotikabehandlinger enkelt gjøres.
Her brukte vi sebrafisk for å midlertidig uttrykke H2O2-spesifikk biosensor roGFP2-Orp1 ved å injisere in vitro-transkribert mRNA. Disse embryoene kan brukes til både in vitro-avbildning av dyrkede nevroner og in vivo-avbildning (figur 2). Vi beskriver en protokoll for dissekering og plating retinal ganglion celler (RGCs) fra sebrafisk embryoer etterfulgt av å vurdereH2O2-nivåer i dyrkede nevroner. Deretter presenterer vi en metode for in vivo-avbildning av roGFP2-Orp1-uttrykkende embryoer og larver ved hjelp av konfokal mikroskopi. Denne tilnærmingen tillater ikke bare å bestemme fysiologiske H2O2-nivåer,men også potensielle endringer som skjer i forskjellige utviklingsstadier eller forhold. Totalt sett gir dette systemet en pålitelig metode for å oppdage H2O2 i levende celler og dyr for å studere rollen som H2O2 i utvikling, helse og sykdom.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62165/62165fig03.jpg"> Figur 2. Omriss av den eksperimentelle tilnærmingen. Kort sagt, etter embryosamling injiseres roGFP2-Orp1 mRNA i eggeplommen av encellede sebrafiskembryoer. Utvikling av embryoer kan brukes til både (A) in vitro og (B) in vivo avbildning. (A) GFP-positive embryoer brukes til å dissekere netthinner for RGC-oppsamling ved 34 hkf. Dissosierte RGCer er belagt på PDL/lamininbelagte deksler i ZFCM (+)-medier. Vekstkjegleavbildning kan utføres ettersom RGCer utvider axonene sine etter 6-24 timers plating. Celler kan utsettes for ulike behandlinger for å måle de potensielle endringene i H2O2-nivåer. Her målte viH2O2-nivåer i vekstkjeglene til RGCer (rød). (B) GFP positive embryoer brukes til in vivo-avbildning. I ønsket alder kan embryoer bedøves og monteres på 35 mm glassbunnsretter for konfikal avbildning. Her er embryoer montert ventrally for retinal avbildning. Skjematisk viser retinal utvikling i sebrafisk. RGCer danner ganglion cellelag (GCL), som er det innerste laget i netthinnen. RGC-axoner utvikler seg til optisk nerve for å krysse midtlinjen, og danner optisk chiasm. Deretter vokser RGC-axoner dorsalt for å lage synapser i det optiske tectum i midbrain. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62165/62165fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35-mm culture dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83-3900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm glass bottom dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP160-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillary Tubes</td>
			<td>Sutter/Fisher Scientific</td>
			<td>NC9029378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2850-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Petri Dishes (100 x 15 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>26140087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma Aldich</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection Mold</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>TU-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23017-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scanning Confocal Microscopy</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium with phenol red</td>
			<td>Gibco/Fisher Scientific</td>
			<td>11-415-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium without phenol red</td>
			<td>Gibco/Fisher Scientific</td>
			<td>21-083-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting agarose</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V2111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMessage mMachine SP6 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0189S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Hyclone/Fisher Scientific</td>
			<td>SH3025601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td>Sigma Aldich</td>
			<td>P0290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma Aldich</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic PicoPump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PV820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine (PDL)</td>
			<td>Sigma Aldich</td>
			<td>P7280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QiaQUICK PCR Purification Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse slit2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>5444-SL-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Sigma Aldich</td>
			<td>P5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steritop 0.22 &#181;m filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>S2GPT05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE Buffer</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine Methanesulfonate</td>
			<td>Sigma Aldich</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Pipette Puller</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>700C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ros live cell imaging during neuronal development

Reaktive oksygenarter (ROS) er veletablerte signalmolekyler, som er viktige i normal utvikling, homeostase og fysiologi. Blant de forskjellige ROS er hydrogenperoksid(H2O2) best karakterisert med hensyn til roller i cellulær signalering. H2O2 har vært involvert under utviklingen i flere arter. For eksempel har det blitt påvist en forbigående økning i H2O2 i sebrafiskembryoer i løpet av de første dagene etter befruktning. Videre, uttømming av en viktig cellulær H2O2-kilde, NADPH oxidase (NOX), svekker utviklingen av nervesystemet som differensiering, axonal vekst og veiledning av retinal ganglion celler (RGCs) både in vivo og in vitro. Her beskriver vi en metode for avbildning av intracellulære H2O2-nivåer i dyrkede sebrafisk-nevroner og hele larver under utvikling ved hjelp av den genetisk kodede H2O2-spesifikke biosensoren, roGFP2-Orp1. Denne sonden kan være forbigående eller stabilt uttrykt i sebrafisk larver. Videre reduserer den ratiometriske avlesningen sannsynligheten for å oppdage artefakter på grunn av differensialgenuttrykk eller volumeffekter. For det første demonstrerer vi hvordan man isolerer og kultur RGCer avledet fra sebrafisk embryoer som midlertidig uttrykker roGFP2-Orp1. Deretter bruker vi hele larver for å overvåke H2O2 nivåer på vevsnivå. Sensoren er validert ved å legge til H2O2. I tillegg kan denne metoden brukes til å måle H2O2-nivåer i bestemte celletyper og vev ved å generere transgene dyr med vevsspesifikk biosensoruttrykk. Ettersom sebrafisk letter genetiske og utviklingsmessige manipulasjoner, kan tilnærmingen som er demonstrert her tjene som en rørledning for å teste rollen som H2O2 under nevronal og generell embryonal utvikling i vertebrater.

Dyrkede sebrafisk RGCer utvider aksoner innen 1d. Et representativt 405/480-forholdsbilde av H2O2-biosensoren vises i figur 4A. Cellelegemet, axon og vekstkjegler er tydelig synlige i individuelle nevroner. Disse nevronene kan bli utsatt for forskjellige behandlinger over tid for å overvåke H2O2 endringer. Vi har tidligere funnet ut at å legge til 100 μM H2O2 i kulturmedier øker forholdsverdiene, og viser at sanntidsendri...

Watch this Scientific Journal Video about ROS Live Cell Imaging During Neuronal Development at JoVE.com

ROS Live Cell Imaging During Neuronal Development

Denne protokollen beskriver bruken av en genetisk kodet hydrogenperoksid (H2 O2)-biosensori kultiverte sebrafisk-nevroner og larver for å vurdere de fysiologiske signalrollene til H2O2 under nervesystemutvikling. Det kan brukes på forskjellige celletyper og modifisert med eksperimentelle behandlinger for å studere reaktive oksygenarter (ROS) i generell utvikling.

ROS Live Cell Imaging under nevronutvikling

Reactive oxygen species (ROS) are well-established signaling molecules, which are important in normal development, homeostasis, and physiology. Among the ...

Vår protokoll beskriver bruken av en hydrogenperoksidbiosensor i kultiverte sebrafisk-nevroner og larver. Denne protokollen vil hjelpe forskere til å dissekere rollen som reaktive oksygenarter i normal fysiologi og patofysiologi. Den største fordelen med denne teknikken er sanntidsdeteksjon av hydrogenperoksid hos levende dyr og dyrkede celler.Denne metoden kan brukes på andre dyr, som gnagermodellsystem. For å forberede dekslene, bruk syrerengjorte deksler lagret i 100% etanol. Bruk tang til å fjerne ett deksle fra oppbevaringsbeholderen, og flamme det for å fjerne gjenværende etanol.Lufttørk dekslene helt ved å plassere den i en vinkel inne i en 35 millimeter kulturrett. Forbered Poly-D-Lysine eller PDL, eller arbeidsløsning. Påfør PDL i midten av hver dekslelip, unngå spredning av løsningen til kantene og inkuber PDL i 20 til 30 minutter ved romtemperatur.Pass på at PDL ikke tørker ut. Vask PDL med 0,5 milliliter sterilt vann og la platene tørke helt. Forbered laminin arbeidsløsning.Og bruk den på midten av hver dekslelip, sørg for å unngå spredning av løsning til kantene. Inkuber platene ved 37 grader Celsius i en fuktet inkubator i to til seks timer, unngå tørking av lamininoppløsningen. For å utføre en embryo disseksjon i plate retinal ganglion celler eller RGCs, forberede og merke fire 35 millimeter vev kultur retter og fylle dem med fire milliliter av 70%etanol.E2 media 1. E2 media to. Og E2 media tre, på disseksjonsdagen.Oppbevar oppvasken i kjøleskapet. Når sebrafiskembryoer er 34 timer etter befruktning, ta kulturrettene belagt med laminin ut av inkubatoren. Og vask dekselet glir tre ganger med 0,5 milliliter 1X PBS.Etter den endelige vasken, legg til fire milliliter ZFCM + media til hver kulturrett. Unngå å tørke platen. Hent de tilberedte kjølekulturrettene og la dem likevekte til romtemperatur.Fyll fire til seks PCR-rør med 15 mikroliter ZFCM +media. Hent sebrafiskembryoer fra inkubatoren og senk embryoer i en 35 millimeter vevskulturrett som inneholder 70% etanol i 5-10 sekunder for å sterilisere den. Ved hjelp av en overføring av pipette, overfør embryoer til E2 media en tallerken, som inneholder sterile E2-medier for å vaske av overflødig etanol.Overfør deretter embryoene til E2 media to tallerken og fjern sine chorions med skarpe tang. Til slutt overfører du embryoer til E2 media tre retter for å utføre disseksjoner. Bruk et par fine tang, plasser og hold embryoer fremre til eggeplommen med en av tangene.Og fjern hale posterior til eggeplommesekken med de andre tangene. Ta tak i nakken med tang og ta av hodet for å eksponere hjernen og øynene for E2-mediene. Med spissen av fine tang ruller du forsiktig øynene fra hodet mens du holder kranialvevet nede med en annen tang.Overfør fire øyne til et av de tidligere forberedte rørene som inneholder ZFCM +Trianturer forsiktig opp og ned med en p20 pipette ca. 45 ganger for å fjerne celler. Overfør ZFCM+ med de dissosierte cellene til midten av dekslene. Oppretthold kulturer på benken på 22 grader Celsius på et polystyrenskumstativ for å absorbere vibrasjoner.På dagen for avbildning, sjekk celler under mikroskopet for å validere veksten av RGC-axoner. For levende celleavbildning, overfør dekslene fra kulturretten til et levende celleavbildningskammer. Bruk et invertert mikroskop utstyrt med et DIC-objektivt OG-590 Longpass rødt filter og et EMCCD-kamera.Før bildebehandling, erstatt ZFCM + medium med ZFCM-Etter å ha plassert cellene med 10X-målet, skaff bilder ved 60X forstørrelse ved hjelp av et oljeinnlevelsesmål. Bruk en ekstra 1,5X forstørrelse. Først skaffe DIC bilder.Deretter, bilde roGFP2-Orp1, ved hjelp av riktig filtersett. Etter å ha tatt det første settet med bilder, utveksle medier med medier som inneholder forskjellige behandlingsløsninger. Media bør endres hvert 30.For in vivo-avbildning, hold 22 til 24-timers postbefruktning embryoer i E3-medier, som inneholder 0,003% fenyltiourea uten metylenblå. Utveksle medier og fjerne døde embryoer daglig. I ønsket alder bedøver og monterer embryoer i 1% agarose på 35 millimeter glassbunnskulturretter.Embryoer kan orienteres dorsalt, ventrally eller lateralt, avhengig av interesseområdet for avbildning. Etter at agarose størkner, fyll oppvasken med E3-medier uten metylenblå, men med 0,016% trikain. Sett opp mikroskopet for avbildning.Bruk et omvendt laserskanningskonfokalt mikroskop for å avbilde embryoer montert på bunnen av en agarosedråpe. Excite roGFP2-Orp1, og skaffe tilsvarende bilder med de ønskede utslippsfiltrene. Skaff z-stabler med fem mikro meter seksjon tykkelse gjennom ønsket del av embryoene.Etter avbildning, fjern embryoer fra Agarose med fine tang og hold dem i inkubatoren og metylenblå frie medier med fenyltiourea til ønsket alder. Et representativt bilde av hydrogenperoksidbiosensoren og dyrket sebrafisk RGC utvidede aksoner er vist her. Cellelegemet, axon og vekstkjegler er tydelig synlige i individuelle nevroner.Tilsetningen av hydrogenperoksid til kulturmediene øker forholdsverdiene, og viser at sanntidsendringer kan oppdages med dette systemet. Kvantifisering av hydrogenperoksidnivåer er vist i panelet B.To bestemme hydrogenperoksidnivåer i hele sebrafiskembryoer, mRNA ble injisert i løpet av ett cellestadium, noe som fikk alle vev til å uttrykke roGFP2-Orp1 biosensor. Hoderegionen av sebrafisk larver er vist på to forskjellige tidspunkter, med fokus på hydrogenperoksidnivåene i netthinnen.De basale nivåene av hydrogenperoksid i sebrafiskembryoene etter to dager etter befruktning og fem dager etter befruktning ble målt. Etter to dager etter befruktning var forholdsverdiene betydelig lavere enn ved fem dager etter befruktning. Videre viste hvert dyr et annet nivå av økning i deres retinal hydrogenperoksidinnhold.Bruk av fine tang for å fjerne øynene og forsiktig dissosiasjon av øynene med pipetten er de mest kritiske trinnene i denne prosedyren. Denne protokollen kan følges av narkotikabehandlinger for å undersøke faktorene som er involvert i ROS-signalering.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

Høy oppløsning Live-Imaging of Cell Behavior i utviklingsland Neuroepithelium

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Ex vivo Levende Imaging av single celledelinger i mus neuroepithelium

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Levende Imaging av Mitosis i utviklings Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

Utnytte Kombinert Metoder for å definere rollen til plasmamembranen Levering Under Axon Forgrening og neuronal morphogenesis

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

Analysere Dendritic Morfologi i kolonner og Layers

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

I Vivo kalsium bildebehandling av Lateral linje hårcellene i larver sebrafisk

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Forbereder voksen drosophila melanogaster for hele hjerneavbildning under atferd og stimuli responser

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...