Name: ros live cell imaging during neuronal development
Uploaded: 2021-02-09T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about ROS Live Cell Imaging During Neuronal Development at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (Grant R01NS117701), National Science Foundation (Grant 1146944-IOS), Indiana Traumatic Spinal Cord and Brain Injury Research Fund (Grant 20000289), Purdue Research Foundation (Grant 209911) e pelo Escritório do Vice-Presidente Executivo de Pesquisa e Parcerias da Universidade Purdue (Grant 210362). Agradecemos ao Dr. Cory J. Weaver e Haley Roeder por estabelecerem o protocolo de cultura RGC de zebrafish. Agradecemos a Haley Roeder adicionalmente por fornecer os dados da Figura 4. Agradecemos a Leah Biasi e Kenny Nguyen pela ajuda com a cultura do RGC. Agradecemos a Gentry Lee por editar o texto. Agradecemos ao Dr. Tobias Dick por fornecer roGFP2-Orp1 e Dr. Qing Deng para o vetor pCS2+ contendo roGFP2-Orp1. A Figura 2 é criada com Biorender.com.

Todos os experimentos em animais foram eticamente revisados e aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais purdue (PACUC), seguindo as diretrizes do NIH com o protocolo 2006002050 aprovado em 24/07/2020.
1. Preparação de soluções
<ol><li>Mídia E2 (1x)<ol>
<li>Prepare soluções 100x E2A (500 mL), 500x E2B (100 mL) e 500x E2C (100 mL) combinando todos os componentes mostrados na Tabela 1. Soluções Autoclave E2A, E2B e E2C. Armazenar a 4 °C.</li>
		<li>Para 1x E...

<ol>
	<li>B&#243;rquez, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+role+of+redox+signaling+in+neuronal+development.">Dissecting the role of redox signaling in neuronal development.</a> Journal of Neurochemistry. 137 (4), 506-517 (2016).</li><li>Bedard, K., Krause, K. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NOX+family+of+ROS-generating+NADPH+oxidases:+Physiology+and+pathophysiology.">The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: Physiology and pathophysiology.</a> Physiological Reviews. 87 (1), 245-313 (2007).</li><li>Weaver, C. J., Leung, Y. F., Suter, D. 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T., Gonz&#225;lez-Billault, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+NADPH+oxidase+to+the+establishment+of+hippocampal+neuronal+polarity+in+culture.">Contribution of NADPH oxidase to the establishment of hippocampal neuronal polarity in culture.</a> Journal of Cell Science. 128 (16), 2989-2995 (2015).</li><li>Munnamalai, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+interactions+between+Nox2-type+NADPH+oxidase+and+the+F-actin+cytoskeleton+in+neuronal+growth+cones.">Bidirectional interactions between Nox2-type NADPH oxidase and the F-actin cytoskeleton in neuronal growth cones.</a> Journal of Neurochemistry. 130 (4), 526-540 (2014).</li><li>Kishida, K. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nox2-dependent+neuroinflammation+in+an+EAE+model+of+multiple+sclerosis.">Nox2-dependent neuroinflammation in an EAE model of multiple sclerosis.</a> Translational Neuroscience. 10 (1), 1-9 (2019).</li><li>Park, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nox2-derived+radicals+contribute+to+neurovascular+and+behavioral+dysfunction+in+mice+overexpressing+the+amyloid+precursor+protein.">Nox2-derived radicals contribute to neurovascular and behavioral dysfunction in mice overexpressing the amyloid precursor protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (4), 1347-1352 (2008).</li><li>Schiavone, S., Neri, M., Trabace, L., Turillazzi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NADPH+oxidase+NOX2+mediates+loss+of+parvalbumin+interneurons+in+traumatic+brain+injury:+Human+autoptic+immunohistochemical+evidence.">The NADPH oxidase NOX2 mediates loss of parvalbumin interneurons in traumatic brain injury: Human autoptic immunohistochemical evidence.</a> Scientific Reports. 7 (1), 8752 (2017).</li><li>Gutscher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity-based+protein+thiol+oxidation+by+H2O2-scavenging+peroxidases.">Proximity-based protein thiol oxidation by H2O2-scavenging peroxidases.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (46), 31532-31540 (2009).</li><li>Bilan, D. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+toolbox+for+genetic+manipulation+of+zebrafish.">A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish.</a> Advances in Genomics and Genetics. 5, 151-163 (2015).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).</li><li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regular+care+and+maintenance+of+a+Zebrafish+(Danio+rerio)+laboratory:+An+introduction.">Regular care and maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+neuron+culture+for+nerve+growth+and+axon+guidance+studies+in+Zebrafish+(Danio+rerio).">Primary neuron culture for nerve growth and axon guidance studies in Zebrafish (Danio rerio).</a> PLoS One. 8 (3), 57539 (2013).</li><li>Zhang, L., Leung, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdissection+of+zebrafish+embryonic+eye+tissues.">Microdissection of zebrafish embryonic eye tissues.</a> Journal of Visualized Experiments. (40), e2028 (2010).</li><li>Suter, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+of+neuronal+growth+cone+motility+and+duidance+in+vitro.">Live cell imaging of neuronal growth cone motility and duidance in vitro.</a> Cell Migration: Methods in Molecular Biology. , 65-86 (2011).</li><li>Weaver, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=nox2/cybb+deficiency+affects+zebrafish+retinotectal+connectivity.">nox2/cybb deficiency affects zebrafish retinotectal connectivity.</a> Journal of Neuroscience. 38 (26), 5854-5871 (2018).</li><li>Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+EGSH+and+H2O2+with+roGFP2-based+redox+probes.">Measuring EGSH and H2O2 with roGFP2-based redox probes.</a> Free Radical Biology and Medicine. 51, 1943-1951 (2011).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenylthiourea+specifically+reduces+zebrafish+eye+size.">Phenylthiourea specifically reduces zebrafish eye size.</a> PLoS One. 7 (6), 40132 (2012).</li><li>Ermakova, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+fluorescent+genetically+encoded+indicator+for+intracellular+hydrogen+peroxide.">Red fluorescent genetically encoded indicator for intracellular hydrogen peroxide.</a> Nature Communications. 5, 5222 (2014).</li><li>Oparka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+ROS+levels+using+CM-H2DCFDA+and+HyPer.">Quantifying ROS levels using CM-H2DCFDA and HyPer.</a> Methods. 109, 3-11 (2016).</li><li>Dickinson, B. C., Peltier, J., Stone, D., Schaffer, D. V., Chang, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nox2+redox+signaling+maintains+essential+cell+populations+in+the+brain.">Nox2 redox signaling maintains essential cell populations in the brain.</a> Nature Chemical Biology. 7 (2), 106-112 (2011).</li><li>Cannon, M. B., Remington, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox-sensitive+green+fluorescent+protein:+Probes+for+dynamic+intracellular+redox+responses.+A+review.">Redox-sensitive green fluorescent protein: Probes for dynamic intracellular redox responses. A review.</a> Methods in Molecular Biology. 476, 51-65 (2009).</li><li>Meyer, A. J., Dick, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein-based+redox+probes.">Fluorescent protein-based redox probes.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 13 (5), 621-650 (2010).</li><li>Panieri, E., Millia, C., Santoro, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+quantification+of+subcellular+H2O2+and+glutathione+redox+potential+in+living+cardiovascular+tissues.">Real-time quantification of subcellular H2O2 and glutathione redox potential in living cardiovascular tissues.</a> Free Radical Biology and Medicine. 109, 189-200 (2017).</li><li>Breus, O., Dickmeis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+thiol+redox-sensors+in+the+zebrafish+model:+Lessons+for+embryonic+development+and+regeneration.">Genetically encoded thiol redox-sensors in the zebrafish model: Lessons for embryonic development and regeneration.</a> Biological Chemistry. , (2020).</li><li>Morgan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+basal+H2O2+levels+with+peroxiredoxin-based+probes.">Real-time monitoring of basal H2O2 levels with peroxiredoxin-based probes.</a> Nature Chemical Biology. 12 (6), 437-443 (2016).</li><li>Terzi, A., Roeder, H., Weaver, C. J., Suter, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+NADPH+oxidase+2+regulates+growth+cone+guidance+downstream+of+slit2/robo2.">Neuronal NADPH oxidase 2 regulates growth cone guidance downstream of slit2/robo2.</a> Developmental Neurobiology. , (2020).</li><li>Bilan, D. S., Belousov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HyPer+family+probes:+State+of+the+art.">HyPer family probes: State of the art.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 24 (13), 731-751 (2016).</li><li>Ermankova, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SypHer3s:+a+genetically+encoded+fluorescent+ratiometric+probe+with+enhanced+brightness+and+an+improved+dynamic+range.">SypHer3s: a genetically encoded fluorescent ratiometric probe with enhanced brightness and an improved dynamic range.</a> Chemistry Communications. 54 (23), 2898-2901 (2018).</li><li>Pak, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+genetically+encoded+indicator+for+hydrogen+peroxide+identifies+roles+for+the+oxidant+in+cell+migration+and+mitochondrial+function.">Ultrasensitive genetically encoded indicator for hydrogen peroxide identifies roles for the oxidant in cell migration and mitochondrial function.</a> Cell Metabolism. 31 (3), 642-653 (2020).</li><li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tol2kit:+A+multisite+gateway-based+construction+Kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs.">The Tol2kit: A multisite gateway-based construction Kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).</li></ol>

Existem várias etapas críticas que precisam de atenção ao longo deste protocolo. Acreditamos que considerando esses pontos melhorará o fluxo experimental. Para a cultura primária do RGC, a esterilidade do ZFCM(-) é muito importante, uma vez que esta mídia cultural não contém antibióticos e a contaminação pode ocorrer antes ou durante a imagem. Para evitá-lo, aconselhamos preparar e usar ZFCM(-) somente dentro de um gabinete de biossegurança e fazer novas mídias ZFCM(-) regularmente (Passo 1.5). Além diss...

A sinalização reativa da espécie oxigênio (ROS) regula o desenvolvimento e o funcionamento do sistema nervoso1. Uma importante fonte ros celular são as oxidases NADPH (NOX), que são proteínas transmembranas que geram superóxido e peróxido de hidrogênio (H2O2)2. Enzimas NOX são encontradas em todo o sistema nervoso central (CNS), e ros derivado do NOX contribuem para o desenvolvimento neuronal3,4,5,6. A manutenção e diferenciação das células-tronco neurais, o estabelecimento da polaridade neuronal, do crescimento do neurite e da plasticidade sináptica têm sido mostrados como necessários níveis adequados de ROS7,8,9,10,11. Por outro lado, a produção descontrolada de ROS por NOXes contribui para distúrbios neurodegenerativos, incluindo doença de Alzheimer, esclerose múltipla e lesão cerebral traumática12,13,14. Por isso, a produção de ROS fisiologicamente relevante é fundamental para a manutenção de condições saudáveis.
O desenvolvimento de biosensores geneticamente codificados facilitou muito a detecção de ROS celular. Uma vantagem importante dos biosensores geneticamente codificados é o aumento da resolução temporal e espacial do sinal ROS, pois esses sensores podem ser especificamente direcionados a locais distintos. O GFP sensível ao redox (roGFP) é um tipo desses biosensores ROS. A variante roGFP2-Orp1 detecta especificamente H2O2 através de seu domínio Orp1, que é uma proteína geneatoxitina de glutationa peroxiredoxina a partir da levedura15,16. A oxidação da proteína Orp1 é transferida para roGFP2 para alterar sua conformação (Figura 1A). A sonda exibe dois picos de excitação perto de 405 nm e 480 nm, e um único pico de emissão de 515 nm. Após a oxidação, a intensidade da fluorescência em torno dos picos de excitação muda: enquanto a excitação de 405 nm aumenta, a excitação de 480 nm diminui. Assim, roGFP2-Orp1 é um biosensor ratiométrico, e osníveisde H2O 2 são detectados pela razão de intensidades de fluorescência animadas em dois comprimentos de onda diferentes(Figura 1B). No geral, roGFP2-Orp1 é uma ferramenta versátil para imagens ROS que pode ser utilizada de forma eficiente in vivo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62165/62165fig01.jpg"> Figura 1: Espectros de representação e excitação esquemática de roGFP2-Orp1. (A) A transferência oxidante ocorre entre Orp1 e roGFP2 em resposta a H2O2, levando a alterações conformais no roGFP2. (B) O espectro de excitação do roGFP2-Orp1 exibe dois picos de excitação de 405 nm e 480 nm e pico de emissão única de 515 nm. Após a oxidação por H2O2,a excitação de 405 nm aumenta enquanto a excitação de 480 nm diminui. Isso resulta em uma leitura ratiométrica para a presença de H2O2. O número foi modificado de Bilan e Belousov (2017)16 e Morgan et al. (2011)25. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62165/62165fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
O sistema modelo Danio rerio (zebrafish) tem várias vantagens para aplicar biosensores geneticamente codificados. A transparência óptica dos embriões e larvas permite imagens in vivo não invasivas. Novas ferramentas de imagem estão sendo desenvolvidas para alcançar maior resolução e penetração mais profunda17. Além disso, existem ferramentas estabelecidas para manipulação genética (expressão ectópica mRNA, transgênese Tol2, etc.) e edição de genomas (TALENs, CRISPR/Cas9, etc.), que promove a geração de animais transgênicos18. À medida que os embriões de zebrafish se desenvolvem fora da mãe, este sistema permite ainda mais acesso e manipulação dos embriões. Por exemplo, injeções de estágio de uma célula e tratamentos medicamentosos podem ser facilmente feitos.
Aqui, usamos zebrafish para expressar transitoriamente o biosensor H2O2-específico roGFP2-Orp1 injetando mRNA in vitro transcrito. Esses embriões podem ser usados tanto para imagens in vitro de neurônios cultivados quanto para imagens in vivo (Figura 2). Descrevemos um protocolo para dissecar e emplacar células de gânglios de retina (RGCs) de embriões de zebrafish seguidos pela avaliação dos níveis de H2O2em neurônios cultivados. Em seguida, apresentamos um método para imagens in vivo de embriões e larvas que expressam roGFP2-Orp1 usando microscopia confocal. Esta abordagem não só permite determinar os níveis fisiológicos H2O2,mas também possíveis mudanças ocorridas em diferentes estágios ou condições de desenvolvimento. No geral, este sistema fornece um método confiável para detectar H2O2 em células vivas e animais para estudar o papel de H2O2 no desenvolvimento, saúde e doenças.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62165/62165fig03.jpg"> Figura 2. Esboço da abordagem experimental. Brevemente, após a coleta de embriões, roGFP2-Orp1 mRNA é injetado na gema de embriões de zebrafish estágio de uma célula. Embriões em desenvolvimento podem ser usados paraimagens in vitro ein vivo . ( A )Osembriões GFP positivos são usados para dissecar retinas para coleta de RGC a 34 hpf. Os RGCs dissociados são emplacados em tampas revestidas de PDL/laminina na mídia ZFCM (+). A imagem do cone de crescimento pode ser conduzida à medida que os RGCs estendem seus axônios após 6-24 h de revestimento. As células podem ser submetidas a diferentes tratamentos para medir as possíveis mudanças nos níveis de H2O2. Aqui, medimos h2O2 -níveisnos cones de crescimento de RGCs (vermelho). (B) Os embriões positivos GFP são utilizados para imagens in vivo. Na idade desejada, os embriões podem ser anestesiados e montados em pratos de fundo de vidro de 35 mm para imagens confocal. Aqui, os embriões são montados ventrally para imagem da retina. Esquema mostra desenvolvimento de retina em zebrafish. Os RGCs formam camada de células de glion (GCL), que é a camada mais interna da retina. Os axônios RGC desenvolvem-se em nervo óptico para cruzar a linha média, formando quiasmo óptico. Em seguida, os axônios RGC crescem dorsais para fazer sinapses no tectum óptico no cérebro médio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62165/62165fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35-mm culture dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83-3900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm glass bottom dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP160-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillary Tubes</td>
			<td>Sutter/Fisher Scientific</td>
			<td>NC9029378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2850-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Petri Dishes (100 x 15 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>26140087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma Aldich</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection Mold</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>TU-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23017-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scanning Confocal Microscopy</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium with phenol red</td>
			<td>Gibco/Fisher Scientific</td>
			<td>11-415-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium without phenol red</td>
			<td>Gibco/Fisher Scientific</td>
			<td>21-083-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting agarose</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V2111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMessage mMachine SP6 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0189S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Hyclone/Fisher Scientific</td>
			<td>SH3025601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td>Sigma Aldich</td>
			<td>P0290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma Aldich</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic PicoPump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PV820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine (PDL)</td>
			<td>Sigma Aldich</td>
			<td>P7280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QiaQUICK PCR Purification Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse slit2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>5444-SL-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Sigma Aldich</td>
			<td>P5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steritop 0.22 &#181;m filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>S2GPT05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE Buffer</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine Methanesulfonate</td>
			<td>Sigma Aldich</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Pipette Puller</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>700C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ros live cell imaging during neuronal development

Espécies reativas de oxigênio (ROS) são moléculas de sinalização bem estabelecidas, que são importantes no desenvolvimento normal, homeostase e fisiologia. Entre os diferentes ROS, o peróxido de hidrogênio (H2O2) é melhor caracterizado em relação aos papéis na sinalização celular. H2O2 foi implicado durante o desenvolvimento em várias espécies. Por exemplo, um aumento transitório em H2O2 foi detectado em embriões de zebrafish durante os primeiros dias após a fertilização. Além disso, o esgotamento de uma importante fonte celular H2O2, NADPH oxidase (NOX), prejudica o desenvolvimento do sistema nervoso, como a diferenciação, o crescimento axonal e a orientação das células de gânglios retinianos (RGCs) tanto in vivo quanto in vitro. Aqui, descrevemos um método para imagem intracelular H2O2 níveis em neurônios de zebrafish cultivados e larvas inteiras durante o desenvolvimento usando o biosensor específico H2O2geneticamente codificado, roGFP2-Orp1. Esta sonda pode ser transitória ou stably expressa em larvas de zebrafish. Além disso, a leitura ratiométrica diminui a probabilidade de detectar artefatos devido à expressão genética diferencial ou efeitos de volume. Primeiro, demonstramos como isolar e cultivar RGCs derivados de embriões de zebrafish que expressam transitoriamente roGFP2-Orp1. Então, usamos larvas inteiras para monitorar os níveis de H2O2 no nível do tecido. O sensor foi validado pela adição de H2O2. Além disso, essa metodologia poderia ser usada para medir os níveis de H2O2 em tipos e tecidos celulares específicos, gerando animais transgênicos com expressão biosensora específica do tecido. Como os zebrafish facilitam manipulações genéticas e de desenvolvimento, a abordagem aqui demonstrada poderia servir como um pipeline para testar o papel de H2O2 durante o desenvolvimento neuronal e geral embrionário em vertebrados.

RGCs de zebrafish cultivados estendem axônios dentro de 1d. Uma imagem representativa da razão 405/480 do biosensor H2O2é mostrada na Figura 4A. O corpo celular, o axônio e os cones de crescimento são claramente visíveis em neurônios individuais. Esses neurônios podem ser submetidos a diferentes tratamentos ao longo do tempo para monitorar as alterações de H2O2. Descobrimos anteriormente que adicionar 100 μM H2O2 à...

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ROS Live Cell Imaging During Neuronal Development

Este protocolo descreve o uso de um peróxido de hidrogênio geneticamente codificado (H2O2)-biosensor em neurônios e larvas de zebrafish cultivados para avaliar os papéis de sinalização fisiológica de H2O2 durante o desenvolvimento do sistema nervoso. Pode ser aplicado a diferentes tipos de células e modificado com tratamentos experimentais para estudar espécies reativas de oxigênio (ROS) no desenvolvimento geral.

Imagem de células vivas ROS durante o desenvolvimento neuronal

Reactive oxygen species (ROS) are well-established signaling molecules, which are important in normal development, homeostasis, and physiology. Among the ...

Nosso protocolo descreve o uso de um biosensor de peróxido de hidrogênio em neurônios e larvas de zebrafish cultivados. Este protocolo ajudará os pesquisadores a dissecar o papel das espécies reativas de oxigênio na fisiologia e fisiopatologia normais. A principal vantagem dessa técnica é a detecção em tempo real do peróxido de hidrogênio em animais vivos e células cultivadas.Este método pode ser aplicado a outros animais, como o sistema modelo de roedores. Para preparar as tampas, utilize tampas limpas com ácido armazenadas em 100% etanol. Use fórceps para remover uma mancha de cobertura do recipiente de armazenamento e flame-o para remover o etanol residual.O ar seca completamente a mancha de cobertura colocando-a em um ângulo dentro de um prato de cultura de 35 milímetros. Prepare Poly-D-Lysine ou PDL, ou solução de trabalho. Aplique PDL no centro de cada deslizamento de cobertura, evitando a disseminação da solução para as bordas e incubar o PDL por 20 a 30 minutos em temperatura ambiente.Certifique-se de que o PDL não seque. Lave o PDL com 0,5 mililitros de água estéril e deixe as placas secarem completamente. Prepare a solução de trabalho laminin.E aplique-o no centro de cada deslizamento de cobertura, certificando-se de evitar a disseminação da solução para as bordas. Incubar as placas a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada por duas a seis horas, evite uma secagem da solução de laminina. Para realizar uma dissecção de embriões em células de gânglios de retina ou RGCs, prepare e rotule quatro pratos de cultura tecidual de 35 milímetros e encha-os com quatro mililitros de 70% de etanol.E2 mídia um. E2 mídia dois. E e a mídia E2 três, no dia da dissecação.Mantenha os pratos na geladeira. Quando os embriões de zebrafish estiverem 34 horas após a fertilização, leve os pratos de cultura revestidos com laminina para fora da incubadora. E lave os deslizamentos de tampa três vezes com 0,5 mililitros de 1X PBS.Após a lavagem final, adicione quatro mililitros de ZFCM+mídia a cada prato de cultura. Evite secar a placa. Recupere os pratos de cultura refrigerada preparados e deixe-os equilibrar à temperatura ambiente.Encha de quatro a seis tubos PCR com 15 microliters de ZFCM+media. Recupere embriões de zebrafish da incubadora e mergulhe em embriões em um prato de cultura tecidual de 35 milímetros contendo 70% de etanol por 5-10 segundos para esterilizá-lo. Usando uma transferência de pipeta, transfira embriões para o prato de mídia E2, contendo mídia E2 estéril para lavar o excesso de etanol.Em seguida, transfira os embriões para a mídia E2 dois pratos e remova seus acordes com fórceps afiados. Finalmente, transfira embriões para a mídia E2 três prato para realizar dissecções. Usando um par de fórceps finos, posicione e segure os embriões anteriores à gema com um dos fórceps.E remova a cauda posterior para o saco de gema com as outras fórceps. Pegue o pescoço com fórceps e tire a cabeça para expor o cérebro e os olhos à mídia E2. Com a ponta de fórceps finos, revira suavemente os olhos da cabeça enquanto segura o tecido craniano para baixo com um segundo fórceps.Transfira quatro olhos para um dos tubos previamente preparados contendo ZFCM+Gently triturar para cima e para baixo com uma pipeta p20 cerca de 45 vezes para dissociar células. Transfira o ZFCM+com as células dissociadas para o centro das tampas. Mantenha culturas na parte superior do banco a 22 graus Celsius em um rack de espuma de poliestireno para absorver vibrações.No dia da imagem, verifique as células sob o microscópio para validar o crescimento dos axônios de RGC. Para imagens de células vivas, transfira as tampas do prato de cultura para uma câmara de imagem celular viva. Use um microscópio invertido equipado com um filtro vermelho DIC objetivo OG-590 Longpass e uma câmera EMCCD.Antes da imagem, substitua o meio ZFCM+por ZFCM-Depois de posicionar as células com o objetivo de 10X, adquira imagens a ampliação de 60X usando um objetivo de imersão de óleo. Use uma ampliação adicional de 1,5X. Primeiro adquira imagens DIC.Em seguida, imagem roGFP2-Orp1, usando o conjunto de filtros apropriado. Depois de tirar o primeiro conjunto de imagens, troque mídia com mídia contendo diferentes soluções de tratamento. A mídia deve ser alterada a cada 30 minutos de imagem para evitar alterações de pH e osmolaridade.Para imagens in vivo, mantenha embriões pós-fertilização de 22 a 24 horas em meio E3, contendo 0,003% de tiorea fenil sem azul de metileno. Troque mídia e remova embriões mortos diariamente. Na idade desejada, anestesiar e montar embriões em 1%de agarose em pratos de cultura de fundo de vidro de 35 milímetros.Os embriões podem ser orientados dorsalmente, ventricamente ou lateralmente, dependendo da região de interesse para a imagem. Depois que a agarose solidificar, encha os pratos com mídia E3 sem azul de metileno, mas com 0,016%tricaine. Configure o microscópio para imagens.Use um microscópio confocal de varredura a laser invertido para imagens montadas na parte inferior de uma gota de agarose. Excite roGFP2-Orp1 e adquira imagens correspondentes com os filtros de emissão desejados. Adquira pilhas z com espessura de seção de cinco micrometros através da parte desejada dos embriões.Após a imagem, remova os embriões de Agarose com fórceps finos e mantenha-os na incubadora e mídia livre de metileno azul com tiorea fenil até a idade desejada. Uma imagem representativa do biosensor de peróxido de hidrogênio e dos axônios estendidos RGC de peixe-zebra cultivado é mostrada aqui. O corpo celular, o axônio e os cones de crescimento são claramente visíveis em neurônios individuais.A adição de peróxido de hidrogênio à mídia cultural aumenta os valores de proporção, mostrando que mudanças em tempo real podem ser detectadas com este sistema. A quantificação dos níveis de peróxido de hidrogênio é mostrada no painel B.To determinar os níveis de peróxido de hidrogênio em embriões inteiros de zebrafish, o mRNA foi injetado durante o estágio de uma célula, fazendo com que todos os tecidos expressassem o biosensor roGFP2-Orp1. A região principal das larvas de zebrafish é mostrada em dois pontos de tempo diferentes, focando nos níveis de peróxido de hidrogênio na retina.Os níveis basais de peróxido de hidrogênio nos embriões de zebrafish em dois dias após a fertilização e cinco dias após a fertilização foram medidos. Em dois dias após a fertilização, os valores de razão foram significativamente menores do que em cinco dias após a fertilização. Além disso, cada animal mostrou um nível diferente de aumento no teor de peróxido de hidrogênio da retina.O uso de fórceps finos para remover os olhos e a dissociação suave dos olhos com a pipeta são os passos mais críticos neste procedimento. Este protocolo pode ser seguido por tratamentos medicamentosos para investigar os fatores envolvidos na sinalização ros.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Em células vivas, imagens de células precursoras de órgãos sensoriais na Intact Drosophila As pupas

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Neurociência

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

Imagens ao vivo de axônios da raiz dorsal após rizotomia

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

De alta resolução de imagem ao vivo de comportamento de células no desenvolvimento neuroepitélio

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Ex vivo imagens ao vivo de divisões celulares simples no mouse neuroepithelium

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Imagens ao vivo da mitose no desenvolvimento Cortex embrionárias de camundongos

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

Utilizando metodologias combinadas para definir o papel do Plasma Membrane entrega durante Axon Ramificação e Neuronal morfogênese

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

Analisando dendríticas Morfologia em Colunas e Camadas

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

Na imagem latente de cálcio Vivo de células de cabelo linha Lateral no Zebrafish Larval

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Preparando melanogaster de Drosophila adulto para imagem cerebral inteira durante respostas comportamentais e estímulos

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...