Name: ros live cell imaging during neuronal development
Uploaded: 2021-02-09T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about ROS Live Cell Imaging During Neuronal Development at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (Subvención R01NS117701), la Fundación Nacional de Ciencias (Subvención 1146944-IOS), el Fondo de Investigación de la Médula Espinal Traumática y lesiones cerebrales de Indiana (Subvención 20000289), la Fundación de Investigación Purdue (Subvención 209911) y la Oficina del Vicepresidente Ejecutivo de Investigación y Asociaciones de la Universidad de Purdue (Subvención 210362). Agradecemos al Dr. Cory J. Weaver y Haley Roeder por establecer el protocolo de cultivo de RGC de pez cebra. Agradecemos a Haley Roeder, además, por proporcionar los datos de la Figura 4. Agradecemos a Leah Biasi y Kenny Nguyen por la ayuda con la cultura RGC. Agradecemos a Gentry Lee por editar el texto. Agradecemos al Dr. Tobias Dick por proporcionar roGFP2-Orp1 y al Dr. Qing Deng para el vector pCS2+ que contiene roGFP2-Orp1. La figura 2 se crea con Biorender.com.

Todos los experimentos con animales fueron revisados éticamente y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de Purdue (PACUC), siguiendo las directrices de los NIH con el protocolo 2006002050 aprobado el 24/07/2020.
1. Preparación de soluciones
<ol><li>Medios E2 (1x)<ol>
<li>Prepare soluciones de 100x E2A (500 mL), 500x E2B (100 mL) y 500x E2C (100 mL) combinando todos los componentes que se muestran en la Tabla 1. Soluciones de autoclave E2A, E2B y E2C. Conser...

<ol>
	<li>B&#243;rquez, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+role+of+redox+signaling+in+neuronal+development.">Dissecting the role of redox signaling in neuronal development.</a> Journal of Neurochemistry. 137 (4), 506-517 (2016).</li><li>Bedard, K., Krause, K. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NOX+family+of+ROS-generating+NADPH+oxidases:+Physiology+and+pathophysiology.">The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: Physiology and pathophysiology.</a> Physiological Reviews. 87 (1), 245-313 (2007).</li><li>Weaver, C. J., Leung, Y. F., Suter, D. 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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdissection+of+zebrafish+embryonic+eye+tissues.">Microdissection of zebrafish embryonic eye tissues.</a> Journal of Visualized Experiments. (40), e2028 (2010).</li><li>Suter, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+of+neuronal+growth+cone+motility+and+duidance+in+vitro.">Live cell imaging of neuronal growth cone motility and duidance in vitro.</a> Cell Migration: Methods in Molecular Biology. , 65-86 (2011).</li><li>Weaver, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=nox2/cybb+deficiency+affects+zebrafish+retinotectal+connectivity.">nox2/cybb deficiency affects zebrafish retinotectal connectivity.</a> Journal of Neuroscience. 38 (26), 5854-5871 (2018).</li><li>Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+fluorescent+genetically+encoded+indicator+for+intracellular+hydrogen+peroxide.">Red fluorescent genetically encoded indicator for intracellular hydrogen peroxide.</a> Nature Communications. 5, 5222 (2014).</li><li>Oparka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+ROS+levels+using+CM-H2DCFDA+and+HyPer.">Quantifying ROS levels using CM-H2DCFDA and HyPer.</a> Methods. 109, 3-11 (2016).</li><li>Dickinson, B. C., Peltier, J., Stone, D., Schaffer, D. V., Chang, C. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein-based+redox+probes.">Fluorescent protein-based redox probes.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 13 (5), 621-650 (2010).</li><li>Panieri, E., Millia, C., Santoro, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+quantification+of+subcellular+H2O2+and+glutathione+redox+potential+in+living+cardiovascular+tissues.">Real-time quantification of subcellular H2O2 and glutathione redox potential in living cardiovascular tissues.</a> Free Radical Biology and Medicine. 109, 189-200 (2017).</li><li>Breus, O., Dickmeis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+thiol+redox-sensors+in+the+zebrafish+model:+Lessons+for+embryonic+development+and+regeneration.">Genetically encoded thiol redox-sensors in the zebrafish model: Lessons for embryonic development and regeneration.</a> Biological Chemistry. , (2020).</li><li>Morgan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+basal+H2O2+levels+with+peroxiredoxin-based+probes.">Real-time monitoring of basal H2O2 levels with peroxiredoxin-based probes.</a> Nature Chemical Biology. 12 (6), 437-443 (2016).</li><li>Terzi, A., Roeder, H., Weaver, C. J., Suter, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+NADPH+oxidase+2+regulates+growth+cone+guidance+downstream+of+slit2/robo2.">Neuronal NADPH oxidase 2 regulates growth cone guidance downstream of slit2/robo2.</a> Developmental Neurobiology. , (2020).</li><li>Bilan, D. S., Belousov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HyPer+family+probes:+State+of+the+art.">HyPer family probes: State of the art.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 24 (13), 731-751 (2016).</li><li>Ermankova, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SypHer3s:+a+genetically+encoded+fluorescent+ratiometric+probe+with+enhanced+brightness+and+an+improved+dynamic+range.">SypHer3s: a genetically encoded fluorescent ratiometric probe with enhanced brightness and an improved dynamic range.</a> Chemistry Communications. 54 (23), 2898-2901 (2018).</li><li>Pak, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+genetically+encoded+indicator+for+hydrogen+peroxide+identifies+roles+for+the+oxidant+in+cell+migration+and+mitochondrial+function.">Ultrasensitive genetically encoded indicator for hydrogen peroxide identifies roles for the oxidant in cell migration and mitochondrial function.</a> Cell Metabolism. 31 (3), 642-653 (2020).</li><li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tol2kit:+A+multisite+gateway-based+construction+Kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs.">The Tol2kit: A multisite gateway-based construction Kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).</li></ol>

Hay varios pasos críticos que necesitan atención a lo largo de este protocolo. Creemos que teniendo en cuenta estos puntos mejorará el flujo experimental. Para el cultivo primario de RGC, la esterilidad de la ZFCM (-) es muy importante, ya que este medio de cultivo no contiene antibióticos y la contaminación puede ocurrir antes o durante la toma de imágenes. Para evitarlo, aconsejamos preparar y utilizar ZFCM(-) sólo dentro de un gabinete de bioseguridad y hacer medios ZFCM(-) frescos regularmente (Paso 1.5). Adem...

La señalización reactiva de especies de oxígeno (ROS) regula el desarrollo y el funcionamiento del sistema nervioso1. Una fuente celular importante de ROS son las NADPH oxidasas (NOX), que son proteínas transmembrana que generan superóxido y peróxido de hidrógeno(H2O2)2. Las enzimas NOX se encuentran en todo el sistema nervioso central (SNC), y el ROS derivado de NOX contribuye al desarrollo neuronal3,4,5,6. Se ha demostrado que el mantenimiento y la diferenciación de las células madre neurales, el establecimiento de la polaridad neuronal, la excrecencia de la neurita y la plasticidad sináptica requieren niveles adecuados de ROS7,8,9,10,11. Por otro lado, la producción incontrolada de ROS por los NOXes contribuye a trastornos neurodegenerativos como la enfermedad de Alzheimer, la esclerosis múltiple y la lesión cerebral traumática12,13,14. Por lo tanto, la producción de ROS fisiológicamente relevante es fundamental para mantener condiciones saludables.
El desarrollo de biosensores codificados genéticamente facilitó enormemente la detección de ROS celular. Una ventaja importante de los biosensores codificados genéticamente es el aumento de la resolución temporal y espacial de la señal ROS, ya que estos sensores se pueden dirigir específicamente a ubicaciones distintas. GFP sensible a redox (roGFP) es un tipo de estos biosensores ROS. La variante roGFP2-Orp1 detecta específicamenteH2O2 a través de su dominio Orp1, que es una proteína de la familia glutatión peroxiredoxina de la levadura15,16. La oxidación de la proteína Orp1 se transfiere a roGFP2 para alterar su conformación (Figura 1A). La sonda exhibe dos picos de excitación cercanos a 405 nm y 480 nm, y un solo pico de emisión a 515 nm. Tras la oxidación, la intensidad de fluorescencia alrededor de los picos de excitación cambia: mientras que la excitación de 405 nm aumenta, la excitación de 480 nm disminuye. Por lo tanto, roGFP2-Orp1 es un biosensor ratiométrico, y los niveles deH2O2se detectan por la relación de intensidades de fluorescencia excitadas en dos longitudes de onda diferentes (Figura 1B). En general, roGFP2-Orp1 es una herramienta versátil para imágenes ROS que se puede utilizar de manera eficiente in vivo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62165/62165fig01.jpg"> Figura 1:Representación esquemática y espectros de excitación de roGFP2-Orp1. (A)La transferencia de oxidantes se produce entre Orp1 y roGFP2 en respuesta aH2O2,dando lugar a cambios conformacionales en roGFP2. (B) Los espectros de excitación del roGFP2-Orp1 exhiben dos picos de excitación a 405 nm y 480 nm y un pico de emisión única a 515 nm. Tras la oxidación porH2O2, la excitación de 405 nm aumenta mientras que la excitación de 480 nm disminuye. Esto da lugar a una lectura ratiometric para la presencia deH2O2. La cifra ha sido modificada de Bilan y Belousov (2017)16 y Morgan et al. (2011)25. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62165/62165fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.</a>
El sistema modelo Danio rerio (pez cebra) tiene varias ventajas para aplicar biosensores codificados genéticamente. La transparencia óptica de los embriones y larvas permite la obtención de imágenes in vivo no invasivas. Se están desarrollando nuevas herramientas de imagen para lograr una mayor resolución y una penetración más profunda17. Además, existen herramientas establecidas para la manipulación genética (expresión ectópica de ARNm, transgénesis de Tol2, etc.) y la edición del genoma (TALENs, CRISPR/Cas9, etc.), que promueve la generación de animales transgénicos18. A medida que los embriones de pez cebra se desarrollan fuera de la madre, este sistema permite aún más el acceso y la manipulación de los embriones. Por ejemplo, las inyecciones en etapa unicelular y los tratamientos farmacológicos se pueden hacer fácilmente.
Aquí, utilizamos pez cebra para expresar transitoriamente el H2O2-biosensores específicos roGFP2-Orp1 mediante la inyección de ARNm transcrito in vitro. Estos embriones se pueden utilizar tanto para la obtención de imágenes in vitro de neuronas cultivadas como para la obtención de imágenes in vivo (Figura 2). Se describe un protocolo para la disección y chapado de células ganglionares de la retina (RGCs) de embriones de pez cebra seguido de la evaluación de H2O2- niveles en neuronas cultivadas. Entonces, presentamos un método para la proyección de imagen in vivo de roGFP2-Orp1-expresando embriones y larvas usando microscopia confocal. Este enfoque no sólo permite determinar los niveles fisiológicos deH2O2-sino también los cambios potenciales que ocurren en diferentes etapas o condiciones de desarrollo. En general, este sistema proporciona un método confiable para detectarH2O2 en células vivas y animales para estudiar el papel deH2O2 en el desarrollo, la salud y la enfermedad.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62165/62165fig03.jpg"> Figura 2. Esquema del enfoque experimental. Brevemente, después de la recolección de embriones, roGFP2-Orp1 ARNm se inyecta en la yema de los embriones de pez cebra en etapa unicelular. Los embriones en desarrollo se pueden utilizar tanto para(A) imágenes in vitro como(B) in vivo. (A)Los embriones GFP-positivos se utilizan para diseccionar retinas para la colección de RGC en 34 hpf. Los RGCs disociados se platean en cubrebocas recubiertas de PDL/laminina en medios ZFCM (+). La proyección de imagen del cono del crecimiento se puede conducir mientras que RGCs extiende sus axones después de 6-24 h de la galjanoplastia. Las células pueden ser sometidas a diferentes tratamientos para medir los posibles cambios en los niveles deH2O2.- Aquí, medimos H2O2-niveles en los conos de crecimiento de RGCs (rojo). (B)Los embriones positivos de GFP se utilizan para la obtención de imágenes in vivo. A la edad deseada, los embriones pueden anestesiarse y montarse en platos con fondo de vidrio de 35 mm para obtener imágenes confocales. Aquí, los embriones se montan ventralmente para la proyección de imagen retiniana. Schematic muestra el desarrollo de la retina en el pez cebra. Los RGCs forman la capa de la célula del ganglio (GCL), que es la capa más interna en retina. Los axones de RGC se convierten en nervio óptico para cruzar midline, formando quiasma óptico. Entonces, los axones de RGC crecen dorsalmente para hacer sinapsis en el tectum óptico en el mesencéfano. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62165/62165fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35-mm culture dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83-3900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm glass bottom dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP160-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillary Tubes</td>
			<td>Sutter/Fisher Scientific</td>
			<td>NC9029378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2850-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Petri Dishes (100 x 15 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>26140087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma Aldich</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection Mold</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>TU-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23017-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scanning Confocal Microscopy</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium with phenol red</td>
			<td>Gibco/Fisher Scientific</td>
			<td>11-415-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium without phenol red</td>
			<td>Gibco/Fisher Scientific</td>
			<td>21-083-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting agarose</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V2111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMessage mMachine SP6 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0189S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Hyclone/Fisher Scientific</td>
			<td>SH3025601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td>Sigma Aldich</td>
			<td>P0290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma Aldich</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic PicoPump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PV820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine (PDL)</td>
			<td>Sigma Aldich</td>
			<td>P7280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QiaQUICK PCR Purification Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse slit2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>5444-SL-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Sigma Aldich</td>
			<td>P5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steritop 0.22 &#181;m filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>S2GPT05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE Buffer</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine Methanesulfonate</td>
			<td>Sigma Aldich</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Pipette Puller</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>700C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ros live cell imaging during neuronal development

Las especies reactivas de oxígeno (ROS) son moléculas de señalización bien establecidas, que son importantes en el desarrollo normal, la homeostasis y la fisiología. Entre los diferentes ROS, el peróxido de hidrógeno(H2O2)se caracteriza mejor con respecto a los roles en la señalización celular. H2O2 se ha implicado durante el desarrollo en varias especies. Por ejemplo, se ha detectado un aumento transitorio deH2O2 en embriones de pez cebra durante los primeros días después de la fertilización. Además, el agotamiento de una importante fuente celular de H2O2, la NADPH oxidasa (NOX), deteriora el desarrollo del sistema nervioso, como la diferenciación, el crecimiento axonal y la orientación de las células ganglionares de la retina (RGCs) tanto in vivo como in vitro. Aquí, se describe un método para la obtención de imágenes intracelulares H2O2 niveles en las neuronas de pez cebra cultivadas y larvas enteras durante el desarrollo utilizando el genéticamente codificado H2O2-biosensor específico, roGFP2-Orp1. Esta sonda puede expresarse de forma transitoria o estable en larvas de pez cebra. Además, la lectura ratiométrica disminuye la probabilidad de detectar artefactos debido a la expresión génica diferencial o efectos de volumen. En primer lugar, se demuestra cómo aislar y cultivar RGCs derivados de embriones de pez cebra que expresan transitoriamente roGFP2-Orp1. Luego, utilizamos larvas enteras para monitorear los niveles deH2O2 a nivel de tejido. El sensor ha sido validado por la adición deH2O2. Además, esta metodología podría utilizarse para medir los niveles deH2O2 en tipos de células y tejidos específicos mediante la generación de animales transgénicos con expresión de biosensores específicos de tejidos. Como el pez cebra facilita las manipulaciones genéticas y de desarrollo, el enfoque demostrado aquí podría servir como una tubería para probar el papel de H2O2 durante el desarrollo embrionario neuronal y general en vertebrados.

Los RGCs de pez cebra cultivados extienden axones dentro de 1d. En la Figura 4A se muestra una imagen representativa de la relación 405/480 del biosensor H2O2. El cuerpo celular, el axón y los conos de crecimiento son claramente visibles en las neuronas individuales. Estas neuronas pueden ser sometidas a diferentes tratamientos a lo largo del tiempo para monitorizar los cambios deH2O2. Anteriormente encontramos que la adición de 100 μM H2...

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ROS Live Cell Imaging During Neuronal Development

Este protocolo describe el uso de un peróxido de hidrógeno genéticamente codificado (H2O2)-biosensoren neuronas de pez cebra cultivadas y larvas para evaluar las funciones fisiológicas de señalización de H 2 O2durante el desarrollo del sistema nervioso. Se puede aplicar a diferentes tipos de células y modificar con tratamientos experimentales para estudiar especies reactivas de oxígeno (ROS) en el desarrollo general.

Ros imágenes de células vivas durante el desarrollo neuronal

Reactive oxygen species (ROS) are well-established signaling molecules, which are important in normal development, homeostasis, and physiology. Among the ...

Nuestro protocolo describe el uso de un biosensor de peróxido de hidrógeno en neuronas y larvas cultivadas de pez cebra. Este protocolo ayudará a los investigadores a diseccionar el papel de las especies reactivas de oxígeno en la fisiología normal y la fisiopatología. La principal ventaja de esta técnica es la detección en tiempo real de peróxido de hidrógeno en animales vivos y células cultivadas.Este método se puede aplicar a otros animales, como el sistema modelo de roedores. Para preparar las cubiertas, utilice cubrebocas limpiadas con ácido almacenadas en etanol al 100%. Use las autocara para quitar un cubrebocas del contenedor de almacenamiento y quema para eliminar el etanol residual.Seque al aire el cubrebocas por completo colocándolo en un ángulo dentro de un plato de cultivo de 35 milímetros. Prepare Poli-D-Lisina o PDL, o solución de trabajo. Aplique PDL en el centro de cada cubrebocas, evitando la dispersión de la solución a los bordes e incube la PDL durante 20 a 30 minutos a temperatura ambiente.Asegúrese de que la PDL no se seque. Lave la PDL con 0,5 mililitros de agua estéril y deje que las placas se sequen por completo. Prepare la solución de trabajo de laminina.Y aplíquelo al centro de cada cubrebocas, asegurándose de evitar la propagación de la solución a los bordes. Incubar las placas a 37 grados centígrados en una incubadora humidificada durante dos a seis horas, evitar un secado de la solución de laminina. Para realizar una disección embrionaria en células ganglionares de la retina de placa o RGCs, prepare y etiquete cuatro platos de cultivo de tejidos de 35 milímetros y llénelos con cuatro mililitros de etanol al 70%.Medios uno E2. E2 media dos. Y E2 media tres, el día de la disección.Mantenga los platos en la nevera. Cuando los embriones de pez cebra son 34 horas después de la fertilización, tomar los platos de cultivo recubiertos con laminina fuera de la incubadora. Y lavar los resbalones de la cubierta tres veces con 0.5 mililitros de PBS 1X.Después del lavado final, agregue cuatro mililitros de ZFCM+media a cada plato de cultivo. Evite secar la placa. Recupere los platos de cultivo refrigerados preparados y déjelos equilibrar a temperatura ambiente.Llene de cuatro a seis tubos de PCR con 15 microlitros de ZFCM+media. Recupere embriones de pez cebra de la incubadora y sumerja los embriones en un plato de cultivo de tejidos de 35 milímetros que contenga etanol al 70% durante 5-10 segundos para esterilizarlo. Usando una transferencia de pipeta, transfiera embriones al medio E2 un plato, que contiene medios E2 estériles para lavar el exceso de etanol.A continuación, transferir los embriones a la E2 media dos plato y retirar sus coriones con pórceps afilados. Por último, transferir embriones a la E2 media tres platos para realizar disecciones. Usando un par de pórceps finos, coloque y sostenga los embriones anteriores a la yema con uno de los pórceps.Y retirar la cola posterior al saco vitelino con las otras espas denórpides. Agarra el cuello con las medidas de subad y típate la cabeza para exponer el cerebro y los ojos al medio E2. Con la punta de las fórceps finas, ruede suavemente los ojos de la cabeza mientras sostiene el tejido craneal hacia abajo con un segundo fórceps.Transfiera cuatro ojos a uno de los tubos previamente preparados que contienen ZFCM+Triturar suavemente hacia arriba y hacia abajo con una pipeta p20 unas 45 veces para disociar las células. Transfiera el ZFCM+ con las células disociadas al centro de los coverslips. Mantenga los cultivos en la parte superior del banco a 22 grados Centígrados en un estante de espuma de poliestireno para absorber las vibraciones.El día de la proyección de imagen, revise las células bajo el microscopio para validar el crecimiento de los axones de RGC. Para las imágenes de células vivas, transfiera los cubrebocas del plato de cultivo a una cámara de imágenes de células vivas. Utilice un microscopio invertido equipado con un filtro rojo OG-590 Longpass objetivo DIC y una cámara EMCCD.Antes de la toma de imágenes, sustituya el zfcm+medium por ZFCM-Después de colocar las células con el objetivo 10X, adquiera imágenes a un aumento de 60X utilizando un objetivo de inmersión en aceite. Utilice un aumento adicional de 1,5X. Primero adquiera imágenes DIC.A continuación, imagen roGFP2-Orp1, utilizando el conjunto de filtros adecuado. Después de tomar el primer conjunto de imágenes, intercambie medios con medios que contengan diferentes soluciones de tratamiento. Los medios deben cambiarse cada 30 minutos de imágenes para evitar cambios en el pH y la osmolaridad.Para obtener imágenes in vivo, mantenga embriones post-fertilización de 22 a 24 horas en medios E3, que contengan 0,003% de fenil tiourea sin azul de metileno. Intercambiar medios y retirar los embriones muertos diariamente. A la edad deseada, anestesiar y montar embriones en agarosa al 1% en platos de cultivo de fondo de vidrio de 35 milímetros.Los embriones se pueden orientar dorsal, ventral, o lateralmente, dependiendo de la región del interés para la proyección de imagen. Después de que la agarosa se solidifique, llene los platos con medios E3 sin azul de metileno, pero con 0.016% tricaine. Configure el microscopio para la toma de imágenes.Utilice un microscopio confocal de barrido láser invertido para obtener imágenes de embriones montados en la parte inferior de una gota de agarosa. Excitar roGFP2-Orp1, y adquirir las imágenes correspondientes con los filtros de emisión deseados. Adquiera z-stacks con cinco micro metros de espesor de sección a través de la parte deseada de los embriones.Después de la toma de imágenes, retire los embriones de la agarosa con pórceps finos y manténgalos en la incubadora y en medios libres de azul de metileno con fenil tiourea hasta la edad deseada. Aquí se muestra una imagen representativa del biosensor de peróxido de hidrógeno y los axones extendidos RGC de pez cebra cultivados. El cuerpo celular, el axón y los conos de crecimiento son claramente visibles en las neuronas individuales.La adición de peróxido de hidrógeno al medio de cultivo aumenta los valores de relación, mostrando que los cambios en tiempo real se pueden detectar con este sistema. La cuantificación de los niveles de peróxido de hidrógeno se muestra en el panel B.To determinar los niveles de peróxido de hidrógeno en embriones enteros de pez cebra, el ARNm se inyectó durante la etapa de una célula, haciendo que todos los tejidos expresaran el biosensor roGFP2-Orp1. La región de la cabeza de las larvas de pez cebra se muestra en dos puntos de tiempo diferentes, centrándose en los niveles de peróxido de hidrógeno en la retina.Se midieron los niveles basales de peróxido de hidrógeno en los embriones de pez cebra a los dos días posteriores a la fertilización y cinco días después de la fertilización. A los dos días posteriores a la fertilización, los valores de la relación fueron significativamente más bajos que a los cinco días después de la fertilización. Además, cada animal mostró un nivel diferente de aumento en su contenido de peróxido de hidrógeno retiniano.El uso de fórceps finos para eliminar los ojos y la disociación suave de los ojos con la pipeta son los pasos más críticos en este procedimiento. Este protocolo puede ser seguido por tratamientos farmacológicos para investigar los factores implicados en la señalización ros.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Células vivas imágenes de células de los órganos sensoriales Precursor en Intacto Drosophila Las pupas

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Investigación

Neurociencias

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

Imágenes en vivo de los axones de la raíz dorsal después de rizotomía

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

Imágenes de alta resolución en vivo del comportamiento de las células en el desarrollo de neuroepitelio

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Ex vivo de imágenes en vivo de las divisiones sola celda en ratón neuroepitelio

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Imágenes en vivo de la mitosis en el desarrollo de la corteza de embriones de ratón

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

Utilizando metodologías combinadas para definir el papel de la membrana plasmática de entrega Durante Axon ramas y morfogénesis neuronal

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

Analizando dendríticas morfología en las columnas y capas

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

En proyección de imagen del calcio Vivo de las células de pelo de la línea Lateral en el pez cebra larvas

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Preparación de Drosophila melanogaster adulto para imágenes cerebrales completas durante las respuestas de comportamiento y estímulos

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...