Name: ros live cell imaging during neuronal development
Uploaded: 2021-02-09T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about ROS Live Cell Imaging During Neuronal Development at JoVE.com

Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (Grant R01NS117701), National Science Foundation (Grant 1146944-IOS), Indiana Traumatic Spinal Cord and Brain Injury Research Fund (Grant 20000289), Purdue Research Foundation (Grant 209911) och Office of the Executive Vice President for Research and Partnerships vid Purdue University (Grant 210362). Vi tackar Dr. Cory J. Weaver och Haley Roeder för att de upprättade zebrafiskens RGC-kulturprotokoll. Vi tackar Haley Roeder dessutom för att han tillhandahåller uppgifterna i figur 4. Vi tackar Leah Biasi och Kenny Nguyen för hjälpen med RGC-kulturen. Vi tackar Gentry Lee för att han redigerade texten. Vi tackar Dr. Tobias Dick för att ge roGFP2-Orp1 och Dr. Qing Deng för pCS2 + vektor som innehåller roGFP2-Orp1. Bild 2 skapas med Biorender.com.

Alla djurförsök granskades etiskt och godkändes av Purdue Animal Care and Use Committee (PACUC), i enlighet med NIH:s riktlinjer med protokollet 2006002050 som godkändes den 2020-07-24.
1. Utarbetande av lösningar
<ol><li>E2 media (1x)<ol>
<li>Förbered 100x E2A (500 ml), 500x E2B (100 ml) och 500x E2C (100 mL) lösningar genom att kombinera alla komponenter som visas i tabell 1. Autoklav E2A-, E2B- och E2C-lösningar. Förvara vid 4 °C.</li>
		<li>För 1x E2-media: Ko...

<ol>
	<li>B&#243;rquez, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+role+of+redox+signaling+in+neuronal+development.">Dissecting the role of redox signaling in neuronal development.</a> Journal of Neurochemistry. 137 (4), 506-517 (2016).</li><li>Bedard, K., Krause, K. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NOX+family+of+ROS-generating+NADPH+oxidases:+Physiology+and+pathophysiology.">The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: Physiology and pathophysiology.</a> Physiological Reviews. 87 (1), 245-313 (2007).</li><li>Weaver, C. J., Leung, Y. F., Suter, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+dynamics+of+NADPH+oxidases+during+early+zebrafish+development.">Expression dynamics of NADPH oxidases during early zebrafish development.</a> Journal of Comparative Neurology. 524 (10), 2130-2141 (2016).</li><li>Terzi, A., Suter, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+NADPH+oxidases+in+neuronal+development.">The role of NADPH oxidases in neuronal development.</a> Free Radical Biology and Medicine. 154, 33-47 (2020).</li><li>Infanger, D. W., Sharma, R. V., Davisson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidases+of+the+brain:+Distribution,+regulation,+and+function.">NADPH oxidases of the brain: Distribution, regulation, and function.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 8 (9-10), 1583-1596 (2006).</li><li>Coyoy, A., Olguin-Albuerne, M., Martinez-Briseno, P., Moran, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+reactive+oxygen+species+and+NADPH-oxidase+in+the+development+of+rat+cerebellum.">Role of reactive oxygen species and NADPH-oxidase in the development of rat cerebellum.</a> Neurochemistry International. 62 (7), 998-1011 (2013).</li><li>Le Belle, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferative+neural+stem+cells+have+high+endogenous+ROS+levels+that+regulate+self-renewal+and+neurogenesis+in+a+PI3K/Akt-dependant+manner.">Proliferative neural stem cells have high endogenous ROS levels that regulate self-renewal and neurogenesis in a PI3K/Akt-dependant manner.</a> Cell Stem Cell. 8 (1), 59-71 (2011).</li><li>Nayernia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+neural+precursor+cell+pool+in+NADPH+oxidase+2-deficiency:+from+mouse+brain+to+neural+differentiation+of+patient+derived+iPSC.">Decreased neural precursor cell pool in NADPH oxidase 2-deficiency: from mouse brain to neural differentiation of patient derived iPSC.</a> Redox Biology. 13, 82-93 (2017).</li><li>Wilson, C., Nunez, M. T., Gonz&#225;lez-Billault, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+NADPH+oxidase+to+the+establishment+of+hippocampal+neuronal+polarity+in+culture.">Contribution of NADPH oxidase to the establishment of hippocampal neuronal polarity in culture.</a> Journal of Cell Science. 128 (16), 2989-2995 (2015).</li><li>Munnamalai, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+interactions+between+Nox2-type+NADPH+oxidase+and+the+F-actin+cytoskeleton+in+neuronal+growth+cones.">Bidirectional interactions between Nox2-type NADPH oxidase and the F-actin cytoskeleton in neuronal growth cones.</a> Journal of Neurochemistry. 130 (4), 526-540 (2014).</li><li>Kishida, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+plasticity+deficits+and+mild+memory+impairments+in+mouse+models+of+chronic+granulomatous+disease.">Synaptic plasticity deficits and mild memory impairments in mouse models of chronic granulomatous disease.</a> Molecular and Cellular Biology. 26 (15), 5908-5920 (2006).</li><li>Ravelli, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nox2-dependent+neuroinflammation+in+an+EAE+model+of+multiple+sclerosis.">Nox2-dependent neuroinflammation in an EAE model of multiple sclerosis.</a> Translational Neuroscience. 10 (1), 1-9 (2019).</li><li>Park, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nox2-derived+radicals+contribute+to+neurovascular+and+behavioral+dysfunction+in+mice+overexpressing+the+amyloid+precursor+protein.">Nox2-derived radicals contribute to neurovascular and behavioral dysfunction in mice overexpressing the amyloid precursor protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (4), 1347-1352 (2008).</li><li>Schiavone, S., Neri, M., Trabace, L., Turillazzi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NADPH+oxidase+NOX2+mediates+loss+of+parvalbumin+interneurons+in+traumatic+brain+injury:+Human+autoptic+immunohistochemical+evidence.">The NADPH oxidase NOX2 mediates loss of parvalbumin interneurons in traumatic brain injury: Human autoptic immunohistochemical evidence.</a> Scientific Reports. 7 (1), 8752 (2017).</li><li>Gutscher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity-based+protein+thiol+oxidation+by+H2O2-scavenging+peroxidases.">Proximity-based protein thiol oxidation by H2O2-scavenging peroxidases.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (46), 31532-31540 (2009).</li><li>Bilan, D. S., Belousov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+redox+biology:+from+imaging+to+manipulation.">New tools for redox biology: from imaging to manipulation.</a> Free Radical Biology and Medicine. 109, 167-188 (2016).</li><li>Abu-Siniyeh, A., Al-Zyoud, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highlights+on+selected+microscopy+techniques+to+study+zebrafish+developmental+biology.">Highlights on selected microscopy techniques to study zebrafish developmental biology.</a> Laboratory Animal Research. 36 (1), 12 (2020).</li><li>Sassen, W. A., Koster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+toolbox+for+genetic+manipulation+of+zebrafish.">A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish.</a> Advances in Genomics and Genetics. 5, 151-163 (2015).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).</li><li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regular+care+and+maintenance+of+a+Zebrafish+(Danio+rerio)+laboratory:+An+introduction.">Regular care and maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+neuron+culture+for+nerve+growth+and+axon+guidance+studies+in+Zebrafish+(Danio+rerio).">Primary neuron culture for nerve growth and axon guidance studies in Zebrafish (Danio rerio).</a> PLoS One. 8 (3), 57539 (2013).</li><li>Zhang, L., Leung, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdissection+of+zebrafish+embryonic+eye+tissues.">Microdissection of zebrafish embryonic eye tissues.</a> Journal of Visualized Experiments. (40), e2028 (2010).</li><li>Suter, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+of+neuronal+growth+cone+motility+and+duidance+in+vitro.">Live cell imaging of neuronal growth cone motility and duidance in vitro.</a> Cell Migration: Methods in Molecular Biology. , 65-86 (2011).</li><li>Weaver, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=nox2/cybb+deficiency+affects+zebrafish+retinotectal+connectivity.">nox2/cybb deficiency affects zebrafish retinotectal connectivity.</a> Journal of Neuroscience. 38 (26), 5854-5871 (2018).</li><li>Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+EGSH+and+H2O2+with+roGFP2-based+redox+probes.">Measuring EGSH and H2O2 with roGFP2-based redox probes.</a> Free Radical Biology and Medicine. 51, 1943-1951 (2011).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenylthiourea+specifically+reduces+zebrafish+eye+size.">Phenylthiourea specifically reduces zebrafish eye size.</a> PLoS One. 7 (6), 40132 (2012).</li><li>Ermakova, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+fluorescent+genetically+encoded+indicator+for+intracellular+hydrogen+peroxide.">Red fluorescent genetically encoded indicator for intracellular hydrogen peroxide.</a> Nature Communications. 5, 5222 (2014).</li><li>Oparka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+ROS+levels+using+CM-H2DCFDA+and+HyPer.">Quantifying ROS levels using CM-H2DCFDA and HyPer.</a> Methods. 109, 3-11 (2016).</li><li>Dickinson, B. C., Peltier, J., Stone, D., Schaffer, D. V., Chang, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nox2+redox+signaling+maintains+essential+cell+populations+in+the+brain.">Nox2 redox signaling maintains essential cell populations in the brain.</a> Nature Chemical Biology. 7 (2), 106-112 (2011).</li><li>Cannon, M. B., Remington, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox-sensitive+green+fluorescent+protein:+Probes+for+dynamic+intracellular+redox+responses.+A+review.">Redox-sensitive green fluorescent protein: Probes for dynamic intracellular redox responses. A review.</a> Methods in Molecular Biology. 476, 51-65 (2009).</li><li>Meyer, A. J., Dick, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein-based+redox+probes.">Fluorescent protein-based redox probes.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 13 (5), 621-650 (2010).</li><li>Panieri, E., Millia, C., Santoro, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+quantification+of+subcellular+H2O2+and+glutathione+redox+potential+in+living+cardiovascular+tissues.">Real-time quantification of subcellular H2O2 and glutathione redox potential in living cardiovascular tissues.</a> Free Radical Biology and Medicine. 109, 189-200 (2017).</li><li>Breus, O., Dickmeis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+thiol+redox-sensors+in+the+zebrafish+model:+Lessons+for+embryonic+development+and+regeneration.">Genetically encoded thiol redox-sensors in the zebrafish model: Lessons for embryonic development and regeneration.</a> Biological Chemistry. , (2020).</li><li>Morgan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+basal+H2O2+levels+with+peroxiredoxin-based+probes.">Real-time monitoring of basal H2O2 levels with peroxiredoxin-based probes.</a> Nature Chemical Biology. 12 (6), 437-443 (2016).</li><li>Terzi, A., Roeder, H., Weaver, C. J., Suter, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+NADPH+oxidase+2+regulates+growth+cone+guidance+downstream+of+slit2/robo2.">Neuronal NADPH oxidase 2 regulates growth cone guidance downstream of slit2/robo2.</a> Developmental Neurobiology. , (2020).</li><li>Bilan, D. S., Belousov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HyPer+family+probes:+State+of+the+art.">HyPer family probes: State of the art.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 24 (13), 731-751 (2016).</li><li>Ermankova, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SypHer3s:+a+genetically+encoded+fluorescent+ratiometric+probe+with+enhanced+brightness+and+an+improved+dynamic+range.">SypHer3s: a genetically encoded fluorescent ratiometric probe with enhanced brightness and an improved dynamic range.</a> Chemistry Communications. 54 (23), 2898-2901 (2018).</li><li>Pak, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+genetically+encoded+indicator+for+hydrogen+peroxide+identifies+roles+for+the+oxidant+in+cell+migration+and+mitochondrial+function.">Ultrasensitive genetically encoded indicator for hydrogen peroxide identifies roles for the oxidant in cell migration and mitochondrial function.</a> Cell Metabolism. 31 (3), 642-653 (2020).</li><li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tol2kit:+A+multisite+gateway-based+construction+Kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs.">The Tol2kit: A multisite gateway-based construction Kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).</li></ol>

Det finns flera kritiska steg som behöver uppmärksammas i hela protokollet. Vi tror att om man överväger dessa punkter kommer det experimentella flödet att förbättras. För primär RGC-kultur är steriliteten hos ZFCM(-) mycket viktig, eftersom detta kulturmedier inte innehåller antibiotika och förorening kan uppstå före eller under avbildning. För att undvika det rekommenderar vi att du förbereder och använder ZFCM(-) endast inuti ett biosäkerhetsskåp och gör färska ZFCM(-) media regelbundet (steg 1.5)...

Reaktiva syrearter (ROS) signalering reglerar utvecklingen och funktionen hos nervsystemet1. En viktig cellulär ROS källa är NADPH oxidaser (NOX), som är transmembranproteiner som genererar superoxid och väteperoxid (H2O2)2. NOX enzymer finns i hela centrala nervsystemet (CNS), och NOX-härledda ROS bidrar till neuronal utveckling3,4,5,6. Underhåll och differentiering av neurala stamceller, upprättande av neuronal polaritet, neurit utväxt och synaptisk plasticitet har visat sig kräva tillräckliga nivåer av ROS7,8,9,10,11. Å andra sidan bidrar okontrollerad produktion av ROS av NOXes till neurodegenerativa störningar inklusive Alzheimers sjukdom, multipel skleros och traumatisk hjärnskada12,13,14. Därför är produktion av fysiologiskt relevant ROS avgörande för att upprätthålla hälsosamma förhållanden.
Utveckling av genetiskt kodade biosensorer underlättade upptäckten av cellulära ROS kraftigt. En viktig fördel med genetiskt kodade biosensorer är den ökade temporala och rumsliga upplösningen av ROS-signalen, eftersom dessa sensorer specifikt kan riktas till olika platser. Redoxkänslig GFP (roGFP) är en typ av sådana ROS-biosensorer. RoGFP2-Orp1-varianten upptäcker specifikt H2O2 genom sin Orp1-domän, som är ett glutationperoxiredoxinfamiljprotein från jäst15,16. Oxidationen av Orp1-proteinet överförs till roGFP2 för att ändra dess konformation (figur 1A). Sonden uppvisar två excitationstoppar nära 405 nm och 480 nm, och en enda utsläppstopp vid 515 nm. Vid oxidation förändras fluorescensintensiteten runt excitationstopparna: medan 405 nm excitation ökar minskar 480 nm excitation. Således är roGFP2-Orp1 en ratiometric biosensor, och H2O2-nivåerdetekteras av förhållandet mellan fluorescensintensiteter upphetsade vid två olika våglängder (Figur 1B). Sammantaget är roGFP2-Orp1 ett mångsidigt verktyg för ROS-avbildning som kan användas effektivt in vivo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62165/62165fig01.jpg"> Figur 1: Schematisk representation ochexcitationsspektra av roGFP2-Orp1. (A) Oxidantöverföring sker mellan Orp1 och roGFP2 som svar på H2O2,vilket leder till konformationsförändringar i roGFP2. B)RoGFP2-Orp1:s excitationsspektra uppvisar två excitationstoppar vid 405 nm och 480 nm och en enda utsläppstopp vid 515 nm. Vid oxidation med H2O2ökar excitationen på 405 nm medan 480 nm excitation minskar. Detta resulterar i en ratiometric avläsning för H2O2 närvaro. Siffran har ändrats från Bilan och Belousov (2017)16 och Morgan et al. (2011)25. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62165/62165fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
Danio rerio (zebrafisk) modellsystem har flera fördelar med att applicera genetiskt kodade biosensorer. Den optiska transparensen hos embryon och larver möjliggör icke-invasiv in vivo-avbildning. Nya bildverktyg utvecklas för att uppnå högre upplösning och djupare penetration17. Dessutom finns det etablerade verktyg för genetisk manipulering (ectopic mRNA-uttryck, Tol2-transgenes, etc.) och genomredigering (TALENs, CRISPR/ Cas9, etc.), vilket främjar genereringen av transgena djur18. När zebrafiskembryon utvecklas utanför modern möjliggör detta system ytterligare enklare åtkomst och manipulering av embryona. Till exempel kan encelliga injektioner och läkemedelsbehandlingar enkelt göras.
Här använde vi zebrafisk för att tillfälligt uttrycka H2O2-specifikabiosensor roGFP2-Orp1 genom att injicera in vitro-transkriberad mRNA. Dessa embryon kan användas för både in vitro-avbildning av odlade nervceller och in vivo-avbildning (figur 2). Vi beskriver ett protokoll för dissekering och plätering retinal ganglion celler (RGCs) från zebrafish embryon följt av bedömning H2O2-nivåer i odlade nervceller. Sedan presenterar vi en metod för in vivo-avbildning av roGFP2-Orp1-uttryckande embryon och larver med konfokal mikroskopi. Detta tillvägagångssätt tillåter inte bara att bestämma fysiologiska H2O2-nivåerutan också potentiella förändringar som inträffar i olika utvecklingsstadier eller förhållanden. Sammantaget ger detta system en tillförlitlig metod för att upptäcka H2O2 i levande celler och djur för att studera H2O2: s roll i utveckling, hälsa och sjukdom.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62165/62165fig03.jpg"> Figur 2. Översikt över det experimentella tillvägagångssättet. Kort, efter embryosamling, injiceras roGFP2-Orp1 mRNA i äggulan av encelliga zebrafiskembryon. Utveckling av embryon kan användas för både (A) in vitro och (B) in vivo imaging. A)GFP-positiva embryon används för att dissekera näthinne för RGC-insamling vid 34 hpf. Dissocierade RGCs pläteras på PDL/lamininbelagda täcken i ZFCM (+) media. Tillväxt kon imaging kan utföras som RGCs utöka sina axons efter 6-24 h plätering. Celler kan utsättas för olika behandlingar för att mäta de potentiella förändringarna i H2O2-nivåer. Här mätte vi H2O2-nivåeri tillväxtkonerna hos RGCs (röd). B)GFP-positiva embryon används för in vivo-avbildning. Vid önskad ålder kan embryon bedövas och monteras på 35 mm glasbottenfat för konfokal avbildning. Här monteras embryon ventrally för retinal avbildning. Schematiska visar retinal utveckling i zebrafisk. RGCs bildar ganglion cell lager (GCL), som är det innersta skiktet i näthinnan. RGC axoner utvecklas till optisk nerv för att korsa mittlinjen, bilda optik chiasm. Sedan växer RGC-axoner dorsally för att göra synapser i det optiska tectumet i midbrain. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62165/62165fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35-mm culture dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83-3900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm glass bottom dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP160-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillary Tubes</td>
			<td>Sutter/Fisher Scientific</td>
			<td>NC9029378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2850-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Petri Dishes (100 x 15 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>26140087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma Aldich</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection Mold</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>TU-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23017-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scanning Confocal Microscopy</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium with phenol red</td>
			<td>Gibco/Fisher Scientific</td>
			<td>11-415-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium without phenol red</td>
			<td>Gibco/Fisher Scientific</td>
			<td>21-083-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting agarose</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V2111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMessage mMachine SP6 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0189S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Hyclone/Fisher Scientific</td>
			<td>SH3025601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td>Sigma Aldich</td>
			<td>P0290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma Aldich</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic PicoPump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PV820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine (PDL)</td>
			<td>Sigma Aldich</td>
			<td>P7280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QiaQUICK PCR Purification Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse slit2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>5444-SL-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Sigma Aldich</td>
			<td>P5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steritop 0.22 &#181;m filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>S2GPT05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE Buffer</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine Methanesulfonate</td>
			<td>Sigma Aldich</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Pipette Puller</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>700C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ros live cell imaging during neuronal development

Reaktiva syrearter (ROS) är väletablerade signalmolekyler, som är viktiga i normal utveckling, homeostas och fysiologi. Bland de olika ROS kännetecknas väteperoxid (H2O2) bäst med avseende på roller i cellulär signalering. H2O2 har varit inblandad under utvecklingen i flera arter. Till exempel har en övergående ökning av H2O2 upptäckts i zebrafiskembryon under de första dagarna efter befruktning. Dessutom försämrar utarmning av en viktig cellulär H2O2-källa, NADPH oxidas (NOX), nervsystemets utveckling såsom differentiering, axonal tillväxt och vägledning av retinala ganglionceller (RGCs) både in vivo och in vitro. Här beskriver vi en metod för avbildning intracellulära H2O2 nivåer i odlade zebrafisk nervceller och hela larver under utveckling med hjälp av den genetiskt kodade H2O2-specifikabiosensor, roGFP2-Orp1. Denna sond kan vara övergående eller stabilt uttryckt i zebrafisklarver. Dessutom minskar ratiometric avläsning sannolikheten för att upptäcka artefakter på grund av differentiella genuttryck eller volym effekter. För det första visar vi hur man isolerar och odlar RGCs som härrör från zebrafiskembryon som tillfälligt uttrycker roGFP2-Orp1. Sedan använder vi hela larver för att övervaka H2O2-nivåer på vävnadsnivå. Sensorn har validerats genom tillsats av H2O2. Dessutom skulle denna metod kunna användas för att mäta H2O2-nivåer i specifika celltyper och vävnader genom att generera transgena djur med vävnadsspecifikt biosensoruttryck. Eftersom zebrafisk underlättar genetiska och utvecklingsmässiga manipuleringar, kan det tillvägagångssätt som demonstreras här fungera som en pipeline för att testa rollen som H2O2 under neuronal och allmän embryonal utveckling hos ryggradsdjur.

Odlade zebrafisk RGCs utökar axoner inom 1d. En representativ 405/480-ratio-bild av H2O2-biosensornvisas i figur 4A. Cellkroppen, axon och tillväxt koner är tydligt synliga i enskilda nervceller. Dessa nervceller kan utsättas för olika behandlingar över tid för att övervaka H2O2 förändringar. Vi har tidigare funnit att om man lägger till 100 μM H2O2 till odlingsmedier ökar förhållandesvärdena, vilket visar att ...

Watch this Scientific Journal Video about ROS Live Cell Imaging During Neuronal Development at JoVE.com

ROS Live Cell Imaging During Neuronal Development

Detta protokoll beskriver användningen av en genetiskt kodad väteperoxid (H2O2)-biosensori odlade zebrafisk nervceller och larver för att bedöma de fysiologiska signalrollerna för H2O2 under nervsystemet utveckling. Det kan appliceras på olika celltyper och modifieras med experimentella behandlingar för att studera reaktiva syrearter (ROS) i allmän utveckling.

ROS Live Cell Imaging under neuronal utveckling

Reactive oxygen species (ROS) are well-established signaling molecules, which are important in normal development, homeostasis, and physiology. Among the ...

Vårt protokoll beskriver användningen av en väteperoxid biosensor i odlade zebrafisk nervceller och larver. Detta protokoll kommer att hjälpa forskare att dissekera rollen av reaktiva syrearter i normal fysiologi och patofysiologi. Den största fördelen med denna teknik är realtidsdetektering av väteperoxid hos levande djur och odlade celler.Denna metod kan tillämpas på andra djur, som gnagare modellsystem. För att förbereda täckglasen, använd syrarengjorda täcken lagrade i 100% etanol. Använd tång för att ta bort ett locklip från förvaringsbehållaren och flamma upp det för att ta bort kvarvarande etanol.Lufttorka täcket helt genom att placera det i en vinkel inuti en 35 millimeters odlingsfat. Förbered Poly-D-Lysine eller PDL, eller arbetslösning. Applicera PDL på mitten av varje täckglas, undvik att sprida lösningen på kanterna och inkubera PDL i 20 till 30 minuter vid rumstemperatur.Se till att PDL inte torkar ut. Tvätta PDL med 0,5 milliliter sterilt vatten och låt plattorna torka helt. Förbered laminin arbetslösning.Och applicera den på mitten av varje täckglas, se till att undvika spridning av lösningen på kanterna. Inkubera plattorna vid 37 grader Celsius i en fuktad inkubator i två till sex timmar, undvik en torkning av lamininlösningen. För att utföra en embryodesektion i platta retinala ganglionceller eller RGCs, förbered och märka fyra 35 millimeters vävnadskulturrätter och fyll dem med fyra milliliter 70% etanol.E2 media ett. E2 media två. Och E2 media tre, på dissekeringsdagen.Förvara disken i kylen. När zebrafiskembryon är 34 timmar efter befruktning, ta kulturrätterna belagda med laminin ur inkubatorn. Och tvätta locket glider tre gånger med 0,5 milliliter 1X PBS.Efter den slutliga tvätten, tillsätt fyra milliliter ZFCM +media till varje kulturrätt. Undvik att torka plattan. Hämta de beredda kylda kulturrätterna och låt dem balansera till rumstemperatur.Fyll fyra till sex PCR-rör med 15 mikroliter ZFCM+media. Hämta zebrafiskembryon från inkubatorn och doppa embryon i en 35 millimeters vävnadskulturrätt som innehåller 70% etanol i 5-10 sekunder för att sterilisera den. Använd en överföring av pipett, överför embryon till E2-media en maträtt, som innehåller sterila E2-medier för att tvätta bort överskott av etanol.Överför sedan embryona till E2-media två maträtt och ta bort deras käkar med skarpa tång. Slutligen överför embryon till E2 media tre maträtt för att utföra dissekeringar. Använd ett par fina tångar, placera och håll embryon främre mot äggulan med en av tångarna.Och ta bort svansen bakre till äggula säcken med de andra tångarna. Ta tag i nacken med tång och ta av huvudet för att exponera hjärnan och ögonen för E2-media. Med spetsen av fina tångar, rulla försiktigt ögonen från huvudet medan du håller kranialvävnaden ner med en andra tång.Överför fyra ögon till ett av de tidigare preparerade rören som innehåller ZFCM+Triturera försiktigt upp och ner med en p20-pipett ca 45 gånger för att skilja celler åt. Överför ZFCM+med de dissocierade cellerna till mitten av täckglasen. Håll kulturer på bänkskivan vid 22 grader Celsius på ett polystyrenskumställ för att absorbera vibrationer.På avbildningsdagen kontrollerar du celler under mikroskopet för att validera tillväxten av RGC-axoner. För levande cellavbildning, överför täckglasen från kulturrätten till en levande cellavbildningskammare. Använd ett inverterat mikroskop utrustat med ett DIC-objektivt OG-590 Longpass rött filter och en EMCCD-kamera.Innan avbildning, ersätt ZFCM +medium med ZFCM-Efter positionering av cellerna med 10X-målet, förvärva bilder vid 60X förstoring med hjälp av ett oljesänkningsmål. Använd ytterligare en förstoring på 1,5X. Skaffa först DIC-bilder.Avbildning roGFP2-Orp1, med lämplig filteruppsättning. Efter att ha tagit den första uppsättningen bilder, utbyta media med media som innehåller olika behandlingslösningar. Media bör bytas var 30: e minut av avbildning för att undvika pH- och osmolaritetsförändringar.För in vivo-avbildning, förvara 22 till 24-timmars embryon efter befruktning i E3-media, innehållande 0,003% fenyltiourea utan metylenblått. Byt media och ta bort döda embryon dagligen. Vid önskad ålder, bedöva och montera embryon i 1% agarose på 35 millimeter glas botten kulturrätter.Embryon kan orienteras dorsally, ventrally eller i andra lydnad, beroende på den region som är av intresse för avbildning. När agarosen stelnat, fyll disken med E3-media utan metylenblått, men med 0,016%trikain. Ställ in mikroskopet för avbildning.Använd ett inverterat laserskanningskonfokalt mikroskop för att avbilda embryon monterade på botten av en agarose droppe. Excite roGFP2-Orp1, och skaffa motsvarande bilder med önskade utsläppsfilter. Införskaffa z-staplar med tjocklek på fem mikromätare genom önskad del av embryona.Efter avbildning, ta bort embryon från Agarose med fina tångar och håll dem i inkubatorn och metylenblå fria medier med fenyltiourea till önskad ålder. En representativ bild av väteperoxid biosensor och odlade zebrafisk RGC utökade axoner visas här. Cellkroppen, axon och tillväxt koner är tydligt synliga i enskilda nervceller.Tillsatsen av väteperoxid till odlingsmedierna ökar förhållandesvärdena, vilket visar att realtidsförändringar kan upptäckas med detta system. Kvantifiering av väteperoxidnivåer visas i panel B.To bestämma väteperoxidnivåer i hela zebrafiskembryon, mRNA injicerades under ett cellsteg, vilket fick alla vävnader att uttrycka roGFP2-Orp1 biosensor. Huvudregionen av zebrafisklarver visas vid två olika tidpunkter, med fokus på väteperoxidnivåerna i näthinnan.De basala nivåerna av väteperoxid i zebrafiskembryon vid två dagar efter befruktning och fem dagar efter befruktning mättes. Vid två dagar efter befruktning var förhållandevärdena betydligt lägre än vid fem dagar efter befruktning. Dessutom visade varje djur en annan ökningsnivå i sin retinal väteperoxidhalt.Att använda fina tång för att ta bort ögonen och mild dissociation av ögonen med pipetten är de mest kritiska stegen i denna procedur. Detta protokoll kan följas av läkemedelsbehandlingar för att undersöka de faktorer som är involverade i ROS signalering.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell imaging av sensoriska celler orgel Precursor i intakt Drosophila Puppor

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

Live avbildning av dorsala Axoner efter Rhizotomy

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

Högupplöst Live avbildning av cellens beteende i utvecklingsländerna neuroepitelet

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Ex vivo Live avbildning av Single celldelningar i Mouse neuroepitel

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Live avbildning av Mitos i utvecklings Mouse embryonala Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

Med hjälp av kombinerade Metoder för att definiera rollen av plasmamembranet leverans under Axon förgrening och Neuronal Morphogenesis

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

Analysera Dendritic morfologi i kolumner och lager

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

I Vivo kalcium avbildning av sidolinje hårcellerna i Larval zebrafiskar

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Förbereda vuxen Drosophila melanogaster för hela hjärnan imaging under beteende och Stimuli svar

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...