Name: in vivo imaging of fully active brain tissue in awake zebrafish larvae and juveniles by skull and skin removal
Uploaded: 2021-02-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal at JoVE.com

نشكر تيمو فريتش بشكل خاص على الرعاية الممتازة للحيوانات وهيرمان دورينغ ومحمد إلساي وسول بوز منديز وجاكوب فون تروتا وكومالي فاليشيتي وباربرا وينتر على دعمهم المفيد. كما أننا ممتنون لجميع الأعضاء الآخرين في مختبر كوستر على ملاحظاتهم. وتم تمويل المشروع جزئيا من قبل مؤسسة البحوث الألمانية (DFG, KO1949/7-2) 241961032 (إلى RWK) و Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF; ومن المسلم به عصر صافي NEURON الثاني CIPRESS المشروع 01EW1520 إلى JCM).

جميع الأعمال الحيوانية الموصوفة هنا وفقا للوائح القانونية (الاتحاد الأوروبي التوجيه 2010/63). وقد وافقت السلطات المحلية وممثل رعاية الحيوان في جامعة تكنيش براونشفايغ على صيانة الأسماك والتعامل معها.
1. إعداد السائل الشوكي الدماغي الاصطناعي (ACSF) ، وانخفاض ذوبان الآغاروز والإبر ?...

<ol>
	<li>Embryology. Zebrafish Development Available from: <a target="_blank" href="https://embryology.med.unsw.edu.au/embryology/index.php/Zebrafish_Development">https://embryology.med.unsw.edu.au/embryology/index.php/Zebrafish_Development</a> (2020)</li><li>Sassen, W. A., K&#246;ster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+toolbox+for+genetic+manipulation+of+zebrafish.+Advances+in+Genomics+and+Genetics.">A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish. Advances in Genomics and Genetics.</a> Dove Medical Press. 2015 (5), 151-163 (2015).</li><li>Singh, A. P., N&#252;sslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+stripes+as+a+model+for+vertebrate+colour+pattern+formation.">Zebrafish stripes as a model for vertebrate colour pattern formation.</a> Current Biology. 25 (2), 81-92 (2015).</li><li>Kalueff, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+to+recognize+zebrafish+'affective'+behavior.">Time to recognize zebrafish 'affective' behavior.</a> Brill: Behaviour. 149 (10-12), 1019-1036 (2012).</li><li>Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. -. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+transparent+zebrafish:+a+refined+method+to+improve+detection+of+gene+expression+during+embryonic+development.">Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development.</a> Marine Biotechnology. 3, 522-527 (2001).</li><li>Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenothiourea+sensitizes+zebrafish+cranial+neural+crest+and+extraocular+muscle+development+to+changes+in+retinoic+acid+and+IGF+signaling.">Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and IGF signaling.</a> PloS One. 6, 22991 (2011).</li><li>Elsalini, O. A., Rohr, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenylthiourea+disrupts+thyroid+function+in+developing+zebrafish.">Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish.</a> Development Genes and Evolution. 212, 593-598 (2003).</li><li>Baumann, L., Ros, A., Rehberger, K., Neuhauss, S. C. F., Segner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thyroid+disruption+in+zebrafish+(Danio+rerio)+larvae:+Different+molecular+response+patterns+lead+to+impaired+eye+development+and+visual+functions.">Thyroid disruption in zebrafish (Danio rerio) larvae: Different molecular response patterns lead to impaired eye development and visual functions.</a> Aquatic Toxicology. 172, 44-55 (2016).</li><li>White, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transparent+adult+zebrafish+as+a+tool+for+in+vivo+transplantation+analysis.">Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis.</a> Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).</li><li>Antinucci, P., Hindges, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+crystal-clear+zebrafish+for+in+vivo+imaging.">A crystal-clear zebrafish for in vivo imaging.</a> Scientific Reports. 6, 29490 (2016).</li><li>Burr, S. A., Leung, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curare+(d-Tubocurarine).">Curare (d-Tubocurarine).</a> Encyclopedia of Toxicology (3rd Edition). , 1088-1089 (2014).</li><li>Gesler, H. M., Hoppe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3,6-bis(3-diethylaminopropoxy)+pyridazine+bismethiodide,+a+long-acting+neuromuscular+blocking+agent.">3,6-bis(3-diethylaminopropoxy) pyridazine bismethiodide, a long-acting neuromuscular blocking agent.</a> The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 118 (4), 395-406 (1956).</li><li>Furman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Alpha Bungarotxin. Reference Module in Biomedical Sciences. , (2018).</li><li>Attili, S., Hughes, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaesthetic+tricaine+acts+preferentially+on+neural+voltage-gated+sodium+channels+and+fails+to+block+directly+evoked+muscle+contraction.">Anaesthetic tricaine acts preferentially on neural voltage-gated sodium channels and fails to block directly evoked muscle contraction.</a> PLoS One. 9 (8), 103751 (2014).</li><li>Namikawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+neurodegenerative+spinocerebellar+ataxia+type+13+in+zebrafish+using+a+Purkinje+neuron+specific+tunable+coexpression+system.">Modeling neurodegenerative spinocerebellar ataxia type 13 in zebrafish using a Purkinje neuron specific tunable coexpression system.</a> Journal of Neuroscience. 39 (20), 3948-3969 (2019).</li><li>Hennig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theoretical+models+of+synaptic+short+term+plasticity.">Theoretical models of synaptic short term plasticity.</a> Frontiers in Computational Neuroscience. 7 (45), (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moesin1+and+Ve-cadherin+are+required+in+endothelial+cells+during+in+vivo+tubulogenesis.">Moesin1 and Ve-cadherin are required in endothelial cells during in vivo tubulogenesis.</a> Development. 137, 3119-3128 (2010).</li><li>Hobro, A., Smith, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evaluation+of+fixation+methods:+Spatial+and+compositional+cellular+changes+observed+by+Raman+imaging.">An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging.</a> Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).</li><li>Knogler, L. D., Kist, A. M., Portugues, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+context+dominates+output+from+purkinje+cell+functional+regions+during+reflexive+visuomotor+behaviours.">Motor context dominates output from purkinje cell functional regions during reflexive visuomotor behaviours.</a> eLife. 8, 42138 (2019).</li><li>Hsieh, J., Ulrich, B., Issa, F. A., Wan, J., Papazian, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+development+of+Purkinje+cell+excitability,+functional+cerebellar+circuit,+and+afferent+sensory+input+to+cerebellum+in+zebrafish.">Rapid development of Purkinje cell excitability, functional cerebellar circuit, and afferent sensory input to cerebellum in zebrafish.</a> Frontier in Neural Circuits. 8 (147), (2014).</li><li>Scalise, K., Shimizu, T., Hibi, M., Sawtell, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+cerebellar+Purkinje+cells+during+fictive+optomotor+behavior+in+larval+zebrafish.">Responses of cerebellar Purkinje cells during fictive optomotor behavior in larval zebrafish.</a> Journal of Neurophysiology. 116 (5), 2067-2080 (2016).</li><li>Harmon, T. C., Magaram, U., McLean, D. L., Raman, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+responses+of+Purkinje+neurons+and+roles+of+simple+spikes+during+associative+motor+learning+in+larval+zebrafish.">Distinct responses of Purkinje neurons and roles of simple spikes during associative motor learning in larval zebrafish.</a> eLife. 6, 22537 (2017).</li><li>Zehendner, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderate+hypoxia+followed+by+reoxygenation+results+in+blood-brain+barrier+breakdown+via+oxidative+stress-dependent+tight-junction+protein+disruption.">Moderate hypoxia followed by reoxygenation results in blood-brain barrier breakdown via oxidative stress-dependent tight-junction protein disruption.</a> PLoS One. 8 (12), 82823 (2013).</li><li>Dhabhar, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+short-term+stress+response+-+mother+nature's+mechanism+for+enhancing+protection+and+performance+under+conditions+of+threat,+challenge,+and+opportunity.">The short-term stress response - mother nature's mechanism for enhancing protection and performance under conditions of threat, challenge, and opportunity.</a> Frontiers of Neuroendocrinology. 49, 175-192 (2018).</li></ol>

توفر الطريقة المقدمة نهجا بديلا لعزل الدماغ أو علاج يرقات حمار وحشي مع الأدوية التي تمنع التصبغ لتسجيل صور عالية الدقة للخلايا العصبية في بيئتها في الجسم الحي. نوعية الصور المسجلة مع هذه الطريقة مماثلة للصور من العقول المخططة، ولكن في ظل الظروف الطبيعية.
وعلاوة على ذل?...

على مدى العقود الأخيرة ، تطورت سمكة الحمار الوحشي(Danio rerio)كواحدة من الكائنات الحية النموذجية الفقارية الأكثر شعبية للدراسات التنموية الجنينية واليرقات. البراز الكبير للإناث حمار وحشي إلى جانب التطور السريع السابق الرحمي للجنين وشفافيته خلال مراحل النمو الجنينية المبكرة ليست سوى عدد قليل من العوامل الرئيسية التي تجعل حمار وحشي كائن حي نموذج قوي لأسئلة النموadress 1. التقدم في التقنيات الوراثية الجزيئية جنبا إلى جنب مع ارتفاع القرار في دراسات التصوير في الجسم الحي يسمح لمعالجة الآليات البيولوجية الخلية الكامنة وراء عمليات التنمية2. على وجه الخصوص ، في مجال التمايز العصبي ، وعلم وظائف الأعضاء ، والاتصال ، والوظيفة ، ألقت سمكة الحمار الوحشي الضوء على التفاعل بين الديناميات الجزيئية ووظائف الدماغ والسلوك الحي بتفاصيل غير مسبوقة.
ومع ذلك ، فإن معظم هذه الدراسات تقتصر على المراحل الجنينية واليرقات المبكرة خلال الأسبوع الأول من التطور حيث تضيع شفافية أنسجة الجهاز العصبي تدريجيا. في هذه المراحل، يتم منع أنسجة الدماغ من الوصول عن طريق نهج المجهر عالية الدقة تصبح محمية من قبل تمايز الجمجمة وتصبغ3.
لذلك ، من الصعب دراسة الأسئلة الرئيسية المتعلقة بالتمايز العصبي والنضج واللدونة مثل صقل الاتصال العصبي أو التحجيم المتشابك. هذه العمليات الخلوية مهمة من أجل تحديد الآليات الخلوية التي تقود ، على سبيل المثال ، السلوك الاجتماعي ، صنع القرار ، أو السلوك القائم على التحفيز ، وهي المجالات التي ساهمت فيها أبحاث حمار وحشي على يرقات عمرها عدة أسابيع مؤخرا في النتائج الرئيسية استنادا إلى الدراسات السلوكية4.
النهج الدوائية لمنع تصبغ في يرقات حمار وحشي لعدة أسابيع هي بالكاد ممكنة أو قد تسبب حتى آثار ضارة5،6،7،8. سلالات متحولة مزدوجة أو ثلاثية مع عيوب تصبغ محددة، مثل كاسبر9 أو الكريستال10،أصبحت أدوات قيمة للغاية، ولكن شاقة في تربية، وتوفير عدد قليل من النسل، وتشكل خطر تراكم التشوهات الوراثية بسبب التكاثر المفرط.
هنا، يتم توفير إجراء الحد الأدنى الغازية كبديل التي تنطبق على أي سلالة حمار وحشي. تم تكييف هذا الإجراء من الدراسات الكهربية لتسجيل نشاط الخلايا العصبية في يرقات حمار وحشي حية ومستيقظة. في teleosts، يمكن إزالة الجلد وغضاريف الجمجمة الناعمة بعناية عن طريق تقشير هذه الطبقات الصغيرة، لأنها ليست متشابكة بإحكام مع الأوعية الدموية في الدماغ. وهذا يسمح لكشف أنسجة الدماغ التي تحتوي على الخلايا العصبية والمسالك المحورية دون ضرر وتسجيل مورفولوجيا الخلايا العصبية، بما في ذلك الهياكل متشابك ومحتوياتها الجزيئية، والتي بدورها تشمل مراقبة التغيرات الفسيولوجية مثل Ca2 + العابرين أو أحداث النقل داخل الخلايا لمدة تصل إلى عدة ساعات. وعلاوة على ذلك، وإلى جانب الأوصاف الوصفية، يتيح الوصول المباشر إلى أنسجة الدماغ استجواب وظائف الخلايا العصبية الناضجة عن طريق إدارة المواد العصبية الدوائية والنهج البصرية. لذلك ، يمكن الكشف عن علاقات وظيفة الهيكل الحقيقي في دماغ حمار وحشي صغير باستخدام استراتيجية التعرض للدماغ هذه.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>A119.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Laser scanning microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d-Tubocurare</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T2379-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Capillary type 1</td>
			<td>WPI</td>
			<td>1B150F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Capillary type 2</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>GC100F-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Coverslip</td>
			<td>deltalab</td>
			<td>D102424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9105.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen (Thermo Fischer)</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging chamber</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Normapur</td>
			<td>26764298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LM-Agarose</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>8050.55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (Hexahydrate)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>A537.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DFC9000 GTC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle-Puller type 1</td>
			<td>NARISHIGE</td>
			<td>Model PC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle-Puller type 2</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>Model P-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur-Pipettes 3ml</td>
			<td>A.Hartenstein</td>
			<td>20170718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P029.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Normapur</td>
			<td>28244262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath</td>
			<td>Phoenix Instrument</td>
			<td>WB-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm petri dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90 mm petri dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>821473001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo imaging of fully active brain tissue in awake zebrafish larvae and juveniles by skull and skin removal

يتطلب فهم التغيرات الزائلة التي تحدث أثناء نمو الدماغ ونضوجه تصويرا مفصلا عالي الدقة في المكان والزمان بدقة خلوية ودون خلايا. وقد سمح لنا التقدم في التقنيات الجزيئية والتصويرية بالحصول على العديد من الأفكار التفصيلية حول الآليات الخلوية والجزيئية لنمو الدماغ في جنين سمك الحمار الوحشي الشفاف. في الآونة الأخيرة ، انتقلت عمليات صقل الاتصال العصبي التي تحدث في مراحل اليرقات اللاحقة بعد عدة أسابيع من الإخصاب ، والتي هي على سبيل المثال التحكم في السلوك الاجتماعي أو صنع القرار أو السلوك القائم على التحفيز ، إلى تركيز البحث. في هذه المراحل ، يتداخل تصبغ جلد حمار وحشي مع اختراق الضوء في أنسجة الدماغ ، ولم تعد حلول المراحل الجنينية ، على سبيل المثال ، التثبيط الدوائي للتصبغ ، مجدية بعد الآن.
لذلك ، يتم توفير حل جراحي طفيف التوغل للوصول إلى المجهر إلى دماغ حمار وحشي مستيقظ مشتق من النهج الكهربية. في teleosts، يمكن إزالة الجلد وغضاريف الجمجمة الناعمة بعناية عن طريق تقشير هذه الطبقات، وفضح الخلايا العصبية الكامنة ومسالك أكسنال دون ضرر. وهذا يسمح لتسجيل مورفولوجيا الخلايا العصبية، بما في ذلك الهياكل متشابك ومحتوياتها الجزيئية، ومراقبة التغيرات الفسيولوجية مثل Ca2 + العابرين أو أحداث النقل داخل الخلايا. وبالإضافة إلى ذلك، فإن التحقيق في هذه العمليات عن طريق التثبيط الدوائي أو التلاعب البصري الوراثي أمر ممكن. يوفر نهج التعرض للدماغ هذا معلومات حول التغيرات الهيكلية والفسيولوجية في الخلايا العصبية وكذلك ارتباط وترابط هذه الأحداث في أنسجة الدماغ الحية في نطاق دقائق أو ساعات. هذه التقنية مناسبة لتصوير الدماغ في الجسم الحي ليرقات حمار وحشي لمدة تصل إلى 30 يوما بعد الإخصاب ، وهي أحدث مرحلة تنموية تم اختبارها حتى الآن. وبالتالي، فإنه يوفر الوصول إلى أسئلة هامة مثل صقل متشابك والتحجيم، والنقل المحوري والتشجر، واستهداف متشابك من البضائع الهيكل الخلوي أو التعبير المحلي تعتمد على النشاط. لذلك ، يمكن توقع استخدام واسع لهذا النهج المتصاعد والتصوير.

الشكل 3A,C تظهر يرقة 14 ديسف في الطور من خط المعدلة وراثيا TG [-7.5Ca8:GFP]bz12 [15] مع الجمجمة لا تزال سليمة. يتم توزيع الخلايا الصباغية في الجلد المتراكب في جميع أنحاء الرأس وتتداخل مع إشارة الفلورسينس في المنطقة ذات الاهتمام (هنا ، ا...

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal at JoVE.com

In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal

هنا نقدم طريقة لتصوير الدماغ الجنيني حمار وحشي في الجسم الحي حتى اليرقات ومراحل الأحداث. هذا الإجراء المجهري، مقتبس من النهج الكهربية، ويوفر الوصول إلى التفاصيل الخلوية ودون الخلوية من الخلايا العصبية الناضجة ويمكن الجمع بينها وبين علم الوراثة البصرية والدراسات الدوائية العصبية لتوصيف وظائف الدماغ والتدخل المخدرات.

في التصوير الحي لأنسجة الدماغ النشطة بالكامل في يرقات حمار وحشي مستيقظا والأحداث عن طريق إزالة الجمجمة والجلد

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at ...

تسمح هذه الطريقة بتصور دماغ زيبرافيش في مراحل اليرقات اللاحقة للسماح بمراقبة العمارة العصبية بطريقة مفصلة للغاية في الجسم الحي لم تكن ممكنة من قبل. الخلايا الصباغية ، التي ظهرت خلال تطور اليرقات في وقت لاحق وتمنع الدماغ من التصوير الواضح ، ليست مشكلة مع هذه الطريقة لأنها ببساطة تتم إزالتها. مع هذه الطريقة ، يجب أن يكون من الممكن دراسة العمليات التي تحدث في مراحل لاحقة أثناء تطور اليرقات في الدماغ ، والعمليات التي تؤثر على اللدونة المتشابكة ، أو انحطاط الخلايا العصبية أو تجديدها.قبل البدء في التجربة استخدام سحب micropipette لإعداد حادة، رقيقة، والإبر الزجاجية من الشعيرات الدموية الزجاج. بعد ذلك ، استخدم ماصة باستور بلاستيكية لجمع اليرقات في طبق بيتري قطره 90 ملليمترا يحتوي على الحل المناسب. نقل اليرقة المختارة إلى طبق بيتري قطره 35 ملليمترا يحتوي على ACSF ووضع غطاء زجاجي 24 في 24 ملليمترا ومربعا وزجاجا في غطاء طبق بيتري.ثم aliquot حجم ACSF اللازمة للتجربة في phial المناسبة للأوكسجين مع كاربوجين. لتضمين اليرقة ، استخدم ماصة باستور لنقل اليرقة المخدرة إلى غرفة متصاعدة تحت منظار مجسم. إذا كانت أي يرقة لا تزال قادرة على التحرك ، فلا تستخدم السمك للتجربة حتى تكون الأسماك غير قادرة تماما على الحركة.عندما تكون اليرقة غير متحركة ، قم بإزالة الوسط الزائد بعناية وأضف على الفور ملليلتر واحد على الأقل من الآغروز المنخفض الذائب على اليرقة. توجيه حمار وحشي مع المنطقة الظهرية التي تواجه أقرب إلى سطح الآغاروز ممكن. إذا تم تصوير اليرقة باستخدام مجهر مقلوب ، بعد الترسخ ، قم بتقليم الآغاروز الذي يحتوي على اليرقة إلى كتلة صغيرة من التكعيب.لفضح الدماغ للتصوير، تقليم بعيدا agarose الزائدة على منطقة الدماغ من الفائدة حسب الضرورة واستخدام إبرة زجاجية لإجراء شق صغير من خلال الجلد بالقرب من، ولكن ليس أكثر، المنطقة ذات الأهمية دون اختراق عميق جدا في الأنسجة. بالكاد تتحرك الإبرة فقط تحت سطح الجلد، والاستمرار في إجراء تخفيضات صغيرة جدا بعناية في جميع أنحاء المنطقة ذات الاهتمام حتى الجلد على المنطقة من الفائدة يمكن إزالتها أو دفعها جانبا. عندما تتم إزالة الأنسجة من جميع الأجنة، إضافة قطرة صغيرة من agarose ذوبان منخفضة إلى غرفة التصوير المعدة سابقا من المجهر المقلوب واستخدام ملعقة صغيرة لقلب كتلة agarose التكعيبية 180 درجة على قطرة agarose في غرفة التصوير.عندما تتوطد الآغروز ، املأ غرفة التصوير ب ACSF الطازجة وابدأ تصوير اليرقة. هنا ، يمكن ملاحظة يرقة معدلة وراثيا سليمة بعد 14 يوما من الإخصاب مع الجمجمة لا تزال سليمة. كما هو مبين، يتم توزيع الخلايا الصباغية داخل الجلد المتراكب في جميع أنحاء الرأس، مما يتعارض مع إشارة الفلورسنت في المنطقة ذات الاهتمام.بعد جراحة الجمجمة المفتوحة ، تصبح منطقة الاهتمام متاحة بحرية للتصوير التفصيلي عالي الدقة. الجلد والجمجمة ، أو حاجز الدم في الدماغ أيضا عرقلة اختراق المواد في الدماغ ، كما يتضح من صبغة نووية قوية تلطيخ لوحظ في هذه الخلايا الدماغية إلا بعد جراحة الجمجمة المفتوحة. ويلاحظ أيضا هذه المزايا في 30 يوما بعد الإخصاب.في الأسماك المعدلة وراثيا التي تحتوي على الأوعية الدموية في الدماغ الفلورية بسبب التعبير عن البروتين الفلوري الأحمر، mCherry، في الخلايا البطانية، ترميز اللون في قيم عمق كومة الصورة يدل على أنه حتى الأوعية الدموية مدفونة بعمق داخل الدماغ إلى ما يقرب من 250 ميكرون لا تزال مرئية بوضوح ويمكن تتبعها. عند إجراء هذا الإجراء نضع في اعتبارنا دائما أن هذه هي عملية جراحية في حي. لذلك، فإنه يتطلب الاحترام والعقل المركز.بعد هذا الإجراء ، يمكن تسجيل مورفولوجيا الخلايا العصبية ، بما في ذلك الهياكل المتشابكة وأحداث النقل الفسيولوجية وداخل الخلايا في اليرقات التي يزيد عمرها عن سبعة أيام بعد الإخصاب. مع هذه التقنية ، نأمل في توفير نهج يسمح بدراسة العمليات الخلوية أيضا في الدماغ التي تحدث في مراحل اليرقات اللاحقة ، والتي تشارك في إنشاء ، على سبيل المثال ، سلوكيات معقدة مثل السلوك الاجتماعي أو صنع القرار.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

الوقت الفاصل بين التصوير حية من خلايا ذات صلة Clonally السلف العصبية في الدماغ المقدم اسماك الزرد النامية

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

تصور في Proprioceptors<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; يرقات وشرانق

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

تصوير الأعصاب وظيفية عن طريق الموجات فوق الصوتية تعطيل حاجز الدم في الدماغ والتصوير بالرنين المغناطيسي المنغنيز معززة لل

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae

الآلي التحليلات السلوكية عالية الإنتاجية في يرقات اسماك الزرد

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

متزامنة<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; اختبار وظيفي اثنين من شبكية العين من قبل<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; نظام مخطط كهربية

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Exposure of the Pig CNS for Histological Analysis: A Manual for Decapitation, Skull Opening, and Brain Removal

تعرض الجهاز العصبي المركزي الخنزير للتحليل النسيجي: دليل لقطع الرأس، الجمجمة افتتاح، والدماغ إزالة

Pigs have become increasingly popular in large-animal translational neuroscience research as an economically and ethically feasible substitute to ...

Labeling and Imaging of Amyloid Plaques in Brain Tissue Using the Natural Polyphenol Curcumin

وضع العلامات والتصوير من لويحات اميلويد في انسجه المخ باستخدام الكركمين البوليفينول الطبيعية

Deposition of amyloid beta protein (A&#946;) in extra- and intracellular spaces is one of the hallmark pathologies of Alzheimer&#39;s disease (AD). ...

A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

طريقة إزالة الأنسجة الكارهة للماء لأنسجة دماغ الفئران

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered ...

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

زرع نافذة جمجمية للتصوير المتكرر في الجسم الحي في الفئران المستيقظة

To fully understand the cellular physiology of neurons and glia in behaving animals, it is necessary to visualize their morphology and record their ...

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

الدماغ بيريسيت الكالسيوم والتصوير الدموي في الفئران المعدلة وراثيا في فيفو

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to ...