Name: in vivo imaging of fully active brain tissue in awake zebrafish larvae and juveniles by skull and skin removal
Uploaded: 2021-02-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal at JoVE.com

Vi takker især Timo Fritsch for fremragende dyrepleje og Hermann Döring, Mohamed Elsaey, Sol Pose-Méndez, Jakob von Trotha, Komali Valishetti og Barbara Winter for deres hjælpsomme støtte. Vi er også taknemmelige for alle de andre medlemmer af Köster lab for deres feedback. Projektet blev delvist finansieret af det tyske forskningsfond (DFG, KO1949/7-2) projekt 241961032 (til RWK) og Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF; Era-Net NEURON II CIPRESS projekt 01EW1520 til JCM) er anerkendt.

Alt dyrearbejde, der beskrives her, er i overensstemmelse med lovbestemmelser (EU-direktiv 2010/63). Vedligeholdelse og håndtering af fisk er blevet godkendt af de lokale myndigheder og af dyrevelfærdsrepræsentanten for Technische Universität Braunschweig.
1. Fremstilling af kunstig cerebro spinalvæske (ACSF), lavt smeltende agarose og skarpe glasnåle
<ol><li>Forbered ACSF ved at opløse de anførte kemikalier ved følgende koncentrationer i destilleret vand. 134 mM NaCl (58,44 g/mol),...

<ol>
	<li>Embryology. Zebrafish Development Available from: <a target="_blank" href="https://embryology.med.unsw.edu.au/embryology/index.php/Zebrafish_Development">https://embryology.med.unsw.edu.au/embryology/index.php/Zebrafish_Development</a> (2020)</li><li>Sassen, W. A., K&#246;ster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+toolbox+for+genetic+manipulation+of+zebrafish.+Advances+in+Genomics+and+Genetics.">A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish. Advances in Genomics and Genetics.</a> Dove Medical Press. 2015 (5), 151-163 (2015).</li><li>Singh, A. P., N&#252;sslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+stripes+as+a+model+for+vertebrate+colour+pattern+formation.">Zebrafish stripes as a model for vertebrate colour pattern formation.</a> Current Biology. 25 (2), 81-92 (2015).</li><li>Kalueff, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+to+recognize+zebrafish+'affective'+behavior.">Time to recognize zebrafish 'affective' behavior.</a> Brill: Behaviour. 149 (10-12), 1019-1036 (2012).</li><li>Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. -. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+transparent+zebrafish:+a+refined+method+to+improve+detection+of+gene+expression+during+embryonic+development.">Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development.</a> Marine Biotechnology. 3, 522-527 (2001).</li><li>Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenothiourea+sensitizes+zebrafish+cranial+neural+crest+and+extraocular+muscle+development+to+changes+in+retinoic+acid+and+IGF+signaling.">Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and IGF signaling.</a> PloS One. 6, 22991 (2011).</li><li>Elsalini, O. A., Rohr, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenylthiourea+disrupts+thyroid+function+in+developing+zebrafish.">Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish.</a> Development Genes and Evolution. 212, 593-598 (2003).</li><li>Baumann, L., Ros, A., Rehberger, K., Neuhauss, S. C. F., Segner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thyroid+disruption+in+zebrafish+(Danio+rerio)+larvae:+Different+molecular+response+patterns+lead+to+impaired+eye+development+and+visual+functions.">Thyroid disruption in zebrafish (Danio rerio) larvae: Different molecular response patterns lead to impaired eye development and visual functions.</a> Aquatic Toxicology. 172, 44-55 (2016).</li><li>White, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transparent+adult+zebrafish+as+a+tool+for+in+vivo+transplantation+analysis.">Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis.</a> Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).</li><li>Antinucci, P., Hindges, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+crystal-clear+zebrafish+for+in+vivo+imaging.">A crystal-clear zebrafish for in vivo imaging.</a> Scientific Reports. 6, 29490 (2016).</li><li>Burr, S. A., Leung, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curare+(d-Tubocurarine).">Curare (d-Tubocurarine).</a> Encyclopedia of Toxicology (3rd Edition). , 1088-1089 (2014).</li><li>Gesler, H. M., Hoppe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3,6-bis(3-diethylaminopropoxy)+pyridazine+bismethiodide,+a+long-acting+neuromuscular+blocking+agent.">3,6-bis(3-diethylaminopropoxy) pyridazine bismethiodide, a long-acting neuromuscular blocking agent.</a> The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 118 (4), 395-406 (1956).</li><li>Furman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Alpha Bungarotxin. Reference Module in Biomedical Sciences. , (2018).</li><li>Attili, S., Hughes, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaesthetic+tricaine+acts+preferentially+on+neural+voltage-gated+sodium+channels+and+fails+to+block+directly+evoked+muscle+contraction.">Anaesthetic tricaine acts preferentially on neural voltage-gated sodium channels and fails to block directly evoked muscle contraction.</a> PLoS One. 9 (8), 103751 (2014).</li><li>Namikawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+neurodegenerative+spinocerebellar+ataxia+type+13+in+zebrafish+using+a+Purkinje+neuron+specific+tunable+coexpression+system.">Modeling neurodegenerative spinocerebellar ataxia type 13 in zebrafish using a Purkinje neuron specific tunable coexpression system.</a> Journal of Neuroscience. 39 (20), 3948-3969 (2019).</li><li>Hennig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theoretical+models+of+synaptic+short+term+plasticity.">Theoretical models of synaptic short term plasticity.</a> Frontiers in Computational Neuroscience. 7 (45), (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moesin1+and+Ve-cadherin+are+required+in+endothelial+cells+during+in+vivo+tubulogenesis.">Moesin1 and Ve-cadherin are required in endothelial cells during in vivo tubulogenesis.</a> Development. 137, 3119-3128 (2010).</li><li>Hobro, A., Smith, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evaluation+of+fixation+methods:+Spatial+and+compositional+cellular+changes+observed+by+Raman+imaging.">An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging.</a> Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).</li><li>Knogler, L. D., Kist, A. M., Portugues, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+context+dominates+output+from+purkinje+cell+functional+regions+during+reflexive+visuomotor+behaviours.">Motor context dominates output from purkinje cell functional regions during reflexive visuomotor behaviours.</a> eLife. 8, 42138 (2019).</li><li>Hsieh, J., Ulrich, B., Issa, F. A., Wan, J., Papazian, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+development+of+Purkinje+cell+excitability,+functional+cerebellar+circuit,+and+afferent+sensory+input+to+cerebellum+in+zebrafish.">Rapid development of Purkinje cell excitability, functional cerebellar circuit, and afferent sensory input to cerebellum in zebrafish.</a> Frontier in Neural Circuits. 8 (147), (2014).</li><li>Scalise, K., Shimizu, T., Hibi, M., Sawtell, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+cerebellar+Purkinje+cells+during+fictive+optomotor+behavior+in+larval+zebrafish.">Responses of cerebellar Purkinje cells during fictive optomotor behavior in larval zebrafish.</a> Journal of Neurophysiology. 116 (5), 2067-2080 (2016).</li><li>Harmon, T. C., Magaram, U., McLean, D. L., Raman, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+responses+of+Purkinje+neurons+and+roles+of+simple+spikes+during+associative+motor+learning+in+larval+zebrafish.">Distinct responses of Purkinje neurons and roles of simple spikes during associative motor learning in larval zebrafish.</a> eLife. 6, 22537 (2017).</li><li>Zehendner, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderate+hypoxia+followed+by+reoxygenation+results+in+blood-brain+barrier+breakdown+via+oxidative+stress-dependent+tight-junction+protein+disruption.">Moderate hypoxia followed by reoxygenation results in blood-brain barrier breakdown via oxidative stress-dependent tight-junction protein disruption.</a> PLoS One. 8 (12), 82823 (2013).</li><li>Dhabhar, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+short-term+stress+response+-+mother+nature's+mechanism+for+enhancing+protection+and+performance+under+conditions+of+threat,+challenge,+and+opportunity.">The short-term stress response - mother nature's mechanism for enhancing protection and performance under conditions of threat, challenge, and opportunity.</a> Frontiers of Neuroendocrinology. 49, 175-192 (2018).</li></ol>

Den præsenterede metode giver en alternativ tilgang til hjerneisolation eller behandling af zebrafisklarver med lægemidler, der hæmmer pigmentering til optagelse af billeder i høj opløsning af neuroner i deres in vivo-miljø. Kvaliteten af billeder optaget med denne metode kan sammenlignes med billeder fra udplantede hjerner, men under naturlige forhold.
Desuden undgås et tab i intensiteten af fluorescens, fordi der ikke er behov for behandling med fikseringsmidler<sup class="xr...

I løbet af de seneste årtier har zebrafisken (Danio rerio) udviklet sig som en af de mest populære hvirveldyrmodelorganismer til embryonale og larveudviklingsundersøgelser. Zebrafiskhunnernes store fecundity kombineret med embryoets hurtige udvikling og dets gennemsigtighed i de tidlige embryonale udviklingsstadier er blot nogle få nøglefaktorer, der gør zebrafisk til en stærk modelorganisme til at løse udviklingsmæssige spørgsmål1. Fremskridt inden for molekylære genteknologier kombineret med undersøgelser med høj opløsning in vivo-billeddannelse gjorde det muligt at behandle cellebiologiske mekanismer, der ligger til grund for udviklingsprocesser2. Især inden for neuronal differentiering, fysiologi, forbindelse og funktion har zebrafisk kastet lys over samspillet mellem molekylær dynamik, hjernefunktioner og organismeadfærd i hidtil usete detaljer.
Men de fleste af disse undersøgelser er begrænset til embryonale og tidlige larvestadier i løbet af den første uge af udviklingen, da gennemsigtigheden af nervesystemvævet gradvist går tabt. På disse stadier forhindres hjernevæv fra adgang ved højopløsningsmikroskopimetoder, der bliver afskærmet af kraniedifferentiering og pigmentering3.
Derfor er centrale spørgsmål om neuronal differentiering, modning og plasticitet såsom forfinelse af neuronal forbindelse eller synaptisk skalering vanskelige at studere. Disse cellulære processer er vigtige for at definere cellulære mekanismer, der kører, for eksempel social adfærd, beslutningstagning eller motivationsbaseret adfærd, områder, som zebrafisk forsker i flere ugers gamle larver for nylig har bidraget med nøgleresultater baseret på adfærdsundersøgelser4.
Farmakologiske metoder til at hæmme pigmentering i zebrafisklarver i flere uger er næppe gennemførlige eller kan endda forårsage skadelige virkninger5,6,7,8. Dobbelt eller tredobbelt mutant stammer med specifikke pigmenteringsdefekter, såsom casper9 eller krystal10, er blevet enormt værdifulde værktøjer, men er besværlige i avl, giver få afkom og udgør faren for at akkumulere genetiske misdannelser på grund af overdreven indavl.
Her gives en minimal invasiv procedure som et alternativ, der gælder for enhver zebrafiskstamme. Denne procedure blev tilpasset fra elektrofysiologiske undersøgelser for at registrere neuronal aktivitet i levende og vågne zebrafisklarver. I teleosts, hud og bløde kraniet brusk kan forsigtigt fjernes ved mikro-peeling disse lag, fordi de ikke er tæt sammenvævet med hjernen vaskulatur. Dette giver mulighed for at udsætte hjernevæv, der indeholder neuroner og axonale skrifter uden skader og til registrering af neuronal morfologi, herunder synaptiske strukturer og deres molekylære indhold, som igen omfatter observation af fysiologiske ændringer som Ca2 + transienter eller intracellulære transporthændelser i op til flere timer. Ud over beskrivende karakteristik muliggør den direkte adgang til hjernevæv desuden forhør af modne neuronale funktioner ved hjælp af neurofarmakologisk stofbrug og optogenetiske tilgange. Derfor kan ægte strukturfunktionsforhold afsløres i den unge zebrafiskhjerne ved hjælp af denne hjerneeksponeringsstrategi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>A119.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Laser scanning microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d-Tubocurare</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T2379-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Capillary type 1</td>
			<td>WPI</td>
			<td>1B150F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Capillary type 2</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>GC100F-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Coverslip</td>
			<td>deltalab</td>
			<td>D102424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9105.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen (Thermo Fischer)</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging chamber</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Normapur</td>
			<td>26764298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LM-Agarose</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>8050.55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (Hexahydrate)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>A537.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DFC9000 GTC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle-Puller type 1</td>
			<td>NARISHIGE</td>
			<td>Model PC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle-Puller type 2</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>Model P-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur-Pipettes 3ml</td>
			<td>A.Hartenstein</td>
			<td>20170718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P029.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Normapur</td>
			<td>28244262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath</td>
			<td>Phoenix Instrument</td>
			<td>WB-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm petri dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90 mm petri dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>821473001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo imaging of fully active brain tissue in awake zebrafish larvae and juveniles by skull and skin removal

Forståelse af de kortvarige ændringer, der opstår under hjernens udvikling og modning kræver detaljeret høj opløsning billeddannelse i tid og rum på cellulære og subcellulære opløsning. Fremskridt inden for molekylære og billeddannelsesteknologier har gjort det muligt for os at få mange detaljerede indsigter i cellulære og molekylære mekanismer i hjernens udvikling i det gennemsigtige zebrafiskembryo. For nylig er processer til raffinement af neuronal forbindelse, der forekommer på senere larvestadier flere uger efter befrugtning, som for eksempel er kontrol over social adfærd, beslutningstagning eller motivationsdrevet adfærd, flyttet i fokus for forskning. På disse stadier forstyrrer pigmentering af zebrafiskhuden lysindtrængning i hjernevævet, og løsninger til embryonale stadier, f.eks. farmakologisk hæmning af pigmentering, er ikke længere mulige.
Derfor gives en minimalt invasiv kirurgisk løsning til mikroskopiadgang til hjernen af vågen zebrafisk, der stammer fra elektrofysiologiske tilgange. I teleosts, hud og bløde kraniet brusk kan forsigtigt fjernes ved mikro-peeling disse lag, udsætter underliggende neuroner og axonale skrifter uden skader. Dette giver mulighed for registrering af neuronal morfologi, herunder synaptiske strukturer og deres molekylære indhold, og observation af fysiologiske ændringer såsom Ca2 + transienter eller intracellulære transporthændelser. Desuden er det muligt at forhøre disse processer ved hjælp af farmakologisk hæmning eller optogenetisk manipulation. Denne hjerneeksponeringsmetode giver information om strukturelle og fysiologiske ændringer i neuroner samt sammenhængen og den indbyrdes afhængighed mellem disse hændelser i levende hjernevæv inden for få minutter eller timer. Teknikken er velegnet til in vivo hjernescanning af zebrafisk larver op til 30 dage efter befrugtning, den seneste udviklingsstadie testet hidtil. Det giver således adgang til så vigtige spørgsmål som synaptisk raffinement og skalering, axonal og dendritisk transport, synaptisk målretning af cytoskeletal last eller lokalt aktivitetsafhængigt udtryk. Derfor kan der forventes en bred anvendelse af denne monterings- og billedbehandlingsmetode.

Figur 3AC viser en 14 dpf larve af den transgene linje Tg[-7.5Ca8:GFP]bz12[15] med kraniet stadig intakt. Pigmentcellerne i den overlejrende hud fordeles over hele hovedet og forstyrrer fluorescenssignalet i interesseområdet (her lillehjernen). Med larven i denne tilstand er det ikke muligt at opnå billeder i høj opløsning af hjernen. Figur 3B viser en larve af sa...

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal at JoVE.com

In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal

Her præsenterer vi en metode til at forestille zebrafisk embryonale hjerne in vivo op til larve og unge stadier. Denne mikroinvasive procedure, der er tilpasset fra elektrofysiologiske tilgange, giver adgang til cellulære og subcellulære detaljer om moden neuron og kan kombineres med optogenetik og neurofarmakologiske undersøgelser til karakterisering af hjernefunktion og lægemiddelintervention.

In vivo Imaging af fuldt aktivt hjernevæv i vågen zebrafisk larver og unge fugle ved kraniet og fjernelse af huden

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at ...

Denne metode gør det muligt at visualisering af zebrafiskhjerne i senere larvestadier for at muliggøre observation af neuronal arkitektur på en meget detaljeret måde in vivo, der tidligere ikke har været mulig. Pigmentceller, der opstod under senere larveudvikling og forhindrer hjernen i at klare billeddannelse, er ikke noget problem med denne metode, fordi de simpelthen fjernes. Med metoden bør det være muligt at studere processer, der forekommer på senere stadier under larveudvikling af hjernen, processer, der påvirker synaptisk plasticitet, degeneration af neuroner eller deres regenerering.Før du begynder eksperimentet bruge en micropipette puller til at forberede skarpe, tynde, glas nåle fra glas kapillærer. Brug derefter en plast pasteurpipette til at samle larven i en petriskål med en diameter på 90 millimeter, der indeholder den relevante opløsning. Overfør den valgte larve til en petriskål med en diameter på 35 millimeter, der indeholder ACSF, og læg et 24 med 24 millimeter firkantet glasdæksel i petriskållåget.Derefter tilstænkt mængden af ACSF, der er nødvendig for forsøget, til en passende phial til iltning med carbogen. For at integrere larven skal du bruge en Pasteur-pipette til at overføre den bedøvede larve til et monteringskammer under et stereomikroskop. Hvis en larve stadig er i stand til at bevæge sig, må du ikke bruge fisken til forsøget, før fisken er helt ude af stand til at bevæge sig.Når larven er immobil, skal du forsigtigt fjerne det overskydende medium og straks tilføje mindst en milliliter lav smeltende agarose på larven. Orientere Zebrafisk med dorsal regionen vender op så tæt på overfladen af agarose som muligt. Hvis larven vil blive afbildet ved hjælp af et omvendt mikroskop, skal du efter en størkning trimme agarose, der indeholder larven, i en lille kasseblok.At udsætte hjernen for billeddannelse, trimme væk overskydende agarose over hjernen region af interesse efter behov og bruge en glasnål til at gøre et lille snit gennem huden i nærheden, men ikke over, regionen af interesse uden at trænge for dybt ind i vævet. Knap flytte nålen lige under hudens overflade, fortsætte med at omhyggeligt foretage meget små nedskæringer rundt i regionen af interesse, indtil huden over regionen af interesse kan fjernes eller skubbes til side. Når vævet er blevet fjernet fra alle embryoner, tilsæt en lille dråbe lav smeltende agarose til det tidligere forberedte billedkammer i et omvendt mikroskop og brug en lille spatel til at vende cuboid agaroseblokken 180 grader på agarosefaldet i billedkammeret.Når agarose er størknet, fylde billedbehandling kammer med frisk ACSF og begynde billeddannelse larven. Her kan en intakt 14 dages transgen larve efter befrugtning med kraniet stadig intakt observeres. Som vist fordeles pigmentcellerne i den overlejrende hud over hele hovedet, hvilket forstyrrer det fluorescerende signal i interesseområdet.Efter åben kranieoperation bliver interesseområdet frit tilgængeligt for detaljeret billeddannelse i høj opløsning. Huden, kraniet, og eller blod hjerne barrieren også hindre indtrængen af stoffer i hjernen, som illustreret ved den robuste nukleare farvestof farvning observeret i disse hjerneceller først efter åben kranieoperation. Disse fordele observeres også ved 30 dage efter befrugtning.I transgene fisk, der indeholder en fluorescerende hjernevakulature på grund af udtrykket af det røde fluorescerende protein, mCherry, i endotelceller viser farvekodning ved billedstakkens dybdeværdier, at selv blodkar dybt begravet i hjernen til næsten 250 mikron stadig er tydeligt synlige og sporbare. Når du udfører denne procedure altid huske på, at dette er en operation i et levende dyr. Derfor kræver det respekt og et fokuseret sind.Efter denne procedure kan registrering af den neuronale morfologi, herunder synaptiske strukturer, fysiologiske og intracellulære transporthændelser udføres i larver ældre end syv dage efter befrugtning. Med denne teknik håber vi at give en tilgang, der gør det muligt at studere også cellulære processer i hjernen, der opstår på senere larvestadier, og som er involveret i at etablere for eksempel så kompleks adfærd som social adfærd eller beslutningstagning.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualisering af proprioceptorer i<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver og pupper

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Funktionel Neuroimaging Med Ultrasonic blod-hjerne barrieren forstyrrelser og mangan-forstærket MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae

Automatiserede High-throughput Behavioral Analyser i zebrafisk Larver

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Samtidige<em&gt; Ex vivo</em&gt; Functional Test af to nethinder af<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogrammet System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Exposure of the Pig CNS for Histological Analysis: A Manual for Decapitation, Skull Opening, and Brain Removal

Eksponering af Pig CNS til histologisk analyse: En Manual til Decapitation, Skull Åbning og Brain Removal

Pigs have become increasingly popular in large-animal translational neuroscience research as an economically and ethically feasible substitute to ...

Labeling and Imaging of Amyloid Plaques in Brain Tissue Using the Natural Polyphenol Curcumin

Mærkning og billeddannelse af amyloid plaques i hjernevæv ved hjælp af den naturlige polyphenol curcumin

Deposition of amyloid beta protein (A&#946;) in extra- and intracellular spaces is one of the hallmark pathologies of Alzheimer&#39;s disease (AD). ...

A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

En hydrofobisk vævsclearingmetode til rottehjernevæv

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered ...

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

Implantation af et kranievindue til gentagen In Vivo-billeddannelse i vågne mus

To fully understand the cellular physiology of neurons and glia in behaving animals, it is necessary to visualize their morphology and record their ...

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Hjerne pericyt calcium og hæmodynamisk billeddannelse i transgene mus In Vivo

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to ...