Name: in vivo imaging of fully active brain tissue in awake zebrafish larvae and juveniles by skull and skin removal
Uploaded: 2021-02-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal at JoVE.com

We danken vooral Timo Fritsch voor de uitstekende verzorging van dieren en Hermann Döring, Mohamed Elsaey, Sol Pose-Méndez, Jakob von Trotha, Komali Valishetti en Barbara Winter voor hun behulpzame steun. We zijn ook alle andere leden van het Köster lab dankbaar voor hun feedback. Het project werd gedeeltelijk gefinancierd door de Duitse Stichting voor Onderzoek (DFG, KO1949/7-2) project 241961032 (aan RWK) en het Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF; Era-Net NEURON II CIPRESS project 01EW1520 naar JCM) wordt erkend.

Alle hier beschreven dierwerkzaamheden zijn in overeenstemming met wettelijke voorschriften (EU-richtlijn 2010/63). Het onderhoud en de behandeling van vis zijn goedgekeurd door de lokale autoriteiten en door de vertegenwoordiger voor dierenwelzijn van de Technische Universität Braunschweig.
1. Bereiding van kunstmatige cerebro spinale vloeistof (ACSF), laag smeltende agarose en scherpe glazen naalden
<ol><li>Bereid de ACSF voor door de vermelde chemicaliën op te lossen bij de volgende con...

<ol>
	<li>Embryology. Zebrafish Development Available from: <a target="_blank" href="https://embryology.med.unsw.edu.au/embryology/index.php/Zebrafish_Development">https://embryology.med.unsw.edu.au/embryology/index.php/Zebrafish_Development</a> (2020)</li><li>Sassen, W. A., K&#246;ster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+toolbox+for+genetic+manipulation+of+zebrafish.+Advances+in+Genomics+and+Genetics.">A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish. Advances in Genomics and Genetics.</a> Dove Medical Press. 2015 (5), 151-163 (2015).</li><li>Singh, A. P., N&#252;sslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+stripes+as+a+model+for+vertebrate+colour+pattern+formation.">Zebrafish stripes as a model for vertebrate colour pattern formation.</a> Current Biology. 25 (2), 81-92 (2015).</li><li>Kalueff, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+to+recognize+zebrafish+'affective'+behavior.">Time to recognize zebrafish 'affective' behavior.</a> Brill: Behaviour. 149 (10-12), 1019-1036 (2012).</li><li>Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. -. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+transparent+zebrafish:+a+refined+method+to+improve+detection+of+gene+expression+during+embryonic+development.">Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development.</a> Marine Biotechnology. 3, 522-527 (2001).</li><li>Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenothiourea+sensitizes+zebrafish+cranial+neural+crest+and+extraocular+muscle+development+to+changes+in+retinoic+acid+and+IGF+signaling.">Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and IGF signaling.</a> PloS One. 6, 22991 (2011).</li><li>Elsalini, O. A., Rohr, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenylthiourea+disrupts+thyroid+function+in+developing+zebrafish.">Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish.</a> Development Genes and Evolution. 212, 593-598 (2003).</li><li>Baumann, L., Ros, A., Rehberger, K., Neuhauss, S. C. F., Segner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thyroid+disruption+in+zebrafish+(Danio+rerio)+larvae:+Different+molecular+response+patterns+lead+to+impaired+eye+development+and+visual+functions.">Thyroid disruption in zebrafish (Danio rerio) larvae: Different molecular response patterns lead to impaired eye development and visual functions.</a> Aquatic Toxicology. 172, 44-55 (2016).</li><li>White, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transparent+adult+zebrafish+as+a+tool+for+in+vivo+transplantation+analysis.">Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis.</a> Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).</li><li>Antinucci, P., Hindges, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+crystal-clear+zebrafish+for+in+vivo+imaging.">A crystal-clear zebrafish for in vivo imaging.</a> Scientific Reports. 6, 29490 (2016).</li><li>Burr, S. A., Leung, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curare+(d-Tubocurarine).">Curare (d-Tubocurarine).</a> Encyclopedia of Toxicology (3rd Edition). , 1088-1089 (2014).</li><li>Gesler, H. M., Hoppe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3,6-bis(3-diethylaminopropoxy)+pyridazine+bismethiodide,+a+long-acting+neuromuscular+blocking+agent.">3,6-bis(3-diethylaminopropoxy) pyridazine bismethiodide, a long-acting neuromuscular blocking agent.</a> The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 118 (4), 395-406 (1956).</li><li>Furman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Alpha Bungarotxin. Reference Module in Biomedical Sciences. , (2018).</li><li>Attili, S., Hughes, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaesthetic+tricaine+acts+preferentially+on+neural+voltage-gated+sodium+channels+and+fails+to+block+directly+evoked+muscle+contraction.">Anaesthetic tricaine acts preferentially on neural voltage-gated sodium channels and fails to block directly evoked muscle contraction.</a> PLoS One. 9 (8), 103751 (2014).</li><li>Namikawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+neurodegenerative+spinocerebellar+ataxia+type+13+in+zebrafish+using+a+Purkinje+neuron+specific+tunable+coexpression+system.">Modeling neurodegenerative spinocerebellar ataxia type 13 in zebrafish using a Purkinje neuron specific tunable coexpression system.</a> Journal of Neuroscience. 39 (20), 3948-3969 (2019).</li><li>Hennig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theoretical+models+of+synaptic+short+term+plasticity.">Theoretical models of synaptic short term plasticity.</a> Frontiers in Computational Neuroscience. 7 (45), (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moesin1+and+Ve-cadherin+are+required+in+endothelial+cells+during+in+vivo+tubulogenesis.">Moesin1 and Ve-cadherin are required in endothelial cells during in vivo tubulogenesis.</a> Development. 137, 3119-3128 (2010).</li><li>Hobro, A., Smith, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evaluation+of+fixation+methods:+Spatial+and+compositional+cellular+changes+observed+by+Raman+imaging.">An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging.</a> Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).</li><li>Knogler, L. D., Kist, A. M., Portugues, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+context+dominates+output+from+purkinje+cell+functional+regions+during+reflexive+visuomotor+behaviours.">Motor context dominates output from purkinje cell functional regions during reflexive visuomotor behaviours.</a> eLife. 8, 42138 (2019).</li><li>Hsieh, J., Ulrich, B., Issa, F. A., Wan, J., Papazian, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+development+of+Purkinje+cell+excitability,+functional+cerebellar+circuit,+and+afferent+sensory+input+to+cerebellum+in+zebrafish.">Rapid development of Purkinje cell excitability, functional cerebellar circuit, and afferent sensory input to cerebellum in zebrafish.</a> Frontier in Neural Circuits. 8 (147), (2014).</li><li>Scalise, K., Shimizu, T., Hibi, M., Sawtell, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+cerebellar+Purkinje+cells+during+fictive+optomotor+behavior+in+larval+zebrafish.">Responses of cerebellar Purkinje cells during fictive optomotor behavior in larval zebrafish.</a> Journal of Neurophysiology. 116 (5), 2067-2080 (2016).</li><li>Harmon, T. C., Magaram, U., McLean, D. L., Raman, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+responses+of+Purkinje+neurons+and+roles+of+simple+spikes+during+associative+motor+learning+in+larval+zebrafish.">Distinct responses of Purkinje neurons and roles of simple spikes during associative motor learning in larval zebrafish.</a> eLife. 6, 22537 (2017).</li><li>Zehendner, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderate+hypoxia+followed+by+reoxygenation+results+in+blood-brain+barrier+breakdown+via+oxidative+stress-dependent+tight-junction+protein+disruption.">Moderate hypoxia followed by reoxygenation results in blood-brain barrier breakdown via oxidative stress-dependent tight-junction protein disruption.</a> PLoS One. 8 (12), 82823 (2013).</li><li>Dhabhar, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+short-term+stress+response+-+mother+nature's+mechanism+for+enhancing+protection+and+performance+under+conditions+of+threat,+challenge,+and+opportunity.">The short-term stress response - mother nature's mechanism for enhancing protection and performance under conditions of threat, challenge, and opportunity.</a> Frontiers of Neuroendocrinology. 49, 175-192 (2018).</li></ol>

De gepresenteerde methode biedt een alternatieve benadering van hersenisolatie of de behandeling van zebravislarven met geneesmiddelen die pigmentatie remmen voor het opnemen van hoge resolutie beelden van neuronen in hun in vivo omgeving. De kwaliteit van beelden die met deze methode zijn opgenomen, is vergelijkbaar met beelden van uitgeplante hersenen, maar onder natuurlijke omstandigheden.
Bovendien wordt een verlies in intensiteit van fluorescentie vermeden, omdat er geen behandel...

In de afgelopen decennia is de zebravis (Danio rerio) geëvolueerd als een van de meest populaire gewervelde modelorganismen voor embryonale en larvale ontwikkelingsstudies. De grote vruchtbaarheid van zebravis vrouwtjes in combinatie met de snelle ex utero ontwikkeling van het embryo en de transparantie ervan tijdens vroege embryonale ontwikkelingsfasen zijn slechts een paar belangrijke factoren die zebravissen tot een krachtig modelorganisme maken om ontwikkelingsvragen aan te gaan1. Vooruitgang in moleculair genetische technologieën in combinatie met hoge resolutie in vivo beeldvormingsstudies maakten het mogelijk celbiologische mechanismen aan te pakken die ten grondslag liggen aan ontwikkelingsprocessen2. Met name op het gebied van neuronale differentiatie, fysiologie, connectiviteit en functie heeft zebravis in ongekende details licht geworpen op het samenspel van moleculaire dynamica, hersenfuncties en organismegedrag.
Toch zijn de meeste van deze studies beperkt tot embryonale en vroege larvale stadia tijdens de eerste week van ontwikkeling, omdat transparantie van het zenuwstelselweefsel geleidelijk verloren gaat. In deze stadia wordt hersenweefsel verhinderd door microscopiebenaderingen met hoge resolutie die worden afgeschermd door schedeldifferentiatie en pigmentatie3.
Daarom zijn belangrijke vragen over neuronale differentiatie, rijping en plasticiteit, zoals de verfijning van neuronale connectiviteit of synaptische schaling, moeilijk te bestuderen. Deze cellulaire processen zijn belangrijk om cellulaire mechanismen te definiëren die bijvoorbeeld sociaal gedrag, besluitvorming of op motivatie gebaseerd gedrag stimuleren, gebieden waaraan zebravisonderzoek op enkele weken oude larven onlangs belangrijke bevindingen heeft bijgedragen op basis van gedragsstudies4.
Farmacologische benaderingen om pigmentatie bij zebravislarven gedurende enkele weken te remmen zijn nauwelijks haalbaar of kunnen zelfs schadelijke effecten veroorzaken5,6,7,8. Dubbele of drievoudige mutante stammen met specifieke pigmentatiedefecten, zoals casper9 of kristal10,zijn enorm waardevolle hulpmiddelen geworden, maar zijn moeizaam in de fokkerij, bieden weinig nakomelingen en vormen het gevaar van het accumuleren van genetische misvormingen als gevolg van overmatige inteelt.
Hier wordt een minimale invasieve procedure als alternatief geboden die van toepassing is op elke zebravisstam. Deze procedure werd aangepast van elektrofysiologische studies om neuronale activiteit in levende en wakkere zebravislarven vast te leggen. Bij teleosten kunnen huid en zacht schedelkraakbeen zorgvuldig worden verwijderd door deze lagen te micropelen, omdat ze niet nauw verweven zijn met de vasculatuur van de hersenen. Dit maakt het mogelijk om hersenweefsel met neuronen en axonale tractus zonder schade bloot te stellen en voor het registreren van neuronale morfologie, inclusief synaptische structuren en hun moleculaire inhoud, die op hun beurt de observatie van fysiologische veranderingen zoals Ca2 + transiënten of intracellulaire transportgebeurtenissen gedurende maximaal enkele uren omvatten. Bovendien, naast beschrijvende karakteriseringen, maakt de directe toegang tot hersenweefsel ondervraging van volwassen neuronale functies mogelijk door middel van neurofarmacologische toediening van stoffen en optogenetische benaderingen. Daarom kunnen echte structuurfunctierelaties worden onthuld in de juveniele zebravishersenen met behulp van deze hersenblootstellingsstrategie.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>A119.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Laser scanning microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d-Tubocurare</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T2379-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Capillary type 1</td>
			<td>WPI</td>
			<td>1B150F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Capillary type 2</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>GC100F-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Coverslip</td>
			<td>deltalab</td>
			<td>D102424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9105.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen (Thermo Fischer)</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging chamber</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Normapur</td>
			<td>26764298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LM-Agarose</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>8050.55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (Hexahydrate)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>A537.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DFC9000 GTC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle-Puller type 1</td>
			<td>NARISHIGE</td>
			<td>Model PC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle-Puller type 2</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>Model P-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur-Pipettes 3ml</td>
			<td>A.Hartenstein</td>
			<td>20170718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P029.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Normapur</td>
			<td>28244262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath</td>
			<td>Phoenix Instrument</td>
			<td>WB-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm petri dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90 mm petri dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>821473001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo imaging of fully active brain tissue in awake zebrafish larvae and juveniles by skull and skin removal

Het begrijpen van de kortstondige veranderingen die optreden tijdens de ontwikkeling en rijping van de hersenen vereist gedetailleerde beeldvorming met hoge resolutie in ruimte en tijd bij cellulaire en subcellulaire resolutie. Vooruitgang in moleculaire en beeldvormingstechnologieën heeft ons in staat gesteld om tal van gedetailleerde inzichten te krijgen in cellulaire en moleculaire mechanismen van hersenontwikkeling in het transparante zebravisembryo. Onlangs zijn processen van verfijning van neuronale connectiviteit die enkele weken na bevruchting in latere larvale stadia optreden, die bijvoorbeeld controle van sociaal gedrag, besluitvorming of motivatiegestuurd gedrag zijn, in focus van onderzoek gegaan. In deze stadia interfereert pigmentatie van de zebravishuid met lichte penetratie in hersenweefsel, en oplossingen voor embryonale stadia, bijvoorbeeld farmacologische remming van pigmentatie, zijn niet meer haalbaar.
Daarom wordt een minimaal invasieve chirurgische oplossing voor microscopietoegang tot de hersenen van wakkere zebravissen geboden die is afgeleid van elektrofysiologische benaderingen. Bij teleosten kunnen huid en zacht schedelkraakbeen zorgvuldig worden verwijderd door deze lagen te micropelen, waardoor onderliggende neuronen en axonale tractus zonder schade worden blootgelegd. Dit maakt het mogelijk om neuronale morfologie, inclusief synaptische structuren en hun moleculaire inhoud, en de observatie van fysiologische veranderingen zoals Ca2 + transiënten of intracellulaire transportgebeurtenissen vast te houden. Bovendien is ondervraging van deze processen door middel van farmacologische remming of optogenetische manipulatie mogelijk. Deze benadering van blootstelling aan de hersenen biedt informatie over structurele en fysiologische veranderingen in neuronen, evenals de correlatie en onderlinge afhankelijkheid van deze gebeurtenissen in levend hersenweefsel in het bereik van minuten of uren. De techniek is geschikt voor in vivo hersenbeeldvorming van zebravislarven tot 30 dagen na bevruchting, de nieuwste ontwikkelingsfase die tot nu toe is getest. Het biedt dus toegang tot belangrijke vragen zoals synaptische verfijning en schaalvergroting, axonale en dendritische transport, synaptische targeting van cytoskeletlading of lokale activiteitsafhankelijke expressie. Daarom kan een breed gebruik voor deze montage- en beeldvormingsbenadering worden verwacht.

Figuur 3A,C toon een 14 dpf larve van de transgene lijn Tg[-7.5Ca8:GFP]bz12[15] Met de schedel nog intact. De pigmentcellen in de bedekkende huid zijn verspreid over het hoofd en interfereren met het fluorescentiesignaal in het interessegebied (hier, cerebellum). Met de larve in deze toestand is het niet mogelijk om afbeeldingen met hoge resolutie van de hersenen te verkrijgen. <strong class="xfig...

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal at JoVE.com

In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal

Hier presenteren we een methode om de zebravis embryonale hersenen in vivo tot larvale en juveniele stadia in beeld te brengen. Deze microinvasieve procedure, aangepast aan elektrofysiologische benaderingen, biedt toegang tot cellulaire en subcellulaire details van volwassen neuronen en kan worden gecombineerd met optogenetica en neurofarmacologische studies voor het karakteriseren van hersenfunctie en medicamenteuze interventie.

In vivo beeldvorming van volledig actief hersenweefsel in wakkere zebravislarven en juvenielen door schedel- en huidverwijdering

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at ...

Deze methode maakt de visualisatie van zebravishersenen in latere larvale stadia mogelijk om de observatie van de neuronale architectuur op een zeer gedetailleerde manier in vivo mogelijk te maken die voorheen niet mogelijk was. Pigmentcellen, die tijdens latere larvale ontwikkeling naar voren kwamen en voorkomen dat de hersenen duidelijke beeldvorming krijgen, zijn geen probleem met deze methode omdat ze eenvoudig worden verwijderd. Met de methode moet het mogelijk zijn om processen te bestuderen die in latere stadia optreden tijdens de larvale ontwikkeling van de hersenen, processen die van invloed zijn op synaptische plasticiteit, degeneratie van neuronen of hun regeneratie.Gebruik voor aanvang van het experiment een micropipettrekker om scherpe, dunne, glazen naalden van glazen haarvaten te bereiden. Gebruik vervolgens een plastic Pasteur pipet om larven te verzamelen in een Petrischaal met een diameter van 90 millimeter met de juiste oplossing. Breng de geselecteerde larve over in een Petrischaal met een diameter van 35 millimeter met ACSF en plaats een 24 bij 24 millimeter, vierkante, glazen deksel in het deksel van de Petrischaal.Vul vervolgens het volume ACSF dat nodig is voor het experiment in een geschikte phial voor oxygenatie met carbogen. Om de larve in te bedden, gebruikt u een Pasteur-pipet om de verdoofde larve onder een stereomicroscoop naar een montagekamer over te brengen. Als een larve nog steeds kan bewegen, gebruik de vis dan niet voor het experiment totdat de vissen volledig niet in staat zijn om te bewegen.Wanneer de larve onbeweeglijk is, verwijder dan voorzichtig het overtollige medium en voeg onmiddellijk ten minste één milliliter laag smeltende agarose toe aan de larve. Oriënteer de Zebravis met het dorsale gebied zo dicht mogelijk bij het oppervlak van de agarose. Als de larve wordt afgebeeld met behulp van een omgekeerde microscoop, knip dan na een stollen de agarose met de larve in een klein cuboïde blok.Om de hersenen bloot te stellen voor beeldvorming, knipt u het overtollige agarose over het hersengebied van belang weg als dat nodig is en gebruikt u een glazen naald om een kleine incisie door de huid te maken in de buurt van, maar niet over, het interessegebied zonder te diep in het weefsel te doordringen. Nauwelijks bewegen van de naald net onder het huidoppervlak, blijven voorzichtig zeer kleine sneden maken rond het gebied van belang totdat de huid over het interessegebied kan worden verwijderd of opzij kan worden geschoven. Wanneer het weefsel uit alle embryo's is verwijderd, voegt u een kleine druppel laag smeltende agarose toe aan de eerder voorbereide beeldvormingskamer van een omgekeerde microscoop en gebruikt u een kleine spatel om het cuboïde agaroseblok 180 graden op de agarosedruppel in de beeldkamer te draaien.Wanneer de agarose is gestold, vult u de beeldvormingskamer met verse ACSF en begint u de larve in beeld te brengen. Hier kan een intacte 14 dagen na bevruchting transgene larve worden waargenomen met de schedel nog intact. Zoals getoond, worden de pigmentcellen in de bedekkende huid over het hele hoofd verdeeld, waardoor het fluorescerende signaal in het interessegebied wordt verstoord.Na een open schedeloperatie wordt het interessegebied vrij toegankelijk voor gedetailleerde beeldvorming met hoge resolutie. De huid, schedel en of bloed-hersenbarrière belemmeren ook de penetratie van stoffen in de hersenen, zoals blijkt uit de robuuste nucleaire kleurstofkleuring die pas na een open schedeloperatie in deze hersencellen wordt waargenomen. Deze voordelen worden ook waargenomen bij 30 dagen na de bevruchting.In transgene vissen die een fluorescerende hersen vasculatuur bevatten als gevolg van de expressie van het rode fluorescerende eiwit, mCherry, in endotheelcellen, toont kleurcodering op de dieptewaarden van de beeldstapel aan dat zelfs bloedvaten diep begraven in de hersenen tot bijna 250 micron nog steeds duidelijk zichtbaar en traceerbaar zijn. Houd er bij het uitvoeren van deze procedure altijd rekening mee dat dit een operatie bij een levend dier is. Daarom vereist het respect en een gefocuste geest.Na deze procedure kan de registratie van de neuronale morfologie, inclusief synaptische structuren, fysiologische en intracellulaire transportgebeurtenissen worden uitgevoerd bij larven ouder dan zeven dagen na de bevruchting. Met deze techniek hopen we een aanpak te bieden die het mogelijk maakt om ook cellulaire processen in de hersenen te bestuderen die in latere larvale stadia voorkomen en die betrokken zijn bij het vaststellen van bijvoorbeeld dergelijk complex gedrag zoals sociaal gedrag of besluitvorming.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Time-lapse Live-Imaging van klonaal verwante neurale progenitorcellen in de ontwikkelingslanden zebravis voorhersenen

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualisatie van proprioceptoren in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven en poppen

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Functionele neuroimaging Met behulp van ultrasone bloed-hersen barrière verstoring en mangaan-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae

Geautomatiseerde High-throughput Behavioral Analyses in zebravis Larven

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaan<em&gt; Ex vivo</em&gt; Functioneel testen van Two netvliezen door<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Exposure of the Pig CNS for Histological Analysis: A Manual for Decapitation, Skull Opening, and Brain Removal

Blootstelling van het varken voor CNS Histologische analyse: A Manual voor onthoofding, Schedel openen en Brain verwijdering

Pigs have become increasingly popular in large-animal translational neuroscience research as an economically and ethically feasible substitute to ...

Labeling and Imaging of Amyloid Plaques in Brain Tissue Using the Natural Polyphenol Curcumin

Etikettering en beeldvorming van amyloïde plaques in hersenweefsel met behulp van de natuurlijke Polyphenol curcumine

Deposition of amyloid beta protein (A&#946;) in extra- and intracellular spaces is one of the hallmark pathologies of Alzheimer&#39;s disease (AD). ...

A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

Een hydrofobe weefselopruimingsmethode voor rattenhersenweefsel

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered ...

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

Implantatie van een schedelvenster voor herhaalde in vivo beeldvorming bij wakkere muizen

To fully understand the cellular physiology of neurons and glia in behaving animals, it is necessary to visualize their morphology and record their ...

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Pericytencalcium en hemodynamische beeldvorming in de hersenen bij transgene muizen in vivo

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to ...